專利名稱：廣譜細菌宿主綠色熒光蛋白表達載體的構建方法
技術領域：
本發(fā)明涉及微生物學領域。
背景技術：
綠色熒光蛋白(GFP)是一種理想的示蹤標記，已經(jīng)在生物技術、細胞生 物學、轉(zhuǎn)基因動物、環(huán)境工程、微生物學等領域得到廣泛的應用。但是，目 前要在特定宿主細胞表達外源蛋白(也包括GFP)，必須使用與宿主細胞相適 應表達載體。對于原核表達系統(tǒng)來說，大腸桿菌是廣為使用的表達外源基因 的宿主菌，其原核表達載體中使用的啟動子類型主要有基于lac操縱子的啟動 子、T7噬菌體啟動子、入噬菌體PL啟動子、堿性磷酸酶phoA啟動子等。含 這些啟動子的載體表達外源蛋白時都需要滿足特定的誘導條件，而且還需要 特定基因型大腸桿菌作為外源基因表達的宿主菌。誘導lac啟動子需要cAMP 激活蛋白，即CAP，而在含葡萄糖的培養(yǎng)環(huán)境中CAP含量很低，外源基因不 能表達。也就是說含lac啟動子載體必須在無葡萄糖培養(yǎng)時才能表達外源蛋 白，而且還需要補加IPTG誘導。但是IPTG價格昂貴，不能用于大量誘導。 用T7噬菌體啟動子時，宿主菌細胞內(nèi)必須能提供T7噬菌體基因1的產(chǎn)物， 即T7噬菌體RNA聚合酶，要么由感染性A噬菌體提供，要么由插入大腸桿 菌染色體的基因產(chǎn)生， 一般采用的溶源性細菌BL21 (DE3)，其中T7噬菌體 基因1是受控于IPTG誘導的lac UV5啟動子。用入噬菌體PL啟動子時，其 受控于溫度敏感阻抑物clts857，宿主菌必須攜帶clts857基因，阻抑物clts857 在低溫下啟動表達，高溫時不能。phoA啟動子是堿性磷酸酶啟動子，在過量 磷酸鹽存在時被抑制，磷酸鹽饑餓時被逐漸誘導，外源基因與編碼phoA信號 肽序列融合，當?shù)鞍追置诘郊毦鷥?nèi)外膜之間時被信號肽酶切割，因而適宜表 達分泌型蛋白。
因此，目前沒有任何一種表達載體可在所有類型(包括野生型)的大腸 桿菌中都能進行外源基因的表達，更不用說能在多種宿主細菌中表達的廣譜 型表達載體了。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是發(fā)明一種于普通生長條件下均可表達綠色熒光蛋白(GFP) 的廣譜細菌宿主綠色熒光蛋白表達載體。
本發(fā)明技術方案是PCR擴增氨芐青霉素抗性基因的Amp啟動子，將 Amp啟動子與綠色熒光蛋白結構基因連接，得到以其啟動綠色熒光蛋白表達 的廣譜型原核表達載體。
本發(fā)明利用能在細菌中廣泛發(fā)揮作用的氨芐青霉素抗性基因(Amp)的 啟動子構建了一種廣譜型GFP表達載體，所構建的載體表達GFP不受細菌型 別和種類的限制，也不受細菌生長環(huán)境的限制，只要轉(zhuǎn)化進細菌細胞，即可 發(fā)揮作用，表達GFP，因而大大擴展了應用領域。
本發(fā)明包括以下步驟
1) 以pcDNA3為模板通過PCR方法擴增Amp啟動子，亞克隆進pGEMT 載體，然后用戶^11和^附//1消化，凝膠電泳回收Amp啟動子；設計Amp 啟動子的序列上、下游引物時，在上游引物中引入尸w II酶切位點，下游引 物中引入Bam//1酶切位點；
2) 用尸vwn和^W2/ZI消化pEGFP質(zhì)粒，回收載體框架；
3) 將步驟2)回收的載體框架與Amp啟動子連接，得到廣譜細菌宿主綠 色熒光蛋白表達載體pAEGFP。
pAEGFP轉(zhuǎn)化入各種細菌菌株中，在可見光和紫外線激發(fā)條件下分別檢 測相應菌株轉(zhuǎn)化后GFP的表達。表達菌株提取質(zhì)粒，用酶切和PCR方法檢測 Amp啟動子和GFP基因確實存在于菌株細胞中。用本質(zhì)粒構建的工程菌進行 示蹤研究。
另，本發(fā)明中，PCR擴增氨芐青霉素抗性基因的Amp啟動子的步驟包括:
1) 從含Amp啟動子的質(zhì)粒中用引物擴增出Amp啟動子；
2) 將擴增的產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳分析并回收純化；3) 把純化的Amp啟動子與pGEMT載體在16"環(huán)境條件下連接2 h，取 出，置于-2(TC環(huán)境中；
