專(zhuān)利名稱(chēng)：夏枯草區(qū)域道地性分子鑒別方法
夏枯草區(qū)域道地性分子鑒別方法技術(shù)領(lǐng)域-本發(fā)明涉及夏枯草藥材區(qū)域道地性DNA分子鑒別方法，屬于生藥學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
道地藥材是具有良好的社會(huì)信譽(yù)并能產(chǎn)生可觀經(jīng)濟(jì)效益的藥材，其產(chǎn)品貨真、質(zhì)優(yōu)，品 質(zhì)穩(wěn)定可靠，為世人稱(chēng)道。中藥的產(chǎn)地及其質(zhì)量、療效間有密切關(guān)系，在傳統(tǒng)上， 一貫對(duì)藥 材是否來(lái)自原產(chǎn)地給予很大重視，往往以地產(chǎn)、地道藥材作為質(zhì)優(yōu)的標(biāo)志。夏枯草/V"朋/tora/g『"Linn.為中國(guó)傳統(tǒng)中藥材，以干燥果穗入藥，收載在2005版中國(guó)藥 典中。其味苦、性寒、辛，有清熱明目、瀉肝火、清熱散結(jié)等功效。其可用于治療頭痛眩暈， 口眼歪斜，筋骨疼痛，目赤腫痛，畏光流淚，乳腺炎，乳癌，高血壓(有降壓、利尿作用)， 淋巴結(jié)核，浸潤(rùn)性肺結(jié)核，單純性甲狀腺腫，腮腺炎，急性黃疸型傳染性肝炎，血崩，帶下， 豬、牛、羊傳染性結(jié)膜炎、角膜炎等。另外對(duì)痢疾桿菌也有抑制作用。由于其重要的藥用價(jià) 值和廣泛的藥理作用，夏枯草越來(lái)越引起人們的關(guān)注。夏枯草為一廣布種，全國(guó)大部分地區(qū) 均有分布，傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為，夏枯草藥材以江蘇產(chǎn)者為道地。由于不同地區(qū)的夏枯草在植物形態(tài)上沒(méi)有差別，依據(jù)其形態(tài)特征難以對(duì)其進(jìn)行來(lái)源鑒別。 隨著分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展，隨機(jī)擴(kuò)增DNA多態(tài)性(RAPD)、任意引物PCR(AP-PCR) 、 DNA 擴(kuò)增產(chǎn)物指紋DNA(DAF)、特征性片段擴(kuò)增區(qū)域(SCAR)和序列片段分析等多種分子標(biāo)記不 斷被應(yīng)用于中藥材的鑒別。本發(fā)明的目的是提供一種鑒別道地產(chǎn)區(qū)夏枯草藥材的DNA分子鑒別方法，通過(guò)RAPD方 法得到道地產(chǎn)區(qū)夏枯草的特異片段，通過(guò)該片段設(shè)計(jì)SCAR引物，擴(kuò)增得到特異性片段，該片 段只在道地產(chǎn)區(qū)夏枯草材料中出現(xiàn)，在其他產(chǎn)區(qū)夏枯草材料中不存在。該方法對(duì)道地產(chǎn)區(qū)夏 枯草的鑒別可靠、準(zhǔn)確、重復(fù)性高。目前，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)有關(guān)分子標(biāo)記鑒別道地夏枯草方法的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供鑒別道地產(chǎn)區(qū)夏枯草的一組引物和一段DNA片段；本發(fā)明的另外一個(gè)目的是提供一種鑒別道地產(chǎn)區(qū)夏枯草的方法。本發(fā)明運(yùn)用RAPD方法在道地產(chǎn)區(qū)夏枯草基因組中擴(kuò)增出一條特異性條帶，通過(guò)克隆和 測(cè)序獲得一段長(zhǎng)度為792bp的DNA序列，SEQIDNo.l所示，并根據(jù)此序列設(shè)計(jì)了一組鑒別道 地產(chǎn)區(qū)夏枯草的引物，其中，本發(fā)明提供了一對(duì)引物，其序列如SEQIDNo.2:5'-CTTCTCGGTCTTTGTTTTTACAGA-3'(上游弓l物)禾口 SEQIDNo.3: 5'-CTTCTCGGTCCATCAAGTATTTG-3'(下游引物)。本發(fā)明提供一種鑒別道地產(chǎn)區(qū)夏枯草的方法，其特征在于方法是根據(jù)樣品的PCR反應(yīng)產(chǎn) 物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定樣品的來(lái)源。該方法中PCR引物由SEQIDNo.l所示的序列設(shè)計(jì)合 成。該方法中PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果中出現(xiàn)一段792bp條帶的樣品為道地產(chǎn)區(qū)夏枯草，而相同部 位沒(méi)有出現(xiàn)條帶的樣品為其他產(chǎn)區(qū)的夏枯草。