專利名稱：木霉菌酯素的提純方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及到微生物發(fā)酵液的分離技術(shù)，特別涉及到一種南方 紅豆杉內(nèi)生真菌紫杉木霉次生代謝產(chǎn)物木霉菌酯素的提取及純化方法。
背景技術(shù)：
由立枯絲核菌(R/ /zocto/i/aso/aA7/')引起的紋枯病和立枯病、由灰葡萄孢菌(SofAyfc c/A erea)引起的灰霉病是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的重要病害，目前生產(chǎn)上主要靠農(nóng)業(yè)防治和化學(xué)防治 控制其危害，如灰霉病化學(xué)防治主要依賴施佳樂、速克靈等化學(xué)藥劑。由于抗藥性問題等， 從天然動(dòng)植物、微生物中尋找新型生物活性物質(zhì)，并進(jìn)行新型生物農(nóng)藥的研究開發(fā)是現(xiàn)代 農(nóng)藥工業(yè)的一個(gè)重要研究領(lǐng)域。從南方紅豆杉分離得到的內(nèi)生真菌菌株ZJUF0986 (中國 微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保存編號(hào)CGMCC1672)屬于一種木霉屬 新種紫杉木霉，其產(chǎn)生的新結(jié)構(gòu)化合物木霉菌酯素(trichodermisin)對(duì)重要植物病原真 菌立枯絲核菌和灰葡萄孢菌有很強(qiáng)的抑制作用(申請?zhí)?00610050963.5)。研究設(shè)計(jì)一種 高效提取及純化木霉菌酯素的方法，是研究木霉菌酯素的理化特性及解決木霉菌酯素的生 產(chǎn)工藝參數(shù)的改進(jìn)及產(chǎn)品質(zhì)量控制的關(guān)鍵問題之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種簡單、高效且回收率高的木霉菌酯素的提純方法。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種木霉菌酯素的提純方法，包括以下步驟
1) 、選用保存編號(hào)為CGMCC1672的紫杉木霉菌株ZJUF0986發(fā)酵后所得的發(fā)酵液；
2) 、在上述發(fā)酵液中加入助濾劑或絮凝劑攪拌后靜止沉淀蛋白，取上清液離心以除去 沉淀；
3) 、將上述離心處理后的上清液以低極性有機(jī)溶劑為萃取劑進(jìn)行振蕩，靜止后分離， 得水相A和有機(jī)相A;
4) 、在有機(jī)相A中加入干燥劑進(jìn)行干燥，過濾后減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得淡黃色粗提物；
5) 、將淡黃色粗提物用低極性有機(jī)溶劑溶解，然后再以去離子水為萃取劑進(jìn)行振蕩， 靜止后分離，得水相B和有機(jī)相B;
6) 、在有機(jī)相B中加入干燥劑進(jìn)行干燥，過濾后減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得無色重提物。
作為本發(fā)明的木霉菌酯素的提純方法的改進(jìn)將上述無色重提物用氯仿溶解，過硅膠 柱純化，輔以包括高效薄層層析及活性追蹤的辦法獲得木霉菌酯素的純品。
作為本發(fā)明的木霉菌酯素的提純方法的進(jìn)一步改進(jìn)步驟2)中的助濾劑或絮凝劑的 用量是發(fā)酵液重量的0.1%~1.0%;攪拌后靜止12~24小時(shí)沉淀蛋白，離心條件為
5000~10000rmp/min,室溫下離心5~10min。
作為本發(fā)明的木霉菌酯素的提純方法的進(jìn)一步改進(jìn)步驟3)中，室溫條件下以低極
