專利名稱：生產(chǎn)紫穗槐-4,11-二烯和青蒿酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)紫穗槐-4,ll-二烯的方法，具體涉及一種通過代謝工程技術(shù) 生產(chǎn)紫穗槐-4,ll-二烯的方法，以及進(jìn)一步生產(chǎn)青蒿酸的方法。
背景技術(shù)：
青蒿素(artemisinin)是中國科學(xué)家自主開發(fā)的創(chuàng)新抗瘧藥，是中國唯一被世界衛(wèi) 生組織(WHO)認(rèn)可的按西藥研究標(biāo)準(zhǔn)研究開發(fā)的中藥，是中國僅有的兩個收入世界藥 典的中藥之一 (另一為麻黃素)。近來還發(fā)現(xiàn)青蒿素具有抗癌、抗孕、抗血吸蟲、抗 弓形蟲和抗卡氏肺孢子蟲肺炎等作用。不斷擴(kuò)展的適應(yīng)證意味著需要一個穩(wěn)定而充足 的青蒿素供應(yīng)。
現(xiàn)在青蒿素的來源主要有如下四種方式。
第一種方式是直接從青蒿中提取，這種方式如今仍然是青蒿素的主要來源，但天 然青蒿中青蒿素含量很低(0.01% 0.6%，少數(shù)能達(dá)到1%)。此外，不同基因型青蒿 以及青蒿不同組織之間的青蒿素含量差異很大，青蒿雖為雌雄同株，但存在自交不親 和性，因此這種遺傳不穩(wěn)定性是常規(guī)栽培中很難克服的難題。人工栽培青蒿還存在受 季節(jié)和氣候條件限制等問題。所以，通過栽培擴(kuò)大青蒿素的提取量，這種方式不能滿 足人們對青蒿素日益高漲的需求。
第二種方式是通過化學(xué)全合成來生產(chǎn)青蒿素，但這種方式成本高，難度大，目前 還不能投入生產(chǎn)，基本上處于試驗階段。
第三種方式是通過細(xì)胞或愈傷組織來生產(chǎn)青蒿素。中國科學(xué)院植物研究所葉和春 領(lǐng)導(dǎo)的研究組曾通過培養(yǎng)青蒿發(fā)狀根獲取青蒿素，其青蒿素的含量可達(dá)550mg/L(Liu CZ, Wang YC, Ouyang F , Ye HC W Production of artemisinin by hairy root cultures of Artemisia annua L .Biotechnology Letters, 1997， 19(9) : 927-929)，但要進(jìn)行商業(yè)化生 產(chǎn)還需要做很多工作。
第四種方式是通過代謝工程來生產(chǎn)青蒿素，這種方法主要是將青蒿素生物合成基 因在微生物中組合表達(dá)，在微生物中重新組建青蒿素生物合成途徑，利用"微生物工 廠"來生產(chǎn)青蒿素。目前多在微生物中重新構(gòu)建青蒿酸(artemisinic acid)生物合成途徑， 利用重組菌生產(chǎn)青蒿酸，再以此為起始原料化學(xué)半合成青蒿素。
青蒿素的生物合成途徑主要包括三大步驟由乙酰輔酶A形成法尼基焦磷酸 (farnesyl pyrophosphate,FPP)，再由FPP合成紫穗槐-4，ll-二烯(amorpha-4,ll-diene)， 由紫穗槐-4,ll-二烯形成青蒿酸，進(jìn)而形成青蒿素。目前基本上認(rèn)可的青蒿素生物合 成途徑如下FPP在紫穗槐-4，ll-二烯合酶(amorpha-4，ll-diene synthase, ADS)的催化 下合成紫穗槐-4,ll-二烯；紫穗槐-4,ll-二烯通過羥基化形成青蒿醇(artemisinic alcohol),進(jìn)而被氧化形成青蒿醛(artemisinic aldehyde);緊接著，青蒿醛Cn-Cu位
被還原形成二氫青蒿醛，后者再氧化形成二氫青蒿酸。其中紫穗槐-4，ll-二烯氧化形 成青蒿醇、進(jìn)而形成青蒿酸的反應(yīng)由紫穗槐-4,ll-二烯P450羥基化酶(CYP71AV1) (Teoh KH, Polichuk DR, Reed DW， / ， Artemisia annua L. (Asteraceae) trichome-specific cDNAs reveal CYP71AV1, a cytochrome P450 with a key role in the biosynthesis of the antimalarial sesquiterpene lactone artemisinin FE1551 Ze".2006， 580(5):1411-1416)催化。
申請日為1999年8月27日、授權(quán)給吉諾克里普生物技術(shù)有限公司的中國專利 CN1253573C(專利號ZL 99811714.5)中公開了一種編碼紫穗槐-4,ll-二烯合酶的DNA 序列，并提到可以用該DNA序列轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞、組織或生物體，利用其表達(dá)的紫穗 槐-4,ll-二烯合酶催化形成紫穗槐-4,ll-二烯，分離所形成的紫穗槐-4，ll-二烯并將其 轉(zhuǎn)化為青蒿酸。但是在其實施例6中只是公開了在體外將大腸桿菌表達(dá)的紫穗槐-4，11-二烯合酶與a-環(huán)糊精、(3-環(huán)糊精、Y-環(huán)糊精一起溫育來產(chǎn)生青蒿酸的實驗步驟，并沒 有給出具體的實驗數(shù)據(jù)，更沒有數(shù)據(jù)顯示在大腸桿菌中實現(xiàn)了青蒿酸的生成。
申請日為2003年4月9日的Keasling， J等人的美國專利申請No.20040005678公開了 一種在宿主微生物中合成紫穗槐-4,ll-二烯的方法，其中使用合成的優(yōu)化紫穗槐-4，11-二烯合酶基因，并在說明書中給出了具體在大腸桿菌中進(jìn)行優(yōu)化的紫穗槐-4，ll-二烯 合酶基因的序列。
2003年，Martin V J等人(Martin V J， Pitera D J， Withers ST" a/, Engineering a mevalonate pathway in EscAer/c/z co// for production of terpenoids, iVaft#*e 2003, 21:796-803)報道了在大腸桿菌中合成甲羥戊酸的編碼基因以及紫穗槐-4,ll-二 烯合酶基因等9個基因，在大腸桿菌中重建甲羥戊酸途徑和紫穗槐-4,ll-二烯的合成途 徑，并獲得了青蒿素中間產(chǎn)物紫穗槐-4,ll-二烯。
2006年，Lindahl A L等人在釀酒酵母中導(dǎo)入含紫穗槐-4,11 -二烯合酶基因的質(zhì)粒， 或?qū)⒆纤牖?4,ll-二烯合酶基因同源整合到釀酒酵母的染色體上，這兩種方式分別能 獲得600和100嗎/1的紫穗槐-4，11-二烯(Lindahl Ann-Louise， Olsson M E., Mercke P， W a/, Production of the artemisinin precursor amorpha-4,ll-diene by engineered Sacc/wro附y(tǒng)ces cerev/w'ae， 5/otec/ wo/ogy丄e"ens， 2006， 28:571 — 580)。這是第一7火 在真核生物中組合表達(dá)出紫穗槐-4,11 -二烯。 ，
2006年，RoDK等人以釀酒酵母(Sacc/ aTO附y(tǒng)c^cwev/w'fle)為宿主，通過三個 步驟構(gòu)建產(chǎn)青蒿酸酵母工程菌首先，工程化改造FPP生物合成途徑以增加FPP的 合成并降低其用于甾醇合成的消耗；其次，導(dǎo)入來自青蒿的紫穗槐-4，ll-二烯合酶基 因(ADS)到上述FPP高產(chǎn)菌株，產(chǎn)生紫穗槐-4,ll-二烯；再其次，向紫穗槐-4，ll-二烯 產(chǎn)生菌中導(dǎo)入來自青蒿的紫穗槐-4,ll-二烯P450羥基化酶(CYP71AV1)基因，以及 該酶的天然氧化還原酶伴侶NADPH :細(xì)胞色素P450氧化還原酶(NADPH : cytochrome P450 oxidoreductase， C尸W)基因，CYP71AV1完成由ADS到青蒿酸的三步 催化反應(yīng)。通過工程化的上述生物合成途徑等，合成了青蒿酸(RoDK,ParadiseEM., Ouellet M ef a/， Production of the antimalarial drug precursor artemisinic acid in engineered yeast，胸,，2006, 440:940-943)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在Ro， DK等人構(gòu)建的酵母青蒿酸工程菌中，ADS基因和 CYP71AV1基因的表達(dá)采用的是GAL1誘導(dǎo)性啟動子，截短的HMG-CoA還原酶(即 羥甲基戊二單酰輔酶A還原酶)tHMGR和FPP合酶(FPPS)基因整合在同一種位 點(diǎn)即S序列上。這種情況下后整合的基因有可能取代已經(jīng)整合上的基因，導(dǎo)致后者拷 貝數(shù)降低。
為了解決上述問題，本發(fā)明人進(jìn)行了大量的研究，提供了通過代謝工程技術(shù)途徑 在釀酒酵母中合成紫穗槐-4,ll-二烯和青蒿酸的方法。
在本發(fā)明的一個方面中，提供了一種在釀酒酵母細(xì)胞中生產(chǎn)紫穗槐-4,ll-二烯的 方法，包括下列步驟
i) 將HMG-CoA還原酶基因?qū)脶劸平湍讣?xì)胞中的第一位點(diǎn)；
ii) 將FPP合酶基因和紫穗槐-4，ll-二烯合酶基因一起導(dǎo)入釀酒酵母細(xì)胞中的第二 位點(diǎn)，即得紫穗槐-4，ll-二烯酵母工程菌；
iii) 培養(yǎng)步驟(ii)中的紫穗槐-4,ll-二烯酵母工程菌，并純化紫穗槐-4，ll-二烯； 其中所述第一位點(diǎn)和第二位點(diǎn)選自S序列、入DNA序列和HO位點(diǎn)，且彼此不同。
