專利名稱：：玉米細胞色素p450基因的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域。具體的說，本發(fā)明涉及利用玉米細胞色素P450基因能產(chǎn)生抗除草劑的農(nóng)作物；以及利用該基因構(gòu)建得到的反義RNA或RNAi，能獲得可用除草劑選擇性殺滅的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的方法。
背景技術(shù)：
：轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物目前已經(jīng)在世界許多國家大量推廣種植。例如轉(zhuǎn)基因抗蟲、抗除草劑玉米已經(jīng)在北美大量推廣，轉(zhuǎn)基因棉花也已經(jīng)在中國大量種植。改良農(nóng)作物的抗除草劑能力是農(nóng)作物改良的重要方面。因此發(fā)現(xiàn)和利用抗除草劑基因具有重要的應(yīng)用價值。玉米抗草甘膦的研究非常多，但是抗其他除草劑的基因工程比較少。例如，玉米本身具有一定的抗苯達松和磺酰脲類除草劑能力，但是抗性不足；因此進一步提高玉米對抗苯達松和磺酰脲類除草劑的抗性，可以進一步提高玉米的防治雜草能力。另一方面，轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物應(yīng)用的重要工作之一是控制它們的傳播、防止它們混入到非轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物之中。特別是防止作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥物蛋白質(zhì)、工業(yè)酶和其他可能對人和動物有不良作用的轉(zhuǎn)基因品種混入糧食和詞料用品中是非常重要的。因此，開發(fā)一種簡便的方法來控制轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物具有重大價值。苯達松和磺酰脲類除草劑是常用的農(nóng)業(yè)除草劑，其對許多寬葉雜草具有良好的殺草能力；禾本科農(nóng)作物中具有這些除草劑的解毒酶，因此對此除草劑具有一定的抗性。如果通過轉(zhuǎn)基因來增加解毒酶基因的表達，就可以進一步提高農(nóng)作物的抗性，從而能夠更好地利用這些除草劑控制雜草。此外，在轉(zhuǎn)基因植物中抑制抗苯達松和磺酰脲類除草劑的解毒酶的表達、而獲得的對苯達松和磺酰脲類除草劑敏感的轉(zhuǎn)基因玉米，在必要時就能夠上述除草劑選擇性地消滅；從而起到防止、限制轉(zhuǎn)基因玉米的擴散，清除混入到非轉(zhuǎn)基因玉米的作用，有利轉(zhuǎn)基因玉米的生物安全。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供玉米細胞色素P450基因的用途。利用該基因可以產(chǎn)生對抗苯達松和磺酰脲類除草劑具有更高抗性的農(nóng)作物，也可以利用該基因獲得可用除草劑選擇性殺滅的轉(zhuǎn)基因玉米。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種玉米細胞色素P450基因，其具有SEQIDNO:l所示的核苷酸序列；其用途是使用該基因所得的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物具有增強對苯達松和磺酰脲類除草劑更高抗性能力。本發(fā)明還提供了一種DNA質(zhì)粒，該DNA質(zhì)粒含有上述細胞色素P450基因或者其中的基因片斷所構(gòu)建得到的反義RNA或RNAi的抑制表達框。作為本發(fā)明DNA質(zhì)粒的改進反義RNAi的核苷酸序列為SEQIDNO:6。本發(fā)明還提供了一種轉(zhuǎn)基因玉米細胞其含有上述質(zhì)粒。本發(fā)明還提供了一種轉(zhuǎn)基因玉米的制備方法將上述轉(zhuǎn)基因玉米細胞培育成植株。本發(fā)明還提供了上述DNA質(zhì)粒的用途利用該DNA質(zhì)粒所得的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物對苯達松和磺酰脲類除草劑抗性能力大幅度降低，從而利用苯達松和磺酰脲類除草劑能選擇性地控制(殺滅)該轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物。本發(fā)明首先提供一種玉米細胞色素P450基因，該基因的cDNA核苷酸序列為SEQIDNO:1，編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列為SEQIDNO:2;該基因在本發(fā)明中被命名為ZM-P450A。ZM-P450A可以通過轉(zhuǎn)基因?qū)胗衩谆蛘咂渌r(nóng)作物而增強它們的抗苯達松和磺酰脲類除草劑的能力。增強農(nóng)作物的抗除草劑能力有利于雜草的防治。ZM-P450A基因可以和一個啟動子和一個終止子功能性地連接而組成表達框。啟動子可以是水稻或者玉米泛素(Ubiqutin)啟動子、或者水稻Actin啟動子、或者是花椰菜花葉病毒35S啟動子(CaMV35S)、或者是其他有活性的啟動子；終止子可以利用生物中功能基因的天然終止子，例如NOS終止子。ZM-P450A基因表達框可以通過基因槍方法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)等方法導(dǎo)入農(nóng)作物基因組?；驑尫椒ê娃r(nóng)桿菌介導(dǎo)方法都是已知并且成熟的方法(Hieietal.1994Effieienttransformationofrice(OryzasativaL.)mediatedbyagrobacteriumandsequenceanalysisoftheboundariesoftheT畫DNA.777e_P/a"f6:271-282)。含有ZM-P450A基因的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物，由于增強了抗苯達松和磺酰脲類除草劑的能力；因此實際田間操作中，可以提高所使用的苯達松和磺酰脲類除草劑的濃度，從而提高了殺草效果，且大大降低了對該種轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物所造成的藥害可能性。由于任何轉(zhuǎn)基因玉米均可以通過花粉擴散或者直接通過種子傳播到計劃種植以外的地方，這種轉(zhuǎn)基因玉米的傳播是應(yīng)用和推廣轉(zhuǎn)基因玉米中所存在的一個安全性問題。特別是表達藥物蛋白質(zhì)和工業(yè)酶的轉(zhuǎn)基因玉米，它們的傳播可能是有害的。本發(fā)明利用反義RNA或者RNAi抑制玉米中這種細胞色素P450基因的表達，可以使所得的轉(zhuǎn)基因玉米對苯達松和磺酰脲類除草劑敏感，從而能達到可利用苯達松和磺酰脲類除草劑選擇性地殺滅轉(zhuǎn)基因玉米的目的。本發(fā)明通過使轉(zhuǎn)基因玉米對苯達松和磺酰脲類產(chǎn)生敏感性而實現(xiàn)在必要時能夠選擇性地殺滅轉(zhuǎn)基因玉米，從而保證了目的基因能夠被控制。例如在種植非轉(zhuǎn)基因品種的大田中，只要使用苯達松和磺酰脲類除草劑防治雜草就可以消滅可能混入的轉(zhuǎn)基因品種。上述目的基因包括一種抗草甘膦基因，從而使獲得的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物對草甘膦具有高抗性而對苯達松和磺酰脲類除草劑敏感。上述目的基因還可以包括抗蟲等抗逆基因、工業(yè)酶基因、藥物蛋白質(zhì)基因以及其他有價值的適宜在植物中表達的基因；可以是其中的一個、二個或者多個基因。在本發(fā)明中，苯達松和磺酰脲類的解毒基因ZM-P450A抑制表達框可以由二個部分組成一個是啟動子，它可以是水稻或者玉米泛素(Ubiqutin)啟動子、或者水稻Actin啟動子、或者是花椰菜花葉病毒35S啟動子(CaMV35S)、或者是其他在禾本科農(nóng)作物中有活性的啟動子；另一個部分與啟動子功能性相聯(lián)的是本發(fā)明的細胞色素P450基因ZM-P450A(SEQIDNO:l)的反義RNA或者RNAi。利用反義RNA和RNAi抑制表達的機理和技術(shù)已經(jīng)有完整的描述，是已經(jīng)有的技術(shù)(Kusaba2004RNAInterferenceincropplants,CurrentOpinioninBiotechnology,15:139-143)。產(chǎn)生反義RNA的DNA模板可以是全長基因，或者僅僅是其中的一個或幾個片斷。產(chǎn)生RNA干擾的序列(RNAi)可以根據(jù)SEQIDNO:l設(shè)計。同時具有目的基因表達框和苯達松和磺酰脲類的解毒基因抑制表達框的載體可以通過轉(zhuǎn)基因的方法穩(wěn)定導(dǎo)入玉米。這個方法包括基因槍方法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法，這二種方法都是成熟的已知的方法。