專利名稱：一種用共固定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶制備乳果糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用共固定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶制備乳果糖的方法，具 體涉及以共固定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶為催化劑，以乳糖為單一底物，在溫 和的反應(yīng)條件下制備乳果糖，屬于食品生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
乳果糖是一種由半乳糖和果糖以(3-1，4糖苷鍵結(jié)合而成的新型功能性低聚 糖。它具有促進(jìn)雙歧桿菌增殖，調(diào)整腸道菌群平衡；治療肝性腦病，降低內(nèi)毒 素；監(jiān)視腸壁的通透性；預(yù)防結(jié)腸息肉術(shù)后復(fù)發(fā)等許多重要的生理功能，被廣 泛應(yīng)用于便秘、肝性腦病等臨床治療，以及添加到奶粉、面包、嬰兒食品、和 飲料等中。目前市面上已有出售治療慢性功能性便秘和肝性腦病的乳果糖口服 溶液，但純度很低。
工業(yè)上生產(chǎn)乳果糖主要采用化學(xué)催化法進(jìn)行，即以NaOH和硼酸為催化劑, 通過乳糖異構(gòu)化反應(yīng)獲得。曾研究過的催化劑有強(qiáng)堿性試劑、鎂的化合物、堿 金屬的鋁酸鹽、蛋殼等，但化學(xué)法制備乳果糖條件比較激烈，得到的產(chǎn)品色澤 深，副產(chǎn)物多，催化劑分離困難，給糖漿的進(jìn)一步純化及制取結(jié)晶帶來困難。 采用游離酶法生產(chǎn)乳果糖盡管催化劑專一性強(qiáng)、副產(chǎn)物少、產(chǎn)品色澤淺，但酶 的成本較高。因此尋找一種酶可以反復(fù)回收利用，反應(yīng)條件溫和的高效率制備 乳果糖的途徑是很有意義的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明原理在一定的條件下，以乳糖為底物，通過乳糖酶水解活力的作 用，使乳糖水解為葡萄糖和半乳糖，再通過葡萄糖異構(gòu)酶作用葡萄糖將其異構(gòu) 化為果糖，最后通過乳糖酶的轉(zhuǎn)半乳糖苷作用，將半乳糖通過(3-l，4糖苷鍵連接 到果糖上，得到產(chǎn)物乳果糖。
本發(fā)明的目的提供一種用共固定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶作為催化劑， 在溫和的反應(yīng)條件下制備乳果糖的方法。通過對(duì)共固定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu) 酶制備乳果糖的工藝條件進(jìn)行研究，以期得到一條在反應(yīng)過程中能夠發(fā)揮乳糖 酶和葡萄糖異構(gòu)酶之間的協(xié)同作用，催化效率高，副反應(yīng)少，乳果糖產(chǎn)品質(zhì)量 較好的生產(chǎn)工藝。
本發(fā)明的技術(shù)方案 一種用共固定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶制備乳果糖的 方法，用共固定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶為催化劑，以乳糖為單一底物制備乳 果糖；
(A)共固定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶作為催化劑的間歇式乳糖轉(zhuǎn)化反應(yīng)
用pH4—10的磷酸鹽緩沖液配制5。/。一40% (Ww)的乳糖溶液，稍加熱使 乳糖溶解，添加1.5 — 10U/mL的共固定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶，在25—6(TC 溫度下反應(yīng)12—48h，并回收共固定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶；
或(B)共固定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶作為催化劑的連續(xù)式乳糖轉(zhuǎn)化反應(yīng) 用pH4—10的磷酸鹽緩沖液配制5%—40% (w/w)的乳糖溶液，稍加熱使 乳糖溶解，自上而下進(jìn)料反應(yīng)，按0.02—0.3mL/min的流速使乳糖溶液勻速通過 裝載共固定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶的恒溫酶反應(yīng)柱，溫度為25 — 7(TC，單程 操作。
所用的共固定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶的共固定化方法，是以明膠、海藻 酸鈉或卡拉膠中的一種或幾種為載體，采用先包埋后交聯(lián)的方法進(jìn)行構(gòu)建共固 定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶；或以尼龍網(wǎng)為載體采用先交聯(lián)后共價(jià)結(jié)合的方法 進(jìn)行構(gòu)建共固定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶；
(l)用明膠、海藻酸鈉或卡拉膠中的一種或幾種為載體，采用先包埋后交聯(lián) 的方法進(jìn)行構(gòu)建共固定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶
