專利名稱：一種基因免疫制備人類Ⅰ型胸苷激酶單克隆抗體的新方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種基因免疫制備人類I型胸苷激酶單克隆抗體的方法，既是采用基因工程 和分子免疫學技術(shù)，通過對人類I型胸苷激酶基因的克隆和真核分泌型載體的重組構(gòu)建所實 施的一種基因免疫制備人類I型胸苷激酶單克隆抗體的新方法。該方法所制備的單克隆抗體 應屬于基因工程類產(chǎn)品。
背景技術(shù)：
關(guān)于人胸腺嘧啶脫氧核苷激酶I型(hTKl)的技術(shù)背景hTKl，其中文名稱是人胸腺嘧啶 脫氧核苷激酶I型，而中文簡稱則是人胸苷激酶I型；它的英文名稱是Human thymidine kinase,而英文簡稱則是hTKl;它的酶學中文命名是三磷酸腺苷或腺苷三磷酸胸苷5-磷酸 轉(zhuǎn)移酶，EC. 2. 7. 1. 21，激酶，而它的酶學英文命名則為ATP:thymidine
5-phosphotransferase, EC. 2. 7. 1.21。早在上個世紀就有學者指出，DNA在合成之前，胸腺 嘧啶脫氧核苷(TdR)被攝入細胞并在轉(zhuǎn)化成TMP時必須經(jīng)過磷酸化激酶的催化。事實上，通過 從真核和原核生物分離和部分純化所得到的TK的酶學實驗中也確認了磷酸化反應過程必須有 TK酶的催化。人細胞中的hTK主要以兩種同工酶的形式存在，即hTKl和hTK2。 hTKl主要存在 于細胞質(zhì)中，而hTK2則主要存在于亞細胞結(jié)構(gòu)的線粒體中。由于其中一種同工酶大量存在于 胚胎組織，也有學者分別稱它們?yōu)榕咛K (Fetal TK)和成人TK (Adult TK)。有研究發(fā)現(xiàn)，胚 胎TK是與細胞的分裂相關(guān)，存在于細胞質(zhì)中，稱之為hTKl;而成人TK存在于線粒體中，它 的表達與細胞周期無關(guān)，又稱之為hTK2。或者將hTKl稱為細胞質(zhì)胸苷激酶，hTK2稱為線粒體 胸苷激酶。通常，hTKl基因定位在于染色體17q23. 2-q25. 3，靠近于半乳糖激酶；而hTK2基因則 定位于染色體16q22-q23. 1。關(guān)于hTKl的結(jié)構(gòu)，在上個世紀80年代就有學者完成了人TK1基因 編碼區(qū)域的cDNA分子克隆，并且完成了其序列分析。研究表明，從人宮頸癌(HeLa)提取 hTKl，其單體的轉(zhuǎn)錄編碼為分子量2. 4萬并具高度保守區(qū)域的核苷激酶，hTKl全酶是分子量為 96000道爾頓的四聚體，等電點聚焦免疫電泳測得其等電點為8. 3-8. 5。 hTKl的四聚體中每一 單體a螺旋/e折疊區(qū)域組成與ATP酶家系類似，有一p-環(huán)是hTKl酶活性調(diào)節(jié)區(qū)域，即底物反
應區(qū)域。四聚體中e折疊區(qū)域有一鋅原子與e折疊區(qū)域連接。在這e -絲狀帶折疊的底部，
干鏈變寬成為一個套索閉環(huán)，是dTTP負責TKl活性反饋抑制調(diào)節(jié)的的區(qū)域，但TK1這套索環(huán)結(jié) 構(gòu)是不同于其它脫氧核苷酸激酶。hTKl是存在于機體中的重要激酶之一，其主要生理和生化
作用是它作為一種胸腺嘧啶脫氧核苷代謝及補救途徑的激酶，在三磷酸腺苷或腺苷三磷酸 (ATP)作為供體和二價鎂離子(Mg2+)參與的條件下，迅速催化脫氧胸苷(thymidine, Thd)轉(zhuǎn)變 為一腺胸苷酸(TMP)。因此，hTKl是與細胞增殖、分化和細胞周期密切相關(guān)的激酶，也被認 為是機體合成DNA的關(guān)鍵酶之一。然而，hTKl酶并不是機體必需的一種激酶提供體內(nèi)細胞 DNA合成所需要的前體物dTMP，但與體內(nèi)合成途徑比較，TKl酶合成dTMP是直接采用細胞中核 甘酸再循環(huán)方式，在增殖細胞和腫瘤細胞中，具有活性催化的功能的四聚體細胞質(zhì)胸苷激酶 (TK1)。正如前敘，TKl的催化反應過程是在ATP作為供體和二價鎂離子(Mg^)參與的條件下 ，催化脫氧胸苷(Thd)生成一腺胸苷酸(TMP)，這種磷酸化方式是唯一的通途引入Thd到DNA合 成代謝中，又被稱之為一種嘧啶補救合成的DNA的關(guān)鍵酶和S-期特殊酶。hTK作為一種激酶是 胸苷參與DNA合成的關(guān)鍵酶，它能可逆性催化胸腺嘧啶脫氧核苷與磷酸脫氧核苷之間的轉(zhuǎn)化， 它能真實而客觀地反映著細胞的增殖狀況，而其中與細胞增殖關(guān)系最為密切相關(guān)的是hTKl 。 正是由于hTKl與細胞分裂密切相關(guān)，在細胞分裂G1期含量較低，到S期后逐漸升高，至G2期達到 最高，因此，編碼hTKl的mRNA及其所表達的蛋白質(zhì)也就成為細胞增生的標志物?？梢哉f， TK1水平的高低與DNA在細胞周期的S期DNA合成速度密切相關(guān)。 一般情況下，所觀察到正常增 殖細胞TK1的水平在細胞周期的G1和S期交界處開始升高，隨著細胞進入G1晚期，TK1酶的水 平逐漸急劇上升，直至S和G2期交界處，但在腫瘤細胞中，這種高TK1水平從S晚期一直持續(xù) 到M早期。大量離體試驗結(jié)果表明，TK1在增殖細胞和腫瘤細胞周期調(diào)控代謝過程具有特殊的 意義。