在上述方法中，為了增加外源基因的整合拷貝數(shù)，選擇酵母S序列和入DNA， S序列在酵母中存在大約425個拷貝，而ADNA在酵母中有大約200個拷貝，將基 因整合到這兩個位點(diǎn)，能顯著地增加外源基因的拷貝數(shù)。此外，酵母HO位點(diǎn)也是常 用的酵母整合位點(diǎn)，試驗表明，在HO位點(diǎn)整合外源基因?qū)湍傅纳L不會有影響。 將多個外源基因依次整合到同一位點(diǎn)(如5序列或入DNA),會導(dǎo)致原先整合的基因 拷貝數(shù)降低，而且外源基因前后排列在同一位點(diǎn)也容易出現(xiàn)剪切重組，導(dǎo)致整個外源 片段從染色體上剪切掉。因此，在同一酵母染色體上將不同的外源基因整合到不同的 位點(diǎn)有助于克服這些缺陷。本發(fā)明將青蒿酸生物合成途徑的不同酶基因分別整合在S 序列、XDNA和HO位點(diǎn)上，這樣減少了基因之間互相替換的風(fēng)險。
在上述方法中，上調(diào)負(fù)責(zé)FPP合成的基因的表達(dá)是為了顯著增加FPP的產(chǎn)量。 在釀酒酵母FPP的合成中，HMG-CoA還原酶是一個限速酶，過表達(dá)HMG-CoA基因 能顯著增加FPP的產(chǎn)量，而增加FPP合酶的拷貝數(shù)也能促進(jìn)紫穗槐-4,ll-二烯的產(chǎn)量。
在一個優(yōu)選的實施方案中，所述的第一位點(diǎn)是HO位點(diǎn)，第二序列是入DNA序列。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述的HMG-CoA還原酶基因、FPP合酶基因和紫 穗槐-4,ll-二烯合酶基因分別與強(qiáng)啟動子可操作的連接，所述啟動子優(yōu)選為ADH或 GAPDH啟動子。
在本發(fā)明的再一優(yōu)選實施方案中，所述的FPP合酶基因和紫穗槐-4，ll-二烯合酶 基因之間插入有一段連接序列，優(yōu)選是編碼Gly-Ser-Gly的GGATCCGGA。
另外，為了提高CYP71AV1和P450還原酶CPR的電子耦合能力，在這兩個酶 之間也加入了一段連接序列。該序列優(yōu)選是編碼Pro-Arg-Ala的CCTAGGGCT。
在又一優(yōu)選實施方案中，所述的紫穗槐-4,ll-二烯合酶基因含有SEQ ID NO: 1
所示的核苷酸序列。該序列是通過利用 Condon Usage Database (http:〃www.kazusa.or.jp/codon/)等，將青蒿紫穗槐-4，ll-二烯基因(GenBank注冊號 AF138959)的一些密碼子替換為釀酒酵母細(xì)胞所偏好的密碼子而產(chǎn)生的。
SEQIDNO: l所示的核苷酸序列編碼SEQIDNO: 2所示的氨基酸序列，該序 列與GenBank注冊號為AAF61439的序列區(qū)別在于SEQ ID NO: 2在第24位由苯 丙氨酸變成了絲氨酸;158位由異亮氨酸變成蘇氨酸；379位由賴氨酸變成天冬酰胺； 412位由甘氨酸變成天冬氨酸；443位由天冬酰胺變成天冬氨酸；538位由絲氨酸變 成蘇氨酸；541位由纈氨酸變成甘氨酸；546位由異亮氨酸變成亮氨酸。 SEQ ID NO: 1序列的合成可使用SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 44通過PCR來合成，
合成示意圖見圖3。具體方法如下將整個片段分成前后兩個部分分別合成，然后通
過酶切使兩個片段連接成一個完整的片段。將SEQ ID NO: 3 SEQIDNO: 24混合，
按如下體系(SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:24各luL， Buffer: 5uL, dNTP:4uL，
pfuTaqE:l"L， 50uL體系)和PCR程序(95°C， 5min; 95°C， 30S， 60°C， 30S，
72°C， 30S， 30 cycles; 72°C， 7min; 4°C， +°°)進(jìn)行擴(kuò)增，得到一條長約885bp的
條帶，TA克隆，得到載體pMD-FllRll;將SEQ ID NO:25 SEQ ID NO:44混合，
按如下體系(SEQIDNO:25 SEQIDNO:44各luL, Buffer: 5wL, dNTP:4liL，
pfuTaqE:lliL, 50uL體系)和PCR程序(95°C， 5min; 95°C， 30S， 60°C， 30S，
72°C， 30S， 30 cycles; 72°C， 7min; 4°C， +°°)進(jìn)行擴(kuò)增，得到一條長約803bp的
條帶，TA克隆，得到載體pMD-F21R21;將pMD-FllRll和pMD-F21R21送樣測序，
與設(shè)計的完全吻合。用SamHI/Sall分別酶切pMDFllRll和pMECA，連接成載體
pMECAFllRll。用SpW/WoI分別酶切pMD18F21R21禾Q pGEM7zf，連接成載體
pGEM-F21R21 。用^6al/Smal分別酶切pMECAFllRll和pGEM-F21R21 ，連接成載
體pMECAADSm，其中包含完整的SEQ ID NO: 1序列。
在本發(fā)明的另一個方面中，提供了一種在釀酒酵母細(xì)胞中生產(chǎn)青蒿酸的方法，包 括下列步驟
i) 根據(jù)上述生產(chǎn)紫穗槐-4,ll-二烯的方法中步驟i)和ii)所述構(gòu)建紫穗槐-4,11-
二烯酵母工程菌；
ii) 將CYP71AV1 P450基因和P450還原酶CPR基因一起導(dǎo)入釀酒酵母細(xì)胞中的 第三位點(diǎn)，即得青蒿酸酵母工程菌；
iii) 培養(yǎng)步驟(ii)中的青蒿酸酵母工程菌，并純化青蒿酸； 其中所述第三位點(diǎn)選自S序列、入DNA序列和HO位點(diǎn)，與生產(chǎn)紫穗槐-4,ll-二
烯的方法中所述的第一位點(diǎn)或第二位點(diǎn)相同或不同。
8在上述方法的一個優(yōu)選方案中，所述的第三位點(diǎn)是s序列。
在另一個優(yōu)選實施方案所述的HMG-CoA還原酶基因、FPP合酶基因和紫穗槐 -4，ll-二烯合酶基因、CYP71AV1 P450基因和P450還原酶CPR基因分別與強(qiáng)啟動子 可操作的連接，所述強(qiáng)啟動子優(yōu)選為ADH或GAPDH。
在再一優(yōu)選實施方案中，所述的FPP合酶基因和紫穗槐-4,ll-二烯合酶基因之間 插入有一段連接序列。該序列優(yōu)選是編碼Gly-Ser-Gly的GGATCCGGA。
另外，為了提高CYP71AV1 P450和P450還原酶CPR的電子耦合能力，在這兩 個酶之間也加入了一段連接序列。該序列優(yōu)選是編碼Pro-Arg-Ala的CCTAGGGCT。
在又一優(yōu)選實施方案中，其中所述的紫穗槐-4，ll-二烯合酶基因含有上述SEQID NO: l所示的核苷酸序列。
在酵母中，酵母鯊烯合酶和紫穗槐-4,ll-二烯合酶競爭性地以FPP為底物，催化 FPP生成鯊烯，進(jìn)而生成麥角甾醇。因此除了上調(diào)能促進(jìn)FPP合成的基因的表達(dá)外， 在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明還下調(diào)了酵母鯊烯合酶基因的表達(dá)。在本 發(fā)明的最優(yōu)選實施方案中，通過同源整合技術(shù)構(gòu)建將酵母中控制麥角甾醇合成的一個 關(guān)鍵酶基因鯊烯合酶基因阻斷，減少酵母中轉(zhuǎn)向麥角甾醇代謝流FPP的量，從而增 加青蒿酸代謝流中FPP的供應(yīng)。
在本發(fā)明的另一個方面中，提供了一種生產(chǎn)青蒿酸的釀酒酵母(Sflcc/^ramj;c" cewv/w'w)菌株，該菌株通過下列步驟獲得
i) 根據(jù)上述生產(chǎn)紫穗槐-4,ll-二烯的方法中步驟i)和ii)所述構(gòu)建紫穗槐-4,11-二烯酵母工程菌；
ii) 將CYP71AV1 P450基因和P450還原酶CPR基因一起導(dǎo)入釀酒酵母細(xì)胞中的 第三位點(diǎn)；
其中所述第三位點(diǎn)選自S序列、XDNA序列和HO位點(diǎn)，與生產(chǎn)紫穗槐-4,ll-二 烯的方法中所述的第一位點(diǎn)或第二位點(diǎn)相同或不同。
在一個優(yōu)選的實施方案中，上述酵母菌株是WHTAsquFPR。該酵母菌株已于 2006年11月10日于地址為北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號(中國科學(xué)院微生物研 究所，郵編100080)的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)， 提交保藏，保藏編號為CGMCCNo.1861。
在本方面的另一個方面中，還提供了另一種在釀酒酵母細(xì)胞中生產(chǎn)紫穗槐-4，11-二烯的方法，包括下列步驟
i) 將HMG-CoA還原酶基因和FPP合酶基因一起以附加體形式導(dǎo)入釀酒酵母細(xì) 胞中；
ii) 將紫穗槐-4,ll-二烯合酶基因以附加體形式導(dǎo)入釀酒酵母細(xì)胞中，即得紫穗槐 -4，ll-二烯酵母工程菌；
iii) 培養(yǎng)步驟(ii)中的紫穗槐-4，ll-二烯酵母工程菌，并純化紫穗槐-4,ll-二烯。
在本發(fā)明的另一個方面中，還提供了另一種在釀酒酵母細(xì)胞中生產(chǎn)青蒿酸的方 法，包括下列步驟
i)將HMG-CoA還原酶基因和FPP合酶基因一起以附加體形式導(dǎo)入釀酒酵母細(xì)
胞中；
ii) 將紫穗槐-4，ll-二烯合酶基因和CYP71AVl P450基因以附加體形式導(dǎo)入釀酒 酵母細(xì)胞中，即得青蒿酸酵母工程菌；
iii) 培養(yǎng)步驟(ii)中的青蒿酸酵母工程菌，并純化青蒿酸。 在本發(fā)明的另一個方面中，提供了一種生產(chǎn)青蒿素的釀酒酵母(5^ctoro/K>;cw
cwei^Zae)菌株，該菌株通過下列步驟獲得
0根據(jù)上述生產(chǎn)紫穗槐-4，ll-二烯的方法中步驟i)和ii)所述構(gòu)建紫穗槐-4,11-二烯酵母工程菌；
ii)將CYP71AV1 P450基因和P450還原酶基因一起導(dǎo)入釀酒酵母細(xì)胞中的第三 位點(diǎn)。
在一個優(yōu)選的實施方案中，上述酵母菌株是釀酒酵母(&cc/wraw;;cescewv/w'ae) 菌株WHTFPR。該酵母菌株已于2006年11月8日于地址為北京市海淀區(qū)中關(guān)村北 一條13號(中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100080)的中國微生物菌種保藏管理 委員會普通微生物中心(CGMCC)提交保藏，保藏編號為CGMCCNo.1857。
