專利名稱：一種異養(yǎng)硝化菌的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于污水處理領(lǐng)域，具體涉及一種異養(yǎng)硝化菌的篩選方法。
背景技術(shù)：
廢水的生物脫氮是目前水處理領(lǐng)域中研究的熱點(diǎn)問題，長期以來人們一直 認(rèn)為硝化菌是由一些自養(yǎng)菌組成。但是，當(dāng)環(huán)境條件不適合自養(yǎng)硝化菌生長時(shí)，
也會(huì)生長一些具有硝化活性的異養(yǎng)微生物。例如早在1894年Stutzer和Hartleb描述 過一株真菌的異養(yǎng)硝化現(xiàn)象(Stutzer H， Hartleb R.Uber nitrabildung zentralbl bakteriol parasitonkd infktionskr. Hyg Abt 1 Oring Reihe A, 1894， 22:701)。從那以 后，許多報(bào)道都證實(shí)了銨鹽生成硝酸鹽/亞硝酸鹽的過程不僅存在于自養(yǎng)的氨氧 化菌(如M^wowowaO或亞硝酸鹽氧化菌(如7Wto^cfe。中，許多真菌和異養(yǎng) 菌中也普遍存在這禾中ft謝路斗5 (Johnsrud S C., Heterotrophic nitrification in acid forest soil. Holarctic Ecology, L, 1978， 27-30; Robertson A. L,， Dalsgaard T" Revsbach N. R and Kuenen G. J. Confirmation of aerobic denitrification in batch cultures using gas chromatography and N mass spectrometry. FEMS Microbiology Ecology, 1995, 18， 113-120.)。對異養(yǎng)硝化菌脫氮作用的研究，是對傳統(tǒng)硝化-反 硝化理論的豐富與突破(溫東輝，唐孝炎.異養(yǎng)硝化及其在污水脫氮中的作用. 環(huán)境污染與防治,2003, 25 (5): 283-285;林燕，孔海南，何義亮，等.異養(yǎng)硝化細(xì) 菌的分離及其脫氮特性試驗(yàn)研究.環(huán)境科學(xué),2006,27(2):324-328)。與傳統(tǒng)的自 養(yǎng)硝化菌相比，雖然單位生物量的異養(yǎng)菌氧化銨鹽的速率比自養(yǎng)菌要慢2-3個(gè)數(shù) 量級，但異養(yǎng)菌的生長速率快，對環(huán)境的適應(yīng)能力也強(qiáng)，其總體的氧化銨鹽的 速率并不比自養(yǎng)菌慢。在某些環(huán)境中異養(yǎng)硝化作用能與自養(yǎng)硝化作用相當(dāng)甚至 超出(方蘋，范偉平，沈珈琦，等.氨氮脫除的生物技術(shù)研究進(jìn)展.南京工業(yè)大學(xué)學(xué)J艮，2003， 25(5): 107-110; Brierley EDR， Wood M. Heterotrophic nitrification in an acid forest soil: isolation and characterisation of a nitrifying bacterium. Soil Biol. Biochem,2001，33: 1403-1409)。雖然目前對異養(yǎng)硝化作用仍有很多機(jī)理未得到 揭示，但異養(yǎng)硝化作用的重要性日益受到關(guān)注，特別是具有好氧反硝化特性的 異養(yǎng)硝化細(xì)菌的發(fā)現(xiàn)，為污水脫氮引入了全新的概念，從理論上進(jìn)一步增加了 污水硝化與反硝化在一個(gè)單元內(nèi)同步進(jìn)行的可能性，有望克服傳統(tǒng)處理工藝在 處理效率與經(jīng)濟(jì)適用兩方面的矛盾，實(shí)現(xiàn)廢水高效而經(jīng)濟(jì)的脫氮。
