專利名稱：一種乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶的共固定化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶的共固定化方法，具體涉及以明膠、 海藻酸鈉或/和卡拉膠為載體的包埋-交聯(lián)法；或以尼龍網(wǎng)為載體的交聯(lián)-共價法， 共固定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶，屬于食品生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
在大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)中使用游離酶，不僅會增加生產(chǎn)成本，而且由于混入 了外加蛋白，導(dǎo)致產(chǎn)品的質(zhì)量不高。酶經(jīng)過固定化之后，不僅能夠?qū)崿F(xiàn)連續(xù)操 作，反復(fù)回收使用，而且簡化了后續(xù)的分離步驟。固定化后的酶其物理化學(xué)性 質(zhì)會發(fā)生一定的改變，對溫度和pH的穩(wěn)定性得到增強，具有很大的優(yōu)越性。1970 年Mosbach建立了固定化多酶體系，實現(xiàn)了固定化多酶體系的共固定和共反應(yīng)。 共固定化酶技術(shù)不僅能使酶反應(yīng)的連續(xù)生產(chǎn)成為現(xiàn)實，簡化下游分離純化步驟， 而且還具有單獨固定化酶所不具有的協(xié)同反應(yīng)能力，能夠?qū)⒌孜镆徊睫D(zhuǎn)化成產(chǎn) 物，副反應(yīng)少，催化效率高，經(jīng)濟效益顯著。
目前工業(yè)上生產(chǎn)乳果糖主要采用化學(xué)催化法，但此法反應(yīng)條件激烈，得到 的產(chǎn)品色澤深，副產(chǎn)物多，催化劑分離困難，給糖漿的進一步純化及制取結(jié)晶 帶來困難。而采用酶法制備乳果糖專一性強、副產(chǎn)物較少、產(chǎn)品色澤淺，但成 本較高。因此有必要為乳果糖的生產(chǎn)開發(fā)出一種共固定化的乳糖酶和葡萄糖異 構(gòu)酶，以降低生產(chǎn)成本，提高催化效率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶的共固定化方法。通過研 究共固定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶的構(gòu)建，以期得到一種兩種酶的活力回收率 都比較高、半衰期長、載體對酶的傷害小、機械強度高的固定化方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案 一種乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶的共固定化方法，以明膠、 海藻酸鈉和/或卡拉膠中的一種或幾種為載體，采用先包埋后交聯(lián)的方法進行構(gòu) 建共固定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶；或以尼龍網(wǎng)為載體采用先交聯(lián)后共價結(jié)合 的方法進行構(gòu)建共固定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶；
(A)包埋-交聯(lián)法以明膠、海藻酸鈉和/或卡拉膠中的一種或幾種為載體， 采用先包埋后交聯(lián)的方法進行構(gòu)建共固定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶
a) 配制pH4—10的質(zhì)量濃度5%—27%的20g膠溶液，在30"C水浴中使膠完 全溶解；
b) 按照活力比2:1 —1:5將乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶溶于2mL去離子水中；
C)將b)配制的乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶的混合酶液添加到膠溶液中，使兩種 酶的添加量為l一30U/g膠溶液，攪拌混勻；
d) 在c)所得的膠溶液中加入2mL體積分?jǐn)?shù)0.05% — 5%的戊二醛，攪拌后立 即倒入培養(yǎng)皿中，4'C硬化過夜，得凝膠；
e) 次日將凝膠浸入到體積分?jǐn)?shù)0.05% — 5%的戊二醛中，在4。C一30。C交聯(lián) 10min—60min，然后用去離子水清洗凝膠若干次，濾紙吸干表面水，最后切成 2mm見方的小方塊，即為共固定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶；
或(B)交聯(lián)-共價法采用尼龍網(wǎng)為載體共固定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶
a) 尼龍網(wǎng)的預(yù)處理將60目的尼龍網(wǎng)裁成邊長2cm的小片，先用lmol/L NaOH浸洗10min，水洗至中性，再用lmol/LHCl浸洗10min，再水洗至中性， 然后用乙醇洗去水分，丙酮浸洗20min除去脂溶性雜質(zhì)，再用乙醇除去丙酮， 晾干，接著將尼龍網(wǎng)浸泡在含18.6% CaCl2禾卩18.6%水的甲醇溶液中，5(TC保 溫20min,將尼龍網(wǎng)濾出并徹底水洗，乙醇脫水，晾干；