通常， 一些非增殖細胞的TK1和健康人血清和組織中TK1，其含量極微或檢測不到，而 在異常增殖細胞或惡性腫瘤患者中，TK1酶伴隨著腫瘤細胞數(shù)的急劇增殖而升高。不同來組 織增殖細胞中細胞周期與TK1信使RNA (TKlmRNA)的表達關(guān)系是復雜的，mRNA的剪切和翻譯也 是隨細胞生長狀態(tài)變化的，推測TK1水平主要是通過翻譯后調(diào)控機制發(fā)揮作用。而且，已有 研究表明，增殖細胞生長的不同時期，TKl活性的調(diào)控則主要是通過dTTP反饋抑制途徑和底 物循環(huán)方式進行調(diào)節(jié)的。正是由于TK1與細胞異常增殖和腫瘤細胞表達密切相關(guān)，即在非增 殖細胞和健康人血清中，含量極微或檢測不到，而在惡性腫瘤患者中伴隨著腫瘤細胞的急劇 增殖而升高等特征，使學術(shù)界對TK1的研究引起了廣泛的關(guān)注和重視，并認為TK1有可能作為 一種有價值的血清學細胞增殖標記物來檢測增殖細胞的增殖活性，適用于惡性腫瘤的細胞增 殖度檢測。特別是已有文獻表明，TK1的活性在腫瘤細胞大于總量的95。/。，而TK2低于5。/。，在 正常健康人的血清中檢測很低或不可以檢測，因此采用檢測血清TK活性將評估腫瘤增殖的惡 性程度。hTKl在細胞異常增生時含量或活性增高，特別是在細胞增生旺盛的早期惡性腫瘤患 者的體液或血液中更是顯著增高，且hTKl水平的高低與惡性腫瘤的切除和復發(fā)呈降低和升高的趨勢。曾有學者曾采用12種人癌組織進行免疫組化分析，發(fā)現(xiàn)TK1均呈現(xiàn)陽性結(jié)果，這初步 證明了癌癥患者與TK1活力或含量增高有關(guān)，且進一步試驗也證明，隨著腫瘤細胞增殖速度明 顯提高，TK1活力增強，DNA合成速度加快，從而促進了腫瘤細胞的進一步增殖，形成一個病情 不斷加重的惡性循環(huán)。關(guān)于TK1的穩(wěn)定性，大多數(shù)報道認為TK1的穩(wěn)定性欠佳，而且在組織或 細胞萃取液中的TK1的穩(wěn)定性也較差，即使是在4'C環(huán)境條件下也不穩(wěn)定，這可能與TK1四聚 體結(jié)構(gòu)降解有關(guān)。如保存在-2(TC以下，TKl活性可以穩(wěn)定l-3星期。純化的TK1或重組人TK1 則需要保存在-8(TC冷藏環(huán)境。當然，TK1在血清中保存是穩(wěn)定的，通常在-2(TC條件下可保 存5年以上，其之所以穩(wěn)定的可能原因，被認為是TK1在血清中是與其它蛋白質(zhì)形成一大分子 穩(wěn)定的復合物有關(guān)。不過，關(guān)于血清TK1的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)仍然是不清楚的，其中包括這酶在細 胞內(nèi)被破壞或者是由細胞以活性或非活性的狀態(tài)被分泌出去。為了進一步研究及臨床診斷和 治療的需要，有學者設法從相關(guān)癌組織或癌細胞對TK1進行提取分離制備。但采用生物化學 的方式進行提取制備不僅十分繁瑣且得不償失。為此國內(nèi)外學者(包括我們自己的研究團隊 )采用基因工程的方法制備TK1和TK1單克隆抗體的制備。
目前制備hTKl單克隆抗體方法的技術(shù)背景用雜交瘤成功制備單克隆抗體技術(shù)發(fā)明至今 已有30多年的歷史，到目前為止單克隆抗體的種類非常繁多，已廣泛地用于生命科學等領域， 特別是用于臨床相關(guān)疾病的診斷和治療，以及生物制品的生產(chǎn)和純化等。以往常規(guī)制備單克 隆抗體的方法主要是從相關(guān)的細胞或組織中提取抗原或購買商品抗原用于免疫實驗動物?？?原的來源不同其生物學性質(zhì)有很多差別，特別是一些真核細胞表達的蛋白質(zhì)在制備和純化過 程中使用的試劑影響蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，由此導致蛋白質(zhì)的免疫原性的改變。用于制備抗體 的抗原來源是影響抗體產(chǎn)生的關(guān)鍵問題，有些抗原來源非常困難，甚至沒有商品試劑，也沒有 標準品，在這種情況下制備單克隆抗體比較復雜，首先需要鑒定提取的抗原是否正確，否則 免疫原錯誤必導致抗體的錯誤；因此，抗原是制備抗體的關(guān)鍵問題。隨著分子生物學技術(shù)的 發(fā)展，得到任何一個已知蛋白質(zhì)的基因序列，且克隆基因和進行基因工程表達已是一個十分成 熟的技術(shù)，所以大量的基因工程制備的蛋白質(zhì)非常多，用于免疫動物也非常方便，許多生物公 司均可以提供一定數(shù)量的純化蛋白質(zhì)，只是價格較高，另外不同公司的產(chǎn)品和實驗人員制備的 蛋白質(zhì)在某些性質(zhì)上還有差別，有時同一種蛋白質(zhì)在免疫原性上差別很大，甚至與生理條件 下天然蛋白的免疫原性相差甚遠；由于蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)(一級結(jié)構(gòu)以上)在抗原制備過程 中發(fā)生改變導致有些抗原性丟失，或暴露出非生理條件下的抗原決定簇。因為抗體用于診斷 和治療等過程時，抗體識別的抗原是天然結(jié)構(gòu)，是具有一定空間結(jié)構(gòu)的單體或多聚體，所以 制備抗體的理想蛋白質(zhì)抗原應該是具有天然結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，另外對于真核細胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)
在某些情況下還要考慮糖基化對蛋白質(zhì)的影響。有些蛋白質(zhì)是否糖基化將影響蛋白質(zhì)的免疫 原性；由于原核細胞沒有糖基化系統(tǒng)，因此通過大腸桿菌基因工程制備的抗原沒有糖基化， 所以有些必須糖基化的蛋白質(zhì)抗原不能用大腸桿菌制備，糖基化對有些抗原是必需的，其影 響抗原的決定簇，因此有些免疫原必須來源于真核細胞(從細胞中提取或真核細胞表達)。 人TK1是細胞合成DNA必備的激酶，其存在細胞內(nèi)，是一個非分泌性蛋白。TK1基因的開放讀 碼框架是702個核苷酸，除去終止密碼外可以編碼233個氨基酸的蛋白質(zhì)；目前認為TK1沒有 信號肽結(jié)構(gòu)，因此不能分泌到細胞外，是否有糖基化位點尚不清楚。由于目前沒有TK1的純 商品試劑，所以關(guān)于TK1的單克隆抗體制備的文獻很少，還沒有一個非常理想的TK1單克隆抗 體。目前已有報道，TK1單克隆抗體的文獻均是采用原核細胞表達的方式，用大腸桿菌表達 的TK1或從細胞提取的TK1作為抗原，包括我們前期的工作，即嚴格按照無菌操作規(guī)程，取新 鮮抗凝血用淋巴細胞分離液分離出該抗凝血中的白細胞，用頂DM培養(yǎng)基稀釋成一定數(shù)量的白 細胞置于細胞培養(yǎng)瓶后，加入十二烷基氟波酯(TPA)，然后置于二氧化碳C02培養(yǎng)箱中進行細 胞培養(yǎng)后離心收獲細胞。同時傳代HeLa細胞至長成單層后加入氨基碟呤后置于二氧化碳C02 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并同步化至S期后直接提取其RNA。緊接著，再進行人外周血白細胞和HeLa細 胞RNA制備，即將誘導后的白細胞和HeLa細胞分別加入Trizol試劑，輕輕混合均勻后，加入 三氯甲烷(氯仿)，再次輕輕混合均勻后，立即置于高速冷凍離心機中，并以高速離心10分 鐘，取出離心管，吸出上層水相，再次加入等體積的三氯甲烷(氯仿)，輕輕混合均勻，再 以高速離心10分鐘，取上清液體，立即加入等體積的異丙醇，輕輕混合均勻后，置于低溫冰 箱中過夜，次日再高速離心10分鐘，棄去上清液體，用乙醇洗滌沉淀一次，置于室溫中自然 干燥后，于每個樣品中加入DEPC處理的水懸浮其沉淀；再采用逆轉(zhuǎn)錄PC財廣增TKlcDNA，即 根據(jù)TK1序列和載體的多克隆位點設計引物(引物1和引物2)，引物TKl中含有EcoR頂每切點 ;引物TK2含有Xho頂每切點。通過一系列逆轉(zhuǎn)錄后，充分混合均勻其反應液，并置于PCR儀上 進行擴增。然后，即可進行TA克隆，并用TA克隆試劑進行連接和連接反應液轉(zhuǎn)化大腸桿菌 JM109，并用氯化鈣處理JM109，取其加入到連接液中再處理后，離心留取液體，混勻沉淀，將 菌液涂于含有X-gal和IPTG的LB培養(yǎng)皿上培養(yǎng)過夜，挑取白色菌落再接種于LB平皿上培養(yǎng)過 夜，用質(zhì)粒提取試劑盒進行質(zhì)粒DNA提取。然后，再對hTKl重組TA克隆的酶切鑒定和DNA序列 分析，再將hTKl PET28a+重組質(zhì)粒在E.Coli B L21 DE3中表達hTKl融合蛋白，最后，應 hTKl PcDNA3重組質(zhì)?；蛎庖咝∈蠹癶TKl基因蛋白表達和純化最后，再用純化抗原免疫 動物制備hTKl單克隆抗體，即取Balb/c小鼠，在小鼠股四頭肌處注入IOO y l質(zhì)?；旌弦喝?后再免疫。以后，取免疫鼠脾細胞與骨髓瘤細胞融合形成雜交瘤細胞，最后，再用此雜交瘤細
胞注入Balb/C小鼠腹腔制備含TKl單克隆抗體的小鼠腹水，并從中獲得純化的HTK1單克隆抗體 。由于提取TK1的過程比較復雜，在提取的過程中將影響TK1的分子構(gòu)型，由此可能導致TK1 的某些抗原決定簇消失，這將影響抗TK1天然構(gòu)型抗體的產(chǎn)生，特別是影響高親和力和高特 異性抗體的出現(xiàn)；為此本項研究采用了基因免疫的方法制備TK1單克隆抗體。本發(fā)明采用可 以分泌的載體(由于TK1沒有信號肽)與TK1基因重組，然后用重組的載體進行基因免疫制備 TK1單克隆抗體。基因免疫已在(除TK1以外)許多蛋白制備抗體獲得成功；但是選擇的載體 有很多差別，對于有信號肽的蛋白質(zhì)可以選擇普通的真核表達載體即可以免疫出抗體；但無 信號肽結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)必須用分泌型載體；許多文獻報道已證明了這一點，并且證明了基因免 疫制備抗體具有很多優(yōu)點，首先蛋白質(zhì)抗原是通過載體攜帶的基因在動物體內(nèi)表達，其表達 的蛋白質(zhì)是天然構(gòu)型的蛋白質(zhì)分子，因此免疫原的天然抗原決定簇沒有丟失，同時也不需要 純化抗原需要的煩瑣步驟和高額的費用，通過基因免疫制備抗體已有很多成功的例子，如凝 血酶調(diào)節(jié)蛋白，丙型肝炎病毒，HBV，人溶菌酶，肝特異新基因FF456，人CD34抗原胞外區(qū)，人 BLyS，人CD154等，并且有些報道是用基因免疫誘導抗體，觀察基因免疫對感染因子的保護作 用。因此基因免疫制備單克隆抗體是一個非常實用的技術(shù)，特別是抗原來源困難的情況下， 以及結(jié)構(gòu)復雜和有糖基化的分子。目前的分子生物學技術(shù)非常成熟，載體系統(tǒng)也非常方便， 所以未來制備抗體可能均用基因免疫的方法。本項發(fā)明是將TK1基因重組入分泌型表達載體 pSecTag2/Hygro B，通過重組質(zhì)粒在動物肌肉細胞內(nèi)表達人TK1蛋白質(zhì)抗原刺激動物產(chǎn)生抗體 。通過基因免疫的方法制備出高親和力的多個TK1的單克隆抗體。