反應(yīng)體系為20^L，其組分及終濃度為lxTaq DNA酶緩沖液(10 mmoI/LTris-HCl， 50mmol/LKCI， 0.1%Trionx-IOO， pH8.4)， 2.5mmol/LMgCI2， lUTaq酶，60ng模板，上下游 引物各0.3^mol/L， 150(amol/LdNTP。反應(yīng)程序?yàn)?4。C預(yù)變性3min; 94。C變性45s， 58。C退 火30s， 72'C延伸60s， 35個(gè)循環(huán)，最后72。C保溫5min， 4'C保存。本發(fā)明一共實(shí)驗(yàn)了80個(gè)RAPD引物，購(gòu)自上海英駿生物技術(shù)有限公司，其中 AUll(5、-CTTCTCGGTC-3、)能在道地產(chǎn)區(qū)夏枯草基因組中擴(kuò)增出一條792bp的特征條帶，而 相同位置上其他基因組DNA中沒(méi)有出現(xiàn)。(圖l)將上述特征條帶克隆、測(cè)序，序列如SEQ ID No.l所示，片段長(zhǎng)度為792bp，將該序列在 Genebank上進(jìn)行序列比對(duì)，未發(fā)現(xiàn)與之同源的序列。根據(jù)全序列設(shè)計(jì)出 一對(duì)SCAR弓I物SEQ ID No.2: 5'-CTTCTCGGTCTTTGTTTTTACAGA-3' SEQ ID No.3: 5'墨CTTCTCGGTCCATCAAGTATTTG-3' 分別對(duì)應(yīng)于SEQ ID No.l序列的l-24nt及770-792nt位點(diǎn)。通過(guò)8個(gè)產(chǎn)區(qū)56個(gè)夏枯草個(gè)體及硬毛夏枯草和大花夏枯草各7個(gè)個(gè)體檢驗(yàn)這對(duì)引物的有效 性，SCAR反應(yīng)表明，除道地產(chǎn)區(qū)的7個(gè)夏枯草個(gè)體出現(xiàn)預(yù)期的長(zhǎng)度為792bp的SCAR條帶外， 其他7個(gè)產(chǎn)區(qū)的夏枯草個(gè)體及硬毛夏枯草和大花夏枯草個(gè)體都沒(méi)有出現(xiàn)SCAR條帶(圖2， 3， 4， 5， 6， 7)。本發(fā)明有益效果本發(fā)明提供了一段長(zhǎng)度為792bp的道地產(chǎn)區(qū)夏枯草特異性的DNA序列，并根據(jù)該序列設(shè) 計(jì)的引物，可以用于夏枯草的道地性鑒別。檢驗(yàn)結(jié)果證明了本發(fā)明中引物和PCR方法可以準(zhǔn) 確鑒別出道地產(chǎn)區(qū)的夏枯草。


圖l道地產(chǎn)區(qū)和非道地產(chǎn)區(qū)夏枯草及硬毛夏枯草和大花夏枯草由RAPD引物AU11(5'-CTTCTCGGTC-3')擴(kuò)增得到的RAPD指紋圖譜。箭頭所示的是道地產(chǎn)區(qū)夏枯草 的特有譜帶。M: 100bpladderDNA分子量標(biāo)記 Ddx:道地產(chǎn)區(qū)夏枯草f-Ddx:非道地產(chǎn)區(qū)夏枯草Ymx:硬毛夏枯草Dhx:大花夏枯草圖2 RAPD-SCAR標(biāo)記單株檢測(cè)結(jié)果1，除江蘇句容的7個(gè)夏枯草個(gè)體出現(xiàn)792bp譜帶外，浙江磐安的7個(gè)夏枯草個(gè)體都未出現(xiàn)該譜帶。M: 100bpladderDNA分子量標(biāo)記JS1-JS7:江蘇句容 ZJ1-ZJ7:浙江磐安圖3 RAPD-SCAR標(biāo)記單株檢測(cè)結(jié)果2，安徽蕪湖和湖北浠水的14個(gè)夏枯草個(gè)體都未出現(xiàn)792bp譜帶。M: 100bpladderDNA分子量標(biāo)記 AH1-AH7:安徽蕪湖 HB1-HB7:湖北浠水 圖4 RAPD-SCAR標(biāo)記單株檢測(cè)結(jié)果3，湖南和江西新余的14個(gè)夏枯草個(gè)體都未出現(xiàn)792bp 譜帶。M: 100bpladderDNA分子量標(biāo)記 HN1-HN7:湖南 JX1-JX7:江西新余圖5 RAPD-SCAR標(biāo)記單株檢測(cè)結(jié)果4，四川映秀和貴州貴陽(yáng)的14個(gè)夏枯草個(gè)體都未出現(xiàn) 792bp譜帶。M: 100bpladderDNA分子量標(biāo)記 SC1-SC7:四川映秀 GZ1-GZ7:貴州貴陽(yáng)圖6 RAPD-SCAR標(biāo)記單株檢測(cè)結(jié)果5，硬毛夏枯草和大花夏枯草個(gè)體都未出現(xiàn)792bp譜帶 外。.M: 1 OObp ladderDNA分子量標(biāo)記Yml-Ym7:硬毛夏枯草 Dhl-Dh7:大花夏枯草具體實(shí)施方式