在本發(fā)明中，由于目的基因表達框與苯達松和磺酰脲類除草劑的解毒酶基因ZM-P450A抑制表達框連接在同一個DNA導(dǎo)入片斷上，從而達到在轉(zhuǎn)基因玉米中目的基因與苯達松、磺酰脲類除草劑的解毒酶基因的抑制表達基因緊密連鎖。該種轉(zhuǎn)基因玉米在必要時能夠被苯達松或磺酰脲類抗除草劑殺滅，從而防止它們的傳播。本發(fā)明提供了利用不同的除草劑(苯達松和磺酰脲類除草劑)對轉(zhuǎn)基因植物可以進行正選擇和負選擇的技術(shù)。當(dāng)目的基因為抗草甘膦基因時，其與抑制玉米細胞色素P450基因的DNA片斷構(gòu)建在同一個質(zhì)粒上；這樣，對草甘膦的抗性和對苯達松和磺酰脲類的敏感性在轉(zhuǎn)基因玉米中高度連鎖。用這種方法獲得的轉(zhuǎn)基因植物可以利用草甘膦進行篩選和雜草防治，同時也可以利用苯達松和磺酰脲類除草劑控制和消滅轉(zhuǎn)基因玉米。綜上所述，本發(fā)明的優(yōu)點如下1、本發(fā)明的基因是玉米自己的基因，因此利用本發(fā)明的基因進一步培育抗性更高的轉(zhuǎn)基因抗除草劑農(nóng)作物，其安全性更高。當(dāng)某些農(nóng)作物對苯達松或磺酰脲類除草劑沒有抗性時，使用本發(fā)明的方法可以使其具有抗性；當(dāng)某些農(nóng)作物對苯達松或磺酰脲類除草劑具備抗性時，使用本發(fā)明的方法可以進一步增強其抗性。2、在轉(zhuǎn)基因玉米中表達目的基因的同時，利用反義RNA或者RNAi的方法抑制水稻中這種細胞色素P450基因的表達，從而使該種轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物對苯達松和磺酰脲類除草劑敏感，進而可以被選擇性地殺滅。由于目的基因表達框與苯達松、磺酰脲類除草劑的解毒酶基因抑制表達框連接在同一個DNA導(dǎo)入片斷上，從而達到在轉(zhuǎn)基因玉米中目的基因與苯達松、磺酰脲類除草劑的解毒酶基因的抑制表達基因緊密連鎖。因此必要時可以通過使用常用的苯達松和磺酰脲類除草劑防止轉(zhuǎn)基因玉米的傳播、消滅混入非轉(zhuǎn)基因玉米中的轉(zhuǎn)基因玉米。下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式作進一步詳細說明。圖l是pCAMB1300Rice-GlyR-450i-ZM450A的T-DNA轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建示意圖。圖中G6為人工合成的i^ew6fomo"os/w&fe的EPSPS基因(gb:EU169459);載體pCAMB1300Rice-GlyR-450i在專利200610155661.7中有詳細表述；ZM-P450A是本發(fā)明的基因；21111;^1為玉米"6/^衍"-/的啟動子；35S是花椰菜花葉病毒(CaMV35S)35S啟動子；在LB和RB之間是能夠插入植物基因組的T-DNA片段。圖2是pCAMBIA1300-G6-ZM450i的T-DNA轉(zhuǎn)化載體示意圖。G6為人工合成的尸ww^w2o"os/她V^的EPSPS基因(gb:EU169459);ZmUbi-l,玉米w&々w"/"-7的啟動子；在LB和RB之間是能夠插入植物基因組的T-DNA片段。具體實施例方式實施例l、相關(guān)玉米細胞色素P450基因的克隆根據(jù)玉米基因組數(shù)據(jù)庫的序列，設(shè)計了能夠通過對基因組DNA進行PCR擴增分別獲得包含完整細胞色素P450基因的一個DNA片斷。這個細胞色素P450基因是ZM-450A。其cDNA序列為SEQIDNO:1，所編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列為SEQIDNO:2。擴增ZM-450A的PCR的引物為zm450aF:NO:4)。PCR擴增的條件是95。Cl分鐘，60°C1分鐘，72。C2分鐘，進行30個循環(huán)。這些細胞色素P450基因組PCR產(chǎn)物被克隆到T載體(上海生工)中，得到pT-zm450A質(zhì)粒，測序說明克隆獲得的基因和數(shù)據(jù)庫的序列相同。實施例2、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化ZM-450A基因的T-DNA載體的構(gòu)建農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化T-DNA載體pCAMB1300Rice-GlyR-450i被用作構(gòu)建在水稻中表達玉米細胞色素P450基因ZM-450A的T-DNA載體(申請?zhí)?00610155661.7《選擇性地消滅禾本科轉(zhuǎn)基因植物的方法》)。pCAMB1300Rice-GlyR-450i中的T-DNA包含一個抑制水稻中降解苯達松和磺酰脲類除草劑基因P450表達的RNAi片斷和一個耐草甘膦除草劑的基因。因此pCAMB1300Rice-GlyR-450i將導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因水稻對苯達松和磺酰脲類除草劑的敏感。但是如果在pCAMB1300Rice-GlyR-450i中同時導(dǎo)入能夠提高苯達松和磺酰脲類除草劑抗性的外源基因，所獲得的轉(zhuǎn)基因水稻仍然能夠表現(xiàn)為對苯達松和磺酰脲類除草劑的高抗性。含有ZM-450A的表達框的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化T-DNA載體pCAMB1300Rice-GlyR-450i-ZM450A構(gòu)建如圖1所示。載體pCAMB1300Rice-GlyR-450i在5amM和雙酶切后，與玉米啟動子ZmUbi-l(///m/in和5amHl酶切pCAMB1300Rice-GlyR-450i而獲得)以及ZM-450A基因(BawHl和《;"I酶切質(zhì)粒pT-zm450A而獲得)3個片斷連接，獲得農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化T-DNA載體pCAMB1300Rice-GlyR-450i-ZM450A(SEQIDN0:5)。實施例3、轉(zhuǎn)基因水稻的獲得將pCAMB1300Rice-GlyR-450i-ZM450A和pCAMB1300Rice隱GlyR-450i二個轉(zhuǎn)化載體通過電擊方法分別導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404。水稻的轉(zhuǎn)基因植物的獲得方法是采用現(xiàn)有技術(shù)(盧雄斌龔祖塤1998生命科學(xué)10:125-131;劉凡等，2003分子植物育種1:108-115)。選取成熟飽滿的秀水IIO種子去殼，誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織作為轉(zhuǎn)化材料。取含pCAMB1300Rice-GlyR-450i-ZM450A和pCAMB1300Rice-GlyR-450i的農(nóng)桿菌劃板，分別挑單菌落接種準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化用農(nóng)桿菌。將待轉(zhuǎn)化的愈傷組織放入適當(dāng)濃度的農(nóng)桿菌液中(含乙酰丁香酮)，讓農(nóng)桿菌結(jié)合到愈傷組織表面，然后把愈傷組織轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)基中，共培養(yǎng)23天。用無菌水沖洗轉(zhuǎn)化后的愈傷，轉(zhuǎn)移到含1—4mM草甘膦的篩選培養(yǎng)基上，篩選培養(yǎng)兩個月(中間繼代一次)。把篩選后，生長活力良好的愈傷轉(zhuǎn)移到預(yù)分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)20天左右，然后將預(yù)分化好的愈傷組織移到分化培養(yǎng)基，14小時光照分化發(fā)芽。2—3周后，把抗性再生植株轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上壯苗生根，最后將再生植株洗去瓊脂移植于溫室，作為鑒定材料。每個轉(zhuǎn)化載體獲得了15個以上獨立的再生水稻株系。T-DNA的插入及其基因的表達可以通過PCR和western印跡分析檢測?；蚪MDNA可以根據(jù)現(xiàn)有的方法從轉(zhuǎn)化再生植株和非轉(zhuǎn)化水稻中提取。實施例4、轉(zhuǎn)基因水稻抗性能力的測定將每個轉(zhuǎn)化載體獲得的不同10個獨立轉(zhuǎn)化株系水稻植株和沒有轉(zhuǎn)化的水稻植株在溫室中單株培養(yǎng)。這些再生植株分為4個處理，處理l:噴20mM草甘膦；處理2:噴1000mg/L苯達松；處理3:4mg/L芐嘧磺??；處理4:噴水。處理后7天記錄植株的成活率，結(jié)果如表l所示。表l、不同10個獨立轉(zhuǎn)化株系在不同的除草劑下的成活率<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>ZM450A的表達使本來應(yīng)該對苯達松和磺酰脲類除草劑敏感的水稻又獲得了抗性。