中國專利CN1884480A描述了一種利用牛肉膏培養(yǎng)基進(jìn)行富集，然后從牛肉 膏蛋白胨固體培養(yǎng)基中挑取單菌落，再順序接種于氨化培養(yǎng)基和亞硝化培養(yǎng)基 中進(jìn)行培養(yǎng)純化獲得異養(yǎng)硝化菌的過程。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種篩選異養(yǎng)硝化菌的方法，用于高氨氮工業(yè)廢水生 化處理過程，以解決傳統(tǒng)廢水生化處理過程中自養(yǎng)硝化菌生長緩慢帶來的高氨 氮廢水處理難的問題。
本發(fā)明異養(yǎng)硝化菌的篩選方法包括以下內(nèi)容 (1 )通過逐步提高氨氮負(fù)荷的方法培養(yǎng)能夠耐受高氨氮負(fù)荷的富集硝化菌 的活性污泥；
(2) 從富集硝化菌的活性污泥中分離純化異養(yǎng)硝化菌。
對于步驟(2)分離純化的異養(yǎng)硝化菌可以進(jìn)行性能考察和種屬鑒定
(3) 考察分離純化的異養(yǎng)硝化菌的硝化作用；
(4) 分離純化的異養(yǎng)硝化菌的種屬鑒定。
其中步驟(1)富集硝化菌活性污泥的培養(yǎng)過程如下采用間歇式活性污泥 法，通過逐漸提高培養(yǎng)液氨氮濃度的方法來進(jìn)行富集，所用富集培養(yǎng)液包括微 量元素Fe、 Mg、 Na和K及緩沖液，所述的富集培養(yǎng)液中還包括Ca^， C^+濃度 為0.01 0.05g/L， Ca2+是采用CaCl2的形式加入的。其中氨氮(NH3-N)初始濃度為50mg/L 200mg/L，最終濃度為300 mg/L 1200mg/L，優(yōu)選為500 mg/L 1000mg/L;化學(xué)需氧量(COD鉻法)^200mg/L。
本發(fā)明方法步驟(1)中所述的富集培養(yǎng)液中，微量元素Fe、 Mg、 Na和K可 采用常規(guī)的用量和常用物質(zhì)引入，優(yōu)選如下Fe是以FeS04 7^0的形式加入的， Fe2+的濃度為2mg/L 14 mg/L，最好為3 11 mg/L; Mg是以MgS04 '7&0的形 式加入的，Mg"濃度為10 20m g/L; Na+是以NaCb、 Na2C03禾n^NaHC03的 形式加入，Na+濃度為200 1000mg/L; K是以KH2P04禾P^K2HP04的形式加入， K+濃度為20 70mg/L;所述的緩沖液為KH2 P04、 K2H P04和NaHC03中的一種 或多種，其濃度為50 300mg/L。
步驟(1)所述的富集培養(yǎng)液中所需的COD可通過加入葡萄糖或甲醇，以及 其它一些含碳有機(jī)化合物，具體的加入量可根據(jù)所處理廢水中的COD來確定， 與廢水COD值相適應(yīng)。所述的活性污泥可以選取本領(lǐng)域常用的具有硝化作用的 活性污泥，優(yōu)選取自煉油污水處理廠的活性污泥和催化劑污水處理廠的活性污 泥。所述硝化細(xì)菌富集培養(yǎng)的條件為溫度為20 30。C; pH為6.0 9.0，優(yōu)選 6.5~8.0; SV (污泥沉降比)為15% 25%; DO (溶解氧)為大于2mg'L一卜 優(yōu)選為2 10 mg丄—、通過逐漸提高培養(yǎng)液氨氮濃度的方法培養(yǎng)富集硝化菌的活 性污泥，具體如下每次加入培養(yǎng)液后，當(dāng)氨氮濃度降至10mg/L以下，最好是 用GB 7479蒸餾滴定法檢測不出水中氨氮濃度，即低于0.2mg/L時(shí)，提高預(yù)加入 培養(yǎng)液中氨氮的濃度，其提高幅度為50 200mg/L，直至與所需處理廢水中氨氮 濃度相適應(yīng)。