另外，本發(fā)明還提供了一種優(yōu)化的DNA序列，其含有SEQIDNO: 1所示的核 苷酸序列。
本發(fā)明還涉及一種DNA載體，其包含上述優(yōu)化的DNA序列。 本發(fā)明還涉及一種宿主細(xì)胞，其包含上述的DNA載體。在一個優(yōu)選的實施方案 中，該宿主細(xì)胞是釀酒酵母細(xì)胞。
在一個更為優(yōu)選的實施方案中，所述酵母菌株是釀酒酵母(5Wcctora/^c^ cercv/s/oe)菌株WHTAsquFPR，保藏日期2006年11月10日；保藏單位中國微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，地址為北京市海淀區(qū)中關(guān)村北 一條13號(中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100080)，保藏編號為CGMCCNo.1861。 在另一個更為優(yōu)選的實施方案中，所述酵母菌株是釀酒酵母(Sacc^raw_ycM cerev/w'ae)菌株WHTFPR，保藏日期2006年11月8日；保藏單位中國微生物菌 種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，地址為北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條 13號(中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100080);保藏編號CGMCCNo.1857。


圖l:在酵母中重構(gòu)的青蒿酸合成途徑。
圖2: PCR擴(kuò)增的FPP合酶基因，其中l(wèi)是對照；2是FPP合酶基因PCR結(jié)果。 圖3: SEQIDNO:l的合成示意圖，上圖是SEQ ID NO:l 5'端序列合成的示意下圖是SEQIDNO:l 3'端序列合成的示意圖；其中F表示正向引物;R表示
反向引物。
圖4: pYeDP60/G/ADS酶切結(jié)果，其中，1禾H 2是pYeDP60/G/ADS的￡coR I單
酶切結(jié)果；M是DL15000。 圖5: pGBT9/A/HMGOFPP HK^果，其中1是pGBT9/A/HMG/G/FPPfi^R I ZftT I結(jié)果；2 是pGBT9/A/HMQ^FPP/^ I ^H切結(jié)果；3是pGBT9/A/HMCVG^PPfiwR I ^tBg果。
圖6: SQS3/SQS4 PCR的結(jié)果，其中1表示引物SQS3/SQS4 PCR的結(jié)果；M表 示DL2000。
圖7: SQS5/SQS6PCR的結(jié)果，其中1表示引物SQS5/SQS6 PCR的結(jié)果；M表 示DL2000。
圖8: SQS和S序列PCR的結(jié)果，其中1表示S 1/5 2擴(kuò)增的結(jié)果；2表示S 3/ S 4擴(kuò)增的結(jié)果；3表示SQS1/SQS2PCR的結(jié)果；4表示SQS3/SQS4擴(kuò)增的結(jié) 果。
圖9: p4297SQS的JKw I單酶切結(jié)果，其中1-3表示三個p4297SQS質(zhì)粒的JRw
I單酶切結(jié)果；M表示DL 15000。 圖10: ADS基因菌落PCR結(jié)果，其中，l-9表示九個WHT[HMG+FPP+AS]工程
菌克隆中的ADS基因菌落PCR結(jié)果；M表示DL2000。 圖11: HMGR基因菌落PCR結(jié)果，其中，1-9表示九個WHT[HMG+FPP+AS]
工程菌克隆中的HMGR基因菌落PCR結(jié)果；M表示DL2000。 圖12: FPPS基因菌落PCR結(jié)果，其中，1-9表示九個WHT[HMG+FPP+AS]工
程菌克隆中的FPPS基因菌落PCR結(jié)果；M表示DL2000。 圖13:S.cewv/wfle[pGBT9/A/HMG/G/FPP，pYeDP60/G/ADS/P450]菌落PCR結(jié)果，
其中CK是對照；1-12表示12個轉(zhuǎn)化子ADS基因菌落PCR結(jié)果。 圖14:S.cewv/w'ae[pGBT9/A/HMG/G/FPP， pYeDP60/G/ADS/P450]菌落PCR結(jié)果，
其中CK是對照；1-11表示11個轉(zhuǎn)化子CYP71AV1基因菌落PCR結(jié)果。 圖15: FPPS基因菌落PCR結(jié)果，其中，1-9表示九個WHT[HMG+FPP+AS+P450]
工程菌克隆中的FPPS基因菌落PCR結(jié)果；M表示DL2000。 圖16:HMGR基因菌落PCR結(jié)果，其中，l-9表示九個WHT[HMG+FPP+AS+P450]
工程菌克隆中的HMGR基因菌落PCR結(jié)果；M表示DL2000。 圖17: A-C表示紫穗槐-4，ll-二烯酵母工程菌的GC-MS結(jié)果。 圖18:青蒿酸酵母工程菌WHTFPR發(fā)酵提取物的傅立葉轉(zhuǎn)換回旋共振質(zhì)譜結(jié)果。 圖19: p4366-HMG Sfl/I酶切結(jié)果，其中，1-3表示三個p4366-HMG質(zhì)粒；M 表示人////"(1111。
圖20: p4366-HMG 5wwH I酶切結(jié)果，其中，1-3表示三個p4366-HMG質(zhì)粒； M表示入/77/wd111。
圖21: ADNAPCR結(jié)果，其中1表示引物1/2擴(kuò)增的結(jié)果；2表示引物3/4擴(kuò)增 的結(jié)果；M表示DL2000。
圖22:酵母FPPS PCR的結(jié)果，其中，1表示酵母FPPS PCR的結(jié)果；M表示 DL2000。
圖23: pAFSm 5flwHl/^7wI雙酶切結(jié)果，其中，1-6表示6個pAFSm質(zhì)粒； Ml表示X /州mJIII; M2表示DL2000。
圖24: pAFSmWo I單酶切結(jié)果，其中，1-6表示6個pAFSm質(zhì)粒；Ml表示入 /歷wdlll; M2表示DL15000。
圖25: pAFSm5amH I單酶切結(jié)果，其中，1-6表示6個pAFSm質(zhì)粒；Ml表示
入/W/ndlll; M2表示DL15000 。
圖26: pAFSmU/5g/II單酶切結(jié)果，其中，1表示pAFSmU/%/11 I單酶切結(jié)果；
Ml表示DL15000。
圖27: pAFSmU/^h H I單酶切結(jié)果，其中，1表示pAFSmU/BawH I單酶切結(jié) 果；Ml表示DL15000。
圖28: pAFSmU/入1萬g/II單酶切結(jié)果，其中，1-5表示5個pAFSmU/A 1質(zhì)粒； Ml表示A /歷'"dlll; M2表示DL15000。
圖29: pAFSmU/入1MmI單酶切結(jié)果，其中，1-5表示5個pAFSmUA 1質(zhì)粒； Ml表示A ////"dill; M2表示DL2000。
圖30: pAFSmU-入1/戶rall單酶切結(jié)果，其中，1-5表示5個pAFSmU/入1質(zhì)粒； Ml表示DL15000; M2表示DL2000。
圖31: pMECAA2/5WI單酶切結(jié)果，其中，l-6表示6個pMECA入2質(zhì)粒；Ml 表示入/7//^1111; M2表示DL2000。
圖32: pAFSmU-入/SacII單酶切結(jié)果，其中，1-3表示3個pAFSmU-入質(zhì)粒Soc II單酶切結(jié)果；M表示DL15000。
圖33:整合型紫穗槐-4,ll-二烯酵母工程菌的GC-MS結(jié)果。
圖34: P4501/P4502 PCR結(jié)果，其中1表示引物P4501/P4502 PCR結(jié)果；M表 示DL 15000。
圖35: rel/re2 PCR結(jié)果，其中1表示引物rel/re2 PCR結(jié)果；M表示DL15000。
圖36: pADHP450re/Xho I單酶切結(jié)果，其中，1表示pADHP450re/Xho I單酶 切結(jié)果；M表示X/預(yù)'miin。
圖37: pAP450re S URA/ 單酶切結(jié)果，其中，1表示pAP450re S URA/萬g/ II單酶切結(jié)果；M表示X /歷wdHI。
圖38:整合型青蒿酸酵母工程菌發(fā)酵提取物的傅立葉轉(zhuǎn)換回旋共振質(zhì)譜結(jié)果。
具體實施例方式
以下通過合成紫穗槐-4,ll-二烯和青蒿酸的優(yōu)選實施例并結(jié)合附圖具體說明本發(fā) 明的各個方面和特征。這些實施例的基本方案如圖1所示。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理 解，這些實施例只是用于說明目的，而不限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的保護(hù)范圍只受 權(quán)利要求書的限制。在不背離權(quán)利要求書范圍的條件下。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對本 發(fā)明的各個方面進(jìn)行各種修改和改進(jìn)，這些修改和改進(jìn)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。例 如，將實施例中所使用的啟動子和表達(dá)載體替換為本領(lǐng)域中常用的其他啟動子和表達(dá) 載體，是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所能夠理解并實現(xiàn)的。
另外，需要注意的是，除非特別指明，下面實施例中所用的各種材料和試劑都是 本領(lǐng)域中常用的材料和試劑，可以通過常規(guī)的商業(yè)途徑獲得；所用方法均為本領(lǐng)域技 術(shù)人員公知的常規(guī)方法。
實施例l:青蒿酸合成途徑相關(guān)基因的獲得 ,母，絲基,獲獰
