專利名稱：口蹄疫病毒雙效疫苗載體、其制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組疫苗載體，尤其涉及一種具有基因治療及基因免
疫作用的o型口蹄疫病毒雙效疫苗載體，其制備方法以及該雙效疫苗載體
在防治口蹄疫病毒中的用途，屬于基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
目前所有疫苗幾乎都存在著時(shí)間長短不一的有效抗體產(chǎn)生期，即免疫
空白期，動物在這一時(shí)期遇到病原微生物的入侵往往會造成疫病流行；另 外，疫苗接種隱性感染的動物后還可能引起嚴(yán)重的臨床反應(yīng)甚至引起少數(shù) 動物死亡；如何使動物在免疫空白期免受病原的攻擊、防止隱性感染期的 動物接種疫苗后發(fā)生嚴(yán)重的臨床反應(yīng)甚至死亡是亟需要解決的一個(gè)問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明首先所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，構(gòu)建一種 具有基因治療及基因免疫口蹄疫病毒雙重作用的0型口蹄疫病毒(FMDV) 雙效疫苗載體。
本發(fā)明首先所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的 一種具有基因治療及基因免疫口蹄疫病毒雙重作用的0型口蹄疫病
毒(FMDV)雙效疫苗載體，主要由雙順反子表達(dá)載體序列組成，其中含有 能夠與口蹄疫病毒基因組5'非編碼區(qū)(UTR) RNA結(jié)合的反義基因序列和 完整的口蹄疫病毒VP1結(jié)構(gòu)蛋白基因序列。
作為優(yōu)選的，所述的雙順反子表達(dá)載體為pIRES，所述的能夠與口蹄 疫病毒基因組5'非編碼區(qū)RNA結(jié)合的反義基因序列是口蹄疫病毒基因片 段AsN。
更優(yōu)選的，本發(fā)明0型口蹄疫病毒(FMDV)雙效疫苗載體是pAsN-IR-VP1。
本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是提供一種構(gòu)建上述0型口蹄疫 病毒(FMDV)雙效疫苗載體的方法。
本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的
一種上述O型口蹄疫病毒(FMDV)雙效疫苗載體的構(gòu)建方法，包括 將針對FMDV 5' UTR的基因片段反向插入雙順反子表達(dá)載體的一個(gè)多克隆 位點(diǎn)上，將完整的VP1結(jié)構(gòu)蛋白基因正向插入該雙順反子表達(dá)載體的另一 個(gè)多克隆位點(diǎn)上。
優(yōu)選的， 一種上述O型口蹄疫病毒(FMDV)雙效疫苗載體的構(gòu)建方 法，包括將針對FMDV5' UTR的基因片段AsN反向插入雙順反子表達(dá)載 體pIRES的多克隆位點(diǎn)A，將完整的VP1結(jié)構(gòu)蛋白基因正向插入雙順反子 表達(dá)載體pIRES多克隆位點(diǎn)B中。
本發(fā)明依據(jù)反義RNA能夠通過結(jié)合正義的mRNA而阻止mRNA翻譯成 蛋白質(zhì)，從而抑制病毒復(fù)制，而核酸疫苗能誘導(dǎo)有效的細(xì)胞及體液免疫從 而保護(hù)動物免于特異性病原攻擊的原理，構(gòu)建了具有基因治療及基因免疫 雙重作用的0型口蹄疫(FMD)雙效疫苗載體。在核酸疫苗產(chǎn)生有效的抗 體之前，利用反義核酸對病原的抑制作用，抵御在注苗前已隱性感染及外 侵的少量特異性病原對動物的危害，解決疫苗免疫空白期的問題。另外， 在特異性抗體產(chǎn)生以后，利用特異性抗體對病原的中和作用及反義核酸對 病原的抑制作用的雙重功效達(dá)到增強(qiáng)疫苗免疫效力目的，通過雙效載體轉(zhuǎn) 染細(xì)胞，篩選穩(wěn)定克隆及擴(kuò)繁后試制疫苗及疫苗免疫動物后的抗體測定、 動物強(qiáng)毒攻擊等試驗(yàn)，獲得了較為理想的效果。
用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將本發(fā)明雙效重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入BHK-21細(xì)胞中，經(jīng) RT-PCR等檢測表明本發(fā)明雙效重組質(zhì)粒反義RNA在細(xì)胞中得到了轉(zhuǎn)錄，病 毒抑制試驗(yàn)、蝕斑減少試驗(yàn)表明5' AsN轉(zhuǎn)錄子對同源病毒的復(fù)制能產(chǎn)生 有效的阻抑作用，轉(zhuǎn)染24h后接毒，抑制率達(dá)60%以上。經(jīng)夾心ELISA及 間接免疫熒光等試驗(yàn)表明本發(fā)明雙效重組質(zhì)粒VP1結(jié)構(gòu)蛋白基因在BHK-21 細(xì)胞中得到了穩(wěn)定表達(dá)，且有一定的生物學(xué)活性。
對經(jīng)本發(fā)明雙效質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆經(jīng)G418多次篩選后得到了穩(wěn)
定抗性細(xì)胞株，經(jīng)RT-PCR檢測表明重組質(zhì)粒能在BHK-21細(xì)胞中能穩(wěn)定傳 代。
大量提取本發(fā)明雙效疫苗載體試制雙效疫苗免疫小鼠后采血經(jīng) LBP-ELISA檢測表明本發(fā)明雙效疫苗能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，二免三周時(shí)不 同批次小鼠的抗體效價(jià)為1: 32-1: 64; MTT法表明本發(fā)明雙效疫苗載體
能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生脾臟T淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)；免疫小鼠有效抗體的產(chǎn)生及
T淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)，證實(shí)了本發(fā)明雙效疫苗載體具有基因免疫作用。 用本發(fā)明雙效疫苗載體免疫乳鼠后6-12h，以20-100TCID5。強(qiáng)毒攻擊，結(jié)果 該雙效質(zhì)粒能夠保護(hù)乳鼠免于FMDV強(qiáng)毒攻擊感染，保護(hù)率達(dá)到50%-83%， 說明本發(fā)明雙效疫苗載體具有基因治療作用。


圖l 5'AsNPCR產(chǎn)物。
圖2 VP1PCR產(chǎn)物。
圖3 為重組質(zhì)粒pAsN-IR的酶切及PCR鑒定圖。
圖4 為重組質(zhì)粒pAsN-IR-VP1的酶切及PCR鑒定圖。
圖5為雙效疫苗載體RT-PCR檢測RNA的轉(zhuǎn)錄圖。 1， 2:轉(zhuǎn)染后24及48 h細(xì)胞液RT-PCR擴(kuò)增5， AsN; 3: DL2000 Marker
圖6為雙效疫苗載體RT-PCR檢測RNA的轉(zhuǎn)錄圖。
1: DL2000 Marker.