性有機(jī)溶劑為萃取劑分1 5次進(jìn)行萃取，所述離心后的上清液與低極性有機(jī)溶劑的體積 比為1: 0.5 2 ;每次萃取中振蕩時(shí)間為5~10min，靜止時(shí)間為1 5小時(shí)。
作為本發(fā)明的木霉菌酯素的提純方法的進(jìn)一步改進(jìn)步驟4)中干燥劑的用量為有機(jī)
相A重量的5%~10%;步驟6)中干燥劑的用量為有機(jī)相B重量的5%~10%;步驟4) 和步驟6)均為用濾紙過濾后，在負(fù)壓0.08MPa、 50'C的條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，以回收有 機(jī)溶劑。
作為本發(fā)明的木霉菌酯素的提純方法的進(jìn)一步改進(jìn)步驟5)中，首先將淡黃色粗提 物在10 5(TC的溫度下用低極性有機(jī)溶劑溶解；然后在室溫條件下以去離子水為萃取劑分
1 5次進(jìn)行萃取，去離子水的用量是淡黃色粗提物體積的100~500倍；每次萃取中振
蕩時(shí)間為5 10min，靜止時(shí)間為1 5小時(shí)。
作為本發(fā)明的木霉菌酯素的提純方法的進(jìn)一步改進(jìn)助濾劑可選用硅藻土助濾劑、珍
珠巖助濾劑或粘膠棉助濾劑，絮凝劑可選用硫酸鋁鉀、聚合硫酸鋁鐵、甲殼素或高分子聚
殼糖。低極性有機(jī)溶劑可選用石油醚(60 90)、或石油醚(30~60)或乙酸乙酯。干燥 劑可選用無水硫酸鈉、無水碳酸鉀或無水硫酸鈉。
作為本發(fā)明的木霉菌酯素的提純方法的進(jìn)一步改進(jìn)硅膠柱為直徑4cm、長為50 cm
的玻璃柱；無色重提物用氯仿溶解后拌入層析硅膠，用干法上樣；將層析硅膠活化后與氯 仿混勻，并用超聲波趕除氣泡后濕法裝柱；平衡后，放出氯仿至硅膠柱上表面，按極性從 小到大順序，選擇不同梯度的氯仿/甲醇作洗脫劑進(jìn)行洗脫，收集洗脫液；分別將各單位洗 脫液濃縮后配制成甲醇溶液，采用高效薄層層析色譜追蹤斑點(diǎn)，選擇最優(yōu)化展開劑系統(tǒng)， 以254nm及365nm的紫外光照射或碘蒸汽顯跡，同時(shí)以終極腐霉、立枯絲核菌、灰葡萄
孢為指示菌，用濾紙片法進(jìn)行活性追蹤；最終獲得木霉菌酯素的純品。
將本發(fā)明的木霉菌酯素的提純方法用于提純南方紅豆杉內(nèi)生真菌紫杉木霉次生代謝 產(chǎn)物，具有以下優(yōu)點(diǎn)
1、 所用溶劑無毒無害、消耗量少、對(duì)環(huán)境不造成污染；
2、 紫杉木霉發(fā)酵液中木霉菌酯素提取率可達(dá)到98.95%;純化后總回收率達(dá)到85%， 純度在99.5。/。以上。
在本發(fā)明中，所選用的保存編號(hào)為CGMCC1672的紫杉木霉菌株ZJUF0986發(fā)酵后
所得的發(fā)酵液，其發(fā)酵工藝及步驟同本申請人同一天遞交的另一篇專利《發(fā)酵生產(chǎn)木霉菌 酯素的方法及所用的發(fā)酵培養(yǎng)基》。具體內(nèi)容如下
1、 制作發(fā)酵培養(yǎng)基-
將葡萄糖、淀粉、蛋白胨、硫酸鎂、硝酸鈉、磷酸氫二銨和氯化鉀溶于水形成混合液， 葡萄糖、淀粉、蛋白胨、硫酸鎂、硝酸鈉、磷酸氫二銨和氯化鉀在混合液中的濃度分別是 16.0g/L、 25.8 g/L、 2.0 g/L、 1.0g/L、 0.5g/L、 2.0g/L和0.5g/L。
即所得的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為葡萄糖16.0g/L、淀粉25.8g/L、蛋白胨2.0g/L、硫 酸鎂1.0g/L、硝酸鈉0.5g/L、磷酸氫二銨2.0g/L和氯化鉀0.5g/L，其余為水。
2、 一種發(fā)酵生產(chǎn)木霉菌酯素的方法，依次進(jìn)行以下步驟
1) 、先將低溫(即-2(TC)保存的編號(hào)為CGMCC1672的紫杉木霉菌株ZJUF0986接 種在PDA培養(yǎng)基上，于28t: 3(rC活化培養(yǎng)5天，活化處理后，用打孔器切取菌落邊緣 菌餅；