以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述。本實(shí)驗(yàn)利用RAPD-SCAR標(biāo)記鑒別道地產(chǎn)區(qū)夏枯草所采取的步驟如下 (1 ) DNA提取和RAPD-SCAR標(biāo)記的獲得選取生長(zhǎng)良好植株中上部的健康嫩葉，用去離子水清洗葉片，除去主脈，采用CTAB法 提取基因組總DNA。提取的DNA用DNA純化回收試劑盒純化后，溶解于滅菌雙蒸水中，低溫 (-20'C)貯藏，備用。DNA純化回收試劑盒購(gòu)自北京萊博生物實(shí)驗(yàn)材料研究所。RAPD引物的篩選的反應(yīng)體系為20nL，其組分及終濃度為lxTaqDNA酶緩沖液(10 mmol/LTris-HCl， 5Ommol/LKC1， 0.1%Trionx-100, pH8.4)， 2.5mmol/LMgCl2， lUTaq酶，30ng模板，0.4pmol/L引物，150pmol/LdNTP。反應(yīng)程序?yàn)?4。C預(yù)變性3min: 94。C變性45s， 38。C退火30s， 72。C延伸90s， 40個(gè)循環(huán)，最后72。C保溫5min， 4。C保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.4 %瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠(EB)染色，用凝膠成像系統(tǒng)觀察、拍照。經(jīng)過(guò)篩選80條RAPD引物找到道地產(chǎn)區(qū)夏枯草的特異性條帶。特異性條帶經(jīng)割膠回收、 純化、轉(zhuǎn)質(zhì)粒后，隨機(jī)挑選2個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序，得到一致的結(jié)果，本發(fā)明中該特異序列為SEQ IDNal。根據(jù)該特異序列設(shè)計(jì)出一對(duì)長(zhǎng)度分別為24和23個(gè)堿基的特異性引物用于SCAR反應(yīng)， 本發(fā)明中這對(duì)引物為SEQIDNo.2: 5'-CTTCTCGGTCTTTGTTTTTACAGA-3'禾口SEQ ID No.3: 5'-CTTCTCGGTCCATCAAGTATTTG-3' (2) RAPD-SCAR標(biāo)記的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)以SEQ ID No.2和SEQ ID No.3這對(duì)引物為擴(kuò)增引物，用8個(gè)產(chǎn)地的56個(gè)夏枯草單株和硬毛 夏枯草及大花夏枯草各7個(gè)單株DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為20pL，其組分及終濃度 為lxTaqDNA酶緩沖液(10 mmol/LTris-HCl， 5Ommol/LKC1， 0.1%Trion x-100， pH8.4)， 2.5mmol/LMgCl2， lUTaq酶，60ng模板，0.3Mmol/L引物，150|amo/LdNTP。反應(yīng)程序?yàn)?94。C預(yù)變性3min; 94。C變性45s， 58。C退火30s, 72。C延伸60s， 40個(gè)循環(huán)，最后72。C保溫5min， 4'C保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.4W瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠(EB)染色，用凝膠成像系統(tǒng)觀 察、拍照，用100bp的DNAladder作為分子量標(biāo)記。驗(yàn)證結(jié)果如圖2-圖6所示，這表明本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物能夠用于夏枯草的道地性鑒別。序列表〈110〉江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所 〈120〉夏枯草區(qū)域道地性分子鑒別方法 〈160〉 3〈210〉 1 〈211〉 792 <212〉 DNA〈2i3〉來(lái)源于道地產(chǎn)區(qū)夏枯草(/^"/7e7" KW卵n's Linn.) 