直接利用酵母WHT (法國DrWerck-Reichhart饋贈)基因組DNA為模板，用引物 YFS1/4 (YFS1: 5' -GGTATTGGACTGACATAGGC-3' ; YFS4; 5'-CATGGTCCTTATCTAGTTTGAAAT陽3')進(jìn)行第一輪PCR (95°C， 5min; 95°C， 30S， 49°C， 1.5min， 72°C， 1.5min, 30cycles; 72°C， 7min; 4°C， +°°)。利用第一 輪PCR產(chǎn)物為模板，用引物YFS2/3 (YFS2:5' "GGCTAGCGAAAAAGAAATTAGG AGAGA-3' ; YFS3:5'-GGTCGACCTATTTGCTTCrCTTGTAAAC-3')進(jìn)行NEST-PCR 擴(kuò)增(95°C， 5min; 95°C， 30S， 54°C， 1.5min， 72°C, 1.5min， 30cycles; 72°C, 7min; 4'C， +~),得到一條長為1059bp的片段(圖2)。 TA克隆，得到載體pMD-FPP,經(jīng) 測序發(fā)現(xiàn)，與已經(jīng)發(fā)表的FPP合酶基因(GenBank注冊號J05091) —致。
^母/ZMG-Ca4 i 嚴(yán)蘑基腐游獲淳
根據(jù)酵母HMG-CoA還原酶基因(GenBank注冊號M22002)設(shè)計引物HMGI( 5，-GGATCCAAGAAGTCTTACTG-3，)和腹G2(5，-GGCTAGCAAGAGAATACCAATG ACGT-3')，分別引入5amH I和A^e I位點(diǎn)。以酵母基因組DNA為模板，用引物 HMGI/HMG2通過PCR擴(kuò)增(95°C， 5min; 95°C, 30S， 48°C， 2min， 72°C， 2min， 30 cycles; 72°C， 7min; 4°C， +°°)得到長度為1583 bp的HMG還原酶催化結(jié)構(gòu)域 基因片段，TA克隆得到含HMG-CoA還原酶基因的載體pMD-HMG，經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)， 和已經(jīng)發(fā)表的HMG-CoA還原酶基因(GenBank注冊號M22002)—致。
蒙,實蘼膝^U7-二靡會蘼基厲游獲淳浙沐眾
禾U用Condon Usage Database(http:〃www.kazusa.orjp/codon/)，將青蒿紫穗槐-4，ll畫 二烯基因(GenBank注冊號AF138959)的一些密碼子替換為釀酒酵母細(xì)胞所偏好 的密碼子，產(chǎn)生優(yōu)化的序列SEQIDNO: 1。
靜尸柳《1T7L4F"基娜,淳
利用AR12 (AR12: 5'-GACATAACACTTTACACGATATTAT-3')為引導(dǎo)引物，進(jìn) 行cDNA第一條鏈的合成(50°C， 60min);利用引物AR11/8 (AR8: 5'-CTAGAAAC TTGGAACGAGTAACAAC-3，； AR11: 5'-GAGTATACTAAAAGCAATGG隱3')配對進(jìn)行 第一輪PCR (95°C， 5min; 95°C， 30S， 45°C， 2min， 72°C， 2min， 30cycles; 72°C， 7min ; 4°C， +~);以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，用AR7/15引物(AR7: 5'-GGGATCCATGGCACTCTCACTGACCAC陽3，； AR15: ( 5'-GGT
CGACCTAGAAACTTGGAACGAGTAA-3')配對進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增(95'C， 5min; 95°C, 30S， 56°C， 2min， 72°C， 2min,30 cycles; 72°C， 7min; 4°C， +°°)，得到一 條長為1467bp的片段，TA克隆，得到載體pMD-P450，測序發(fā)現(xiàn)，與已經(jīng)發(fā)表的青蒿 CYP71 P450基因存在4個堿基的差異(SEQ ID NO: 48 )。于是，以AR7 ( 5'-GGGATCCATGG CACTCTCACTGACCAC陽3， ) 和 AR15
(5'-GGTCGACCTAGAAACTTGGAACGAGT AA-3')為引物，青蒿cDNA為模板， 前后擴(kuò)增三次(95°C， 5min; 95。C， 30S， 56°C， 2min， 72°C， 2min,30 cycles; 72°C， 7min; 4'C， +~)，均發(fā)現(xiàn)與已經(jīng)發(fā)表的CYP71AV1 P450有四個堿基的差異，由此 斷定我們這些差異是我們所用的青蒿中CYP71AV1 P450基因的真實序列，而并非由于 PCR操作所引入的。
競節(jié)0還嚴(yán)艨CPi 基,蕕淳
根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的青蒿P450還原酶CPR基因(GenBank注冊號DQ318192)，設(shè) 計引物reductase 1 (5 ，-ATGCAATCAACAACTTCCG-3，)； reductase2(5 ，- ATGATACATCT GTTGCCACTCC陽3，)； reductase3(5，-ATGGAGGGAAAGGAGGTG陽3'); reductase4(5，-TTACCATACATCCCGGAGATATC-3')。利用reductase 1/reductase3為引 物，青蒿cDNA為模板，PCR擴(kuò)增(95°C， 5min; 95°C， 30S， 46°C， 2min， 72°C， 2min， 30 cycles; 72°C， 7min; 4°C, + 0，得到一條長U80bp的條帶，T-A克隆， 得到載體pMDrel/3，送樣測序，與經(jīng)發(fā)表的青蒿P450還原酶基因5'端1180bp完全 一致；利用reductase2/reductase4為引物，青蒿cDNA為模板，PCR擴(kuò)增(95°C， 5min; 95°C， 30S， 50°C， 2min， 72°C， 2min， 30 cycles; 72°C， 7min; 4°C， +°°)，得到 一條長1334bp的條帶，T-A克隆，得到載體pMDre2/4,送樣測序，與經(jīng)發(fā)表的青蒿 P450還原酶基因3'端1334bp完全一致。用M/el/尸Wl分別酶切pMDrel/3和 pMDre2/4,連接成載體pMDre，其中包含完整的P450還原酶基因(SEQ ID NO: 49)。
實施例2:載體的構(gòu)建
#，絲續(xù)顛MG-Ca4練基鵬就菱伴游辦 ^a4iW^動請辦; G^PZ)i/股J離逮
用引物GAPDH2/3 ( GAPDH2: 5，-GGGATCCGCTAGCCATTTTGTTTGTTTAT G-3'; GAPDH3:5，-CCTCGAGTTTATCATTATCAA-3，)擴(kuò)增酵母的GAPDH啟動子， "T/A"克隆到pMD-18T (購自大連寶生物公司)中，測序正確；用￡coR I+^Y&a I 酶切平端化處理，然后連接，這樣獲得的pGAPDH (EX)載體含有酵母GAPDH啟 動子，消除了五②R I和力a I中間的其他位點(diǎn)，而又恢復(fù)保留了 ￡coR I、 I位 點(diǎn)。
^^P戶^朦基厲浙FMG-Q^ #朦基厲游表這載沐/ (^7%4/^^(3;/(3:/ 7^游稱遂
用M e I +iV I酶切pMDFPP，然后亞克隆到用Mze I十尸W I酶切的pGAPDH(EX) 中，連接得到載體pG/FPP;再用EcoR I +尸對I酶切pG/FPP，亞克隆到用￡coR I +戶對 I酶切的pGBT9/A/HMG中，得到pGBT9/A/HMG/G/FPP，這樣得到的載體中含有 HMG-CoA還原酶和FPP合酶兩個基因，而且每個基因前面都含有酵母啟動子和終止 子。其中，HMG-CoA還原酶基因上游是ADH啟動子，F(xiàn)PP合酶基因上游是GAPDH 啟動子。
#微膝《"-二靡絲基娜載沐-i)層/G/孺婦遂
先用力fll和五coRI酶切pMD-ADS，平端化處理，連接，得到pMDADS(EX)，
再用J^o I酶切平端化處理，連接。然后含紫穗槐-4,ll-二烯合酶(ADS)基因的 pMD-ADS(EXX)用5a附H I + ￡coR I直接亞克隆到同樣用5awH I +五coR I酶切的 pYeDP60/GAPDH中，得到含ADS基因的表達(dá)載體pYeDP60/G/ADS。在這個載體中， ADS基因前面是GAPDH啟動子。
二靡^蘑基像浙CKVL4W基厲游載銀 plfeZ)，/GZ4Z)5ZP柳游稱虜
用5fl附H I + I酶切pMD-P450，亞克隆到5amH I + ^Tzo I酶切的質(zhì)粒 pGEM-ADH1346上，而后用I單位點(diǎn)把整個融合基因亞克隆到用^Tzo I酶切的 pYeDP60/GAPDH/ADS中，得到載體pYeDP60/G/ADS/P450，其中含紫穗槐-4，ll-二 烯合酶基因和青蒿P450 CYP71AV1基因。
教載鄉(xiāng)鑒定
表達(dá)載體pYeDP60/G/ADS和pGBT9/A/HMG/FPP構(gòu)建好后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，氨 芐青霉素抗性篩選，挑取陽性克隆，搖菌，提質(zhì)粒，分別用進(jìn)行酶切鑒定。
pYeDP60/G/ADS理論上長約ll.Okb，用￡coR I單酶切，切出來的片段與理論上 大小一樣，由此確定pYeDP60/G/ADS構(gòu)建成功(圖4)。
pGBT9/A/HMG/G/FPP理論大小10.7kb，用尸M酶切出來的片段與理論大小一致， 用五coRl/尸對I酶切出兩個片段，大小約9kb和1.7kb，從圖上來看，與理論值完全 吻合(圖5)。由此確定pGBT9/A/HMG/G/FPP構(gòu)建成功。