目前關(guān)于TK1單克隆抗體制備文獻不多，但在有限的文獻中所顯示的制備方法均是采用 傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)抗原進行免疫，而這些抗原又大多來源于生物化學方法所提取的組織抗原，或 者采用原核細胞所表達的TK1蛋白進行免疫小鼠(包括我們的前期工作)。采用生物化學方法 所提取的組織TK1抗原，不僅操作繁瑣，周期長，難度大，純化極其復雜，需要消耗大量制備試劑 及人力物力和財力，而且即使能大量組織提取得到TK1，其得率也微乎其微，很難滿足單克隆抗 體制備和實際應用的需要;采用原核細胞表達TK1蛋白制備其單克隆抗體雖然較從大量組織提 取得到TK1有明顯進步和優(yōu)點，但同樣存在TK1抗原純化難度較大，操作繁瑣，技術(shù)復雜等問題 ;特別是由于目前國際上尚未見到TK1商品試劑，或標準抗原，因此各自報道的TK1單克隆抗 體制備方法及標準均無法統(tǒng)一，而且，TK1的特異性抗原決定簇在哪一段肽段上目前還是一個 未知數(shù)。因此，無論何種方法所純化的TK1 (真核或原核來源)或多或少丟失某些有價值的抗 原決定簇，特別是TK1在生理條件下是多聚體，所以目前關(guān)于TK1單克隆抗體的研究還有待于 進一步深入，這是目前制備hTKl單克隆抗體方法的一些不足、缺陷及存在的問題，而只有克
服這些，才有可能統(tǒng)一TK1抗體的標準和制備出非常適用的TK1單克隆抗體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對背景技術(shù)中存在的缺點和問題加以改進、創(chuàng)新，特別是通過對胸苷 激酶基因克隆和真核分泌型載體重組技術(shù)，提供一種基因免疫制備人類I型胸苷激酶單克隆 抗體的新方法。
本發(fā)明的方法如下
將氨基喋呤處理的Hela細胞RNA作為原始模板，其中RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄PCR獲得TK1 cDNA，其 中TK1基因序列是用TK1 TA克隆雙向測序獲得。
本發(fā)明所述的TKl基因是通過HindIII和XhoI雙酶切獲得。所述的TK1基因通過定向連接 入真核分泌型載體比pSecTag2/Hygro B。所述的定向連接位點是HindIII和XhoI之間。所述 的重組質(zhì)粒作為基因免疫制備TK1抗體的基因。所述的基因免疫是將權(quán)力5的重組質(zhì)粒DNA注 入小鼠股四頭肌。所述的注入的重組質(zhì)粒在小鼠肌細胞中產(chǎn)生TK1蛋白。所述的TK1蛋白是可 以分泌到細胞外，并作為免疫原。所述的免疫原是TK1蛋白分子的天然結(jié)構(gòu)。所述的TK1基因 免疫的小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞融合制成雜交瘤。所述的雜交瘤用重組原核表達的TK1篩選 。所述的產(chǎn)生TK1抗體的雜交瘤細胞于小鼠腹腔內(nèi)大量制備抗體。所述的單克隆抗體用蛋白 G柱純化。所述的純化的單克隆抗體可以標記辣根過氧化物酶或熒光素。所述的抗體應用于 檢測體液中的TK1。
本發(fā)明首先用Trizol試劑(一種從動物細胞和組織、細菌、真菌等提取總RNA的試劑盒) 從500萬個Hela細胞(海拉細胞是一種人宮頸癌傳代細胞)提取經(jīng)氨基喋呤處理48小時的細胞 總核糖核酸(RNA)，純化后用焦碳酸二乙酯(DEPC)處理水溶解沉淀所得液體30 y 1 。該液體經(jīng) 過逆轉(zhuǎn)錄PCR(在體外由酶促反應合成特異DNA片段的一種方法)可擴增出hTKl cDNA (cDNA是 指以mRNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下形成的互補DNA);在TA克隆(即利用T叫聚合酶在每條 PC財廣增產(chǎn)物的3'端自動添加一個3' -A突出端)后即可進行DNA序列分析，以鑒定經(jīng)過PC財廣 增后所形成的hTKl基因序列是否正確；然后，通過亞克隆接入pSecTag2/Hygro B載體(真核分 泌型載體pSecTag2/Hygro B)的HindIII (酶切位點)和XhoI (酶切位點)位點之間 (pSecTag/TKl)，插入片段表達的蛋白質(zhì)可以從真核細胞中分泌到胞外。直接用pSecTag/TKl 重組質(zhì)粒脫氧核糖核酸(DNA)免疫小鼠；再用骨髓瘤細胞和脾細胞融合制備雜交瘤；從制備出 的多株雜交瘤細胞株中進行篩選、配對，最后篩選出兩株親和力較高、結(jié)合位點不同、且能 產(chǎn)生抗TK1單克隆抗體的雜交瘤細胞株;將所篩選出的這兩株親和力較高、結(jié)合位點不同、且 能產(chǎn)生抗hTKl單克隆抗體的兩個雜交瘤細胞株，分別按照數(shù)量為5X1()5個雜交瘤細胞分別直