步驟(2)所述從富集硝化菌的活性污泥中分離純化異養(yǎng)硝化菌的培養(yǎng)基 (HNM)成分為每升含有氨氮0.4 1.5g/L，可以是一切可以作為微生物氮源的
化合物，如(NH4)2S04，尿素等，這里首選(NH4)2S04作為氮源；碳源與氮源重量
比為5 15，碳源可以選用一切微生物可以利用的含C有機(jī)化合物，如甘油，葡 萄糖，甲醇，琥珀酸鈉等，這里首選甘油作為碳源。營養(yǎng)鹽溶液20 90ml (固 體培養(yǎng)基加入1.2% 2%的瓊脂)。營養(yǎng)鹽溶液每升含有K2HP04 3 8 g，MgS04 *7H20 2 5 g， NaCl 2 5 g， Fe '7H20 0.02 0.08 g， MgS04 '4H20 0.02 0.08 g， EDTA2 5 g， EDTA作為避免產(chǎn)生沉淀的陽離子絡(luò)合劑。操作過程如下: 從富集硝化菌的活性污泥中取泥水懸浮液5ml，利用超聲細(xì)胞破碎儀把呈絮狀的 活性污泥打散，靜置30min，取上層液體0.5-2ml接種于100ml HNM培養(yǎng)基中 (30°C， 200rpm)培養(yǎng)24 96h，其間定期利用5-l(P/。(w/v)滅菌的NaHC03調(diào) 節(jié)培養(yǎng)物的pH為7.0 8.5。然后將培養(yǎng)物樣品稀釋103 108倍，將稀釋液按 1% 5%的比例轉(zhuǎn)接于新鮮的HNM培養(yǎng)基中，30°C ， 200rpm振蕩培養(yǎng)24 96h， 檢測氨氮濃度降低最明顯的樣品涂布于HNM固體培養(yǎng)平皿表面，3(TC培養(yǎng)24 96h，挑取單菌落，作為初篩菌劃在斜面上保存在4。C冰箱備用。
步驟(3)所述考察分離純化的異養(yǎng)硝化菌的硝化作用操作過程如下從冰 箱保存的菌種斜面上各挑取1環(huán)菌泥接種于100ml新鮮的HNM培養(yǎng)基中，30 °C， 200rpm振蕩培養(yǎng)24 96h至對數(shù)末期，保持無菌狀態(tài)下收集菌體(采用離 心或過濾等一切可以分離菌體的固液分離手段，這里首選離心)，重新懸浮于 200ml滅菌的HNM培養(yǎng)基中(可以選擇加C源的HNM或不加C源的HNM)， 30°C， 200rpm振蕩培養(yǎng)。每隔一定時(shí)間(如24h)換用新鮮的HNM培養(yǎng)基， 并對已處理的HNM檢測氨氮濃度，亞硝酸鹽氮濃度和硝酸鹽濃度。對加C源 的HNM培養(yǎng)基，氨氮濃度下降最多，而且亞硝酸鹽氮和硝酸鹽濃度積累最少的 菌株為最優(yōu)菌株；而對不加C源的HNM培養(yǎng)基，由于沒有C源，不能實(shí)現(xiàn)同 步硝化與反硝化，氨氮降解的速率會(huì)相對較快，但亞硝酸鹽氮濃度或硝酸鹽濃 度會(huì)同步積累。
步驟(4)所述分離純化的異養(yǎng)硝化菌的種屬鑒定采用一切微生物學(xué)已知的 細(xì)菌或真菌鑒定的方法，如生理生化檢測和16S/18S rDNA分析方法等。
所述的富集培養(yǎng)液中，加入適量的Ca2、 一方面為硝化細(xì)菌生長提供微量 元素，另一方面由于硝化細(xì)菌具有附著于固體顆粒表面生長的特性以及硝化細(xì) 菌的比重輕易浮于水面的特點(diǎn)，所以生成一定量的CaC03沉淀會(huì)增大硝化細(xì)菌的 附著表面，也減少了硝化細(xì)菌在換水過程中的流失。此外，以(^2+的形式加入，還可以在調(diào)節(jié)培養(yǎng)液pH值過程中起到緩沖作用。但C^+的加入量不能過高，否 則生成大量的CaC03破壞硝化細(xì)菌的生長環(huán)境。