實施例3:反義RNA技術(shù)弱化酵母鯊烯合酶基因的表達(dá) 根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的酵母鯊烯合酶基因(GenBank注冊號X59959),設(shè)計兩對引物 SQS3 (5，-acgagctctaactccgcaggaactac-3，)； SQS4 (5'-aatatttccttgggccagaaggatc-3'); SQS5 ( 5 ， -cagctggtcacaatacgctcctcag-3 ，) ； SQS6 ( 5' -gcggatccatttacctaatgcactaaac-3 ，) < 以引物SQS3/SQS4配對，酵母DNA為模板，PCR擴(kuò)增(95°C， 5min; 95°C， 30S， 53°C， 1.5min， 72°C， 1.5min， 30 cycles; 72°C， 7min; 4°C， +°°)，得到一條長是 1078bp的條帶(圖6)， TA克隆，得到載體pMD-SQSl，送樣測序，與已經(jīng)發(fā)表的酵 母鯊烯合酶序列5'端完全一樣。引物SQS5/SQS6配對，酵母DNA為模板，PCR擴(kuò) 增(95。C， 5min; 95°C， 30S， 50°C, 2min， 72。C， 2min， 30 cycles; 72°C， 7min; 4 °C， + >)，得到一條長是1308bp的條帶(圖7)， TA克隆，得到載體pMD-SQS2， 送樣測序，與已經(jīng)發(fā)表的酵母鯊烯合酶序列3'端序列完全一樣。用i^wI/TwI酶切 pMD-SQS2，回收長約1308bp的條帶，然后用PTOlI/5awH I酶切，克隆到用I /尸rfl酶切的pMD-SQSl上，得到載體pMD-SQS，該載體包括完整的反向鯊烯合酶 序列(SEQ ID NO:47 )。用I /5a附H I酶切pMD-SQS，克隆到同樣用&c I /AwmH I酶切的載體pYeDP60 (法國Dr Werck-Reichhart饋贈)中，得到載體pYeDP60-SQS，
醋酸鋰法轉(zhuǎn)化釀酒酵母WHT，通過檢測鯊烯或麥角甾醇的含量篩選反義RNA株。
實施例4:酵母鯊烯合酶基因缺陷株WHT A SQU的獲得
根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的酵母鯊烯合酶基因(GenBank注冊號X59959),設(shè)計兩對引 物SQS 1 (5 ，-GGATCCgagctctaactccgcaggaac-3 ，)； SQS2(5，-CTCGAGGCGGCCGCtgtgtg tgtgtgatatgtgacgt-3，)； SQS3(5，-TCTAGAGCGGCCGCagtctgcgccaaataacataaac-3，);SQS4
(5'-GAATTCttaacgcaataccataaaaggtcag隱3')。引物SQS1/ SQS2配對，酵母DNA為模 板，PCR擴(kuò)增(95°C， 5min; 95°C， 30S， 50°C， 30sec， 72°C， 30sec， 30 cycles; 72 。C， 7min; 4'C， +~)，得到一條長是330bp的條帶(圖8)， TA克隆，得到載體 pMD-SQS3，送樣測序，與已經(jīng)發(fā)表的酵母鯊烯合酶序列5'端上游序列完全一樣。引 物SQS3/ SQS4配對，酵母DNA為模板，PCR擴(kuò)增(95°C， 5min; 95°C， 30S， 50 。C， lmin， 72°C， lmin， 30cycles; 72°C， 7min; 4°C， +~)，得到一條長是831bp 的條帶(圖8)， TA克隆，得到載體pMD-SQS4，送樣測序，與已經(jīng)發(fā)表的酵母鯊烯 合酶序列3'端下游序列完全一樣。用屈o I /萬awH I酶切pMD-SQS3，克隆到用屈o
I ABcwjH I酶切的p4297 (美國David Stillman饋贈)上，得到載體p4297-SQSl ，該 載體包括330bp的酵母鯊烯合酶序列5'端上游序列。用^k/I/五coRl酶切 pMD-SQS4，克隆到同樣用Wa I AEcoR I酶切的載體p4297-SQSl中，構(gòu)建成含酵母 鯊烯合酶基因5'與3'端序列的取代型載體p4297-SQS(圖9)，用iVW I將p4297-SQS 線性化，醋酸鋰法轉(zhuǎn)化釀酒酵母WHT，通過同源雙交換，G418抗性篩選和麥角甾醇 合成缺陷型篩選突變株，得到酵母鯊烯合酶基因缺陷株WHT A squ。
實施例5:陽性酵母轉(zhuǎn)化子WHT [pGBT9/A/HMG/G/FPP+pYeDP60/G/ADS]的獲得 采用醋酸鋰法將pGBT9/A/HMG/G/FPP和pYeDP60/G/ADS共轉(zhuǎn)4七釀酒酵母WHT (用 WH丌HMG+FPP+AS])表示，轉(zhuǎn)化后培養(yǎng)2-4天，然后挑取克隆在補(bǔ)加了組氨酸和亮氨 酸的SGI培養(yǎng)基(無氨基酵母氮源，6.7g/l;葡萄糖，20g/l;酸水解酪素，5g/1，固體 補(bǔ)加2%的瓊脂粉)中脅迫培養(yǎng)2天，提取酵母質(zhì)粒，以質(zhì)粒為模板，通過PCR鑒定 陽性克隆。在酵母工程菌WHT[HMG+FPP+AS]中，導(dǎo)入了3個基因，分別是ADS， tHMGR 和FPPS。 ADS的檢測采用引物AR2和AR3 (圖10)， HMGR基因的檢測用引物ADH1和 HMG(圖11)， FPPS基因的檢測采用引物gapdhpr和FPPC (圖12)。如圖10-12所示， 在待篩的9個克隆中都檢測到了這三個基因，說明這9個克隆都是陽性克隆。
所用引物和參數(shù)如下 引物AR2和AR3 (AR2: 5， -GGGATCCCTTACAGAAGAAAAACC-3，；
AR3: 5， -CCTCGAGTCATATACTCATAGGATA-3'); 參數(shù)95。C， 5min; 95。C， 30S， 51。C， 1min， 72°C， 2min， 30cycles; 72°C， 7min。
引物
HMG 禾卩 ADH1 (HMG: 5'-TGGGCCTCTTGTCATACCATCCT-3'; ADH1: 5'-GGTCGACGTCGAGATCCGGGATC-3')
參數(shù)95°C， 5min; 95°C， 30S， 48°C， 1min， 72°C， 2min， 30cycles; 72。C， 7min。
引 物 Gapdhpr 和
FPPC(Gapdhpr:5'-GGCACAACCTCAATGGAGTGATG-3';FPPC:5'-GGATCCTTTGCT TCTCTTGTAAACTT-3')
參數(shù)95°C， 5min; 95°C， 30S， 48°C， 1min， 72°C， 2min， 30cycles; 72°C, 7min。
實施例6: WHT[pGBT9/A/HMG/G/FPP,pYeDP60/G/ADS/P450]陽性轉(zhuǎn)化子的獲得 采用醋酸鋰法將pGBT9/A/HMG/G/FPP和pYeDP60/G/ADS/P450共轉(zhuǎn)化釀酒酵母 WHT(用股H丌AS+P450+HMG+FPP]表示)，轉(zhuǎn)化后培養(yǎng)2-4天，然后挑取克隆在補(bǔ)加了組 氨酸和亮氨酸的SGI培養(yǎng)基中脅迫培養(yǎng)2天，提取酵母質(zhì)粒，以質(zhì)粒為模板，通過 PCR鑒定陽性克隆。在酵母工程菌WH丌AS+P450+HMG+FPP]中，導(dǎo)入了4個基因，分別 是P450， ADS， tHMGR和FPPS。
檢測紫穗槐-4,11-二烯合酶基因所用引物和參數(shù)如下 引物AR2和AR3 (AR2: 5， -GGGATCCCTTACAGMGAAAAACC-3， AR3: 5， -CCTCGAGTCATATACTCATAGGATA-3');
參數(shù)95°C， 5min; 95°C， 30S, 5TC， 2min, 72°C， 2min， 30cycles; 72°C， 7min。
得到了陽性轉(zhuǎn)化子。從菌落PCR可以看出，所有的菌落都是陽性克隆(圖13)。 檢測CYP71AV1 P450酶基因所用引物和參數(shù)如下AR7 (5' -GGGATCCATGGCACTCT
CACTGACCAC-3，) 和AR15 (5'-GGTCGACCTAGAMCTTGGMCGAGTM-3');
參數(shù)95°C， 5min; 95°C， 30S， 56°C， 1.5min， 72°C， 1.5min， 30cycles; 72
。C， 7min。
得到了陽性轉(zhuǎn)化子。從菌落PCR可以看出，第2、 3、 5、 7、 8、 11號是陽性克隆 (圖14)。
檢測FPPS基因所用引物和參數(shù)如下
引物Gapdhpr ( 5 ' -GGCACAACCTCAATGGAGTGATG-3 ')禾n FPPC ( 5 ' -GGATCCTTTGCTTCimGTAAACTT-3')
參數(shù)95°C， 5min; 95°C， 30S, 48°C， 1min， 72°C， 2min， 30 cycles; 72°C, 7min。
得到了陽性轉(zhuǎn)化子。從菌落PCR可以看出，所有的9個菌落都是陽性克隆(圖
15) 。
檢測tHMGR基因所用引物和參數(shù)如下
引物HMG ( 5 ' -TGGGCCTCTTGTCATACCATCCT-3 ')和 ADH1 ( 5 ' -GGTCGACGTCGAGATCCGGGATC-3')。
參數(shù)95°C， 5min; 95°C， 30S， 48°C， 1min, 72°C， 2min， 30 cycles; 72°C， 7min。
得到了陽性轉(zhuǎn)化子。從菌落PCR可以看出，所有的9個菌落都是陽性克隆(圖
16) 。
實施例7:酵母陽性轉(zhuǎn)化子的發(fā)酵培養(yǎng)
挑取陽性轉(zhuǎn)化子在補(bǔ)加了組氨酸和亮氨酸的SGI培養(yǎng)基中脅迫培養(yǎng)2天，然后按 5-10%的接種量轉(zhuǎn)接到Y(jié)PGA培養(yǎng)基(酵母提取物，10g/l潘白胨，10g/l;葡萄糖，20g/l; 腺嘌吟，20mg/l)中，繼續(xù)培養(yǎng)2天。
實施例8:酵母發(fā)酵產(chǎn)物的鑒定