接注入兩組小鼠腹腔內(nèi)制備含有hTKl特異性單克隆抗體的腹水;待這些受試小鼠腹腔內(nèi)的腹 水達到一定程度后，即可分別用注射針頭抽出這兩株雜交瘤細胞所產(chǎn)生的親和力高和特異性 強的抗TK1單克隆抗體的小鼠腹水；將收集的這些小鼠腹水用冷凍高速離心機以大于 12000rpm/min以上的速度離心5-10分鐘，棄除沉淀，其上清液采用正辛酸一硫酸胺法分別進行 提取，并用蛋白G柱親和層析純化，可得到經(jīng)過純化的兩種結(jié)合位點不同的TK1單克隆抗體;純 化后的這兩種hTKl單克隆抗體分別用蛋白定量試劑(BCA)定量抗體，最后，經(jīng)過十二烷基磺酸 鈉(SDS) -PAGE (聚丙烯酰胺)凝膠電泳法檢測其抗體純度；同時，進行抗體的IgG類型，亞類鑒定 ，以及抗體的結(jié)合位點和親和力測定等;之后，置于低溫冰箱中保存，即可備為后續(xù)應用。
本發(fā)明的原理從HeLa細胞獲得TKl基因序列，經(jīng)DNA序列分析確定TK1 cDNA的正確編碼 序列；用限制性內(nèi)切酶同時酶切TK1基因片段和載體(真核分泌型表達載體pSecTag2/Hygro B)，用連接酶定向克隆入載體；構(gòu)建成TKl的分泌型表達載體(pSecTag/TKl)，重組載體轉(zhuǎn)入細 胞內(nèi)獲得表達，并且重組的TK1蛋白質(zhì)分泌到細胞外；分泌的TK1作為抗原刺激小鼠產(chǎn)生抗體； 通過細胞融合技術(shù)將產(chǎn)生抗體鼠的脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合，經(jīng)HAT選擇培養(yǎng)克隆出雜交 瘤細胞；再經(jīng)克隆化選擇培養(yǎng)和篩選出產(chǎn)生TK1抗體的陽性雜交瘤細胞；克隆化徹底的陽性 雜交瘤經(jīng)擴大培養(yǎng)后凍存和小鼠腹腔注射;用蛋白G試劑從小鼠腹水中純化TK1的單克隆抗體 ;然后鑒定和分裝保存。
本發(fā)明的主要技術(shù)構(gòu)思:本發(fā)明技術(shù)構(gòu)思主要分為三個部分:第一部分:采用基因工程技 術(shù)及分子生物學和分子免疫學技術(shù)，克隆hTKl的cDNA、并進行其核苷酸序列分析;第二部分 利用真核分泌型載體重組和構(gòu)建hTKl基因；第三部分:采用基因免疫的方法制備高特異性和高 親和力的hTKl單克隆抗體。
TK1是一個細胞內(nèi)的激酶，分子結(jié)構(gòu)上沒有信號肽，天然生理條件下是一個四聚體的蛋 白質(zhì)，因此其結(jié)構(gòu)非常復雜。用純化的抗原免疫動物能夠制備出抗體，但是由于免疫原的分 子結(jié)構(gòu)復雜，目前所有報道的TK1抗原和抗體還無統(tǒng)一標準。能夠用于診斷和治療的最佳抗 原靶點不清楚。所以，本項發(fā)明是用真核分泌型載體攜帶TK1基因完整開放讀碼框架進行 TK1單克隆抗體的制備。本發(fā)明重組TK1的真核表達載體直接注入到受試小鼠的肌肉組織之中 ，使這些受試小鼠的肌肉細胞直接產(chǎn)生人TK1蛋白及TK1抗原，然后促使這些TK1蛋白及TK1抗 原直接分泌到細胞外，并由此誘導這些小鼠產(chǎn)生TK1抗體。由此可見，在理論上分泌的TK1是 完整的天然結(jié)構(gòu)，其誘導產(chǎn)生的抗體對應于TK1的生理結(jié)構(gòu)，所以基因免疫制備的單克隆抗 體具有識別天然結(jié)構(gòu)的TK1，更適用診斷和治療，以及TK1系統(tǒng)的標準化和統(tǒng)一標準。而且， 按照本發(fā)明所制備的TK1單克隆抗體具有制備更加簡便，操作更加方便，產(chǎn)量得率更大，周期更
短等特點，而且，目前國際上尚未見到通過對人I型胸苷激酶基因的克隆和真核分泌型載體的 重組構(gòu)建實施基因免疫制備人I型胸苷激酶單克隆抗體的方法。 本發(fā)明所能達到的有益效果
① 本發(fā)明制備的TK1單克隆抗體，應該具有更高的親和力及更高的特異性，
而這些卻是建立相應檢測技術(shù)和測定方法的重要基礎。
② 本發(fā)明制備的TK1單克隆抗體具有與人體TK1抗原更為接近的免疫學反應，因此，更適 用于研制臨床相關(guān)腫瘤標志物診斷的試劑盒。
③ 本發(fā)明制備的TK1單克隆抗體為重組TK1的真核表達載體直接注入到受試小鼠的肌肉組 織之中，使這些受試小鼠的肌肉細胞直接產(chǎn)生人TK1蛋白及TK1抗原，然后促使這些TK1蛋白 及TK1抗原直接分泌到細胞外，并由此誘導這些小鼠產(chǎn)生TK1抗體，其分泌的TK1是完整的天 然結(jié)構(gòu)，其誘導產(chǎn)生的抗體對應于TK1的生理結(jié)構(gòu)，因此，基因免疫制備的單克隆抗體具有 天然免疫的特點和識別天然結(jié)構(gòu)的TK1，因此，有可能用于臨床相關(guān)疾病治療的新耙點。
④ 以及TK1系統(tǒng)的標準化和統(tǒng)一標準?；蛎庖弋a(chǎn)生的天然抗體，因此，更容易統(tǒng)一和 規(guī)范TK1分子和抗體的標準化，為該學科的發(fā)展和技術(shù)進步提供最為科學和規(guī)范的技術(shù)方法
⑤ 本發(fā)明制備的TK1單克隆抗體是由真核表達的質(zhì)粒直接免疫動物獲得，即通過其真核 分泌型載體攜帶TK1基因完整開放讀碼框架進行TK1單克隆抗體的制備，因此，使TK1分子真 正作為診斷腫瘤性疾病的指示分子。