因此說明ZM450A是抗苯達松和磺酰脲類除草劑的基因。實施例5、pCAMB1300-G6-ZM450i玉米轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建根據(jù)玉米的細胞色素P450基因(包括ZM-P450A)設(shè)計和合成了能夠產(chǎn)生RNAi的DNA片斷(SEQIDNO:6)。這個DNA片斷用^Y7zo1酶切后被連接到用屈ol預(yù)先酶切切除去抗潮霉素(/^g)基因的pCambia1300載體(gb:AF234296)，獲得的新載體進一步用五co及I和/fi'mmi酶切，然后用含有抗草甘膦基因G6的用同樣的酶酶切而獲得的DNA片斷連接，獲得載體pCAMB1300-GlyR-ZM450i(圖2)。這個載體包含有一個CaMVS35啟動子控制下的能夠產(chǎn)生RNAi的抑制表達框。實施例6、苯達松和磺酰脲類除草劑敏感的轉(zhuǎn)基因玉米的產(chǎn)生-取授粉后8—10天的Hi-II玉米穗。收集所有的未成熟胚(大小為1.0—1.5mm)。將含有T-DNA載體pCAMB1300-GlyR-ZM450i的農(nóng)桿菌與未成熟胚共培育共培養(yǎng)2—3天(22°C)。轉(zhuǎn)移未成熟胚到愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上(M3，含200mg/L的Timentin殺農(nóng)桿菌)，28"C暗培養(yǎng)10—14天。將所有的愈傷轉(zhuǎn)到帶有2mM草甘膦的篩選培養(yǎng)基上(M4)，28""C暗培養(yǎng)2—3周。轉(zhuǎn)移所有的組織到新鮮草甘膦的篩選培養(yǎng)基上(M4)，28"C暗培養(yǎng)2—3周。然后，轉(zhuǎn)移所有篩選后成活的胚性組織到再生培養(yǎng)基上(M5)，28"C暗培養(yǎng)10—14天，每皿一個株系。轉(zhuǎn)移胚性組織到新鮮的再生培養(yǎng)基上(M5)，26'C光照培養(yǎng)10—14天。轉(zhuǎn)移所有發(fā)育完全的植株到生根培養(yǎng)基上(M6)，26'C光照培養(yǎng)直到根發(fā)育完全,然后移植到溫室中單株培養(yǎng)，并且鎮(zhèn)定它們的抗除草劑能力。實施例7、轉(zhuǎn)基因玉米敏感性的測定獲得的轉(zhuǎn)化pCAMB1300-G6-ZM450i玉米植株和沒有轉(zhuǎn)化的玉米植株在溫室中單株培養(yǎng)。這些再生植株分為3個處理，每個處理包括pCAMB1300-G6-ZM450i轉(zhuǎn)化植株和非轉(zhuǎn)化植株各20株。處理1:噴10mM草甘膦；處理2:噴2000mg/L苯達松；處理3:噴水。處理后10天記錄植株的成活率，結(jié)果如表2所示。表2、轉(zhuǎn)化玉米植株在不同的除草劑下的成活率<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實施例子。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例子，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認為是本發(fā)明的保護范圍。序列表SEQIDNO1:1atggataaggcctacgtggccgtgctctccttcgccttectcttcgtgatccactacctc61gtgggacgtgctggccgcaagggcaatggcaagggcaagggaacgcagcggttgcctccc121agccctccggccgtcccgttcctcggccacctccacctcgtcaagacgccgttccacgag181gcgctggccggcctcgccgcgcgccacgggccggtgttctccatgcgcatggggtcccgc241cgcgcgctggtcgtgtcctcgcccgagtgcgccaaggagtgcttcacggagcacgacgtg301gtgttcgccaaccggccgaggttcgccacgcaggacctcgtgtccttcgggggcgccgcg361ctcgccgcggccagctacgggccctactggcgcaacctccggcgcgtggccaccgtgcag421ctcctctccgcgcaccgcgtcgcctgcatgtccgccgtcgtcgccgccgaggtgcgcgcc481atggcgcgccgcatgggccgcgcggccgcggcggcgcccggcggcgccgcgcgcgtccag541ctcaagcggaggctgttcgaggtctccctcagcgtgctcatggagaccatcgcgegcacc601aagacgtcccgcgccgaggcggacgccgactcggacatgtcgcccgaggcgcacgaattc661aagcagatcgtcgacgagatcgtgccgcacctcggcacggccaacct魄ggactacctg721ccggtgctgcggtggctcgacgtgttcggcgtgaggaacaagatcacggccgctgtgggc781aggagggacgcgttcctgcggcggctcatcgacgcggagcggcggaggctggacgacggc841ggcggcgacagcgacagcgacaagaagagcatgatagccgtgctgctctcgttgcagaag901tcagagccggaggtgtacacggataccatgatcatggcactttgcgggaacttatttggc961gecggaacggagaccacgtcgaccacgacagaatgggccatgtcgctcctcctgaaceac1021ccggaggcgctgaagaaggcacaggcagagatcgacgcagtcgtgggcacctcccgccta1081ctcgccgcagaggacgtgccccgactcggctacctgcaccgcgtcatcagcgagaccctg1141cgcatgtacccggccgccccgctgctcctgccgcacgagtcgtcggcggactgcaaggtc1201ggcggctacgacgtggcccgcggcacgctgctcatcgtgaacgcgtacgccatccacagg1261gacccgctggtgtgggaggacccggacgagttcaggccggagcggttcgaggacggcaag1321gcegaggggcggctcctgatgccgttcgggatggggcggcgcaagtgccctggggagacc1381ctcgcgctgcggaccatcagcctggtgctcggcacgctgatccagtgcttcgactgggac1441cgagtcgacggcctcgagatcgacatggccgcgggcggcgggctcactctgcccagggcc1501gteccgttggaggccacgtgcaagcctcgtgcagctgtgcgccatcttcttctggagctc1561tgaatctgatgcSEQIDNO2:1MetAspLysAlaTyrValAlaValLeuSerPheAlaPheLeuPheVallieHisTyrLeu21ValGlyArgAlaGlyArgLysGlyAsnGlyLysGlyLysGlyThrGinArgLeuProPro41SerProProAlaValProPheLeuGlyHisLeuHisLeuValLysThrProPheHisGlu61AlaLeuAlaGlyLeuAlaAlaArgHisGlyProValPheSerMetArgMetGlySerArg81ArgAlaLeuValValSerSerProGluCysAlaLysGluCysPheThrGluHisAspVal101ValPheAlaAsnArgProArgPheAlaThrGinAspLeuValSerPheGlyGlyAlaAla121LeuAlaAlaAlaSerTyrGlyProTyrTrpArgAsnLeuArgArgValAlaThrValGin141LeuLeuSerAlaHisArgValAlaCysMetSerAlaValValAlaAlaGluValArgAla161MetAlaArgArgMetGlyArgAlaAlaAlaAlaAlaProGlyGlyAlaAlaArgValGin181LeuLysArgArgLeuPheGluValSerLeuSerValLeuMetGluThrHeAlaArgThr201LysThrSerArgAlaGluAlaAspAlaAspSerAspMetSerProGluAlaHisGluPhe221LysGinlieValAspGlulieValProHisLeuGlyThrAlaAsnLeuTrpAspTyrLeu241ProValLeuArgTrpLeuAspValPheGlyValArgAsnLysIkThrAlaAlaValGly261ArgArgAspAlaPheLeuArgArgLeulieAspAlaGluArgArgArgLeuAspAspGly281GlyGlyAspSerAspSerAspLysLysSerMetlieAlaValLeuLeuSerLeuGinLys301SerGluProGluValTyrThrAspThrMetlieMetAlaLeuCysGlyAsnLeuPheGly321AlaGlyThrGluThrThrSerThrThrThrGluTrpAlaMetSerLeuLeuLeuAsnHis341ProGluAlaLeuLysLysAlaGinAlaGlulieAspAlaValValGlyThrSerArgLeu361LeuAlaAlaGluAspValProArgLeuGlyTyrLeuHisArgVallieSerGluThrLeu381ArgMetTyrProAlaAlaProLeuLeuLeuProHisGluSerSerAlaAspCysLysVal401GlyGlyTyrAspValAlaArgGlyThrLeuLeulieValAsnAlaTyrAlalieHisArg421AspProLeuValTrpGluAspProAspGluPheArgProGluArgPheGluAspGlyLys441AlaGluGlyArgLeuLeuMetProPheGlyMetGlyArgArgLysCysProGlyGluThr461LeuAlaLeuArgThrlieSerLeuValLeuGlyThrLeuHeGinCysPheAspTrpAsp481ArgValAspGlyLeuGluIkAspMetAlaAlaGlyGlyGlyLeuThrLeuProArgAla501ValProLeuGluAlaThrCysLysProArgAlaAlaValArgHisLeuLeuLeuGluLeuSEQIDNO:31GgatccaccatggataaggcctacgtggccgtgSEQIDNO:41c汪gtat3caggac肌cctgc3g肌gscc3caatttSEQIDNO:51cgtaatacgactcactatagggegacatatgatcgatgatatcccatgggcggccgcctg61cagaccaggtctacagtatacaggacaacctgcagaagaccacaatttgctataaaccat121actgtgaaccaactactgattgattgttcacgcaaacgactgtacaacacattttacaga181agataacacgcacgagggtattacgcactcaagcttatttagtttagcacacaccatcag241gcaaagcatactagggatcatatgcatgccaagatgttactacagcatcagattcagagc301tccagaagaagatggcgcacagctgcacgaggcttgcacgtggcctccaacgggacggcc361ctgggcagagtgagcccgccgcccgcggccatgtcgatctcgaggccgtcgactcggtcc421cagtcgaagcactggatcagcgtgccgagcaccaggctgatggtccgcagcgcgagggtc481tccccagggeacttgcgccgceccatcccgaacggcatcaggagccgcccctcggccttg541ccgtcctcg犯ccgctccggcctgasctcgtccgggtcctcccscaccagcgggtccctg601tggatggcgtacgcgttcacgatgagcagc魄ccgcgggccacgtcgtagccgccgacc661ttgcagtccgccgacgactcgtgcggcaggagcagcggggcggccgggtacatgcgcagg721gtctcgctgatgacgcggtgcaggtagccgagtcggggcacgtcctctgcggcgagtagg781cgggaggtgcccacgactgcgtcgatctctgcctgtgccttcttcagcgcctccgggtgg841ttcaggaggagcgacatggcccattctgtcgtggtcgacgtggtctccgttccggcgcca卯laataagttcttcatcacagagaaaaaacagtcagtgtctctgtttgtattgggaaaaaca961aacaaacacgacagcgacgctgttgttatgaagatgtcacatcgctaggtttgtcaaagc1021ttcgctcagagaaagaagtactggaaggaaaaaaactcaccccgcaaagtgccatgatca1081tggtatccgtgtacacctccggctctgacttctgcaacgagagcagcacggctatcatge1141tcttcttgtcgctgtcgctgtcgccgccgccgtcgtccagcctccgccgctccgcgtcga1201tgagccgccgcaggaacgcgtccctcctgcccacagcggccgtgatcttgttcctcacgc1261cgaacacgtcgagccaccgeagcaccggcaggtagtcecacaggttggccgtgccgaggt1321gcggcacgatctcgtcgacgatctgcttgaattcgtgcgcctcgggcgacatgtccgagt1381cggcgtccgcctcggcgcgggacgtcttggtgcgcgcgatggtctccatgagcacgctga1441gggagacctcgaacagcctccgcttgagctggacgcgcgcggcgccgccgggcgccgccg1501cggccgcgcggcccatgcggcgcgccatggcgcgcacctcggcggcgacgacggcggaca1561tgcaggcgacgcggtgcgcggagaggagctgcacggtggccacgcgccggaggttgcgcc1621agtagggccegtagctggccgcggcgagcgcggcgcccccgaaggacacgaggtcctgcg1681tggcgaacctcggccggttggcgaacaccacgtcgtgctccgtgaagcactccttggcgc1741actcgggcgaggacacgaccagcgcgcggcgggaccccatgcgcatggagaacaccggcc1801cgtggcgcgcggcgaggccggccagcgcctcgtggaacggcgtcttgacgaggtggaggt1861ggccgaggaacgggacggccggagggctgggaggcaaccgctgcgttcccttgcccttgc1921cattgcccttgcggccagcacgtcccacgaggtagtggatcacgaagaggaaggcgaagg1981agagcacggccacgtaggccttatccatggtggatcctctagagtcgacctgcagaagta2041acaccaaacaacagggtgagcatcgacaaaagaaacagtaccaagcaaataaatagcgta2101tgaaggcagggctaaaaaaatccacatatagctgctgcatatgccatcatccaagtatat2161caagatcaaaataattataaaacatacttgtttattataatagataggtactcaaggtta2221gagcatatgaatagatgctgcatatgccatcatgtatatgcatcagtaaaacccacatca2281acatgtatacctatcctagatcgatatttccatccatcttaaactcgtaactatgaagat2341gtatgacacacacatacagttccaaaattaataaatacaccaggtagtttgaaacagtat2401tctactccgatctagaacgaatgaacgaccgcccaaccacaccacatcatcacaaccaag2461cgaacaaaaagcatctctgtatatgcatcagtaaaacccgcatcaacatgtatacctatc2521ctagatcgatatttccatccatcatcttcaattcgtaactatgaatatgtatggcacaca2581catacagatccaaaattaataaatccaccaggtagtttgaaacagaattctactccgatc2641tagaacgaccgcccaaccagaccacatcatcac犯ccaagacaaaaaaaagcatgaaaag2701atgacccgacaaacaagtgcacggcatatattgaaataaaggaaaagggcaaaccaaacc2761ctatgcaacgaaacaaaaaaaatcatgaaatcgatcccgtctgcggaacggctagagcca2821tcccaggattccccaaagagaaacactggcaagttagcaatcagaacgtgtctgacgtac2881aggtcgcatccgtgtacgaacgctagcagcacggatctaacacaaacacggatctaacac2941aaacatgaacagaagtagaactaccgggccctaaccatggaccggaacgccgatctagag3001aaggtagagagggggggggggggaggacgagcggcgtaccttgaagcggaggtgccgacg3061ggtggatttgggggagatetggttgtgtgtgtgtgcgctccgaacaacacgaggttgggg3121aaagagggtgtggagggggtgtctatttattacggcgggcgaggaagggaaagcgaagga3181gcggtgggaaaggaatcccccgtagctgccgtgccgtgagaggaggaggaggccgcctgc3241cgtgccggctcacgtctgccgctccgccacgcaatttctggatgccgacagcggagcaag3301tccaacggtggagcggaactctcgagaggggtccagaggcagcgacagagatgccgtgcc3361gtctgcttcgcttggcccgacgcgacgctgetggttcgctggttggtgtccgttagactc3421gtcgacggcgtttaacaggctggcattatctactcgaaacaagaaaaatgtttccttagt3481ttttttaatttcttaaagggtatttgtttaatttttagtcactttattttattctatttt3541atatctaaattattaaataaaaaaactaaaatagagttttagttttcttaatttagaggc3601taaaatagaataaaatagatgtactaaaaaaattagtctataaaaaccattaaccctaaa3661ccctaaatggatgtactaataaaatggatgaagtattatataggtgaagctatttgcaaa3721aaaaaaggagaacacatgcacactaaaaagataaaactgtagagtcctgttgtcaaaata3781ctcaattgtcctttagaccatgtctaactgttcatttatatgattctctaaaacactgat3841attattgtagtactatagattatattattcgtagagtaaagtttaaatatatgtataaag3901atagataaactgcacttcaaacaagtgtgacaaaaaaaatatgtggtaattttttataac3961ttagacatgcaatgctcattatctctagagaggggcacgaccgggtcacgctgcactgta4021ggcatgcaagcttggcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcg4081ttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaag4141aggecegcaccgatcgcccttcccaacagttgegeagectgaatggcgaatgetagagca4201gcttgagcttggatcagattgtcgtttcccgectteagtttaaactatcagtgtttgaca4261ggatatattggcgggtaaacctaagagaaaagagcgtttattagaataacggatatttaa4321aagggcgtgaaaaggtttatccgttcgtccatttgtatgtgcatgccaaccacagggttc4381ccctcgggatcaaagtactttgatccaacccctccgctgctatagtgcagtcggcttctg4441acgttcagtgcagccgtcttctgaaaacgacatgtcgcacaagtcctaagttacgcgaca4501ggctgccgccctgecettttcctggcgttttcttgtcgcgtgttttagtcgcataaagta4561gaatacttgcgactagaaccggagacattacgccatgaacaagagcgccgccgctggcct4621gctgggctatgcccgcgtcagcaccgacgaccaggacttgaccaaccaacgggccgaact4681gcacgcggccggctgcaccaagctgttttccgagaagatcaccggcaccaggcgcgaccg4741cccggagctggccaggatgcttgaccacctacgccctggcgacgttgtgacagtgaccag4801gctagaccgcctggcccgcagcacccgcgacctactggacattgccgagcgcatccagga4861ggccggcgcgggcctgcgtagcctggcagagccgtgggccgacaccaccacgccggccgg4921ccgcatggtgttgaccgtgttcgccggcattgccgagttcgagcgttccctaatcatcga4981ccgcacccggagcgggcgcgaggccgccaaggcccgaggcgtgaagtttggcccccgccc5041taccctcaccccggcacagatcgcgcacgcccgcgagctgatcgaccaggaaggccgcac5101cgtgaaagaggcggctgcactgcttggcgtgcatcgctcgaccctgtaccgcgcacttga5161gcgcagcgaggaagtgacgcccaccgaggccaggcggcgcggtgccttccgtgaggacgc5221attgaccgaggccgacgccctggcggccgccgagaatgaacgccaagaggaacaagcatg5281aaaccgcaccaggacggccaggacgaaccgtttttcattaccgaagagatcgaggcggag5341atgatcgcggccgggtacgtgttcgagccgcccgcgcacgtctcaaccgtgcggctgcat5401gaaatcctggccggtttgtctgatgccaagctggcggcctggccggccagcttggccgct5461gaagaaaccgagcgccgccgtctaaaaaggtgatgtgtatttgagtaaaacagcttgcgt5521catgcggtcgctgcgtatatgatgcgatgagtaaataaacaaatacgcaaggggaacgca5581tgaaggttatcgctgtacttaaccagaaaggcgggtcaggcaagacgaccatcgcaaccc5641atctagcccgcgccetgcaactcgccggggccgatgttctgttagtcgattccgatcccc5701agggcagtgcccgcgattgggcggccgtgcgggaagatcaaccgctaaecgttgtcggca5761tcgaccgcccgacgattgaccgcgacgtgaaggccatcggccggcgcgacttcgtagtga5821tcgacggagcgccccaggcggcggacttggctgtgtccgcgatcaaggcagccgacttcg5881tgctgattccggtgcagccaagcccttacgacatatgggccaccgccgacctggtggagc5941tggttaagcagcgcattgaggtcacggatggaaggctacaagcggcctttgtcgtgtcgc6001gggcgatcaaaggcacgcgcatcggcggtgaggttgccgaggcgctggccgggtacgagc6061tgcccattcttgagtcccgtatcacgcagcgcgtgagctacccaggcactgccgccgccg6121gcacaaccgttcttgaatcagaacccgagggcgacgctgcccgcgaggtccaggcgctgg6181ccgctgaaattaaatcaaaactcatttgagttaatgaggtaaagagaaaatgagcaaaag6241cacaaacacgctaagtgccggccgtccgagcgcacgcagcagcaaggctgcaacgttggc6301cagcctggcagacacgccagccatgaagcgggtcaactttcagttgccggcggaggatca6361caccaagctgaagatgtacgcggtacgccaaggcaagaccattaccgagctgctatctga6421atacatcgcgcagctaccagagtaaatgagcaaatgaataaatgagtagatgaattttag6481cggctaaaggaggcggcatggaaaatcaagaacaaccaggcaccgacgccgtggaatgcc6541ccatgtgtggaggaacgggcggttggccaggcgtaagcggctgggttgtctgccggcect6601gcaatggcactggaacccccaagcccgaggaatcggcgtgacggtcgcaaaccatccggc6661ccggtacaaatcggcgcggcgctgggtgatgacctggtggagaagttgaaggccgcgcag6721gccgcccagcggcaacgcatcgaggcagaagcacgccccggtgaatcgtggcaagcggcc6781gctgatcgaatccgcaaagaatcccggcaaccgccggcagccggtgcgccgtcgattagg6841aagccgcccaagggcgacgagcaaccagattttttcgttccgatgctctatgacgtgggc6901acccgcgatagtcgcagcatcatggacgtggccgttttccgtctgtcgaagcgtgaccga6961cgagctggcgaggtgatccgctacgagcttccagacgggcacgtagaggtttccgcaggg7021ccggccggcatggccagtgtgtgggattacgacctggtactgatggcggttteccatcta7081accgaatccatgaaccgataccgggaagggaagggagacaagcccggccgcgtgttccgt7141ccacacgttgcggacgtactcaagttctgccggcgagccgatggcggaaagcagaaagac7201gacctggtagaaacctgcattcggttaaacaccacgcacgttgccatgcagcgtacgaag7261aaggccaagaacggccgcctggtgacggtatccgagggtgaagccttgattagccgctac7321aagatcgtaaagagcgaaaccgggcggccggagtacatcgagatcgagctagctgattgg7381atgtaccgcgagatcacagaaggcaagaacccggacgtgctgacggttcaccccgattac7441tttttgatcgatcccggcatcggccgttttctctaccgcctggcacgccgcgccgcaggc7501aaggcagaagccagatggttgttcaagacgatctacgaacgcagtggcagcgccggagag7561ttcaagaagttctgtttcaccgtgcgcaagctgatcgggtcaaatgacctgceggagtac7621gatttgaaggaggaggcggggcaggctggcccgatcctagtcatgcgctaccgcaacctg7681atcgagggcgaagcatccgccggttcctaatgtacggagcagatgctagggcaaattgcc7741ctagcaggggaaaaaggtcgaaaaggtctctttcctgtggatagcacgtacattgggaac7801ccaaagccgtacattgggaaccggaacccgtacattgggaacccaaagccgtacattggg7861aaccggtcacacatgtaagtgactgatataaaagagaaaaaaggcgatttttccgcctaa7921aactctttaaaacttattaaaactcttaaaacccgcctggcctgtgcataactgtctggc7981cagcgcacagccgaagagctgcaaaaagcgcctacccttcggtcgctgcgctccctacgc8041cccgccgcttcgcgtcggcctatcgcggccgctggccgctcaaaaatggctggcctacgg8101ccaggc組ctaccagggcgcggacaagccgcgccgtcgccactcgaccgccggcgccca8161catcaaggcaccctgcctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgca8221gctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtca8281gggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggcgcagccatgacccagtcacgtagcga8341tagcggagtgtatactggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcac8401catatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgctct8461tccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatca8521gctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaac8581atgtgagcaaaaggccagca幼aggccaggaaccgtaa犯過ggccgcgttgctggcgttt8641ttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtgg8701cgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgc8761tctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagc8821gtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctcc8881aagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaac8941tatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggt9001aacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcct9061aactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttacc9121ttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggt9181ttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttg9241atcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtc9301atgcattctaggtactaaaacaattcatccagtaaaatataatattttattttctcccaa9361tcaggcttgatccccagtaagtcaaaaaatagctcgacatactgttcttccccgatatcc9421tccctgatcgaccggacgcagaaggcaatgtcataccacttgtccgccctgccgcttctc9481ccaagatcaataaagccacttactttgccatctttcacaaagatgttgctgtctcccagg9541tcgccgtgggaaaagacaagttcctcttcgggcttttccgtctttaaaaaatcatacagc9601tcgcgcggatctttaaatggagtgtcttctteccagttttcgcaatccacatcggccaga9661tcgttattcagtaagtaatccaattcggctaagcggctgtctaagctattcgtataggga9721caatccgatatgtcgatggagtgaaagagcctgatgcactccgcatacagctcgataatc9781ttttcagggctttgttcatcttcatactcttccgagcaaaggacgccatcggcctcactc9841atgagcagattgctccagccatcatgccgttcaaagtgcaggacctttggaacaggcagc9901tttccttccagccatagcatcatgtccttttcccgttccacatcataggtggtcccttta9961taccggctgtccgtcatttttaaatataggttttcattttctcccaccagcttatatacc10021ttagcaggagacattccttccgtatcttttacgcagcggtatttttcgatcagttttttc10081aattccggtgatattctcattttagccatttattatttccttcctcttttctacagtatt10141taaagataccccaagaagctaattataacaagacgaactccaattcactgttccttgcat10201tctaaaaecttaaataccagaaaacagctttttcaaagttgttttcaaagttggcgtata10261acatagtatcgacggagccgattttgaaaccgcggtgatcacaggcagcaacgctctgtc10321atcgttacaatcaacatgctaccctccgcgagatcatccgtgtttcaaacccggcagctt10381agttgccgttcttccgaatagcatcggt犯catgagc咖gtctgccgccttacaacggc10441tctcccgctgacgccgtcccggactgatgggctgcctgtatcgagtggtgattttgtgcc10501gagctgccggtcggggagctgttggctggctggtggcaggatatattgtggtgtaaacaa10561attgacgcttagacaacttaataacacattgcggacgtttttaatgtactgaattaacgc10621cgaattaattcgggggatctggattttagtactggattttggttttaggaattagaaatt10681ttattgatagaagtattttacaaatacaaatacatactaagggtttcttatatgctcaac10741acatgagcgaaaccctataggaaccctaattcccttatctgggaactactcacacattat10801tatggagaaactcgagcagtgcaccaggagtcacagaaacacatcacacattcgtgagct10861cagcttagccatggataacgcctacattattgccattctctctgtagctatcctcttctt10921gctccactactacctcctcggccgcggcaatggcggggcggcgcggctgccgccgggtcc10981accggccgtcccgatcctgggacacctccacctcgtcaagaagcagatctcggtgaagca11041ctccctggcgcaceccggcgacgacaccaccacggcgcgccgcgacccgaggcgcagcga11101gaacaccggcccgtaccgctcggcgaggcgggacatggtggcgtgcatcggcttcttgac11161gaggtggaggtgtcccaggatcgggacggccggtggacccggcggcagccgcgccgcccc11221gccattgccgcggccgaggaggtagtagtggagcaagaagaggatagctacagagagaat11281ggcaataatgtaggcgttatccatggctaagctgagctcacgaatgtgtgatgtgtttct11341gtgactctggtgcactgctcgagagagatagatttgtagagagagactggtgatttcagcU401gtgtcctctccaaatgaaatgaacttccttatatagaggaaggtcttgcgaaggatagtg11461ggattgtgcgtcatcccttacgtcagtggagatatcacatcaatccacttgctttgaaga11521cgtggttggaacgtcttc飾ccacgatgctcctcgtgggtgggggtccatctttggg11581accactgtcggcagaggcatcttgaacgatagcctttcctttatcgcaatgatggcatttII641gtaggtgccaccttccttttctactgtccttttgatgaagtgacagatagctgggcaatg11701gaatccgaggaggtttcccgatattaccctttgttgaaaagtctcaatagccctttggtc11761ttctgagactgtatctttgatattcttggagtagacgagagtgtegtgctccaccatgtt11821atcacatcaatccacttgctttgaagacgtggttggaacgtcttctttttccacgatgct11881cctcgtgggtgggggtccatctttgggaccactgtcggcagaggcatcttgaacgatagc11941ctttcctttatcgcaatgatggcatttgtaggtgccaccttcc加ctactgtcctttt12001gatgaagtgacagatagctgggcaatggaatccgaggaggtttcccgatattaccctttg12061ttgaaaagtctcaatagccctttggtcttctgagactgtatctttgatattcttggagta12121gacgagagtgtcgtgctccaccatgttggcaagctgctctagccaatacgcaaaccgcct12181ctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaa12241gcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggct12301ttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcac12361acaggaaacagctatgaccatgattacgaattcgccactggattttggttttaggaatta12421gaaattttattgatagaagtattttacaaatacaaatacatactaagttctgcacaaagt12481ggagtagtcagtcatcgatcaggaaccagacaccagac加attcatacagtgaagtga12541agtgaagtgcagtgcagtgagttgctggtttttgtacaacagatcttgagctctcagctc12601ttgccctcctcggccaccctgatgcccacctcggcgcacagggccaggaagttcgggaag12661ctggtggceacgttggcgcagtcgtggattctgatcggggcgctggccctcaggctggcc12721acgctgaaggccatggcgatcctgtggtcgccgtggccgtgcacctcgccgccgcccagc12781tggccgccgtcgatgatgatgccgtccggggtcggctcgcacttgatgcccagggtgatc12841aggccgtcggccatcacctgaatcctgtcgctctccttcaccctcagctcctcggcgccc12901ctcagcacggtcctgccctcggcgcaggcggcggccacgaacagcaccgggaactcgtcg12961atggccagcggcaccagggcctccgggatgtcgatgcccttcagctgggcgcccctcacc13021ctcaggtcggccaccggctcgccgcccacctccctctggttctccagggtgatgtcgccg13081cccatcagcctcaggatgtcgatcacgccggtcctggtcgggttgatgcccacgtgctcc13141agcaccagctcgctgccctcggcgatgctggcggccaccaggaagaaggcggcgctgctg13201atgtcggccggcacctcgatcctggtggcggtcagcttgccgccgctctgcaggctggcc13261accgggccgttgctctccacgctgtagccgaagcccctcagcatcctctcggtgtggtcc13321ctggtcggggccggctcggtcacggtggtcttgccctcggcgtacaggccggccagcagc13381aggcagctcttcacctgggcgctggccatcggcagggtgtaggtcaggcccttcagcttg13441tggccgcccctgatggtcagcggcggcctgccctccgggccggtctccaccacggcgccc13501atctccctcagcgggttggccaccctgttcatcggcctcttgctcaggctggcgtcgccg13561gtcatggtcacgtcgaagctctggccggccagcaggccgctcagcagcctcatgctggtg13621ccgctgttgcccacgtacagcgggcccggcggcggcttcaggccgtgcaggcccacgceg13681tggatggtcaccctgccgtggttcgggccctcgatcaccacgcccatgtccctgaaggcc13741tgcagggtggccagggcgtcctcgccctccaggaagccctccacctcggtggtgccctcg13801gccaggctgcccagcatgatgctcctgtggctgatgctcttgtcgcccggcaccctgatc13861ctgccgttcagcctgccgcccggctgggccaggaagatcaggtcgttggccccagatccc13921ttgcggggatcggtggggccccacggccggagcggggtggccgggggagccatcggeatg13981gcgggtgacgccgctgagcacctgatgggcgcggcgagggcgcggcgggtggccaggagg14041tgcgcccggcgcctcgccttgggcgcagcggtagtggcgccagtgagcgcggtagacgcg14101gcggcggcggtggccatggtagatcctctagagtcgacctgcagaagtaacaccaaacaa14161cagggtgagcatcgacaaaagaaacagtaccaagcaaataaatagcgtatgaaggcaggg14221ctaaaaaaatccacatatagctgctgcatatgccatcatccaagtatatcaagatcaaaa14281taattataaaacatacttgtttattataatagataggtactcaaggttagagcatatgaa14341tagatgctgcatatgccatcatgtatatgcatcagtaaaacccacatcaacatgtatacc14401tatcctagatcgatatttccatccatcttaaactcgtaactatgaagatgtatgacacac14461acatacagttccaaaattaataaatacaccaggtagtttgaaacagtattctactccgat14521ctagaacgaatgaacgaccgcccaaccacaccacatcatcacaaccaagcgaacaaaaag14581catctctgtatatgcatcagtaaaacccgcatcaacatgtatacctatcctagatcgata14641tttccatccatcatcttcaattcgtaactatgaatatgtatggcacacacatacagatcc14701aaaattaataaatccaccaggtagtttgaaacagaattctactccgatctagaacgaccg14761cccaaccagaccacatcatcacaaccaagacaaaaaaaagcatgaaaagatgacccgaca14821aacaagtgcacggcatatattgaaataaaggaaaagggcaaaccaaaccctatgcaacga14881aacaaaaaaaatcatgaaatcgatcccgtctgcggaaeggetagageeatcccaggattc14941cccaaagagaaacactggcaagttagcaatcagaacgtgtctgacgtacaggtcgcatcc15001gtgtacgaacgctagcagcaeggatctaacacaaacacggatctaacacaaacatgaaca15061gaagtagaactaccgggccctaaccatggaccggaacgccgatctagagaaggtagagag15121ggggggggggggaggacgagcggcgtaccttgaagcggaggtgecgaegggtggatttgg15181gggagatctggttgtgtgtgtgtgcgctccgaacaacacgaggttggggaaagagggtgt15241ggagggggtgtctatttattacggcgggcgaggaagggaaagcgaaggagcggtgggaaa15301ggaatcccccgtagctgccgtgccgtgagaggaggaggaggccgectgccgtgccggctc15361acgtctgccgctccgccacgcaatttctggatgccgacagcggagcaagtccaacggtgg15421agcggaactctcgagaggggtccagaggcagcgacagagatgccgtgccgtctgcttcgc15481ttggcccgacgcgacgctgctggttcgctggttggtgtccgttagactcgtcgacggcgt15541ttaacaggctggcattatctactcgaaacaagaaaaatgtttccttagtttttttaattt15601cttaaagggtatttgtttaatttttagtcactttattttattctattttatatctaaatt15661attaaataaaaaaactaaaatagagttttagttttcttaatttagaggctaaaatagaat15721aaaatagatgtactaaaaaaattagtctataaaaaccattaaccctaaaccctaaatgga15781tgtactaataaaatggatgaagtattatatag魄aagctatttgcaaaaaaaaaggaga15841acacatgcacactaaaaagataaaactgtagagtcctgttgtcaaaatactcaattgtcc15901tttagaccatgtctaactgttcatttatatgattctctaaaacactgatattattgtagt15961aetatagattatattattcgtagagtaaagtttaaatatatgtataaagatagataaact16021gcacttcaaacaagtgtgacaaaaaaaatatgtggtaattttttataacttagacatgca16081atgctcattatctctagagaggggcacgaccgggtcaegctgcactgtaggcatgeaegg16141tacSEQIDNO:61ctcgagggttttcagagcctcttaagaacaccacgcatagctgtacgcggcctgcacatg61gcctccaacgggacggcccggggcatggtcagcccgccgctagccttcatgtcaacctga121gctccatcaaccgtgtcccagtcgaagcactggagcagcgtggegagcaccagcccgacg181gtccgcagcgcgagcgtctccccggggcacttgcgccgccccatcccgaacggcatcagg241agccgcccctcggccttgccgtcctcgaaccgctccggcctgaactcgtccgggtcctcc301cacaccagcgggtccctgtggatggcgtacgcgttcacgatgagcagcgtgccgcgggcc361acgtcgtagccgccgaccttgcagtccgccgacgactcgtgcggcaggagcagcggggcg421gccgggtacatgcgcagggtctcgctgatgacgcggtgcaggtagccgagtcggggcacg481tcctctgcggcgagtaggcgggaggtgcceacgactgcgtcgatctctgcctgtgccttc541ttcagcgcctccgggtggttcaggaggagcgacatggcccattctgtcgtggtcgacgtg601gtctccgttccggcgccaaataagatcccgactcggctacctgcaccgcgteatcagega661gaccctgcgcatgtacccggccgccccgctgctcctgccgcacgagtcgteggcggactg721caaggtcggcggctacgacgtggcccgcggcacgctgctcatcgtgaacgcgtacgccat781ccacagggacccgctggtgtgggaggacccggacgagttcaggccggagcggttcgagga841cggcaaggccgaggggcggctcctgatgccgttcgggatggggcggcgcaagtgccccgg901ggagacgctcgcgctgcggaccgtcgggctggtgctcgccacgctgctccagtgcttcga961ctgggacacggttgatggagctcaggttgacatgaaggctagcggcgggctgaccatgcc1021ccgggccgtcccgttggaggccatgtgcaggccgcgtacagctatgcgtggtgttettaa1081gaggctetgaaaacctcctcgagt權(quán)利要求1、一種玉米細胞色素P450基因，具有SEQIDNO1所示的核苷酸序列；其用途是使用該基因所得的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物具有增強對苯達松或磺酰脲類除草劑的高抗性能力。2、一種DNA質(zhì)粒，其特征在于含有權(quán)利要求1所述的細胞色素P450基因或者其中的基因片斷所構(gòu)建得到的反義RNA或RNAi的抑制表達框。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的DNA質(zhì)粒，其特征是所述反義RNAi的核苷酸序列為SEQIDNO:6。4、一種轉(zhuǎn)基因玉米細胞，其特征在于含有權(quán)利要求2或3所述的質(zhì)粒。5、一種轉(zhuǎn)基因玉米的制備方法，其特征在于將權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)基因玉米細胞培育成玉米。6、如權(quán)利要求2或3所述的DNA質(zhì)粒的用途利用該DNA質(zhì)粒所得的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物降低對苯達松和磺酰脲類除草劑的抗性能力，從而利用苯達松或磺酰脲類除草劑選擇性地控制所述轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物。全文摘要本發(fā)明公開了一種玉米細胞色素P450基因，其具有SEQIDNO1所示的核苷酸序列；使用該基因所得的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物具有增強對苯達松或磺酰脲類除草劑的高抗性能力。本發(fā)明還公開了一種DNA質(zhì)粒，其含有上述細胞色素P450基因或者其中的基因片斷所構(gòu)建得到的反義RNA或RNAi的抑制表達框。本發(fā)明還公開了一種轉(zhuǎn)基因玉米細胞以及利用上述細胞所進行的轉(zhuǎn)基因玉米的制備方法。利用本發(fā)明的DNA質(zhì)粒所得的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物能降低對苯達松和磺酰脲類除草劑的抗性能力，從而可利用苯達松或磺酰脲類除草劑選擇性地控制轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物。文檔編號C12N15/29GK101182521SQ20071015639公開日2008年5月21日申請日期2007年11月2日優(yōu)先權(quán)日2007年11月2日發(fā)明者沈志成申請人:浙江大學(xué)