收集酵母WHT [pGBT9/A/HMG/G/FPP+pYeDP60/G/ADS]發(fā)酵物，將酵母發(fā)酵物 冷干，然后在冷干的菌體和發(fā)酵物中加入甲醇，震蕩培養(yǎng)3-4天，過濾，濾液旋轉(zhuǎn)蒸 干，然后用水溶解，加入正己烷，萃取三遍，萃取液旋轉(zhuǎn)蒸干，用少量的正己烷溶解； 正己烷萃取后剩余的液體用乙酸乙酯萃取，萃取液旋轉(zhuǎn)蒸干，用少量的乙酸乙酯溶解。 分別將發(fā)酵產(chǎn)物的正己垸萃取液和乙酸乙酯萃取液進(jìn)行GC-WIS，結(jié)果檢測到了紫穗槐 -4,11-二烯的生成(圖17-A-C)，根據(jù)朱欒倍半萜標(biāo)準(zhǔn)曲線，對上述酵母工程菌中的 紫穗槐-4,"-二烯進(jìn)行了定量測定。1^丌剛6+「 45]工程菌發(fā)酵液中紫穗槐-4,"-二烯的濃度為23.6mg L1。
收集WHT [pGBT9/A/HMG/G/FPP+pYeDP60/G/ADS/P450]陽性轉(zhuǎn)化子酵母發(fā)酵 物，將酵母發(fā)酵物冷干，然后在冷干的菌體和發(fā)酵物中加入含1.2M山梨醇的 Tris'CL(pH9.5)堿化菌體，28。C震蕩培養(yǎng)3-4天，然后加入HC1，使 11=2.0,然后用乙 酸乙酯萃取，萃取液旋轉(zhuǎn)蒸干，取少量進(jìn)行傅立葉轉(zhuǎn)換回旋共振質(zhì)譜檢測，結(jié)果檢測 到了青蒿酸的生成(圖18)，能產(chǎn)生青蒿酸的酵母工程菌命名為WHTFPR。
實施例9: HMG-CoA還原酶基因酵母整合載體的構(gòu)建
用5awH I /Mze I雙酶切pMD18T-HMG，將酶切的HMG-CoA片段克隆到同樣用 萬awHl/iW el雙酶切的載體pGEM-ADH1346中，得到載體pADH1346-HMG，其中， HMG-CoA還原酶基因上游是ADHl啟動子，下游是ADH1終止子。用j/w I/S; e I分 別酶切pADH1346-HMG和pMECA，然后連接得至UpMECA-AHMG。用Pme I /￡coR I 分別酶切pMECA-AHMG和p4366 (美國David Stillman饋贈)，將ADH-HMG序列克隆 到p4366上，得到含Padh-HMG-Tadh的酵母整合裁體p4366-HMG (圖19-20)。
實施例10: HMG-CoA還原酶基因酵母整合子的篩選
用JVW I將p4366-HMG線性化，轉(zhuǎn)化釀酒酵母WHT A squ，然后在含5-FOA(即 5-氟乳清酸)的培養(yǎng)基上反選擇。5-FOA是乳清酸的結(jié)構(gòu)類似物，它生成對細(xì)胞具有 毒害作用的5-氟脲嘧啶核苷酸。因此，在補(bǔ)加了 5-FOA的培養(yǎng)基中，原養(yǎng)型菌株不 能生長，而Ura-突變株不生成具有毒性的5-氟脲嘧啶核苷酸。因而，可以用補(bǔ)加Um 的5-FOA的平板篩選脲嘧啶缺陷型突變株。得到整合了 HMG-CoA表達(dá)盒的酵母整 合子WHTAsqu-H。
實施例ll:入DNA序列的克隆
根據(jù)酵母人DNA序列，設(shè)計合成兩對引物，l:5，-AGATCTggaacctctaatcattcgcttt-3，
2: 5'-GAGCTCGCGGCCGCaggtataatgcaagtacggtcg陽3' 3:5， -CGGCCGGCGGCCgcacgcagagaaacctctcttt-3' 4: 5 ， -CCGCGGaacgaacgagaccttaacctact-3'
引物l/2配對，酵母DNA為模板，PCR擴(kuò)增(95°C， 5min; 95°C，. 30S， 50°C， 2min， 72°C， 2min， 30 cycles; 72°C， 7min; 4°C， +°°)，得到一條長是U37bp的條帶(圖 21)， TA克隆，得到載體pMD-入l，送樣測序，與已經(jīng)發(fā)表的人DNA序列完全一樣。 引物3/4配對，酵母DNA為模板，PCR擴(kuò)增(95°C， 5min; 95°C， 30S， 50°C， 2min， 72°C， 2min， 30 cycles; 72°C， 7min; 4°C， +°°)，得到一條長是llllbp的條帶(圖 21)， TA克隆，得到載體pMD-A2，送樣測序，與己經(jīng)發(fā)表的入DNA序列完全一樣 (SEQIDNO: 53)。
實施例12: FPP-ASM融合基因酵母整合載體的構(gòu)建
根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的酵母FPP合酶基因(GenBank注冊號J05091)設(shè)計合成兩條引 物，F(xiàn)PP-N ( 5，-GTTAACatggcttcagaaaaagaaat-3，)和FPP-C ( 5,-GGATCCtttgc ttctcttgtaaactt-3，)。以FPP-N/FPP-C為引物，質(zhì)粒pMD-FPP為模板，PCR擴(kuò)增(95°C， 5min; 95°C， 30S， 50°C， 1.5min， 72°C， L5min， 30 cycles; 72°C， 7min; 4°C， + ~)，得到一條長是1059bp的條帶，TA克隆，得到載體pMDFPPNC，送樣測序，與已 經(jīng)發(fā)表的FPP合酶基因完全一樣，而且在N末端和C末端分別加上了Wpa I和5"wH I 位點(diǎn)(圖22)。
用//戸I /5amH I雙酶切pMDFPPNC，克隆到同樣用7/戸I /^fl附H I雙酶切的 pGEMADH1346中，接著用5fl/wH I /A7w I分別酶切pGEMADHFPP和pMECA-ASM， 將ASM基因克隆到pGEMADHFPP中，得到pAFSm (ADH1346-FPP-ASM)載體(圖 23-25)。在pAFSm載體中，包含了完整的FPP-ASM融合基因，而且在該融合基因 上游是ADH啟動子，其下游是ADH終止子。
用1 /￡coR I酶切p4366和pMECA，連接得到pMECAURA。然后用JiTlIASflc I酶切pMECAURA，用S， I /^c I酶切pAFSm，連接得到載體pAFSmU(圖26-27)。 用Bg/ II / Sac I分別酶切pAFSmU和pMD-入1 ，連接形成一個含有一條入DNA臂的 載體pAFSmU-入1 (圖28-30);用S附a I /尸對I酶切pMECA和pMD-入2，連接形成 pMECA入2 (圖31);用&cII分別酶切pAFSmU-M和pMECAA2，連接形成一個 含有兩條人DNA臂的酵母整合載體pAFSmU-A (圖32)。
實施例13: HMG-CoA/FPP-ASM融合基因酵母整合子的篩選 用I酶切pAFSmU-入，將其線性化，通過醋酸鋰方法導(dǎo)入釀酒酵母WHTA squ-H中，將轉(zhuǎn)化后的釀酒酵母在含5-FOA的培養(yǎng)基上反選擇。5-FOA是乳清酸的結(jié) 構(gòu)類似物，它生成對細(xì)胞具有毒害作用的5-氟脲嘧啶核苷酸。因此，在補(bǔ)加了 5-FOA 的培養(yǎng)基中，原養(yǎng)型菌株不能生長，而Um-突變株不生成具有毒性的5-氟脲嘧啶核 苷酸。因而，可以用補(bǔ)加Um的5-FOA的平板篩選脲嘧啶缺陷型突變株。挑取轉(zhuǎn)化 子在非選擇性的YPD(酵母提取物，10g/l虔白胨，20g/l滯萄糖，20g/l贈養(yǎng)基上培養(yǎng)，
然后鋪在含5-FOA的YPD平板上，挑取陽性轉(zhuǎn)化子接種到不含脲嘧啶的SC (無氨 基酵母氮源，6.7g/l;葡萄糖，20g/l; Dropout mix,0.2%;固體補(bǔ)加2%的瓊脂粉)平板 上確認(rèn)。確認(rèn)不長的整合子命名為WHT A squ-HFA。
實施例14:酵母WHT A squ-HFA陽性整合子的發(fā)酵培養(yǎng)
挑取WHT A squ-HFA陽性整合子在不含脲嘧啶的SC培養(yǎng)棊中脅迫培養(yǎng)2天， 然后按5-10%的接種量轉(zhuǎn)接到Y(jié)PGA培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)2天。
實施例15:酵母WHT △ squ-HFA發(fā)酵產(chǎn)物的GC-MS鑒定
收集WHTAsqu-HFA陽性整合子酵母發(fā)酵物，將酵母發(fā)酵物冷干，然后在冷干的 菌體和發(fā)酵物中加入甲醇，震蕩培養(yǎng)3-4天，過濾，濾液旋轉(zhuǎn)蒸干，然后用水溶解， 加入正己烷，萃取三遍，萃取液旋轉(zhuǎn)蒸干，用少量的正己烷溶解；正己烷萃取后剩余 的液體用乙酸乙酯萃取，萃取液旋轉(zhuǎn)蒸干，用少量的乙酸乙酯溶解。分別將發(fā)酵產(chǎn)物 的正己垸萃取液和乙酸乙酯萃取液進(jìn)行GC-MS,結(jié)果檢測到了紫穗槐-4,ll-二烯的生 成(圖33)。
實施例16: P450-P450還原酶融合基因的克隆
根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的青蒿P450 (CYP71AV1)和P450還原酶CPR基因設(shè)計兩對引物 P4501( 5，- GTTAACATGGCACTCTCACTGACCACT-3， )；P4502 ( 5， -GGATCCCCTAGGTGGAACGAGTAACAAC-3， ) ； rel(5，-
CCTAGGGCTatgcaatcaacaactt-3，) ； re2(5，- CTCGAGttaccatacatcacggagatat-3，)。 以 P4501/P4502為引物，pMD-P450為模板，PCR擴(kuò)增(95°C， 5min; 95。C， 30S， 48°C， 1.5min， 72°C， 1.5min, 30 cycles; 72°C， 7min; 4'C， +°°),得到一條長是1467bp 的條帶，TA克隆，得到載體pMDP450-l，送樣測序，與pMDP450的測序結(jié)果一致， 而且在N末端加上了/f/7al位點(diǎn)，C末端依次加上別M I和5amH I位點(diǎn)(圖34)。以 rel/re2為引物，pMDre為模板，PCR擴(kuò)增(95°C， 5min; 95°C， 30S， 48°C， 2.1min， 72°C， 2.1min， 30 cycles; 72°C， 7min; 4'C， +°°),得到一條長是2113bp的條帶， TA克隆，得到載體pMDre-l，送樣測序，與pMDre的測序結(jié)果一致，而且在N末端和 C末端分別加上了說w I和屈o I位點(diǎn)(圖35 )。分別用I /SamH I酶切 pGEMADH1346和pMDP450-l，連接成載體pADHP450，然后分別用說w I/^ o I酶切 pADHP450和pMDre-l，連接成載體pADHP450re(圖36)，其中包含有融合的P450-P450 還原酶基因，而且該融合基因上游有ADH啟動子，下游是ADH終止子。