4) 用一步法試劑制備大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，并將上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn) 化進感受態(tài)細胞，挑取長出的白色菌落擴培后小量制備質(zhì)粒DNA， 1%瓊脂 糖凝膠電泳分析，篩選出攜帶目的DNA片段的重組質(zhì)粒，即Amp啟動子。
以質(zhì)粒pcDNA3作為模板擴增Amp啟動子的上、下游引物序列為 CGp在GCTC5GACGTC AGGTGGC ACTTT ， CGG拳TCCACTC TTCCTTTTTCAATATTAT。


圖1為本發(fā)明構建的廣譜細菌宿主GFP表達載體的結構示意圖。 圖2為攜帶pAEGFP的大腸桿菌DH5 a菌落在紫外光激發(fā)下的圖像。 圖3為攜帶pAEGFP的大腸桿菌BL21菌落在紫外光激發(fā)下的圖像。 圖4為攜帶pAEGFP的傷寒桿菌無鞭毛株菌落在紫外光激發(fā)下的圖像。 圖5為攜帶pAEGFP的傷寒桿菌有鞭毛株菌落在紫外光激發(fā)下的圖像。 圖6為攜帶pAEGFP的大腸桿菌分離株菌落在紫外光激發(fā)下的圖像。
具體實施例方式
1、 Amp啟動子的擴增
根據(jù)Amp啟動子序列設計引物，并分別于上下游引物中引入PvuII和 BamH I 酶切位點，上下游引物序列為 CGC!GClTGGACGTCAGGTGGCACTTT ， CGGGATC6aCTC
TTCCTTTTTCAATATTAT 。
小量提取質(zhì)粒pcDNA3作為模板擴增Amp啟動子，50 pl PCR擴增體系包 括5jxll0x緩沖液，2mmol/LMg2+， 200 pmol/L dNTPs， 200nmol/L正、反向 引物，lngpcDNA3， 2.5 U LA Tag DNA聚合酶。30次循環(huán)的PCR程序為 94°C/30 s(第一次循環(huán)為5 min)，55°C/30 s，72°C/20 s(最后一次循環(huán)為5 min)。 擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳分析并回收純化。
參照TaKaRa公司的DNA Ligation Kit說明書把擴增的Amp啟動子進行T 克隆，即與pGEMT載體連接，反應體系含pGEMT50ng、 Amp啟動子10ng、Ligation buffer I 5 ul，其中Amp啟動子與pGEMT摩爾比大于3:1。 16℃連接2 h，取出置于-20℃?zhèn)溆谩Ｓ蒙虾Ｉさ囊徊椒ㄔ噭┲苽浯竽c桿菌DH5a感受 態(tài)細胞，并將上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進感受態(tài)細胞，挑取長出的白色菌落擴培后 小量制備質(zhì)粒DNA， 1。％瓊脂糖凝膠電泳分析，篩選可能攜帶目的DNA片段 的重組質(zhì)粒，用尸vm II和Bam/ZI進行酶切鑒定。
2、 廣譜型GFP表達載體的構建
含Amp啟動子的pGEM載體用PvwII和BanHI進行酶切。50ul酶切反 應體系含pGEM-Amp 10ug、10XH Buffer 5ul、Pvu II和BamHI各20 U，用 水補足到50ul， 37°C酶切4h后進行l(wèi)^瓊脂糖凝膠電泳，長波長紫外燈下 用刀片將含Amp啟動子的凝膠條帶切下，用TaKaRa公司的Agarose Gel DNA Purification kit進行回收純化。
回收產(chǎn)物與經(jīng)PvuII和BamHI消化后凝膠回收的pEGFP載體骨架區(qū)(大 片段)進行連接。即，用Amp啟動子替換pEGFP載體中l(wèi)ac啟動子。
連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細胞。長出的菌落擴培后提取質(zhì)粒， 凝膠電泳分析是否含有重組載體pAGFP,并用Amp啟動子的引物作PCR進 行進一步驗證。
3、 廣譜型GFP表達載體的應用
把pAGFP分別轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5 a 、大腸桿菌BL21、傷寒桿菌無鞭毛 株、傷寒桿菌有鞭毛株、分離株大腸桿菌后，分別獲得攜帶pAEGFP的大腸 桿菌DH5a菌落、大腸桿菌BL21菌落、傷寒桿菌無鞭毛株、傷寒桿菌有鞭 毛株、分離株大腸桿菌菌落。
