專利名稱：豬精囊腺生物反應(yīng)器及利用其生產(chǎn)重組蛋白或多肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種在轉(zhuǎn)基因豬精囊腺中合成重組蛋白或多肽并分泌至公豬精液中的方 法，更具體而言，涉及一種轉(zhuǎn)基因豬精囊腺生物反應(yīng)器及利用該生物反應(yīng)器生產(chǎn)重組蛋白 或多肽的方法。
背景技術(shù)：
目前許多珍貴的藥用蛋白可利用DNA重組技術(shù)在細菌、真菌和酵母中表達，經(jīng)大規(guī)模 的培養(yǎng)而進行生產(chǎn)。但是許多蛋白質(zhì)的生物活性是經(jīng)后加工后才具有的，比如進行糖基化、 羥基化和羧基化。在許多情況下，原核細菌缺乏轉(zhuǎn)譯后加工修飾能力，而酵母細胞對表達 蛋白的加工模式不同于人源蛋白質(zhì)，表達產(chǎn)物可能有免疫原性或無活性。雖然動物細胞培 養(yǎng)基因工程制藥體系可以實現(xiàn)這些活性加工過程，但動物細胞培養(yǎng)體系成本太高，產(chǎn)量較 低，無法滿足大多藥用蛋白的臨床需求。利用轉(zhuǎn)基因動物生物反應(yīng)器生產(chǎn)的蛋白是在動物 體內(nèi)合成和分泌的，體內(nèi)系統(tǒng)環(huán)境具有對異源蛋白質(zhì)進行翻譯后修飾和加工功能，生產(chǎn)的 蛋白質(zhì)生理活性好，與人同源性高，非常接近天然產(chǎn)品，而且產(chǎn)量高、成本低。這是其它 表達系統(tǒng)所無法比擬的。因此轉(zhuǎn)基因動物生物反應(yīng)器是當前極具發(fā)展前景的蛋白藥物生產(chǎn) 方式。轉(zhuǎn)基因動物生物反應(yīng)器是指利用轉(zhuǎn)基因活體動物的某種能夠高效表達外源蛋白的器 官或組織來進行工業(yè)化生產(chǎn)活性功能蛋白的技術(shù)，這些蛋白 一般是藥用蛋白或營養(yǎng)保健蛋 白。用于表達的生物反應(yīng)器包括動物血液、泌尿系統(tǒng)、乳腺等，還包括禽蛋和昆蟲(例如 家蠶)個體等。其基本原理是應(yīng)用重組DNA技術(shù)，構(gòu)建具有在組織特異表達的啟動子和 目的基因及其它相關(guān)元件的基因表達載體，然后利用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)將該表達載體整合到動 物的基因組中，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物，該基因表達載體則能在相應(yīng)組織特異表達并分泌到相應(yīng)體液中。據(jù)此原理，任何具有大量表達某種或某些蛋白的組織或器官都具有研發(fā)生物反應(yīng) 器的可能。自從第一只轉(zhuǎn)基因小鼠誕生以來，人們就提出了利用轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)藥用蛋白的可 能。目前利用轉(zhuǎn)基因動物生物反應(yīng)器生產(chǎn)重組蛋白已經(jīng)取得重要進展，特別是動物乳腺生 物反應(yīng)器。目前全世界有二三十家公司致力于開發(fā)動物生物反應(yīng)器重組蛋白藥物，包括重組人抗凝血酶m(預(yù)防和治療急慢性血栓血塞形成)、重組組織血纖維蛋白溶酶原激活劑 (抗栓藥)和人ci抑制劑(治療血管神經(jīng)性水腫的藥物)等，其中重組人抗凝血酶in是 第一個獲準上市的動物生物反應(yīng)器蛋白藥物。轉(zhuǎn)基因綿羊、牛和兔乳腺生物反應(yīng)器等生產(chǎn) 的重組蛋白已經(jīng)完成或進入臨床m期試驗，還有io多種重組蛋白藥物處于臨床研究，另 有數(shù)百種重組蛋白處于研發(fā)階段。此外還有動物血液生物反應(yīng)器、膀胱生物反應(yīng)器(尿液 中生產(chǎn)重組蛋白)等表達系統(tǒng)處在不同的研發(fā)階段。