b) 尼龍網(wǎng)的活化:將預(yù)處理后的尼龍網(wǎng)浸入到3-二甲氨基丙胺中7(TC活化5 一15h，徹底水洗；
c) 載體的交聯(lián)將活化后的尼龍網(wǎng)浸入體積分?jǐn)?shù)0.05%—5%、 pH4—10的戊 二醛中，4'C一3(TC浸泡10min—60min，接著用pH7的磷酸鹽緩沖液反復(fù)清洗 尼龍網(wǎng)；
d) 酶與載體的結(jié)合配制濃度為l一30U/mL的乳糖酶溶液，按照5g/100mL 酶液一30g/100mL酶液的量將尼龍網(wǎng)添加到乳糖酶液中，4"C一3(TC下不斷攪拌 浸泡5—20h，濾出尼龍網(wǎng)，水洗至水洗液中無蛋白之后再將尼龍網(wǎng)浸泡到l一 30U/ mL的葡萄糖異構(gòu)酶溶液中，尼龍網(wǎng)的添加量為100mL酶液用5-30g尼龍 網(wǎng)，4-C一30'C不停緩慢攪拌浸泡5—20h，最后用去離子水多次清洗尼龍網(wǎng)表面 至水洗液中無蛋白，用冷風(fēng)吹干即得共固定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶。
所用的游離乳糖酶的比活力為3000U/g，游離葡萄糖異構(gòu)酶的比活力為 2000U/g。
共固定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶用于乳糖為底物制備乳果糖。
一種用共固定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶制備乳果糖的方法，以共固定化乳 糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶為催化劑，以乳糖為單一底物制備乳果糖；
(A)共固定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶作為催化劑的間歇式乳糖轉(zhuǎn)化反應(yīng)
用pH4—10的磷酸鹽緩沖液配制5。/。一40W (w/w)的乳糖溶液，稍加熱使 乳糖溶解，添加1.5—10U/mL的共固定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶，在25—6(TC 溫度下反應(yīng)12—48h，并回收共固定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶；
或(B)共固定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶作為催化劑的連續(xù)式乳糖轉(zhuǎn)化反應(yīng): 用pH4—10的磷酸鹽緩沖液配制5。/。一40e/。 (w/w)的乳糖溶液，稍加熱使乳糖
溶解，自上而下進料反應(yīng)，按0.02_0.3mL/min的流速使乳糖溶液勻速通過裝載 共固定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶的恒溫酶反應(yīng)柱，溫度為25—70°C，單程操作。 本發(fā)明的有益效果
1、 與液態(tài)酶相比，共固定化酶具有能夠回收利用，簡化下游分離步驟等顯 著優(yōu)點。因此采用將乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶進行共固定化的方法，可以節(jié)約經(jīng) 濟成本，增強市場競爭力。
2、 與固定化單一酶相比，共固定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶能夠發(fā)揮兩種酶 之間的協(xié)同作用，實現(xiàn)底物到產(chǎn)物的一步轉(zhuǎn)化，減少副產(chǎn)物。因此采用將乳糖 酶和葡萄糖異構(gòu)酶進行共固定化的方法，具有提高反應(yīng)效率和產(chǎn)品質(zhì)量等優(yōu)點。


圖1共固定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶的熱穩(wěn)定性變化。 圖2共固定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶的pH穩(wěn)定性變化。 圖3共固定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶的操作穩(wěn)定性。
具體實施例方式
實施例1:配制pH 8.6 27。/。(w/w)明膠溶液20g，在3(TC水浴中使明膠完全 溶解，按照活力比l:l將乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶溶于2mL去離子水中，將酶液 加到明膠中，使兩種酶的添加量均為3U/g (明膠溶液)，攪拌混勻，再加入體積 分?jǐn)?shù)為0.15。/。的戊二醛2mL，攪拌后立即倒入培養(yǎng)皿，在4。C固化過夜，次日將 其浸入體積分?jǐn)?shù)為0.15%的戊二醛中4'C交聯(lián)10min，然后用去離子水清洗多次， 濾紙吸干表面水，最后切成2mm見方的小方塊。測得共固定酶中乳糖酶的回收 率為30.85%，葡萄糖異構(gòu)酶的回收率為83.48%。
