專利名稱：：一種由Vibriosp.JG07-007制備的褐藻膠裂解酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：生物技術(shù)
背景技術(shù)：
：褐藻膠是褐藻細(xì)胞壁和細(xì)胞間質(zhì)的主要組成部分，也是褐藻中含量較高的一種多糖，其分子是由P^D-l,4-甘露糖醛酸(>D-mannuronicacid,簡(jiǎn)稱M)和a-L-l，4-古羅糖醛酸(a-L-guluronicacid，簡(jiǎn)稱G)兩種單體組成的嵌段式線性聚合物，其分子中存在三種嵌段均聚甘露糖醛酸(MV均聚古羅糖醛酸(G、和M、G兩種單體交替(MG、的嵌段。褐藻膠裂解酶的酶解反應(yīng)都是在底物的非還原末端生成4"deoxy"erthro4iex-4"enopyranuronosyl基的p消除反應(yīng)。1992年，Gaseca報(bào)道了關(guān)于褐藻膠裂解酶的裂解機(jī)制，褐藻膠分子中的羧基與酶分子中的陽(yáng)離子性氨基酸殘基結(jié)合，C5位的C-H電子對(duì)被6位的羧基吸弓|，5位的C-H結(jié)合變?nèi)?，然后又一個(gè)酶分子中的親核性氨基酸殘基與C5位的質(zhì)子結(jié)合，電子向著生成穩(wěn)定的中間體的方向運(yùn)動(dòng)，最終在C4《5間生成雙鍵，所以褐藻膠酶解的產(chǎn)物分子中的非還原末端產(chǎn)生C4，5不飽和雙鍵，在23(K240nm有強(qiáng)吸收。據(jù)本發(fā)明人通過(guò)査閱資料、文獻(xiàn)檢索所知，迄今為止報(bào)道的褐藻膠裂解酶大多是由海洋生物如褐藻、海洋軟體動(dòng)物、革蘭氏陰性細(xì)菌、革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌、真菌、病毒分離純化而來(lái)的，陸上生物分離得到的褐藻膠裂解酶全部是來(lái)源于細(xì)菌。黃桿菌(尸/ovo6flc"te/7'amOTM/ftW鵬)；(J/gj'Hov訪rfo叫uoft7is);固氮菌(4zo6acterW恥/aKft-);克里伯氏菌(A/eto'e〃aaeragewe),(X/efoiW/apwe柳o/H'。e);腸桿菌(五wtero6ac欣c/oacaeM-l);別單胞菌C4/tero柳nassp.);芽胞桿菌(5a"7/Msdrc"/fls);(Jgar6actert柳a/g/m'cum)。專利公開(kāi)了一種Vibriasp.QY101產(chǎn)生的其特征為酶的分子量為39kD的褐藻膠裂解酶。Vibriasp.QY2產(chǎn)生的其特征為酶的分子量為28.5Kd。Vibriasp.QYl產(chǎn)生的其特征為酶的分子量為39kD。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種來(lái)源于海藻的菌株W6rfo艱JG07-007并利用該菌株制備的褐藻膠裂解酶以及相關(guān)的酶學(xué)性質(zhì)。本發(fā)明分離純化出一株來(lái)源于海藻的菌株WArio艱JG07"007，其具有產(chǎn)生褐藻膠裂解酶的特性，保藏單位:中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，簡(jiǎn)稱CCTCC，保藏號(hào)為CCTCCNO:M207068。本發(fā)明的特點(diǎn)是首次分離出產(chǎn)褐藻膠裂解酶W6rfosp.JG07-007菌株。該菌株為不產(chǎn)孢子的彎桿狀，革蘭氏陰性。不抗酸，沒(méi)有莢膜，在標(biāo)準(zhǔn)肉湯上生長(zhǎng)良好，氧化酶陽(yáng)性，無(wú)色素和黃色，脲酶陽(yáng)性。0.4"0.7um><1.3-1.5iim,端生單鞭毛。該菌株來(lái)源于海藻體表環(huán)境，為發(fā)酵型糖代謝，3%和7%NaCl胨水中生長(zhǎng)良好，且對(duì)CM29敏感試驗(yàn)呈陽(yáng)性等特征，經(jīng)過(guò)boilog鑒定確定其為弧菌屬,但是未能給出具體種，暫命名取JG07-007。為此菌株在2216E培養(yǎng)基上26'C培養(yǎng)24h形成單菌落，菌落乳白色，圓形，邊緣整齊。該菌株具有會(huì)養(yǎng)要求范圍廣，容易培養(yǎng)和培養(yǎng)時(shí)間短的特點(diǎn)。在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)18h,其發(fā)酵液中褐藻膠裂解酶的活力達(dá)到最高(32C下測(cè)定)。用本發(fā)明的菌株作為褐藻膠裂解酶的生產(chǎn)菌株，具有產(chǎn)品的活性高、穩(wěn)定性好、生產(chǎn)周期短、成本低的特點(diǎn)，能夠?qū)崿F(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。