2) 、將上述直徑為5mm的菌餅10粒接入到內(nèi)裝液體種子培養(yǎng)基的1000 mL三角瓶 中(1000 mL的三角瓶裝200 mL液體種子培養(yǎng)基)，28。C 30。C、 180 r/min避光培養(yǎng)72 小時(shí)，得種子液。液體種子培養(yǎng)基組成葡萄糖20.0g/L、淀粉15.0g/L、蛋白胨2.0g/L、 尿素0.5g/L、硫酸鎂1.0g/L、硝酸鈉0.5 g/L、磷酸氫二銨2.0g/L、氯化鉀0.5 g/L、碳 酸鈣0.4g/L，其余為水。
3) 、選用10升機(jī)械通氣發(fā)酵罐(FJG-10，江蘇格瑞生物技術(shù)有限公司)作為發(fā)酵罐， 選用上述發(fā)酵培養(yǎng)基。
將上述步驟2)所得的種子液以發(fā)酵培養(yǎng)基10% (體積比)的比例接入內(nèi)裝發(fā)酵培養(yǎng) 基的發(fā)酵罐中，依次進(jìn)行以下發(fā)酵步驟(在整個(gè)發(fā)酵過程中罐壓控制在0.03MPa
0.05MPa之間，培養(yǎng)時(shí)間共為240小時(shí))
初期溫度控制在28。C 3(TC，通入空氣進(jìn)行攪拌，通氣比1: 0.5V/V/min，攪拌 轉(zhuǎn)速為200 r/min， pH自然調(diào)節(jié)；培養(yǎng)時(shí)間為120小時(shí)，
中期將溫度降低到25t:，提高通氣比，使通氣比為1: 1 V/V/min，當(dāng)還原糖濃度 降到10g/L左右、溶解氧(DO)開始緩慢上升時(shí)補(bǔ)加質(zhì)量濃度為20%的淀粉溶液， 一次性 補(bǔ)加量為淀粉溶液中的淀粉是發(fā)酵培養(yǎng)基中的淀粉重量的30%，用氫氧化鈉人工調(diào)節(jié)的方 式來控制發(fā)酵罐中的PH值為5.0 6.0，培養(yǎng)時(shí)間為48小時(shí)；
后期溫度保持在25t:，停止補(bǔ)加碳源，降低通氣比，使通氣比為1: 0.5V/V/min; 當(dāng)還原糖降到1 g/L以下時(shí)，鏡檢發(fā)現(xiàn)菌絲開始自溶，形成節(jié)孢子后將所得的發(fā)酵液放罐； 培養(yǎng)時(shí)間為72小時(shí)。
在本發(fā)明中，所用的高效液相色譜檢測方法，同本申請人同一天遞交的另一篇專利《木
霉菌酯素的測定方法及用途》。具體內(nèi)容如下
1、 色譜條件
1) 、 Waters C18分析柱(sunfire C18 5卩m 4.6X250mm)
2) 、 Waters的二元高壓梯度泵(1525 binary HPLC pump)
3) 、 Waters 2487檢測器(Waters 2487 Dual入Absorbance Detector)
4) 、 77251手動(dòng)進(jìn)樣器(KIT 72251 Manual injector 1500 series)
5) 、流動(dòng)相為乙腈水=3: 2 (V: V)
6) 、流速0.8 mL/min 1.2 mL/min，例如為1.0mL/min
7) 、進(jìn)樣量20IJL
8) 、檢測波長為193 nm
9) 、溫度室溫
2、 所用儀器設(shè)備
1) 、 Waters液相色譜儀，配Waters的二元高壓梯度泵(1525 binary HPLC pump)、 Waters2487檢測器(Waters 2487 Dual A Absorbance Detector)、 77251手動(dòng)進(jìn)樣器(KIT 72251 Manual injector 1500 series)
2) 、色譜工作站Breeze
3) 、高速臺(tái)式離心機(jī)Sigma 1-15K