a) 配制pH4—10的質(zhì)量濃度5%—27%的20g膠溶液，在30"C水浴中使膠完 全溶解；
b) 按照活力比2:1 — 1:5將乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶溶于2mL去離子水中；
c) 將b)配制的乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶的混合酶液添加到膠溶液中，使兩種酶 的添加量為l一30U/g膠溶液，攪拌混勻；
d) 在c)所得的膠溶液中加入2mL體積分?jǐn)?shù)0.05%—5%的戊二醛，攪拌后立 即倒入培養(yǎng)皿中，fC硬化過夜，得凝膠；
e) 次日將凝膠浸入到體積分?jǐn)?shù)0.05%_5%的戊二醛中，在4X:—3(TC交聯(lián) 10min—60min，然后用去離子水清洗凝膠若干次，濾紙吸干表面水，最后切成 2mm見方的小方塊，即為共固定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶。
或(2)采用尼龍網(wǎng)為載體共固定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶
a) 尼龍網(wǎng)的預(yù)處理將60目的尼龍網(wǎng)裁成邊長(zhǎng)2cm的小片，先用lmol/L NaOH浸洗10min，水洗至中性，再用lmol/LHCl浸洗10min，再水洗至中性， 然后用乙醇洗去水分，丙酮浸洗20min除去脂溶性雜質(zhì)，再用乙醇除去丙酮， 晾干，接著將尼龍網(wǎng)浸泡在含18.6% CaCl2和18.6%水的甲醇溶液中，5(TC保 溫20min，將尼龍網(wǎng)濾出并徹底水洗，乙醇脫水，晾干；
b) 尼龍網(wǎng)的活化將預(yù)處理后的尼龍網(wǎng)浸入到3-二甲氨基丙胺中，7(TC活化 5h—15h,徹底水洗；
c) 載體的交聯(lián)將活化后的尼龍網(wǎng)浸入體積分?jǐn)?shù)0.05%—5%、 pH4—10的戊 二醛中，4'C一3(TC浸泡10min—60min，接著用pH 7的磷酸鹽緩沖液反復(fù)清洗 尼龍網(wǎng)；
d)酶與載體的結(jié)合配制濃度為l一30U/mL的乳糖酶溶液，按照5g/100mL 酶液一30g/100mL酶液的量將尼龍網(wǎng)添加到乳糖酶液中，4。C一30'C下不斷攪拌 浸泡5—20h，濾出尼龍網(wǎng)，水洗至水洗液中無蛋白之后再將尼龍網(wǎng)浸泡到l一 30U/ mL的葡萄糖異構(gòu)酶溶液中，尼龍網(wǎng)的添加量在5g/100mL酶液一30g/100mL 酶液之間，4t:一3(TC不停緩慢攪拌浸泡5—20h，最后用去離子水多次清洗尼龍 網(wǎng)表面至水洗液中無蛋白，用冷風(fēng)吹干即得共固定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶。
所用的游離乳糖酶的比活力為3000U/g，游離葡萄糖異構(gòu)酶的比活力為 2000U/g。
共固定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶制備乳果糖的連續(xù)式反應(yīng)中使用恒溫酶反 應(yīng)柱。
所制備的乳果糖在食品添加劑和醫(yī)藥領(lǐng)域中均有廣泛應(yīng)用。 本發(fā)明所述的間歇式乳糖轉(zhuǎn)化反應(yīng)，具體內(nèi)容涉及以明膠、海藻酸鈉或/和 卡拉膠為載體。
本發(fā)明所述的連續(xù)式乳糖轉(zhuǎn)化反應(yīng)，具體內(nèi)容涉及以尼龍網(wǎng)為載體。 本發(fā)明的有益效果-
1、 與目前的化學(xué)催化法制備乳果糖相比，酶法生產(chǎn)乳果糖反應(yīng)條件溫和， 催化劑專一性強(qiáng)，產(chǎn)品色澤淺，對(duì)設(shè)備沒有較大損耗，且不產(chǎn)生高堿性廢水， 不會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染。
2、 與液態(tài)酶相比，共固定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶能夠回收利用，使生產(chǎn) 過程中酶的成本大大下降，簡(jiǎn)化反應(yīng)產(chǎn)物的提純，提高產(chǎn)物乳果糖的收率。
3、 與單獨(dú)固定化一種酶相比，共固定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶在制備乳果 糖的過程中更能發(fā)揮兩種酶之間的協(xié)同作用，實(shí)現(xiàn)底物到產(chǎn)物的一步轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn) 化效率高，副產(chǎn)物少。


圖1不同溫度對(duì)共固定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶制備乳果糖的影響。 圖2不同pH對(duì)共固定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶制備乳果糖的影響。 圖3不同乳糖濃度對(duì)共固定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶制備乳果糖的影響。 圖4不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)共固定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶制備乳果糖的影響。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l:配制20mL乳糖溶液，稍加熱使乳糖溶解，添加100U共固定化 乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶進(jìn)行間歇式反應(yīng)，在一定溫度、pH和時(shí)間下反應(yīng)，反應(yīng) 結(jié)束后回收共固定化酶凝膠顆粒。