通過(guò)酶的分離純化，SDS-PAGE確定該菌株產(chǎn)生的堿性蛋白酶的分子量為34.6kDa(圖1)。其分子量不同于己報(bào)導(dǎo)的褐藻膠裂解酶(表l)。通過(guò)硫酸銨分級(jí)沉淀，DEAE—Sepharose陰離子交換層析和Superdex75凝膠過(guò)濾技術(shù)對(duì)柳rfo乎JG07-007菌株產(chǎn)生的褐藻膠裂解酶進(jìn)行純化和精制，獲得電泳純度的酶蛋白組分，將純化出的酶蛋白經(jīng)過(guò)Edman法降解后迸行蛋白質(zhì)N末端測(cè)序，結(jié)果如圖2，此酶的N端氨基酸序列為AEILATDDAD。此蛋白的N端不同于任何已報(bào)道的褐藻膠裂解酶的N端，將此酶與其它的褐藻膠裂解酶的N端進(jìn)行比較可知此蛋白的N端氨基酸序列不同于任何己報(bào)道的褐藻膠裂解酶的N端序列(表2),判定其為一個(gè)新酶。圖l，純化的堿性蛋白酶SDS-PAGE電泳結(jié)果。左邊為純酶單帶，右邊為標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量。圖2,附WoW.JG07-007產(chǎn)生的褐藻膠裂解酶N末端測(cè)序結(jié)果圖譜。具體實(shí)施例方式1.制備酶將W6Wo^.JG07"007菌株用液體2216E培養(yǎng)基活化后，以5%的接種量接入到裝有IOOmL發(fā)酵培養(yǎng)基(含有0.2%褐藻酸鈉的2216￡培養(yǎng)基去除瓊膠)的250mL三角瓶中，26匸搖瓶培養(yǎng)20h,培養(yǎng)液4'C下3000rpm將酶發(fā)酵液冷凍離心3500r/min、5min，上清液加入硫酸銨使飽和度達(dá)到30%，析出的雜蛋白質(zhì)經(jīng)高速離心(7，000xg,4°C)去掉，上清液繼續(xù)加入硫酸銨使飽和度達(dá)到80%,析出的蛋白質(zhì)經(jīng)高速離心(7，000xg，4°C)回收，作為粗酶用于進(jìn)一步純化。2、純化酶將粗酶液分散，以含有0.05MTris-HCl緩沖液(pH7.5)進(jìn)行透析，每隔4h更換一次透析外液，用BaCl2檢査透析外液是否含有硫酸根，直至無(wú)硫酸根檢出。將透析好的酶液加樣于AKTAexplorechromatography的HitrapDEAE-SepharoseFF柱，洗脫液為含有不同濃度的NaCl(0，0.3,0.6，0.9M)的0.05MTris-HCl(pH7.5)緩沖液進(jìn)行分步洗脫，在280iirn下檢測(cè)蛋白峰，DNS法測(cè)酶活，收集有活性的蛋白，進(jìn)行下一步純化。將DEAE-SepharoseFF部分純化后的活性蛋白加樣于Superdex75柱，洗脫液為含有0.2MNaCl的0.05MTris-HCl(pH7.5)緩沖液，在280mn下檢測(cè)蛋臺(tái)峰，DNS法測(cè)酶活后收集有活性的蛋白，進(jìn)行下一步純化。在280nm下檢測(cè)蛋白峰，DNS法測(cè)酶活后收集有活性的蛋白。3、酶分子量測(cè)定用SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)技術(shù)確定褐藻膠裂解酶的分子。具體方法是將樣品加入2倍濃度的SampleBuffer中，在沸水浴中加熱5min變性，取出冷卻后進(jìn)行電泳。固定后，用考馬斯亮藍(lán)R250進(jìn)行染色。標(biāo)準(zhǔn)蛋白是Myosin:205kD4肌球蛋白；b"Galaktosidase:116kDa^-半乳糖苷酶；PhosphorylaseB:97，4kD4磷酸化酶B;Rinderserumalbumin(BSA):66kDa^牛血清白蛋白；Ovalbumin:45kD4卵清蛋白；Carbonhydrase:29kDa碳酸酐酶。電泳后，測(cè)定各樣品從開(kāi)始電泳的位置起移動(dòng)的距離，將它們相對(duì)全長(zhǎng)的比例和各標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量的對(duì)數(shù)以最小二乘法做曲線，計(jì)算此酶的分子量此酶在SDS-PAGE上顯示的分子量為34.6kDa(見(jiàn)圖1)。4、酶蛋白的N端測(cè)序依據(jù)Edman降解法原理，即蛋白質(zhì)的自由ct一氨基與PITC(異硫氰酸苯酯)偶聯(lián)后，與之相鄰的第二殘基的肽鍵大為消弱，在無(wú)水酸TFA(三氟乙酸)的作用下發(fā)生特異性的斷裂，暴露出第二殘基的a—氨基，再與PITC反應(yīng)，循環(huán)往復(fù)地進(jìn)行偶聯(lián)降解地反應(yīng)。循環(huán)次數(shù)受Edman反應(yīng)產(chǎn)率的限制。