4) 、電子天平METTLERAB204-E
5) 、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52AA
6) 、 PH測定儀METTLER TOLEDO 320
3、所用試劑
1) 、乙腈HPLC美國Weston Scientific
2) 、水三蒸水(自制)
3) 、其它所用試劑均為國產(chǎn)分析純。


下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
圖1提取純化木霉菌酯素的技術(shù)路線流程圖2紫杉木霉發(fā)酵液的高效液相色譜檢測圖譜；
圖3紫杉木霉發(fā)酵液石油醚萃余液的高效液相色譜檢測圖譜；
圖4初提獲得的淡黃色粘稠狀物的高效液相色譜檢測圖譜；
圖5重提獲得無色粘稠狀物的高效液相色譜檢測圖譜；
圖6純化獲得的木霉菌酯素純品的高效液相色譜檢測圖譜。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、 一種木霉菌酯素的提純方法，依次進(jìn)行以下步驟(其流程圖如圖1所示)
1 )、選用保存編號(hào)為CGMCC1672的紫杉木霉菌株ZJUF0986發(fā)酵后所得的發(fā)酵液； 用高效液相色譜進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖2所示。
2) 、在上述發(fā)酵液中加入硫酸鋁鉀攪拌后靜止12 24小時(shí)沉淀蛋白，硫酸鋁鉀用量是 發(fā)酵液重量的0.5%;然后取上清液離心以除去沉淀，離心條件為5000~10000rmp/min， 室溫下離心5 10min。
3) 、取用1000 mL上述離心處理后的上清液，以石油醚(60 90)為萃取劑；在室 溫條件下將離心處理后的上清液用石油醚(60 90)分三次進(jìn)行萃取，每次萃取時(shí)石油 醚(60 90)的用量是300mL，振蕩時(shí)間為10min，靜止時(shí)間為2小時(shí)；靜止后分離， 得水相A和有機(jī)相A。
4) 、在有機(jī)相A中加入無水硫酸鈉進(jìn)行干燥，無水硫酸鈉的重量是有機(jī)相A的7。/。；
再用濾紙過濾后，在負(fù)壓0.08MPa、 5CTC的條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，以回收有機(jī)溶劑石油醚。 得1.25g淡黃色粗提物。該淡黃色粗提物用高效液相色譜進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖4所示。
同時(shí)將步驟3)所得的水相A在80°C/-0.08Mpa的條件下進(jìn)行蒸發(fā)，回收萃取劑后定 容至100mL，用高效液相色譜進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖3所示。
通過圖2、圖3及圖4這三張高效液相檢測圖譜可知，發(fā)酵液經(jīng)石油醚萃取后木霉菌 酯素的殘留量已極微，提取效率達(dá)到98.95%，表明石油醚已完全萃取發(fā)酵濾液中的木霉 菌酯素。
5) 、首先將淡黃色粗提物在10 5CTC的溫度下用石油醚(60 90)溶解，淡黃色粗提 物與石油醚(60 90)的體積比為1: 100;然后在室溫條件下以去離子水為萃取劑，去 離子水總的用量為淡黃色粗提物體積的315倍，平均分成3次進(jìn)行萃取，每次萃取中 振蕩時(shí)間為10min，靜止時(shí)間為2小時(shí)。靜止后分離，得水相B和有機(jī)相B;
6) 、在有機(jī)相B中加入有機(jī)相B10。/。重量比的無水硫酸鈉干燥；然后用濾紙過濾后， 在負(fù)壓0.08MPa、 5CTC的條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，回收有機(jī)溶劑石油醚，重提得1.08g無色 重提物。