然而，相比較而言，乳腺等表達系統(tǒng)也存在一些無法改進的不足，如出生至第一次泌乳時間間隔相當長；繁殖周期長；存在較長的泌乳間隔期；有些動物比較難以收集乳汁， 如豬、兔等；另外有些乳腺表達的外源生物活性蛋白能被動物吸收，可能對動物健康有害， 特別是在表達水平比較高時。轉(zhuǎn)基因雞生物反應(yīng)器目前所不能克服的缺點是禽類的胚胎發(fā)育與哺乳類相比較有很多 不同點，對它的研究暫時落后于其它動物，使得轉(zhuǎn)基因雞的應(yīng)用仍存在較多困難，致使在 哺乳動物中己經(jīng)廣泛應(yīng)用的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，不適合在禽類中應(yīng)用。而對于血液生物反應(yīng)器而 言，由于人源和家畜血液中的蛋白往往比較相似，再加上血液的成份比較復(fù)雜，分離比較 困難；此外高濃度外源蛋白在血液中，可能對動物機體健康有害，這些不利因素限制了血 液表達系統(tǒng)的應(yīng)用。尿液表達系統(tǒng)的主要問題是尿中能夠表達的外源蛋白產(chǎn)量比較低。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個目的在于提供一種在轉(zhuǎn)基因公豬精囊腺中生產(chǎn)重組蛋白或多肽的方法， 其具有產(chǎn)量大，分離純化簡單，無繁殖間隔期等特點。本發(fā)明另一個目的在于提供了一種在公豬精囊腺組織中特異表達和分泌外源蛋白的 基因表達載體。本發(fā)明人以小鼠為實驗動物模型，經(jīng)過大量基礎(chǔ)研究工作，終于完成了本發(fā)明。
在轉(zhuǎn)基因豬精囊腺組織中特異表達的基因表達載體，該表達載體所含的5'側(cè)翼區(qū)、 啟動子、信號肽、多聚腺苷酸化信號和3'側(cè)翼區(qū)序列能指導(dǎo)外源基因在公豬精囊腺組織
中特異表達，并分泌重組蛋白或多肽至精液中。
所述的啟動子選自豬精漿蛋白基因的啟動子。選自豬精漿蛋白基因的啟動子為豬精漿 中精子粘附素蛋白家簇基因的啟動子。豬精漿中精子粘附素蛋白家簇基因的啟動子為豬精 漿蛋白I基因或精漿蛋白II基因的啟動子。
所述的在轉(zhuǎn)基因豬精囊腺組織中特異表達的基因表達載體，還包括一段豬精槳蛋白I
基因或精漿蛋白n基因的5'側(cè)翼序列。
所述的信號肽DNA序列為豬精漿蛋白I基因或精漿蛋白II基因的信號肽序列。 所述的3'側(cè)翼序列為豬精漿蛋白I基因或精漿蛋白II基因的3'側(cè)翼序列。 所述的多聚腺苷酸化信號序列為豬精漿蛋白I基因或精漿蛋白II基因的多聚腺苷酸化 信號序列。
本發(fā)明提供的一套全新的以轉(zhuǎn)基因豬為宿主動物的生物反應(yīng)器，由轉(zhuǎn)基因豬精囊腺組 織組成，其中所述的轉(zhuǎn)基因豬由上述本發(fā)明提供的基因表達載體制作而成。
利用這個系統(tǒng)，可以從轉(zhuǎn)基因豬精液中獲取基因重組蛋白或多肽。本發(fā)明的生物反應(yīng) 器提供了一種在活體狀態(tài)下在特定組織特異表達蛋白質(zhì)和多肽，并進行糖基化、羥基化和 羧基化等生物活性加工方法。
從轉(zhuǎn)基因豬精囊腺生產(chǎn)外源蛋白或多肽的方法，主要包括如下步驟(1)構(gòu)建在公 豬精囊腺組織特異表達的基因表達載體；(2)釆用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，如精子 載體法或胚胎顯微注射法將基因表達載體整合進動物基因組中，制作轉(zhuǎn)基因動物；(3) 母豬分娩后，采集后代仔豬的血細胞或組織DNA分析和確定轉(zhuǎn)基因個體；(4)培育轉(zhuǎn)基 因公豬和母豬至性成熟并交配傳代；(5)采集F0或Fl代性成熟轉(zhuǎn)基S公豬的精液，分 析外源基因表達產(chǎn)物的含量，選擇高產(chǎn)個體作為生物反應(yīng)器的宿主或作為生物反應(yīng)器種 豬；(6)從性成熟轉(zhuǎn)基因公豬的精液中分離純化所述的外源蛋白或多肽。更具體地，對本發(fā)明的進一步描述如下-