圖1顯示了游離乳糖酶、游離葡萄糖異構(gòu)酶及共固定化乳糖酶和葡萄糖異 構(gòu)酶的熱穩(wěn)定性變化，并均以酶在20。C保溫lh的活力作為100%。如圖示，游 離乳糖酶在不高于3(TC保溫lh活力始終保持在90%以上，而在35'C保溫后活 力迅速下降到80.55%;游離葡萄糖異構(gòu)酶在不高于35'C時保溫lh活力始終保 持在90%以上，而在40。C保溫后活力迅速下降到83.31%;而共固定化乳糖酶和 葡萄糖異構(gòu)酶在不高于45'C時保溫lh活力始終保持在90%以上，在5(TC保溫 后活力下降到84.47%。說明共固定化之后酶的熱穩(wěn)定性比兩種游離酶有所提高。
圖2顯示了游離乳糖酶、游離葡萄糖異構(gòu)酶及共固定化乳糖酶和葡萄糖異 構(gòu)酶的pH穩(wěn)定性變化。如圖示，游離乳糖酶在pH 6.2保存8h活力最大，pH6.8 保存殘余活力為96.82%，髙于或低于這個范圍其殘余活力迅速下降；游離葡萄 糖異構(gòu)酶在pH8.5保存8h活力最大，pH 7.5—8.5之間保存殘余活力始終保持在 90%以上，高于或低于這個范圍其殘余活力迅速下降；而共固定化乳糖酶和葡萄 糖異構(gòu)酶在pH 7.5保存8h活力最大，在pH6.8—9之間保存殘余活力始終保持 在90%左右，高于或低于這個范圍其殘余活力迅速下降。說明共固定化之后酶
的pH穩(wěn)定性比兩種游離酶大大提高。
圖3顯示了同一批共固定乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶在45°C、 pH7.5不同操作 次數(shù)后的殘余活力，并以第一次使用時的活力作為100%。如圖示，在第二次使 用時，體系殘余酶活力比第一次下降了約10%，之后數(shù)次使用損失都不是很大， 經(jīng)過6次使用，酶活力仍然保持在77%，直到第八次使用時，其殘余活力下降 到不足40%。
實施例2:配制含明膠與海藻酸鈉質(zhì)量濃度分別為20%和4%的混合膠液 20g， pH7，在3(TC水浴中完全溶解，按照活力比1:2將乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶 溶于2mL去離子水，將酶液加到混合膠液中，使乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶的添加 量分別為9U/g和18U/g (混合膠液)，攪拌混勻，再加入體積分?jǐn)?shù)0.25%的戊二 醛2mL，注入培養(yǎng)皿，冷凝后用4MCaCl2浸泡過夜。次日用去離子水洗滌，清 澈后用體積分?jǐn)?shù)0.25。/。的戊二醛15"C交聯(lián)30min，再用去離子水清洗多次，濾紙 吸干表面水，切成2mm見方的小方塊。
實施例3:配制pH7.5 20。/。的卡拉膠溶液20mL，在30'C水浴中使卡拉膠完 全溶解，按照活力比l:5將乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶溶于2mL去離子水，將酶液 加到卡拉膠溶液中，使乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶的添加量分別為6U/g和30U/g(卡 拉膠溶液)，攪拌混勻，再加入體積分?jǐn)?shù)為P/。的戊二醛2mL，攪拌后立即倒入 培養(yǎng)皿，固化后將其浸入0.2mol/LKCl中4'C硬化過夜。次日用體積分?jǐn)?shù)1%的 戊二醛3(TC交聯(lián)40min，然后用去離子水清洗多次，濾紙吸干表面水，切成2mm 見方的小方塊。
實施例4:將60目的尼龍網(wǎng)先用lmol/LNaOH浸洗10min，水洗至中性， 再用lmol/LHCl浸洗10min,水洗至中性，接著用乙醇洗去水分，丙酮洗20min 除去脂溶性雜質(zhì)，乙醇除去丙酮，晾干。然后將尼龍網(wǎng)用含18.6。/。CaCl2和18.6% 水的甲醇溶液在5(TC水浴處理20min，徹底水洗，乙醇脫水，再晾干。再將尼 龍網(wǎng)浸入3-二甲氨基丙胺中7(TC浸泡活化12h，徹底水洗。用體積分?jǐn)?shù)3%的戊 二醛，6"C下浸泡尼龍網(wǎng)lh，然后濾出尼龍網(wǎng)用pH7的磷酸鹽緩沖液反復(fù)清洗。 配制濃度為20U/mL的乳糖酶溶液，按照100mL酶液用20g尼龍網(wǎng)的量將尼龍 網(wǎng)添加到乳糖酶液中，4'C下浸泡10h，并不斷攪拌。濾出尼龍網(wǎng)，水洗至水中 無蛋白。之后再將尼龍網(wǎng)浸泡到20U/ mL的葡萄糖異構(gòu)酶溶液中，尼龍網(wǎng)的添 加量為100mL酶液用20g尼龍網(wǎng)，4'C浸泡10h，并不停緩慢攪拌。最后用去離 子水多次清洗尼龍網(wǎng)表面至水中無蛋白，用冷風(fēng)吹干即可。
權(quán)利要求