圖5為重提獲得的無色粘稠狀物(即無色重提物)的高效液相色譜檢測圖譜，從分析 結(jié)果來看，無色重提物的主成份木霉菌酯素含量達(dá)到98%左右。
7) 、為獲得純品，將無色重提物過硅膠柱再純化。具體操作如下將200 300目的 層析硅膠(青島海洋化工集團(tuán))置于12(TC活化1h，稱取約200 g活化后的硅膠與500mL 的氯仿混勻，并用超聲波趕除汽泡后濕法裝入直徑4cm、長為50cm的玻璃柱。將1.08g 無色重提物用5mL 10mL氯仿溶解后拌入200 300目的層析硅膠(不呈油漬狀為宜)， 待溶劑揮干后上樣。平衡2h后，放出氯仿至硅膠柱上表面，按極性從小到大順序，選擇 不同梯度的氯仿/甲醇(1/0~1.0)作洗脫劑進(jìn)行洗脫，50mL為單位進(jìn)行洗脫液收集，收得 40份洗脫液。分別將各單位洗脫液濃縮后配制成甲醇溶液，采用高效薄層層析色譜(TLC) 追蹤斑點(diǎn)，選擇最優(yōu)化展開劑系統(tǒng)，以紫外光(254nm及365nm)照射或碘蒸汽顯跡， 同時(shí)以終極腐霉、水稻紋枯病菌、灰葡萄孢為指示菌，用濾紙片法進(jìn)行活性追蹤。
純品木霉菌酯素為氯仿/甲醇為1/0.2的組份，濃縮后用高效液相色譜(HPLC)進(jìn)行 檢測，保留時(shí)間在11.4 min左右的就是本發(fā)明所述方法提取純化后所獲得的木霉菌酯素 (如圖6所示)，經(jīng)硅膠柱純化后共獲得純品木霉菌酯素0.836g，純度可達(dá)到99.5%以上， 以紫杉木霉發(fā)酵濾液中木霉菌酯素的含量來計(jì)算，總回收效率達(dá)到85%。
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不 限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接 導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1、一種木霉菌酯素的提純方法，其特征在于包括以下步驟1)、選用保存編號(hào)為CGMCC1672的紫杉木霉菌株ZJUF0986發(fā)酵后所得的發(fā)酵液；2)、在上述發(fā)酵液中加入助濾劑或絮凝劑攪拌后靜止沉淀蛋白，取上清液離心以除去沉淀；3)、將上述離心處理后的上清液以低極性有機(jī)溶劑為萃取劑進(jìn)行振蕩，靜止后分離，得水相A和有機(jī)相A；4)、在有機(jī)相A中加入干燥劑進(jìn)行干燥，過濾后減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得淡黃色粗提物；5)、將淡黃色粗提物用低極性有機(jī)溶劑溶解，然后再以去離子水為萃取劑進(jìn)行振蕩，靜止后分離，得水相B和有機(jī)相B；6)、在有機(jī)相B中加入干燥劑進(jìn)行干燥，過濾后減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得無色重提物。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的木霉菌酯素的提純方法，其特征在于將上述無色重提物用氯 仿溶解，過硅膠柱純化，輔以包括高效薄層層析及活性追蹤的辦法獲得木霉菌酯素的純品。
3、 根據(jù)權(quán)力要求1或2所述的木霉菌酯素的提純方法，其特征在于所述步驟2)中的 助濾劑或絮凝劑的用量是發(fā)酵液重量的0.1%~1.0%;攪拌后靜止12 24小時(shí)沉淀蛋白，離心 條件為5000~10000rmp/min，室溫下離心5~10min。