本發(fā)明針對氨氮含量高(NH3-N含量2200mg/L)、有機(jī)物含量少(COD 含量低于200mg/L)的廢水的特點(diǎn)，通過逐漸提高基質(zhì)氨氮質(zhì)量濃度的方法，并 采用適宜的以無機(jī)鹽為主要組分的培養(yǎng)液，在不加入其它碳源或只加入少量有 機(jī)物的情況下，使污泥中的原生動(dòng)物、后生動(dòng)物、真菌以及碳化菌等雜菌的生 長明顯受到抑制，有利于硝化細(xì)菌成為優(yōu)勢菌群，并耐受越來越高的氨氮濃度， 最終達(dá)到處理濃度高達(dá)1200mg/L、容積負(fù)荷高達(dá)卯OgNH3-N/m^d的氨氮廢水， 使污水中高濃度氨氮能夠降到10mg/L以下。本發(fā)明方法可以獲得純的異養(yǎng)硝化 菌，有利于提高氨氮污水的有效處理，具有良好的應(yīng)用前景。


圖1為實(shí)施例1硝化污泥富集培養(yǎng)過程脫氨氮情況。 圖2為實(shí)施例3廢水脫氮處理效果情況。 圖3為實(shí)施例4高氨氮廢水處理效果情況。 其中圖2和圖3中
- -為殘留的NH3-N -參-為產(chǎn)生的N02-N
-■-為產(chǎn)生的N03-N -▲-為NH3-N去除率
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l硝化污泥富集
采用的硝化菌富集裝置反應(yīng)池底設(shè)曝氣頭，氣升式攪拌；反應(yīng)體系有效體 積2.2L，每24h停止曝氣靜置30min，換1.5L新水；活性污泥來自撫順石油三 廠廢水處理車間曝氣池，初始SV30為30。/。；培養(yǎng)參數(shù)T (溫度)25 3(TC; pH:6.5 8.5;溶氧DO2.0 mg/l;緩慢加入卯g/L的NaHC03溶液補(bǔ)充硝化菌降 氨氮消耗的堿度。氨氮進(jìn)水為人工配制的富集培養(yǎng)液，逐漸提高富集培養(yǎng)液中的NHs-N濃度，富集能夠耐受高濃度氨氮的硝化菌。所用的富集培養(yǎng)液組成為
(NH4)2S04、 FeS04-7H20、 MgS04-7H20 、 NaCl、 CaCl2禾QKH2P04，濃度如 下NH3-N凈頂g被為86.9mg/L，最終濃度為1400 mg/L; Fe"濃度為12mg/L; Mg"濃度為18mg/L; Na+濃度為800mg/L; Ca2+濃度為16mg/L; 1012 04濃度 為260mg/L。經(jīng)過7個(gè)月的試驗(yàn)，NH3-N負(fù)荷從0.054 kgNH3-N/(mM)增加至1.02 kgNH3-N/(m3d)，處理效果見圖l。
在進(jìn)水氨氮濃度低于1000mg/L時(shí)，每天氨氮去除率>80%，而且大部分時(shí) 間氨氮去除率在90%以上。氨氮濃度越高，脫除越困難，特別是每次增加氨氮負(fù) 荷，都會(huì)降低體系的氨氮去除率，但是經(jīng)過馴化培養(yǎng)，最后都能恢復(fù)，而且恢 復(fù)之后比較穩(wěn)定，最終得到能夠耐受1400mg/L氨氮的硝化菌群。
實(shí)施例2從富集硝化菌的活性污泥中分離純化異養(yǎng)硝化菌