轉(zhuǎn)基因動物生物反應(yīng)器的關(guān)鍵是獲得高效特異表達的基因表達載體。本發(fā)明成功裝配 了一套合適的基因表達載體，攜帶有該表達載體的轉(zhuǎn)基因公豬能在精囊腺組織中特異地高 水平表達外源基因，進行相應(yīng)生物活性加工，并分泌至精液中。在一個實施方案中，本發(fā) 明的基因表達載體的啟動子是源自公豬精漿蛋白的主要成員精漿蛋白II(porcine seminal proteins II， PSPII)基因的啟動子，該啟動子是基因高效表達的重要調(diào)控元件。豬精漿 蛋白I和II是精子黏附蛋白(Spermadhesion)家簇的主要成員，主要在精囊腺表達，精 漿蛋白工和II的含量占精漿總蛋白的50%以上，提示該基因的表達調(diào)控元件具有高效特異 表達的特性。在本發(fā)明的其它實施方案中，能在公豬精囊腺組織中表達，并在精液中含有 的精漿蛋白的基因表達調(diào)控元件(啟動子、信號肽和多聚腺苷酸化信號等)均可指導(dǎo)外源 基因表達。
除啟動子外，本發(fā)明的基因表達載體還裝配了豬精漿蛋白II信號肽(SP)和多聚腺 苷酸(poly A)化信號及5'和3'側(cè)翼區(qū)序列，這些基因表達調(diào)控元件能使表達的外源 基因的信使核糖核酸(mRNA)趨于穩(wěn)定，延長其半衰期，提高其在組織的表達量。
上述基因元件預(yù)先裝配在可在大腸桿菌里復(fù)制的質(zhì)粒載體上，外源基因通過克隆位點 插入啟動子下游，從而構(gòu)建成含外源基因的表達載體。該基因表達載體可通過本領(lǐng)域技術(shù) 人員熟知的方法，進行重組質(zhì)粒的大量制備和純化，然后利用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的精子 載體法或胚胎顯微注射法等進行轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)。
轉(zhuǎn)基因仔豬出生后，利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和Southern印跡技術(shù)分析確定轉(zhuǎn)基因 個體(F0)，傳代(Fl)并培育至性成熟。收集F0和F1成年公豬精液，檢測目標蛋白的 表達水平。優(yōu)選表達水平高的公豬作為本發(fā)明的生物反應(yīng)器宿主進行種群擴繁。
本發(fā)明方法先進簡單，成本低。在公豬精囊腺中特異表達的基因表達載體，該表達載 體含啟動子、信號肽和多聚腺苷酸化信號的DNA序列等調(diào)控元件，當該表達載體通過轉(zhuǎn)基 因技術(shù)整合入豬基因組中后，重組蛋白或多肽能在轉(zhuǎn)基因成年公豬精囊腺組織中特異表 達，并分泌至精液中。本發(fā)明的特點是所生產(chǎn)的重組蛋白或多肽可以從精液中直接收獲。
利用轉(zhuǎn)基因豬精囊腺生產(chǎn)外源蛋白是很有吸引力的一個全新領(lǐng)域。與其它動物相比，制作豬精囊腺生物反應(yīng)器，利用豬精液生產(chǎn)外源蛋白具有獨特優(yōu)勢(1)豬的精液量較 大， 一次射精在200-400ml左右，精液中的蛋白質(zhì)含量較高，每次射精精液中的蛋白質(zhì)可 達6-9克，并且其中主要蛋白精漿蛋白1和精漿蛋白11占50%以上，主要由精囊腺分泌， 其基因的調(diào)控區(qū)非常適合做基因表達載體的調(diào)控元件。(2)豬的精囊腺組織具有表達和 加工復(fù)雜蛋白的能力；(3)公豬性成熟早，6-9月齡即性成熟；成年后可持續(xù)利用，每周 可采集4-5次，精液在一年四季中可以不斷采集，可利用年限長達4-6年；(4)豬精液 采集和處理技術(shù)已經(jīng)相當成熟，精液成份也相對簡單，容易純化蛋白；(5)容易繁殖， 產(chǎn)仔數(shù)多， 一旦成功研制轉(zhuǎn)基因種豬，即可迅速繁殖，擴大種群，產(chǎn)業(yè)化后商業(yè)成本低；(6)表達產(chǎn)物主要在精囊腺組織及精液中，對身體的潛在危害小。因此豬精囊腺生物反 應(yīng)器具有和牛乳腺生物反應(yīng)器同樣的生產(chǎn)潛力，而在維持成本、生產(chǎn)周期等方面具有明顯 優(yōu)勢。