含pAGFP的各菌株在可見光下觀察即可見到淡淡的藍綠色熒光，在紫外 光激發(fā)下則發(fā)出很明亮的綠色熒光。如圖2 6所示。
同樣的上述5株菌株，用pEGFP載體轉(zhuǎn)化后，在不誘導的條件下，均未 能觀察到綠色熒光蛋白的表達。
總結本發(fā)明所構建的廣譜細菌宿主綠色熒光蛋白表達載體，在普通生 長條件下均可表達綠色熒光蛋白(GFP)。
<110>揚州大學
<120>廣譜細菌宿主綠色熒光蛋白表達載體的構建方法
<160>2
<210>1 <211>26 <212>DNA <213>人工序列
<220>
<223>根據(jù)質(zhì)粒pcDNA3基因序列設計 <權>1
cgcagctgga cgtcaggtgg cacttt
<210>2 <211〉29 <212>DNA <213>人工序列
<220>
<223>根據(jù)質(zhì)粒pcDNA3基因序列設計 <400>2
cgggatccac tctccttttt caatattat
權利要求
1、廣譜細菌宿主綠色熒光蛋白表達載體的構建方法，其特征在于PCR擴增氨芐青霉素抗性基因的啟動子，將Amp啟動子與綠色熒光蛋白結構基因連接，得到以其啟動綠色熒光蛋白表達的廣譜型原核表達載體。
2、 根據(jù)權利要求1所述廣譜細菌宿主綠色熒光蛋白表達載體的構建方 法，其特征在于包括以下步驟1 )以pcDNA3為模板通過PCR方法擴增Amp啟動子，亞克隆進pGEMT 載體，然后用PvulI和mT/I消化，凝膠電泳回收Amp啟動子；設計Amp 啟動子的序列上、下游引物時，在上游引物中引入Pvull酶切位點，下游引 物中引入Sam//1酶切位點；2) 用pvu II和BamHI消化pEGFP質(zhì)粒，回收載體框架；3) 將步驟2)回收的載體框架與Amp啟動子連接，得到廣譜細菌宿主 綠色熒光蛋白表達載體pAEGFP。
3、 根據(jù)權利要求2所述廣譜細菌宿主綠色熒光蛋白表達載體的構建方 法，其特征在于PCR擴增氨芐青霉素抗性基因的Amp啟動子的步驟包括1) 從含Amp啟動子的質(zhì)粒中用引物擴增出Amp啟動子；2) 將擴增的產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳分析并回收純化；3) 把純化的Amp啟動子與pGEMT載體在16℃ 環(huán)境條件下連接2 h，取 出，置于-20℃ 環(huán)境中；4) 用一步法試劑制備大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細胞，并將上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn) 化進感受態(tài)細胞，挑取長出的白色菌落擴培后小量制備質(zhì)粒DNA， 1%瓊脂 糖凝膠電泳分析，篩選出攜帶目的DNA片段的重組質(zhì)粒，即Amp啟動子。
4、根據(jù)權利要求3所述廣譜細菌宿主綠色熒光蛋白表達載體的構建方法， 其特征在于以質(zhì)粒pcDNA3作為模板擴增Amp啟動子的上、下游引物序列 為CGCAGCTGGACGTCAGGTGGCACTTT， CGGGATCCACTC TTCCTTTTTCAATATTAT。
全文摘要
廣譜細菌宿主綠色熒光蛋白表達載體的構建方法，涉及微生物學領域。技術方案是PCR擴增氨芐青霉素抗性基因的Amp啟動子，將Amp啟動子與綠色熒光蛋白結構基因連接，得到以其啟動綠色熒光蛋白表達的廣譜型原核表達載體。本發(fā)明利用能在細菌中廣泛發(fā)揮作用的氨芐青霉素抗性基因(Amp)的啟動子構建了一種廣譜型GFP表達載體，所構建的載體表達GFP不受細菌型別和種類的限制，也不受細菌生長環(huán)境的限制，只要轉(zhuǎn)化進細菌細胞，即可發(fā)揮作用，表達GFP，因而大大擴展了應用領域。
文檔編號C12N15/70GK101173296SQ20071013380
公開日2008年5月7日 申請日期2007年10月22日 優(yōu)先權日2007年10月22日
發(fā)明者季明春, 朱立天, 李國才, 潘興元, 焦紅梅, 王勁松, 王曉紅, 龔衛(wèi)娟 申請人:揚州大學