實施例17: SDNA序列的克隆
根據(jù)酵母SDNA序列設(shè)計引物，Sl (5'-TCTAGAAGATCTGGCGCGCCATTTA AATgtaagagataggttaattt-3 ， ) ； 5 2(5，隱ACGCGTGCGGCCGCtctactttcgcttaagctgctg-3 *); S3 (5，-CGGCCGGCGGCCGCaaatgaggcggatatttgtt-3，)； S4 (5，-CCGCGGtgtaga gaat gtggattttgatg-38)。以S1/S2為引物，酵母基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增(95°C， 5mi
n; 95°C， 30S， 60°C， 0.5min， 72°C， 0.5min， 30 cycles; 72°C， 7min; 4°C， +~)， 得到一條長是348bp的條帶(圖8)， TA克隆，得到載體pMDSl，送樣測序，與己經(jīng) 發(fā)表的測序結(jié)果一致，而且在N末端加上了^&fl I ， 5g/H， ^ cI和Swfll位點(diǎn)，C末 端依次加上M n和AffwI位點(diǎn)。以S3/S4為引物，酵母基因組DNA為模板，PCR擴(kuò) 增(95°C， 5min; 95°C， 30S， 55°C， 0.5min， 72°C， 0.5min， 30 cycles; 72°C， 7mi n; 4'C， + >)，得到一條長是348bp的條帶(圖8)， TA克隆，得到載體pMDS2，送 樣測序，與已經(jīng)發(fā)表的測序結(jié)果一致，而且在N末端加上了^WZI和M^I位點(diǎn)，C末 端依次加上SacII位點(diǎn)(SEQ ID NO: 52 )。
實施例18: CYP71AV1-P450還原酶酵母整合載體的構(gòu)建
用力a I /Mw I酶切pADHP450re和pMD S 1 ，連接成載體pADHP450re S 1;用萬對Z I /Sac II酶切pADHP450re S l和pMD S 2，連接成載體pADHP450re S ;然后用5g/H I分別酶切pADHP450re S和pMECAURA，連接成酵母整合表達(dá)載體pAP450re SURA(圖37)，其中包含CYP71AV1-P450還原酶融合基因，URA標(biāo)記和S同源整合 片段。
實施例19: HMG-CoA/FPP-ADS/CYP71AVl-P450還原酶融合基因酵母整合子的
篩選
用iVW I線性化pAP450re S URA，通過醋酸鋰法轉(zhuǎn)化釀酒酵母WHT A squ-HFA， 將轉(zhuǎn)化后的釀酒酵母在不含尿嘧啶的SC平板上篩選，挑取轉(zhuǎn)化子在非選擇性的YPD 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，然后鋪在含5-FOA的YPD平板上，挑取陽性轉(zhuǎn)化子接種到不含尿嘧啶 的SC平板上確認(rèn)。確認(rèn)不長的整合子命名為WHTAsquFPR。
實施例20:酵母WHT A squFPR陽性整合子的發(fā)酵培養(yǎng)
挑取WHT A squFPR陽性整合子在不含尿嘧啶的SC培養(yǎng)基中脅迫培養(yǎng)2天，然 后按5-10%的接種量轉(zhuǎn)接到Y(jié)PG培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)2天。
實施例21:酵母WHT A squFPR發(fā)酵產(chǎn)物的鑒定
收集WHTAsquFPR陽性整合子酵母發(fā)酵物，將酵母發(fā)酵物冷干，然后在冷干的 菌體和發(fā)酵物中加入含1.2]\4山梨醇的1 3 'CL(pH9.5)堿化菌體，28。C震蕩培養(yǎng)3-4天， 然后加入HC1，使pH-2.0，然后用乙酸乙酯萃取，萃取液旋轉(zhuǎn)蒸干，取少量進(jìn)行傅立 葉轉(zhuǎn)換回旋共振質(zhì)譜檢測，結(jié)果檢測到了青蒿酸的生成(圖38)。
<110> <120> <160> <170>
<210> <211> <212> <213>
<400>
1
61
121
181
241
301
361
421
481
541
601
661
721
781
841
卯l
961
1021
1081
1141
1201
1261
1321
1381
1441
1501
1561
1621
<210> <211> <212>
序 列 表
中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所 生產(chǎn)紫穗槐-4，11-二烯和青蒿酸的方法
Patentln version 3.2
1
1641 DNA
人工序列
1
GGTTACCCAATGTCTTTGTAA
2
547 PRT <213>人工序列
<400> 2
KDNFTRMGDEYKHLIKTLLGYPMSLZ
<210> <211> <212> <213>
<210> <211> <212> <213>
<210> <211> <212> <213>
<400>
<210> <211> <212> <213>
3
59
正向引物F1 人工序列
<400> 3
4 59
反向引物R1 人工序列
<400> 4
59
正向引物F2 人工序列
6
59
反向引物R2 人工序列
<400> 6
<210> <211> <212> <213>
7
59
正向引物F3 人工序列
<400>
<210> <211> <212> <213>
8
59
反向引物R3 人工序列
<400> 8
<210> <211> <212> <213>
9
59
正向引物F4 人工序列
<400> 9
<210> <211> <212> <213>
10 59
反向引物R4 人工序列
<400> 10
<210> 11
<211> 59 <212>正向引物F5 <213>人工序列
<400> 11
<210> 12
<211> 59 <212>反向引物R5 <213>人工序列
<400> 12
<210> <211> <212> <213>
13 59
正向引物F6 人工序列
<400> 13
<210> <211> <212> <213>
14 59
反向引物R6 人工序列
<400> 14
<210> <211> <212> <213>
15 59
正向引物F7 人工序列
<400> 15
<210> 16 <211> 59<212>反向引物R7 <213>人工序列
<400> 16
<210> 17
<211> 59 <212>正向引物F8 <213>人工序列
<400> 17
<210> 18
<211> 59 <212>反向引物R8 <213>人工序列
<400> 18
<210> 19
<211> 59 <212>正向引物F9 <213>人工序列
<400> 19
<210> 20
<211> 59 <212>反向引物R9 <213>人工序列
<400> 20
<210> 21
<211> 59
<212>正向引物FIO <213>人工序列
<400> 21
<210> <211> <212> <213>
22 59
反向引物RIO 人工序列
<400> 22
<210> <211> <212> <213>
23 59
正向引物Fll 人工序列
<400> 23
<210> <211> <212> <213>
24 59
反向引物Rll 人工序列
<400> 24
<210> <211> <212> <213>
25 59
正向引物F12 人工序列
<400> 25 <210> 26
<211> 59
<212>反向引物R12 <213>人工序列
<400> 26
<210> <211> <212> <213>
27 59
正向引物F13 人工序列
<400> 27
<210> <211> <212> <213>
28 59
反向引物R13 人工序列
<400> 28
<210> <211> <212> <213>
29 59
正向引物F14
人工序列
<400> 29
<210> <211> <212> <213>
30 59
反向引物R14 人工序列<400> 30
<210> <211> <212> <213>
31 59
正向引物F15 人工序列
<400> 31 5'-
<210> <211> <212> <213>
32 59
反向引物R15
人工序列
<400> 32
<210> <211> <212> <213>
33 59
正向引物F16 人工序列
<400> 33
<210> <211> <212> <213>
34 59
反向引物R16 人工序列
<400> 34
<210> <211> <212>
35 59
正向引物F17
<213>人工序列
<400> 35
<210> <211> <212> <213>
36 59
反向引物R17 人工序列
<400> 36
<210> 37
<211> 59
<212> 正向引物F18
<213>人工序列
<400> 37 5'
<210> 38
<211> 59
<212>反向引物R18 <213>人工序列
<400> 38
<210> <211> <212> <213>
39 59
正向引物F19 人工序列
<400> 39
<210> 40
<211> <212> <213>
59
反向引物R19 人工序列
<400> 40
<210> <211> <212> <213>
41 59
正向引物F20 人工序列
<400> 41
<210> <211> <212> <213>
42 59
反向引物R20 人工序列
<400> 42
<210> <211> <212> <213>
43 59
正向引物F21 人工序列
<400> 43
<210> <211> <212> <213>
44 35
反向引物R21 人工序列
<400> 44
5'-ctcgagTTACAAAGACATTGGGTAACCCAACAATG-3'<210> 45
<211> 1064