圖1顯示了溫度分別為25。C、 3(TC、 35°C、 40°C、 45°C、 5(TC和55。C對(duì)共 固定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶制備乳果糖的影響。如圖所示，最適溫度為45"C。
圖2顯示了pH分別為4、 5、 6、 7.5、 8和9對(duì)共固定化乳糖酶和葡萄糖異 構(gòu)酶制備乳果糖的影響。如圖所示，最適pH為7.5。
圖3顯示了乳糖濃度分別為10%、 20%、 30%和40%對(duì)共固定化乳糖酶和葡 萄糖異構(gòu)酶制備乳果糖的影響。如圖所示，最適乳糖濃度為40%。
圖4顯示了反應(yīng)時(shí)間分別為6h、 10h、 15h、 24h、 36h和48h對(duì)共固定化乳 糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶制備乳果糖的影響。如圖所示，最適反應(yīng)時(shí)間為24h。
實(shí)施例2:先將自由狀態(tài)的乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶經(jīng)60目的尼龍網(wǎng)固定， 再制成固定化酶柱。所使用的恒溫酶反應(yīng)柱直徑26mm，高200mm。共固定化 酶的裝柱體積為40mL，總活力為2580U。將乳糖配成30% (w/w)的溶液，調(diào) 節(jié)pH7，自上而下進(jìn)料反應(yīng)，恒溫50士rC，按0.06mL/min勻速通過共固定化 酶反應(yīng)柱，單程操作并收集反應(yīng)液，得到產(chǎn)物乳果糖溶液。
權(quán)利要求
1、一種用共固定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶制備乳果糖的方法，其特征是用共固定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶為催化劑，以乳糖為單一底物制備乳果糖；(A)共固定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶作為催化劑的間歇式乳糖轉(zhuǎn)化反應(yīng)用pH4-10的磷酸鹽緩沖液配制5％-40％(w/w)的乳糖溶液，稍加熱使乳糖溶解，添加1.5-10U/mL的共固定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶，在25-60℃溫度下反應(yīng)12-48h，并回收共固定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶；或(B)共固定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶作為催化劑的連續(xù)式乳糖轉(zhuǎn)化反應(yīng)用pH4-10的磷酸鹽緩沖液配制5％-40％(w/w)的乳糖溶液，稍加熱使乳糖溶解，自上而下進(jìn)料反應(yīng)，按0.02-0.3mL/min的流速使乳糖溶液勻速通過裝載共固定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶的恒溫酶反應(yīng)柱，溫度為25-70℃，單程操作。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用共固定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶制備乳果 糖的方法，其特征是連續(xù)式反應(yīng)中使用恒溫酶反應(yīng)柱。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用共固定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶制備乳果 糖的方法，其特征是所制備的乳果糖在食品添加劑和醫(yī)藥領(lǐng)域中均有廣泛應(yīng)用。
全文摘要
一種用共固定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶制備乳果糖的方法，屬于食品生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明是利用共固定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶為催化劑，以乳糖為單一底物，在溫和的反應(yīng)條件下轉(zhuǎn)化乳糖制備乳果糖。本發(fā)明的獨(dú)特之處是以乳糖作為底物，在反應(yīng)過程中利用乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶的協(xié)同作用，提高制備乳果糖的反應(yīng)效率，減少副產(chǎn)物，簡(jiǎn)化下游分離步驟。本發(fā)明思路新穎，環(huán)境友好，實(shí)用性強(qiáng)，是化學(xué)法和游離酶法制備乳果糖的良好替代。
文檔編號(hào)C12P19/00GK101182563SQ200710134999
公開日2008年5月21日 申請(qǐng)日期2007年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月2日
發(fā)明者芳 劉, 楊瑞金 申請(qǐng)人:江南大學(xué)