圖1示出豬精漿蛋白II基因5'調(diào)控序列的克隆，重組質(zhì)粒命名為pMDI8-T-PSPII 5。 (實施例l所述)圖2示出將豬精漿蛋白II基因5'調(diào)控序列亞克隆至改造的pcDNA3.0載體,命名為 pcPSPI15。(實施例1所述)圖3示出豬精漿蛋白II基因3'調(diào)控序列的克隆，重組質(zhì)粒命名為pMD18-T-PSPI1 3。 (實施例l所述)圖4示出含有豬精漿蛋白II基因5'調(diào)控序列、多聚腺苷酸化信號和3'側(cè)翼區(qū)序列 的特異表達載體的構(gòu)建，重組載體命名為pcPSPI153。(實施例l所述)圖5示出含有豬精漿蛋白II基因啟動子、信號肽、多聚腺苷酸化信號和3'側(cè)翼區(qū)序 列的pcPSPII重組質(zhì)粒的構(gòu)建。(實施例1所述)圖6示出含有豬精漿蛋白II基因啟動子、信號肽、增強型綠色熒光蛋白報告基因、多聚腺苷酸化信號和3'側(cè)翼區(qū)序列的pcPSPII-EGFP重組質(zhì)粒的構(gòu)建。(實施例1所述) 圖7示出進行轉(zhuǎn)基因小鼠制作時所用的表達構(gòu)件，含豬精漿蛋白II基因啟動子、信號
肽序列、增強型綠色螢光蛋白報告基因的編碼序列、豬精漿蛋白II基因多聚腺苷酸化信號
序列和3'端側(cè)翼區(qū)。(實施例2所述)
圖8示出轉(zhuǎn)基因小鼠的PCR鑒定結(jié)果。(實施例3所述)
圖9示出綠色熒光蛋白在轉(zhuǎn)基因陽性公鼠精囊腺組織中的表達。(實施例3所述)
圖IO示出轉(zhuǎn)基因陽性公鼠交配后形成的陰道栓中綠色熒光蛋白的表達。(實施禍3所
述)
具體實施例方式
實施例1構(gòu)建基因表達載體
為了構(gòu)建能在公豬精囊腺中表達的專用表達載體，并分泌至精液中，本實施方案選擇 pcDNA3.0作為載體構(gòu)建的基礎(chǔ)骨架，依次將各種基因元件插入改造后的pcDNA3.0載體。
1. pcDNA3.0的改造根據(jù)酶切圖譜分析結(jié)果，用限制酶PvuII消化pcDNA3.0載體， 切除其中的neo基因及其表達調(diào)控序列，消化產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分離，用DNA凝膠 回收試劑盒回收3.2kb片段，自體連后轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)大腸桿菌，從陽性轉(zhuǎn)化菌種獲得 不含neo基因及其表達調(diào)控序列的改造質(zhì)粒。
2. 制備和克隆豬精漿蛋白II基因啟動子根據(jù)Genbank己發(fā)表的豬精漿蛋白II基因 序列(AJ853849)，用DNASTAR分析PSP-II基因全序列的限制性內(nèi)切酶位點，并設(shè)計一 對引物擴增PSP-II基因5'端側(cè)翼區(qū)，長度為4087bp，上游至-4087，下游至ATG起始密 碼子處，其中包括啟動子。上游引物為5' —AG rCGCG^ TGA GTT GAG GGG TAT TCA CCA AAC —3'，在引物中引進了 Nru I酶切位點(下劃線處)，下游引物為5' —AT GGC^CGCGrCTC AGC AGC CTG GCC CTAGC— 3，在引物中引進了 Kpn I和Mlu I 酶切位點(下劃線處)。取500納克豬基因組模板，加入上述引物，在高保真DNA聚合酶 LATaq (日本寶生物公司)作用下(反應(yīng)體系參數(shù)按說明書設(shè)置)，經(jīng)95'C預(yù)變性5分鐘；94。