4、 根據(jù)權(quán)力要求3所述的木霉菌酯素的提純方法，其特征在于所述步驟3)中，室溫 條件下以低極性有機(jī)溶劑為萃取劑分1 5次進(jìn)行萃取，所述離心后的上清液與低極性有機(jī)溶 劑的體積比為1: 0.5 2 ;每次萃取中振蕩時(shí)間為5~10min，靜止時(shí)間為1 5小時(shí)。
5、 根據(jù)權(quán)力要求4所述的木霉菌酯素的提純方法，其特征在于步驟4)中干燥劑的用 量為有機(jī)相A重量的5。/。 10。/。；步驟6)中干燥劑的用量為有機(jī)相B重量的5。/。 10。/。；步驟 4)和步驟6)均為用濾紙過濾后，在負(fù)壓0.08MPa、 5CTC的條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，以回收有 機(jī)溶劑。
6、 根據(jù)權(quán)力要求5所述的木霉菌酯素的提純方法，其特征在于所述步驟5)中，首先 將淡黃色粗提物在10 5CTC的溫度下用低極性有機(jī)溶劑溶解；然后在室溫條件下以去離子水 為萃取劑分1 5次進(jìn)行萃取，去離子水的用量是淡黃色粗提物體積的100~500倍；每次萃 取中振蕩時(shí)間為5~10min，靜止時(shí)間為1 5小時(shí)。
7、 根據(jù)權(quán)力要求6所述的木霉菌酯素的提純方法，其特征在于所述助濾劑為硅藻土助濾劑、珍珠巖助濾劑或粘膠棉助濾劑，所述絮凝劑為硫酸鋁鉀、聚合硫酸鋁鐵、甲殼素或高 分子聚殼糖。
8、 根據(jù)權(quán)力要求7所述的木霉菌酯素的提純方法，其特征在于所述低極性有機(jī)溶劑為石油醚(60 90)、或石油醚(30~60)或乙酸乙酯。
9、 根據(jù)權(quán)力要求8所述的木霉菌酯素的提純方法，其特征在于所述干燥劑為無水硫酸鈉、無水碳酸鉀或無水硫酸鈉。
10、 根據(jù)權(quán)力要求9所述的木霉菌酯素的提純方法，其特征在于:所述硅膠柱為直徑4cm、長為50 Cm的玻璃柱；無色重提物用氯仿溶解后拌入層析硅膠，用干法上樣；將層析硅膠活 化后與氯仿混勻，并用超聲波趕除氣泡后濕法裝柱；平衡后，放出氯仿至硅膠柱上表面，按 極性從小到大順序，選擇不同梯度的氯仿/甲醇作洗脫劑進(jìn)行洗脫，收集洗脫液；分別將各單 位洗脫液濃縮后配制成甲醇溶液，采用高效薄層層析色譜追蹤斑點(diǎn)，選擇最優(yōu)化展開劑系統(tǒng)，以254nm及365nm的紫外光照射或碘蒸汽顯跡，同時(shí)以終極腐霉、立枯絲核菌、灰葡萄孢 為指示菌，用濾紙片法進(jìn)行活性追蹤；最終獲得木霉菌酯素的純品。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種木霉菌酯素的提純方法，包括以下步驟1)選用保存編號(hào)為CGMCC1672的紫杉木霉菌株ZJUF0986發(fā)酵后所得的發(fā)酵液；2)在上述發(fā)酵液中加入助濾劑或絮凝劑攪拌后靜止沉淀蛋白，取上清液離心以除去沉淀；3)將上述離心處理后的上清液進(jìn)行萃取、分離，得水相A和有機(jī)相A；4)在有機(jī)相A中加入干燥劑進(jìn)行干燥，過濾后減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得淡黃色粗提物；5)將淡黃色粗提物進(jìn)行萃取、分離，得水相B和有機(jī)相B；6)有機(jī)相B中加入干燥劑進(jìn)行干燥，過濾后減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得無色重提物。使用本發(fā)明的方法提純木霉菌酯素簡單、高效且回收率高。
文檔編號(hào)C12P7/62GK101168758SQ20071015639
公開日2008年4月30日 申請日期2007年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月2日
發(fā)明者林福呈, 王國平, 章初龍, 鄭必強(qiáng) 申請人:建德市大洋化工有限公司