從富集硝化菌的活性污泥中分離純化異養(yǎng)硝化菌的培養(yǎng)基(HNM)采用每 升含有(NH4)2S04 2.4g/L，甘油16g/L，營養(yǎng)鹽溶液40 ml (固體培養(yǎng)基加入2% 的瓊脂)。營養(yǎng)鹽溶液每升含有K2HP04 6.4 g， MgS04 7H20 3 g， NaCl 2.5 g， Fe 7H20 0.04 g， MgS04 4H20 0.05 g， EDTA 4 g。操作過程如下從富集硝 化菌的活性污泥中取泥水懸浮液5ml，利用超聲細(xì)胞破碎儀把呈絮狀的活性污泥 打散，靜置30min，取上層液體0.5ml接種于100ml HNM培養(yǎng)基中(3(TC ， 200rpm) 培養(yǎng)48h，其間定期利用9W(w/v)滅菌的NaHC03調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的pH為8.0。然后 將培養(yǎng)物樣品稀釋105倍，將稀釋液按5。/。的比例轉(zhuǎn)接于新鮮的HNM培養(yǎng)基中， 30°C， 200rpm振蕩培養(yǎng)48h，檢測氨氮濃度降低最明顯的樣品涂布于HNM固 體培養(yǎng)平皿表面，3(TC培養(yǎng)96h，挑取單菌落，獲得一株異養(yǎng)菌FN-4，劃斜面 保藏于4"C冰箱中備用。
實(shí)施例3 FN-4菌體對高COD高氨氮廢水的同步硝化與反硝化
把FN-4接種于含C的HNM培養(yǎng)基中3(TC， 200rpm振蕩培養(yǎng)48h，離心收集細(xì) 胞，重新懸浮于200ml含有300mg/mL氨氮、24 g/L甲醇的人工配水(模擬高COD，高氨氮廢水)中，30°C， 200rpm振蕩培養(yǎng)，每24h離心收集菌體換新鮮的HNM 培養(yǎng)基，其間定期利用堿溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)體系中因降解氨氮消耗的堿度。出水檢 測氨氮，亞硝氮和硝氮濃度，結(jié)果見圖2。同時(shí)設(shè)置未加菌的搖瓶加入人工配水 空搖作為初始氨氮濃度的對照， 一共做了16次對照，取平均值為278mg/L氨氮。
氨氮去除率在35%到50%之間，但是能夠同時(shí)硝化與反硝化把氨氮直接降解
成Ny
實(shí)施例4 FN-4菌體對低COD高氨氮廢水的硝化作用
把FN-4接種于含C的HNM培養(yǎng)基中3(TC， 200rpm振蕩培養(yǎng)48h，離心收集細(xì) 胞，重新懸浮于200ml含有300mg/mL氨氮的人工配水(模擬低COD，高氨氮廢 水)中，3CTC， 200rpm振蕩培養(yǎng)，每24h離心收集菌體換新鮮的HNM培養(yǎng)基，
其間定期利用堿溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)體系中因降解氨氮消耗的堿度。出水檢測氨氮， 亞硝氮和硝氮濃度，結(jié)果見圖3。初始氨氮濃度對照與實(shí)施例3同。
從圖3可知，菌株FN-4對人工配制的不含有機(jī)物(COD)的氨氮廢水(主要 模擬催化劑廢水)具有很強(qiáng)的降解能力，經(jīng)過一個(gè)星期左右的適應(yīng)，脫除率即 達(dá)到100%。
權(quán)利要求
1、一種異養(yǎng)硝化菌的篩選方法，包括以下內(nèi)容(1)通過逐步提高氨氮負(fù)荷的方法培養(yǎng)能夠耐受高氨氮負(fù)荷的富集硝化菌的活性污泥；(2)從富集硝化菌的活性污泥中分離純化異養(yǎng)硝化菌。
2、 按照權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述步驟(1)富集硝化菌活性 污泥的培養(yǎng)過程如下采用間歇式活性污泥法，通過逐漸提高培養(yǎng)液氨氮濃度 的方法來進(jìn)行富集，所用富集培養(yǎng)液包括微量元素Fe、 Mg、 Na和K及緩沖液， 所述的富集培養(yǎng)液中還包括Ca2、 Ca^濃度為0.01 0.05g/L， Ca^是采用CaCl2 的形式加入的。
3、 按照權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的培養(yǎng)液的氨氮初始濃 度為50mg/L 200mg/L，最終濃度為300 mg/L 1200mg/L，化學(xué)需氧量^200 mg/Lc