C變性40秒，6rC復(fù)性90秒，72。C延伸6分鐘，共30循環(huán)；然后72。C延伸10分鐘， 最后擴增出長度為4087bp的豬精漿蛋白II基因5'端側(cè)翼區(qū)，該片段即含有精漿蛋白II 基因的啟動子。PCR擴增產(chǎn)物于0.7n/。瓊脂糖凝膠中進行電泳，然后切膠回收純化4087bp 長度的目標DNA片段，純化用DNA片段純化試劑盒(TaKaRa Agarose Gel DNA Purification KitVer.2.0，日本寶生物公司)，按操作說明書進行。然后按常規(guī)方法克隆入TA克隆載體 pMD18-T (日本寶生物公司)，篩選陽性克隆，并對陽性克隆進行酶切和測序鑒定，得到 含4087bp的豬精漿蛋白II基因5'端側(cè)翼區(qū)的pMD18-T-PSPI15重組質(zhì)粒(圖1 )。然后將 pMD18-T-PSPII5重組質(zhì)粒和改造過的pcDNA3質(zhì)粒用Nrul和Kpnl進行酶切，電泳后切膠 回收純化4087bp和線性化的2589bp片段，在T4 DNA連接酶的作用下進行連接，轉(zhuǎn)化大 腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，挑取轉(zhuǎn)化后生長的白色菌落接種于lml含10(Vg/ml氨芐青霉素 的LB培養(yǎng)基中，37'C振蕩培養(yǎng)10-12小時，然后按照常規(guī)方法提取質(zhì)粒DNA,篩選陽性 克隆，進行酶切鑒定，得到含4087bp的豬精漿蛋白II基因5'端側(cè)翼區(qū)的pcPSPI15重組 質(zhì)粒(圖2)。
3.制備和克隆豬精漿蛋白II基因3'端側(cè)翼區(qū)根據(jù)Genbank已發(fā)表的豬精漿蛋白 II基囟序列(AJ853849)，用DNASTAR分析PSP-II基因全序列的限制性內(nèi)切酶位點，并 設(shè)計一對引物擴增PSP-II基因3'端側(cè)翼區(qū)，長度為3094bp，上游至終止密碼子，下游至 終止密碼子后3094bp，其中包括PSP-II基因多聚腺苷酸化信號序列。上游引物為5' CT ^e￡i￡￡TGCTGTAATCATTTTGAATAAAG3，，在引物中引進了KpnI酶切位點(下 劃線處)，下游引物為5'ATCT2^GTGAACTGTTTACCATGAATTGT3'，在引物中 引進了Xho I酶切位點(下劃線處)。取500納克豬基因組模板，加入上述引物，在高保 真DNA聚合酶LATaq (日本寶生物公司)作用下(反應(yīng)體系參數(shù)按說明書設(shè)置)，經(jīng)95°C 預(yù)變性5分鐘；94。C變性40秒，57'C復(fù)性60秒，72。C延伸4分鐘，共30循環(huán)；然后72°C 延伸10分鐘，最后擴增出長度為3094bp的豬精漿蛋白II基因3'端側(cè)翼區(qū)，該片段含有 精漿蛋白II基因多聚腺苷酸(polyA)化信號序列。PCR擴增產(chǎn)物于0.7。/。瓊脂糖凝膠中進 行電泳，然后切膠回收純化3094bp長度的目標DNA片段，按本實施方案例子中第2條所 述方法插入pMD18-T克隆載體，并對陽性克隆進行酶切和測序鑒定，得到含3094bp的豬精漿蛋白II基因3'端側(cè)翼區(qū)的pMD18-T-PSPII3重組質(zhì)粒(圖3)。然后將pMD18-T-PSPII3 和pcPSPII5'用Kpnl和Xhol進行酶切，電泳后切膠回收純化3094bp和線性化的pcPSPI15 片段，按本實施方案例子中第2條所述方法進行連接，轉(zhuǎn)化，篩選陽性克隆，進行酶切鑒 定，得到含4087bp的豬精漿蛋白II基因5'端側(cè)翼區(qū)和含3094bp的豬精漿蛋白1I基因3' 端側(cè)翼區(qū)的重組質(zhì)粒pcPSPI153 (圖4)。
4. 合成豬精漿蛋白II基因信號肽序列和插入位點:按照豬精漿蛋白II基因的mRNA序 列(NM_213836)所示，其信號肽長為21個氨基酸，自ATG起，共由63個核苷酸編碼。 根據(jù)此序列，從ATG起始密碼子，人工合成此信號肽的DNA雙鏈序列，并延伸了豬精漿 蛋白II成熟肽的兩個氨基酸的密碼子(GCACGG)，使信號肽易于識別。最后在5'端引 入MM酶切位點(ACGCGT，如下圖所示下劃線部分)，在3'端引入EcoRV HindIII Not I Kpn I酶切位點(GATATC AAGCTT GCGGCCGC GGTACC，如下圖所示下劃線部分)， 便于外源基因的插入。合成的信號肽編碼序列和插入位點如下
MM EcoR V他d III Notl Kpnl
ACGCGTATGAAGCTGGGCACTGCCATCCCCTGGGCaTGCTGCTCAGTACAGCCACACTGGnTCAACTGCACGGGATATCAAGCnGCGGCCGCGGTACC 5' 3'
5. 裝配豬精漿蛋白II基因信號肽序列和插入位點將重組質(zhì)粒pcPSPI153和人工合 成的信號肽DNA雙鏈序列片段用Kpnl和Mlul進行酶切，電泳后切膠回收純化線性化片 段，按本實施方案例子中第2條所述方法進行連接，轉(zhuǎn)化，篩選陽性克隆，進行酶切和測 序鑒定，得到含4087bp的豬精漿蛋白II基因5'端側(cè)翼區(qū)、信號肽序列和3094bp的豬精 漿蛋白II基因3'端側(cè)翼區(qū)pcPSPII重組質(zhì)粒(圖5)。
6. 在pcPSPII表達載體中插入綠色螢光蛋白報告基因?qū)cPSPII重組質(zhì)粒和商業(yè)化 質(zhì)粒pEGFP-Nl用HindIII和Notl進行酶切，電泳后切膠回收純化目的片段，按本實施方 案例子中第2條所述方法進行連接，轉(zhuǎn)化，篩選陽性克隆，進行酶切和PCR鑒定，將增強 型綠色螢光蛋白報告基因的編碼序列插入pcPSPII，得到pcPSPII-EGFP重組質(zhì)粒(圖6)。
實施例2通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將表達構(gòu)件導(dǎo)入小鼠基因組
將pcPSPII-EGFP表達載體用Nrul和Xhol酶切，電泳后切膠回收純化含豬精漿蛋白II基因啟動子、信號肽序列、綠色螢光蛋白報告基因的編碼序列、豬精漿蛋白II基因多聚 腺苷酸化信號序列和3'端側(cè)翼區(qū)的目的片段(圖7)。將30微克該片段用多聚陽離子PEI 包裹，注入到六周齡的公鼠睪丸中，共注射三次，間隔為3天，從最后一次注射算起，20 天后，將注射的公鼠與正常母鼠進行交配。待雜交小鼠出生后用PCR鑒定，篩選轉(zhuǎn)基因陽 性小鼠。并繼續(xù)培育轉(zhuǎn)基因陽性公鼠和母鼠到性成熟(FO),并與正常小鼠交配，培育出 Fl代轉(zhuǎn)基因陽性公鼠和母鼠。圖8顯示了F0代和F1代轉(zhuǎn)基因小鼠PCR鑒定結(jié)果。圖A 代表了FO代檢測結(jié)果，泳道1-5為F0代個體，泳道6為陽性對照，泳道7為非轉(zhuǎn)基因小 鼠陰性對照，其中泳道2， 4為轉(zhuǎn)基因陽性小鼠。圖B代表了F1代檢測結(jié)果，泳道l-8為 轉(zhuǎn)基因陽性小鼠，泳道9為非轉(zhuǎn)基因小鼠陰性對照，泳道10為陽性對照。 實施例3分析轉(zhuǎn)基因公鼠中外源基因的表達
將實施例2中的性成熟轉(zhuǎn)基因陽性公鼠Fl代的轉(zhuǎn)基因公鼠切開腹腔，分別切下一塊 精囊腺組織，制作冰凍切片。同時取一只陰性公鼠，制作冰凍切片，作為對照，于熒光顯 微鏡下觀察綠色熒光，在轉(zhuǎn)基因陽性公鼠的精囊腺組織觀察到綠色熒光，而在陰性對照公 鼠中觀察不到綠色熒光(圖9)。其中圖A為轉(zhuǎn)基因陽性小鼠精囊腺組織切片，圖B為非 轉(zhuǎn)基因小鼠精囊腺組織切片。并將轉(zhuǎn)基因陽性公鼠與正常母鼠交配后收集陰道栓，用緩沖 液(TrislOmM,EDTAlmM)溶解陰道栓，于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光，在轉(zhuǎn)基因陽性 公鼠交配后收集到的陰道栓溶解液中觀察到綠色熒光，而在陰性對照公鼠交配后收集到的 陰道栓溶解液中觀察不到綠色熒光(圖10)。其中圖A為轉(zhuǎn)基因陽性公鼠與正常母鼠交 配后所收集陰道栓的溶解液，圖B為非轉(zhuǎn)基因陽性公鼠與正常母鼠交配后所收集陰道栓的 溶解液。