⑥ 本發(fā)明制備的TK1單克隆抗體在制備方法上更有創(chuàng)新性和先進性，而且，在TK1單克隆 抗體技術(shù)上實施更加簡單，操作更加容易，周期更加縮短，制備更易產(chǎn)業(yè)化和標準化。
本發(fā)明的主要技術(shù)特點是將人TKl基因重組入分泌型表達載體pSecTag2/Hygro B，用基 因免疫的方法免疫小鼠，成功制備可產(chǎn)生人TK1單克隆抗體的雜交瘤，此單克隆抗體可特異性 識別人TK1分子。
本發(fā)明的主要技術(shù)優(yōu)點本發(fā)明采用的分泌型載體作為基因免疫的載體，其可以攜帶任 何基因片段用于基因免疫，不需要純化蛋白的煩瑣步驟，特別是對于沒有信號肽結(jié)構(gòu)的蛋白 質(zhì)更為適用，并且誘導抗體產(chǎn)生的抗原是在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的天然結(jié)構(gòu)蛋白，其免疫產(chǎn)生的單 克隆抗體更易與天然生理條件下的TK1結(jié)合。
本發(fā)明的主要創(chuàng)新點本發(fā)明首次用分泌型載體基因免疫的方法制備出產(chǎn)人TK1單克隆 抗體的雜交瘤；免疫原是在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的人TK1分子，因此免疫原更接近于TK1的天然生理 條件下的結(jié)構(gòu)，成功制備出的抗體特異性識別TK1分子；得到雜交瘤細胞，使TK1的單克隆抗
體能夠用雜交瘤大量生產(chǎn)。
具體實施例方式
實驗材料Taq DNA聚合酶，dNTP， Oliga-dT，連接酶，(大連TAKARA公司)；逆轉(zhuǎn)錄 酶(Roche公司)；Trizol試劑，頂DM培養(yǎng)基(Invitrogen);小牛血清(杭州天津血研所 );Balb/c小鼠(吉林大學白求恩醫(yī)學部動物室)；質(zhì)粒DNA提取試劑盒和凝膠DNA回收試劑 盒(杭州Axygen公司)；蛋白胨和酵母粉(0X0ID);瓊脂糖(西班牙)；丙烯酰胺，甲叉 雙丙烯酰胺，過硫酸銨，TEMED (FLUKA) ; BCA蛋白定量試劑(Pierce公司)；HRP標記羊抗兔 IgG和堿性磷酸酶標記的羊抗鼠IgG (R and D SYSTEM)，人TK1原核表達蛋白(從表達人 TK1的大腸桿菌中提取)，人TKl抗體IgY (深圳華瑞同康生物技術(shù)有限公司)；蛋白G純化膠
(BD公司);NBT禾口BCIP (Roche) ; Tris，蛋白酶K， RNA酶，氨基喋呤，0PD (Sigma); HAT和HT培養(yǎng)基(GIBC0);硫酸，磷酸鹽等(北京化工廠)。
所需要用的全部儀器和設備PCR儀(Hybaid);低溫離心機(德國賀力氏，Stratols )，二氧化碳培養(yǎng)箱(德國賀力氏，BB5060);加樣器(法國Gilson， P20-P1000);倒置 顯微鏡(上海，H0508);生物安全柜(北京哈爾東聯(lián)儀器制造有限公司，B2);酶標儀( Lybsystems dragon MK3);電泳設備(水平和垂直，上海天能)，凝膠成像系統(tǒng)(上海天 能GIS1000);核酸和蛋白檢測儀(HITACHI, Genespec I);純水機(德國SG) ; pH儀( Mettler320);天平(Satorius， BS110S);深低溫冰箱(FORMA，)；液氮罐(成都液氮 容器廠，YDS-30-125)，超聲細胞粉碎機(寧波新芝JY92-I1);普通離心機(北京醫(yī)用離 心機廠，LD5-2A)。
實施例
①hTKl基因進行克隆及序列分析
l)逆轉(zhuǎn)錄PC財廣增TKl cDNA:用可從動物細胞和組織、細菌、真菌等提取總提取總核糖 核酸(RNA)的Trizol試劑試劑盒從500萬個Hela細胞中提取RNA，經(jīng)氨甲喋呤處理48小時，并經(jīng) 純化后再用一種高效烷化劑-焦碳酸二乙酯(DEPC)處理水溶解沉淀得30 y 1 。由于DEPC可破壞 核糖核酸酶(RNase)活性，因此可去除RNase的污染。
在進行逆轉(zhuǎn)錄時，加入5倍緩沖液4y 1、引物01igo-dT(0. 5 y g/1 y 1) lyl、 10mMol/L濃度的脫氧核苷三磷酸(dNTP) :2y 1、 RNA:10yl、去離子水水2yl， 充分混勻，并置于7(TC恒溫水浴10分鐘；然后，再置于冰上2分鐘；加入lul逆轉(zhuǎn)錄酶 (50U， Roche)，混勻，再置于42。C水浴90分鐘，其逆轉(zhuǎn)錄體積共20yl。根據(jù)人TK1基因序列 設計一對引物
引物1 5-AGCTAAGCTTAGCTGCATTAACCTGCCCAC-3 引物2.5-TACTCTCGAGGTTGGCAGGGCTGCATTGCAGAATC-3 引物l引入Hindin酶切序列；引物2引入Xho頂每切序列 再進行PC財廣增，即加入10倍緩沖液5y 1， dNTP(2. 5mMol/L) :4y 1， 引物l:lul (200ng)，弓l物2:lyl (200ng) ， cDNA:5 y 1， Taq酶1 y 1 (2. 5U)，去離子 水33 y 1; PC財廣增液體積共50 y 1 ?；靹颍肞CR儀上擴增94。C60秒，55。C60秒，72°C 120秒， 共進行30個循環(huán)，最后補加72。C5分鐘。然后，取10y 1 PCR產(chǎn)物于2。/。瓊脂糖凝膠上電泳，切下 700bp位置的DNA條帶，用凝膠回收試劑盒回收DNA片段用于TA克隆。