按照常規(guī)條件進(jìn)行SDS-PAGE，將電泳完畢的凝膠按照海綿，濾紙，PVDF膜，凝膠，濾紙，海綿的次序?qū)㈦娪≯E夾層裝好，并放入小型電轉(zhuǎn)槽中，在50V(100-170mA)于室溫下進(jìn)行電印跡轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移時(shí)間為2小時(shí)。取出PVDF膜并用去離子水略為漂洗，用甲醇浸泡數(shù)秒鐘，用麗春紅(PonceauS)染色。蛋白質(zhì)N末端測(cè)序是采用Edman降解法，N端前10位氨基酸殘基的序列由AppliedBiosystems公司的PROCISE蛋白質(zhì)測(cè)序儀測(cè)定，此酶的N端氨基酸序列為Ala-Glu-Ie-Leu-Ala-Thr-Asp^As，Ala-Asp(丙氨酸-谷氨酸-異亮氨酸-亮氨酸-丙氨酸-蘇氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-丙氨酸-天冬氨酸)簡(jiǎn)寫為:AEILATDDAD。結(jié)果見(jiàn)圖2。表l不同文獻(xiàn)報(bào)道的褐藻膠裂合酶分子量范圍來(lái)源分子量參考文獻(xiàn)(kDa)柳,to取JG07-00734.6110Stevens&Levin^1977.32Sawabeetal.，1992.Haloninas39Kraiwattanapongetal"1999b.Mari加bacteriumA丁CC433367(AlgA)29Brownetal.，1991.MarinebacteriumATCC43336738Brownetal"1991.sp.(ATCC433367)30Malissardetal.,1995.尸5^wrfo/noworf(marine)50Davidsonetal"1976.尸5:eMJ0/w0wassp,(marine)94Muramatsu&Sogi，1990.32尸sew6towowosa/g/wnwa(strainX017)28Boyenetal"1990a;Chavagnatet24al"1996.附打osp.(marinebacterium)4042Takeshitaetal.，1993，1995.,o啦ATCC1774947Kitamikadoetal.，1990，1992;Tsengetal.,1992bc.57Kitamikadoetal.，1990，1992;Tsengetal"1992a.MarinebacteriumA3100Doubet&Q咖tr加o,1982,1984.Marinebacterium35Doubet&Q咖trano，1982，1984.表2不同來(lái)源褐,裂合酶N端序列<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>權(quán)利要求1、一株弧菌Vibriosp.JG07-007，其保藏號(hào)為CCTCCM207068。2、一種使用權(quán)利要求1所述的菌株制備的褐藻膠裂和酶。3、如權(quán)利要求2所述的褐藻膠裂和酶，其特征是該酶的分子量為34.6kD。4、如權(quán)利要求2所述的褐藻膠裂和酶，其特征是該此酶的N端氨基酸序列為-丙氨酸-谷氨酸-異亮氨酸-亮氨酸-丙氨酸-蘇氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-丙氨酸-天冬氨酸(Ala>Glu-Ile-Leu-Ala-Thr-Asp-Asp-Ala-Asp)。全文摘要本發(fā)明的目的是提供一種來(lái)源于海藻的菌株VibriospJG07-007并利用該菌株制備的褐藻膠裂解酶以及相關(guān)的酶學(xué)性質(zhì)。該菌種具有營(yíng)養(yǎng)要求范圍廣，容易培養(yǎng)和培養(yǎng)時(shí)間短的特點(diǎn)。在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)18h，其發(fā)酵液中堿性蛋白酶的活力即達(dá)到960U/mL(30℃下測(cè)定)。SDS-PAGE確定該菌株產(chǎn)生的堿性蛋白酶的分子量為34.6kDa(圖1)。通過(guò)硫酸銨分級(jí)沉淀，DEAE-Sepharose陰離子交換層析和Superdex75凝膠過(guò)濾技術(shù)對(duì)Vibriosp.JG07-007菌株產(chǎn)生的褐藻膠裂合酶進(jìn)行純化和精制，獲得電泳純度的酶蛋白組分，將純化出的酶蛋白經(jīng)過(guò)Edman法降解后進(jìn)行蛋白質(zhì)N末端測(cè)序，此酶的N端氨基酸序列為AEILATDDAD。文檔編號(hào)C12N9/00GK101319197SQ20071011232公開(kāi)日2008年12月10日申請(qǐng)日期2007年6月5日優(yōu)先權(quán)日2007年6月5日發(fā)明者江曉路申請(qǐng)人:中國(guó)海洋大學(xué)