權(quán)利要求
1、一種在轉(zhuǎn)基因豬精囊腺組織中特異表達的基因表達載體，其特征是所含的5’側(cè)翼區(qū)、啟動子、信號肽、多聚腺苷酸化信號和3’側(cè)翼區(qū)序列能指導(dǎo)外源基因在公豬精囊腺組織中特異表達，并分泌重組蛋白或多肽至精液中。
2、 如權(quán)利要求1所述的基因表達載體，其特征是所述的啟動子選自豬精漿蛋 白基因的啟動子。
3、 如權(quán)利要求2所述的基因表達載體，其特征是所述的啟動子為豬精漿中精 子粘附素蛋白家簇基因的啟動子。
4、 如權(quán)利要求3所述的基因表達載體，其特征是所述的啟動子為豬精漿蛋白 I基因或精漿蛋白II基因的啟動子。
5、 如權(quán)利要求1所述的基因表達載體，其特征是還包括一段豬精漿蛋白I基 因或精漿蛋白II基因的5'側(cè)翼序列。
6、 如權(quán)利要求1所述的基因表達載體，其特征是所述的信號肽DNA序列為豬 精漿蛋白I基因或精漿蛋白II基因的信號肽序列。
7、 如權(quán)利要求1所述的基因表達載體，其特征是所述的3'側(cè)翼序列為豬精 漿蛋白I基因或精漿蛋白II基因的3'側(cè)翼序列。
8、 如權(quán)利要求1所述的基因表達載體，其特征是所述的多聚腺苷酸化信號序 列為豬精漿蛋白I基因或精漿蛋白II基因的多聚腺苷酸化信號序列。
9、 一種生物反應(yīng)器，其特征是由轉(zhuǎn)基因豬精囊腺組織組成，其中所述的轉(zhuǎn)基 因豬由權(quán)利要求1-8的基因表達載體制作而成。
10、 一種從轉(zhuǎn)基因豬精囊腺生產(chǎn)外源蛋白或多肽的方法，其特征是包括如下 步驟(1)將編碼所述的蛋白或多肽的外源基因插入到權(quán)利要求1-8的基因表達載體中；(2) 利用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的精子載體法或胚胎顯微注射法將基因表達載 體和目標基因整合進豬基因組中；(3) 母豬分娩后，采集仔豬的血細胞或組織DNA分析和確定轉(zhuǎn)基因個體；(4) 培育轉(zhuǎn)基因公母豬個體至性成熟并傳代；(5) 采集F0或Fl代成熟轉(zhuǎn)基因公豬的精液，分析外源基因表達產(chǎn)物的含量， 選擇高產(chǎn)個體作為生物反應(yīng)器的宿主動物或作為生物反應(yīng)器種用動物；(6) 從轉(zhuǎn)基因公豬的精液中分離純化所述的外源蛋白或多肽。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種豬精囊腺生物反應(yīng)器及利用其生產(chǎn)重組蛋白或多肽的方法，在公豬精囊腺中特異表達的基因表達載體，該表達載體含啟動子、信號肽和多聚腺苷酸化信號的DNA序列等調(diào)控元件，當該表達載體通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)整合入豬基因組中后，重組蛋白或多肽能在轉(zhuǎn)基因成年公豬精囊腺組織中特異表達，并分泌至精液中。本發(fā)明的特點是所生產(chǎn)的重組蛋白或多肽可以從精液中直接收獲，方法先進簡單，成本低。與其它動物相比，在維持成本、生產(chǎn)周期等方面具有明顯優(yōu)勢。
文檔編號C12N15/09GK101294166SQ200710134099
公開日2008年10月29日 申請日期2007年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月29日
發(fā)明者宋成義, 滕尚輝, 王宵燕, 王志躍, 飛 謝, 趙文明, 陳國宏, 波 高 申請人:揚州大學(xué)