〈400〉1cttctcggtcUtgttUtacagattatgtgggtgg郷ELtggaagaaatggtg3tg3tg60tgg卿gtcatgttggtgtagtgstt犯ctctcgtttctt120tcttttcttgtgtgcagg3agcatgccccagatggg昭tggtgttgtggt180g眺ggagctt3tacgtgaactttgtsatagccatccaacaatgttggaa240ttgtggtcat犯gaagctccacacgtggcttagt3aagCC300tttagatatttttcttttaatatttctttgtaatagttattgg3tatta^c360tcatttattcttgttttgattattgtattgtcttttactt420taaattttgtttcttttaaattaggta犯cgttctaattt480tcsttctactcgtttt犯犯atcgttatccgatttaa^tt540aatgaaactc犯catcggagtttt3El犯ttcttaatggatatgagsactc600ggggtattac660tacgatcataatacatcttaacttcgtcactCttttC3gCttgactgtctcttgtactat720tgttgtcacttgatcatgacctttgtttatgtacttgfiaca犯tacttga780tgg3CCg卿郎792<210〉 2 〈211〉 24 <212> DNA <213〉人工引物 <400〉2cttctcggtc tttgttttta caga 24〈210> 3 <211〉 23 <212>薩 <213〉人工引物 <400>3cttctcggtc catcaagtat ttg 2權(quán)利要求
1.夏枯草道地性DNA分子鑒別的特異性片段，其序列為SEQ ID No.1所示。
2. 夏枯草道地性DNA分子鑒別的一組引物，該組引物由SEQIDNo.l所示序列設(shè)計(jì)合成，其 序列為SEQ ID No.2: 5'陽(yáng)CTTCTCGGTCTTTGTTTTTACAGA-3'，SEQ ID No.3: 5'-CTTCTCGGTCCATCAAGTATTTG-3'。
3. 夏枯草道地性DNA分子鑒別方法，其特征在于該方法是利用序列為SEQIDNo.2: 5'-CTTCTCGGTCTTTGTTTTTACAGA-3'和SEQ ID No.3: 5'-CTTCTCGGTCCATCAAGTATTTG-3'所示的引物對(duì)待鑒定樣品進(jìn)行PCR反應(yīng)，然后通過(guò)PCR反應(yīng)產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定 樣品，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果中出現(xiàn)一條792bp條帶的樣品來(lái)源于道地產(chǎn)區(qū)江蘇句容，而相同部位 沒(méi)有出現(xiàn)條帶的樣品則為其他產(chǎn)區(qū)的夏枯草材料。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于該反應(yīng)體系為2(VL，其組分及終濃度為lxTaq DNA酶緩沖液(10 mmol/LTris-HCl， 5Ommol/LKC1， 0.1%Trion x-lOO， pH8.4)， 2.5mmol/LMgCl2， lUTaq酶，60ng模板，0.3nmol/L引物，150|imol/LdNTP。反應(yīng)程序?yàn)?4。C預(yù)變性3min; 94。C變性45s， 58。C退火30s， 72。C延伸60s, 35個(gè)循環(huán)，最后72。C保溫5min， 4"C保存。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.4%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠(EB)染色，用凝膠成像系統(tǒng)觀察、拍照，用100bp 的DNA ladder作為分子量標(biāo)記,該方法中PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果中出現(xiàn)一條792bp條帶的樣品為來(lái) 源于道地產(chǎn)區(qū)江蘇句容的夏枯草，而相同部位無(wú)此條帶的樣品為其他產(chǎn)區(qū)的夏枯草。
全文摘要
本發(fā)明涉及中藥夏枯草道地性分子鑒別的方法，具體公開(kāi)了一段鑒定江蘇句容夏枯草的DNA片段和一組引物及鑒別方法。使用該組引物進(jìn)行PCR反應(yīng)可以從江蘇句容夏枯草中獲得792bp的擴(kuò)增片段，而在硬毛夏枯草、大花夏枯草及其他產(chǎn)區(qū)的夏枯草材料中無(wú)此片段，說(shuō)明該片段為江蘇句容夏枯草的特異片段，根據(jù)此片段設(shè)計(jì)出江蘇句容夏枯草的高特異性鑒別引物，能成功進(jìn)行夏枯草道地性的高特異性PCR鑒別。
文檔編號(hào)C12N15/11GK101230388SQ200710135289
公開(kāi)日2008年7月30日 申請(qǐng)日期2008年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月26日
發(fā)明者吳寶成, 杭悅宇, 趙亞美, 韋陽(yáng)連, 顧子霞, 興 高 申請(qǐng)人:江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所