2)TA克隆和DNA序列分析純化的PCR產(chǎn)物與pMD-18T載體重化大腸桿菌組，轉(zhuǎn)JM109，涂布 于含有氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上，37"C培養(yǎng)過夜，次日挑取10個白色的單菌落擴大培養(yǎng)， 用質(zhì)粒提取試劑盒純化質(zhì)粒，雙酶切(HindIII和XhoI)鑒定插入片段，在所選的10個克隆中均 有插入片段，片段大小約為700bp。 TK1重組TA克隆(TA9)用T7和SP6引物雙向測序，結(jié)果與 GenBank的TK1序列比較證明本次克隆的cDNA是人TKl基因，全長702個堿基。
② TK基因亞克隆入真核分泌型表達載體
采用真核分泌型表達載體pSecTag2/Hygro B (簡稱pSecTag2)，其可以將重組基因表達 的蛋白分泌到細胞外，由于TK1沒有信號肽，所以選擇分泌型載體是一最佳的方法。
用HindlII和XhoI分別酶切TKl/TA克隆質(zhì)粒和pSecTag2質(zhì)粒，用凝膠電泳和膠回收試劑 分別純化TKl和pSecTag2的DNA片段，然后進行連接反應。連接反應體積共15 y 1 ，即10倍的連 接緩沖液1.5yl， TK1 DNA片段8. 0 y 1， PSecTag2 DNA:4.5yl，T4 DNA連接酶1.0yl?；靹?，置4"C冰箱過夜；加入300 y 1感受態(tài)的大腸桿菌JM109，置冰浴中l(wèi)小時，42"C水浴90秒，再于 冰水浴中5分鐘;加LB培養(yǎng)基lml，混勻，置37'C培養(yǎng)1小時，離心收集沉淀，將沉淀的菌體涂于含 氨芐青霉素(50yg/ml)的LB瓊脂培養(yǎng)基上，于37'C過夜培養(yǎng)。挑取10個菌落擴大培養(yǎng)，用試 劑盒小提質(zhì)粒DNA，再用內(nèi)切酶和電泳鑒定重組質(zhì)粒，所挑選的10個質(zhì)粒均含有TK1基因，電 泳顯示可以切下大約700bp的DNA片段，同時在TKl片段中有一個Sf頂每切位點。TK1重組質(zhì)粒 命名為pSecTag/TKl。
③ PSecTag/TKl DNA的大量制備
PSecTag/TKl重組菌于37。C活化培養(yǎng)過夜，然后接種于50ml的LB培養(yǎng)基中(含氨芐青霉素 50y g/ml)， 37r振蕩培養(yǎng)5小時，再轉(zhuǎn)入500mL培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)5小時，離心回收菌體；按試劑 盒程序提取質(zhì)粒DNA;在最后洗脫時選用無菌蒸餾水。純化的質(zhì)粒DNA用紫外分光光度計檢測 純度和定量.500ml培養(yǎng)的菌體可以提取400y g質(zhì)粒DNA，冰箱中凍存?zhèn)溆谩?br> ④基因免疫制備TK1單克隆抗體
1) TKl基因免疫Balb/c小鼠免疫過程取4周齡Balb/c純系
雌性小鼠3只(其中一只不免疫作為對照)，每只鼠兩側(cè)股四頭肌分別注入50 y g pSecTag/TKl DNA (每側(cè)50 y 1);對照鼠注入等量的生理鹽水；每15天免疫一次，總共免疫5 次，第二次免疫后10天開始檢測血清中抗體；于末次免疫后一周進行細胞融合。
2) TK1基因免疫小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合:A:飼養(yǎng)細胞制備:Balb/C小鼠拉頸處 死，取其胸腺，置于10ml培養(yǎng)液中，在鋼網(wǎng)上研磨分散細胞，棄大塊組織，將細胞調(diào)成
5. 0X106/ml， 96孔培養(yǎng)板每孔100ul。 B:骨髓瘤細胞準備小鼠骨髓瘤細胞為NS1細胞株，融合 前細胞生長良好，細胞濃度為5Xl(^/ml。 C:細胞融合:2X1(/個骨髓瘤細胞與2X10S個細胞混勻 ，離心，棄上清，輕微振蕩混勻，于37。C水浴中，在90秒內(nèi)滴加lml 50。/。的PEG，然后滴加20ml無血 清培養(yǎng)基，離心，棄上清，再洗一次，加入15。/。血清的培養(yǎng)基20ml (含HAT)，混勻，每孔加入IOO y 1(原有100y l的飼養(yǎng)細胞)，同時設有單獨脾細胞和單獨骨髓瘤對照孔(12 L/每個)。4天后換 液；吸出100y 1，加入100y 1含15。/。血清HAT培養(yǎng)基；第三次換液時為HT培養(yǎng)基；每日觀察細
胞生長狀態(tài)，io天左右出現(xiàn)克隆。
3) 雜交瘤培養(yǎng)上清TK1抗體的檢測用直接ELISA檢測雜交瘤培養(yǎng)上清中的抗體，用TK1抗 原包被ELISA板，加入培養(yǎng)上清，沖洗后加辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG，孵浴和沖洗后，加 顯色底物OPD，然后測492nm的光密度，以高于陰性對照光密度2倍以上為陽性克隆。結(jié)果在融 合后兩周的培養(yǎng)上清中有28孔顯示TK1抗體陽性。選擇效價高的幾個孔進行克隆化。