<212> FPP合酶基因 <213>釀酒酵母
<400> 45
1021TGCGTTCTTG AACAAAGTTT ACAAGAGAAG CAAATAGGTC GACC
<210> 46
<211> 1597
<212> HMG-CoA還原酶基因 <213>釀酒酵母
<400> 46
1561TAAACTTAGT CATACGTCAT TGGTATTCTC TTGCTAG
<210> 47
<211> 2496
<212>酵母鯊烯合酶基因的反向序列 <213>釀酒酵母
<400> 47 2461GGCAATCAAA TCTGACCTTT TATGGTATTG CGTTAA
<210> 48
<211> 1552
<212> CYP71AV1基因
<213> 青蒿(Artemisiaannua"
<400> 48
<formula>formula see original document page 35</formula> 2221 CTCCCG
<210> 50
<211> 2706
<212> FPP-ADS融合基因 <213>人工序列
<400> 50
<210> 51
<211> 3582
<212> CYP71AV1-P450還原酶融合基因
<213> 人工序列
<210> 52
<211> 696 <212>酵母S序列 <213>釀酒酵母
<400> 52
661 ATCCCAACAA TTACATCAAA ATCCACATTC TCTACA
<210> 53
<211> 2248
<212> 酵母ADNA序列
<213>釀酒酵母
<400> 53
2221TATTTAGTAG GTTAAGGTCT CGTTCGTT
權(quán)利要求
1.一種在釀酒酵母細(xì)胞中生產(chǎn)紫穗槐-4，11-二烯的方法，包括下列步驟i)將HMG-CoA還原酶基因?qū)脶劸平湍讣?xì)胞中的第一位點(diǎn)；ii)將FPP合酶基因和紫穗槐-4，11-二烯合酶基因一起導(dǎo)入釀酒酵母細(xì)胞中的第二位點(diǎn)，即得紫穗槐-4，11-二烯酵母工程菌；iii)培養(yǎng)步驟(ii)中的紫穗槐-4，11-二烯酵母工程菌，并純化紫穗槐-4，11-二烯；其中所述第一位點(diǎn)和第二位點(diǎn)選自δ序列、λDNA序列和HO位點(diǎn)，且彼此不同。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的第一位點(diǎn)是HO位點(diǎn)，第二位點(diǎn)是ADNA 序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的HMG-CoA還原酶基因、FPP合酶基因和 紫穗槐-4,11-二烯合酶基因分別與強(qiáng)啟動子可操作的連接，所述啟動子優(yōu)選為ADH 或GAPDH啟動子。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的FPP合酶基因和紫穗槐-4,11-二烯合酶 基因之間插入有一段連接序列，優(yōu)選是編碼Gly-Ser-Gly的GGATCCGGA;所述的 CYP71AV1 P450基因和P450還原酶CPR基因之間插入有一段連接序列，該序列優(yōu)選 是編碼Pro-Arg-Ala的CCTAGGGCT。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1一4中任意一項所述的方法，其中所述的紫穗槐-4,11-二烯合酶基 因含有SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。
6. —種在釀酒酵母細(xì)胞中生產(chǎn)青蒿酸的方法，包括下列步驟i)根據(jù)權(quán)利要求1中步驟i)和ii)所述構(gòu)建紫穗槐-4,11-二烯酵母工程菌； i i)將CYP71 AV1 P450基因和P450還原酶CPR基因一起導(dǎo)入釀酒酵母細(xì)胞中的 第三位點(diǎn)，即得青蒿酸酵母工程菌；iM)培養(yǎng)步驟(ii)中的青蒿酸酵母工程菌，并純化青蒿酸； 其中所述第三位點(diǎn)選自S序列、入DNA序列和H0位點(diǎn)，與權(quán)利要求1中所述的第一位點(diǎn)或第二位點(diǎn)相同或不同。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述的第三位點(diǎn)是S序列。，
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述的HMG-CoA還原酶基因、FPP合酶基因和 紫穗槐-4,11-二烯合酶基因、CYP71AV1 P450基因和P450還原酶CPR基因分別與強(qiáng) 啟動子可操作的連接，所述啟動子優(yōu)選為ADH或GAPDH啟動子。
9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述的FPP合酶基因和紫穗槐-4,"-二烯合酶 基因之間插入有一段連接序列，優(yōu)選是編碼Gly-Ser-Gly的GGATCCGGA;所述的 CYP71AV1 P450基因和P450還原酶CPR基因之間插入有一段連接序列，該序列優(yōu)選 是編碼Pro-Arg-Ala的CCTAGGGCT。
10. 根據(jù)權(quán)利要求6~9中任意一項所述的方法，其中所述的紫穗槐-4,11-二烯合酶 基因含有SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。
11. 一種生產(chǎn)青蒿酸的釀酒酵母"acc/^ram;;c^cwewWfle)，其通過下列步驟獲得i) 根據(jù)權(quán)利要求l中步驟i)和ii)所述構(gòu)建紫穗槐-4,ll-二烯酵母工程菌；ii) 將CYP71 P450基因和P450還原酶基因一起導(dǎo)入釀酒酵母細(xì)胞中的第三位點(diǎn)； 其中所述第三位點(diǎn)選自S序列、入DNA序列和HO位點(diǎn)，與權(quán)利要求1中所述的第一位點(diǎn)或第二位點(diǎn)相同或不同。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11的釀酒酵母(saccharomyces cerevisae)，其生物保藏編號為 CGMCC No.1861。
13. —種在釀酒酵母細(xì)胞中生產(chǎn)紫穗槐-4,11-二烯的方法，包括下列步驟i) 將HMG-CoA還原酶基因和FPP合酶基因一起以附加體形式導(dǎo)入釀酒酵母細(xì)胞中；ii) 將紫穗槐-4,11-二烯合酶基因以附加體形式導(dǎo)入釀酒酵母細(xì)胞中；iii) 培養(yǎng)步驟(ii)中的紫穗槐-4,"-二烯酵母工程菌，并純化紫穗槐-4,"-二烯。
14. 一種在釀酒酵母細(xì)胞中生產(chǎn)青蒿酸的方法，包括下列步驟 i )將HMG-CoA還原酶基因和FPP合酶基因一起以附加體形式導(dǎo)入釀酒酵母細(xì)胞中；ii) 將紫穗槐-4,11-二烯合酶基因和CYP71AV1 P450基因以附加體形式導(dǎo)入釀酒 酵母細(xì)胞中；iii) 培養(yǎng)步驟(ii)中的青蒿酸酵母工程菌，并純化青蒿酸。
15. —種生產(chǎn)青蒿酸的釀酒酵母(&07力anM7/ces cerei^/s/ae)，其通過下列步驟獲 得i)將HMG-CoA還原酶基因和FPP合酶基因一起以附加體形式導(dǎo)入釀酒酵母細(xì)胞中；M)將紫穗槐-4,11-二烯合酶基因和CYP71AV1 P450基因以附加體形式導(dǎo)入釀酒 酵母細(xì)胞中。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15的釀酒酵母(5^cc/73廠o歷ycesce廠ei^/5/ae)，其生物保藏編號為 CGMCC No.1857。
17. —種優(yōu)化的DNA序列，其含有SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。
18. —種DNA載體，其包含權(quán)利要求17所述優(yōu)化的DNA序列。
19. 一種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求17所述的DNA載體。
20. 權(quán)利要求19所述的宿主細(xì)胞，其是釀酒酵母細(xì)胞。
21. 權(quán)利要求20所述的宿主細(xì)胞，其生物保藏編號為CGMCC No.1861。
22. 權(quán)利要求20所述的宿主細(xì)胞，其生物保藏編號為CGWICC No.1857。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種在釀酒酵母細(xì)胞中生產(chǎn)紫穗槐-4，11-二烯的方法，包括i)將HMG-CoA還原酶基因?qū)脶劸平湍讣?xì)胞中的第一位點(diǎn)；ii)將紫穗槐-4，11-二烯合酶基因和FPP合酶基因一起導(dǎo)入釀酒酵母細(xì)胞中的第二位點(diǎn)，即得紫穗槐-4，11-二烯酵母工程菌；iii)培養(yǎng)步驟ii)中的紫穗槐-4，11-二烯酵母工程菌，并純化紫穗槐-4，11-二烯；其中所述第一位點(diǎn)和第二位點(diǎn)選自δ序列、λDNA序列和HO位點(diǎn)，且彼此不同。另外，本發(fā)明還提供了一種通過進(jìn)一步將CYP71AV1 P450基因和P450還原酶CPR基因?qū)脶劸平湍讣?xì)胞中的第三位點(diǎn)來獲得青蒿酸酵母工程菌、從而生產(chǎn)青蒿酸的方法，其中所述第三位點(diǎn)選自δ序列、λDNA序列和HO位點(diǎn)，與上述第一位點(diǎn)和第二位點(diǎn)相同或不同。
文檔編號C12N1/19GK101338309SQ20071018792
公開日2009年1月7日 申請日期2007年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月15日
發(fā)明者孔建強(qiáng), 戴均貴, 平 朱, 偉 王, 王麗娜, 程克棣, 鄭曉東 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所