4、 按照權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的培養(yǎng)液中，微量元素以 FeS04'7H20的形式加入，F(xiàn)e2+的濃度為2mg/L 14 mg/L; Mg以MgS04 7&0的 形式加入，Mg2+濃度為10 20m g/L; Na+以NaCl2、 Na2C03禾喊NaHC03的形 式加入，Na+濃度為200 1000mg/L; K以KH2P04禾喊K2HP04的形式加入，K+ 濃度為20 70mg/L;所述的緩沖液為KH2P04、 K2HP04和NaHC03中的一種或多 種，其濃度為50 300mg/L。
5、 按照權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述的活性污泥選取自煉油污 水處理廠的活性污泥或催化劑污水處理廠的活性污泥。
6、 按照權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述的硝化細(xì)菌富集培養(yǎng)的條 件為溫度為20 3(TC; pH為6.0 9.0; 污泥沉降比為15 % 25 %;溶解氧 為大于2 mg丄—、
7、 按照權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述的硝化細(xì)菌富集培養(yǎng)pH為,6.5 8.0， i容解氧為2 10mg丄—、
8、按照權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述的步驟(2)所述從富集硝 化菌的活性污泥中分離純化異養(yǎng)硝化菌的培養(yǎng)基成分為每升含有氨氮0.4 1.5g/L，碳源與氮源重量比為5 15;操作方法為從富集硝化菌的活性污泥中 取泥水懸浮液5ml，把呈絮狀的活性污泥打散，靜置后取上層液體0.5-2ml接種于 在培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 96h，用NaHC03調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的pH為7.0 8.5，然后將培養(yǎng)物 樣品稀釋103 108倍，將稀釋液按1% 5%的比例轉(zhuǎn)接于新鮮的培養(yǎng)基中培養(yǎng) 24 96h，檢測氨氮濃度降低最明顯的樣品涂布于固體培養(yǎng)平皿表面，培養(yǎng)24 96h，挑取單菌落，劃在斜面上保存?zhèn)溆谩?br> 全文摘要
本發(fā)明涉及一種異養(yǎng)硝化菌的篩選方法。本發(fā)明包括以下內(nèi)容(1)通過逐步提高氨氮負(fù)荷的方法培養(yǎng)能夠耐受高氨氮負(fù)荷的富集硝化菌的活性污泥；(2)從富集硝化菌的活性污泥中分離純化異養(yǎng)硝化菌；(3)考察分離純化的異養(yǎng)硝化菌的硝化作用；(4)分離純化的異養(yǎng)硝化菌的種屬鑒定。利用本發(fā)明方法篩選的異養(yǎng)硝化菌生長速率快，既能對高COD高氨氮工業(yè)廢水進(jìn)行同步硝化與反硝化，還能對低COD高氨氮廢水進(jìn)行高效的硝化作用。
文檔編號C12N1/00GK101434905SQ20071015837
公開日2009年5月20日 申請日期2007年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月15日
發(fā)明者佟明友, 唐似茵, 全 張, 高會(huì)杰, 黎元生 申請人:中國石油化工股份有限公司;中國石油化工股份有限公司撫順石油化工研究院