1、一種乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶的共固定化方法，其特征是以明膠、海藻酸鈉和/或卡拉膠中的一種或幾種為載體，采用先包埋后交聯(lián)的方法進行構(gòu)建共固定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶；或以尼龍網(wǎng)為載體采用先交聯(lián)后共價結(jié)合的方法進行構(gòu)建共固定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶；(A)包埋-交聯(lián)法以明膠、海藻酸鈉和/或卡拉膠中的一種或幾種為載體，采用先包埋后交聯(lián)的方法進行構(gòu)建共固定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶a)配制pH4-10的質(zhì)量濃度5％-27％的20g膠溶液，在30℃水浴中使膠完全溶解；b)按照活力比2∶1-1∶5將乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶溶于2mL去離子水中；c)將b)配制的乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶的混合酶液添加到膠溶液中，使兩種酶的添加量為1-30U/g膠溶液，攪拌混勻；d)在c)所得的膠溶液中加入2mL體積分?jǐn)?shù)0.05％-5％的戊二醛，攪拌后立即倒入培養(yǎng)皿中，4℃硬化過夜，得凝膠；e)次日將凝膠浸入到體積分?jǐn)?shù)0.05％-5％的戊二醛中，在4℃-30℃交聯(lián)10min-60min，然后用去離子水清洗凝膠若干次，濾紙吸干表面水，最后切成2mm見方的小方塊，即為共固定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶；或(B)交聯(lián)-共價法采用尼龍網(wǎng)為載體共固定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶a)尼龍網(wǎng)的預(yù)處理將60目的尼龍網(wǎng)裁成邊長2cm的小片，先用1mol/LNaOH浸洗10min，水洗至中性，再用1mol/L HCl浸洗10min，再水洗至中性，然后用乙醇洗去水分，丙酮浸洗20min除去脂溶性雜質(zhì)，再用乙醇除去丙酮，晾干，接著將尼龍網(wǎng)浸泡在含18.6％CaCl2和18.6％水的甲醇溶液中，50℃保溫20min，將尼龍網(wǎng)濾出并徹底水洗，乙醇脫水，晾干；b)尼龍網(wǎng)的活化將預(yù)處理后的尼龍網(wǎng)浸入到3-二甲氨基丙胺中70℃活化5-15h，徹底水洗；c)載體的交聯(lián)將活化后的尼龍網(wǎng)浸入體積分?jǐn)?shù)0.05％-5％、pH4-10的戊二醛中，4℃-30℃浸泡10min-60min，接著用pH 7的磷酸鹽緩沖液反復(fù)清洗尼龍網(wǎng)；d)酶與載體的結(jié)合配制濃度為1-30U/mL的乳糖酶溶液，按照5g/100mL酶液-30g/100mL酶液的量將尼龍網(wǎng)添加到乳糖酶液中，4℃-30℃下不斷攪拌浸泡5-20h，濾出尼龍網(wǎng)，水洗至水洗液中無蛋白之后再將尼龍網(wǎng)浸泡到1-30U/mL的葡萄糖異構(gòu)酶溶液中，尼龍網(wǎng)的添加量為100mL酶液用5-30g尼龍網(wǎng)，4℃-30℃不停緩慢攪拌浸泡5-20h，最后用去離子水多次清洗尼龍網(wǎng)表面至水洗液中無蛋白，用冷風(fēng)吹干即得共固定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶的共固定化方法，其 特征是所用的游離乳糖酶的比活力為3000U/g，游離葡萄糖異構(gòu)酶的比活力為 2000U/g。
3、 用權(quán)利要求l所述方法構(gòu)建的共固定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶的應(yīng)用， 其特征是將共固定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶用于以乳糖為底物制備乳果糖。
全文摘要
一種乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶的共固定化方法，屬于食品生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明是以明膠、海藻酸鈉和/或卡拉膠為載體，采用先包埋后交聯(lián)；或以尼龍網(wǎng)為載體，采用先交聯(lián)后共價結(jié)合的方法共固定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶。本發(fā)明的獨特之處是將乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶進行共固定化，不僅能夠?qū)崿F(xiàn)酶的回收利用，節(jié)約經(jīng)濟成本，簡化下游分離步驟，而且在反應(yīng)過程中能夠發(fā)揮兩種酶之間的協(xié)同作用，提高反應(yīng)效率。本發(fā)明思路新穎，流程簡單，實用性強，所得到的共固定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶可以用來轉(zhuǎn)化乳糖制備乳果糖，具有較好的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N11/04GK101182508SQ200710134998
公開日2008年5月21日 申請日期2007年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月2日
發(fā)明者芳 劉, 楊瑞金 申請人:江南大學(xué)