4) 克隆化和擴大培養(yǎng)多克隆培養(yǎng)孔內(nèi)的細胞采用有限稀釋法進行克隆化，用含有HAT的 培養(yǎng)基制備小鼠胸腺細胞作為飼養(yǎng)細胞，多克隆孔內(nèi)的細胞進行稀釋至每孔含有IOO， IO和O個 細胞(100ul)，培養(yǎng)觀察，對只有一個克隆雜交瘤的培養(yǎng)上清進行檢測。選擇陽性克隆轉(zhuǎn)入 24孔培養(yǎng)板中進行擴大培養(yǎng)，每孔lml，培養(yǎng)5天后，加入4ml培養(yǎng)液，混勻，分入4個培養(yǎng)孔中，繼 續(xù)培養(yǎng)5天，然后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中進行擴大培養(yǎng)，選擇抗體陽性，且效價穩(wěn)定的克隆進行進一步 擴大和凍存。結(jié)果得到兩株結(jié)合位點不同、且穩(wěn)定分泌TK1抗體的雜交瘤。
5) TKl單克隆抗體大量制備和純化:Balb/C小鼠腹腔注入0. 5ml液體石蠟， 一周后每只小 鼠腹腔注入5X1()5個雜交瘤細胞，然后當有明顯腹水形成時，針頭穿刺放腹水。收集的腹水 12000rpm/min離心5分鐘，棄除沉淀，其上清液采用正辛酸一硫酸胺法分別進行提取，并用蛋 白G柱親和層析純化，可得到經(jīng)過純化的兩種結(jié)合位點不同的TK1單克隆抗體;將純化后的TK1 單克隆抗體用蛋白定量試劑(BCA)定量抗體，分裝保存。
6) TK1單克隆抗體的鑒定單克隆抗體特異性的鑒定:A:直接ELISA:TK1包被固相，加TK1腹
水，再抗體和酶標抗體。B:雙抗體夾心ELISA:用腹水包被固相(1:200);加入不同濃度的 TK1，然后加堿性磷酸酶標記抗TKl的IgY，用堿性磷酸酶底物顯色，測570nm的光密度。C:免疫 組化:制備HeLa細胞涂片，分成兩組 一組為HeLa細胞；另一組為氨基喋呤誘導48小時的HeLa細 胞，EDTA消化培養(yǎng)的細胞，使其分散，用PBS洗一次，稀釋成5X105/1111，每個細胞涂點為30 y 1; 室溫干燥，丙酮固定5分鐘，然后用1%的雙氧水處理30分鐘；再用3。/。的BSA封閉30分鐘。然后 加抗體(l :400稀釋，培養(yǎng)上清用原液)，孵浴和沖洗，加酶標抗體，沖洗后加DAB底物顯色，光鏡 下觀察結(jié)果，同時用商品試劑盒對照進行。最后，經(jīng)過十二烷基磺酸鈉(SDS)-PAGE(聚丙烯酰 胺)凝膠電泳法檢測其抗體純度；同時，進行抗體的IgG類型、亞類鑒定、以及抗體的結(jié)合位 點和親和力測定等。之后，置于低溫冰箱中保存，即可備為后續(xù)應用。
(4)本發(fā)明操作的注意事項本發(fā)明制備的產(chǎn)生TK1抗體的雜交瘤細胞常規(guī)保存于液氮中 ，定期復蘇和鑒定。雜交在小鼠體內(nèi)誘導產(chǎn)生的腹水，以及后續(xù)純化的抗體等均應保存于低 溫，并且在應用時稀釋中應含有O. 1%的牛血清白蛋白；長期保存腹水，或純化的抗體應存于深 低溫(攝氏零下70度)；每一個批次制備的抗體或腹水小樣分裝保存，避免反復凍融。
本發(fā)明所述的實施例僅僅是對本發(fā)明的優(yōu)選實施方式進行的描述，并非對本發(fā)明構(gòu)思和 范圍進行限定，在不脫離本發(fā)明設計思想的前題下，本領域的學者和研究人員對本發(fā)明的技 術(shù)方案作出的各種變型和改進，均應落入本發(fā)明的保護范圍，本發(fā)明請求保護的技術(shù)內(nèi)容， 已經(jīng)全部記載在權(quán)利要求書中。
權(quán)利要求
1.一種基因免疫制備人類I型胸苷激酶單克隆抗體的新方法，其特征在于將氨基喋呤處理的Hela細胞RNA作為原始模板，其中RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄PCR獲得TK1 cDNA，其中TK1基因序列是用TK1 TA克隆雙向測序獲得。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基因免疫制備人類Ⅰ型胸苷激酶單克隆抗體的新方法。其具體方法是首先，從經(jīng)過氨基喋呤處理的Hela細胞中提取RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄PCR擴增出TK1 cDNA，TA克隆后進行DNA序列分析，確定正確的TK1基因序列，然后亞克隆入pSecTag2/Hygro B載體的HindIII和XhoI位點之間(pSecTag/TK1)，插入片段表達的蛋白質(zhì)可以從真核細胞中分泌到胞外。直接用pSecTag/TK1重組質(zhì)粒DNA免疫小鼠，用骨髓瘤細胞和脾細胞融合制備雜交瘤，篩選出產(chǎn)抗TK1的單克隆抗體的雜交瘤；通過小鼠腹水大量制備TK1的單克隆抗體。最后，將收集的小鼠腹水高速冷凍離心，其上清液用正辛酸一硫酸胺法分別進行提取，并用蛋白G柱親和層析法純化，即可得到可用于檢測臨床樣品中TK1標志物的TK1單克隆抗體。
文檔編號C12N15/54GK101186922SQ200710203299
公開日2008年5月28日 申請日期2007年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月21日
發(fā)明者宇 丁, 丁克祥, 劉衛(wèi)國, 費定宇, 鄭永晨 申請人:丁克祥