2:穩(wěn)定細(xì)胞液體擴(kuò)VP1;
3:提取朋K細(xì)胞DNA擴(kuò) VP1;
4:陰性對照。
圖7轉(zhuǎn)染的BHK-21細(xì)胞間接免疫熒光染色結(jié)果。
A轉(zhuǎn)染雙效質(zhì)粒；B:未轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
圖8 SDS-PAGE及Western-blot檢測結(jié)果。
1:細(xì)胞培養(yǎng)液上清；
2:經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞裂解液上清；
3， 10:低分子蛋 白Marker; 4， 5， 6， 7, 9經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞裂解液；8， BHK-21對照。
圖9病毒抑制試驗(yàn)的細(xì)胞病變圖及蝕斑減少試驗(yàn)結(jié)果 (A)第一排，IBRS-2細(xì)胞按100 TCIDs。的量接種FMDV OMIII毒:1. IBRS-2 對照；2，3，4及5:分別為IBRS-2細(xì)胞接毒后12，24，36， 48h;第二排
轉(zhuǎn)染雙效質(zhì)粒后24h時(shí)按100 TCIDs。的量接種FMDV OMIII毒1. IBRS-2對 照；2,3，4及5:分別為轉(zhuǎn)染細(xì)胞接毒后12，24，36, 48h; (B)蝕斑減少情況1. IBRS-2細(xì)胞對照；2.轉(zhuǎn)染雙效質(zhì)粒后24h時(shí)按10TCID5。 的量接種FMDV OMIII毒的蝕斑形成情況；3及4:分別是以100TCID5。和 lOTCIDs。的量接毒后的蝕斑形成情況。
圖IO小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖圖。
圖ll本發(fā)明雙效疫苗載體的構(gòu)建示意圖。
具體實(shí)施例方式
以下通過具體實(shí)施方式
對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明。這里想要指出的 是，下面的具體實(shí)施方式
僅用來說明本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員在理解本發(fā) 明精神的前提下，可以根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)和公知知識對本發(fā)明進(jìn) 行相應(yīng)變換，這些技術(shù)方案均落入本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
實(shí)施例1
雙效疫苗載體pAsN-IR-VPl的構(gòu)建
一、制備目的基因
所設(shè)計(jì)的5' AsN片段及VPl結(jié)構(gòu)蛋白基因的擴(kuò)增引物為
AsNl :5，-gcgaattcatgccagcacggcaactttac-3'; (856-873 ) EcoRI
AsN2: 5 ，-ctagctagcgttgggcctggagtagaatg—3; (1200-1219) Nhel
XP1:5，-gcgt2gi^Ccaccatgcacgcagaccacctccac-3'; (3247-3264) Sail
XP2: 5，-gcgcggccgcttcacaggcgccacaatc -3， (3865-3882) Notl
其中，在AsNl及XP1上游引入起始密碼子ATG，在其下游引物的3' 端引入終止密碼子，同時(shí)在XP1上游加入Kozak序列等元件。以口蹄疫病 毒OMIII毒株(為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所分離、保存并經(jīng) BHK-21細(xì)胞傳代增殖的細(xì)胞毒；該口蹄疫病毒OMIII毒株也可由其它
的口蹄疫病毒毒株來代替，本領(lǐng)域技術(shù)人員按照現(xiàn)有技術(shù)或文獻(xiàn)所公開 的方法均可以分離或獲得類似的口蹄疫病毒毒株，這些毒株均可替代口
蹄疫病毒OMIII毒株)為模板進(jìn)行擴(kuò)增(AsN基因片段的擴(kuò)增程序94°C 預(yù)變性5min; 94°C， lrain; 58°C， 45s; 72°C 50s; 30個(gè)循環(huán)后，72 °C 延伸8 min。 VPl基因的擴(kuò)增程序94"C預(yù)變性5 min; 94°C， lmin; 60 °C， lmin; 72°C lmin; 30個(gè)循環(huán)后，72 °C延伸8 min)。擴(kuò)增后所得到 的PCR產(chǎn)物分別見圖l和圖2。
二、雙效疫苗載體的構(gòu)建
將5， AsN基因片段及VPl結(jié)構(gòu)蛋白基因分別亞克隆到雙順反子表達(dá) 載體pIRES (購自Invitrogen生物公司)(雙順反子載體啟動子為CMV; 終止子為polyA)的多克隆位點(diǎn)A及B中，構(gòu)建成了 FMDV雙效載體 pAsN-IR-VP1。
所述的雙順反子表達(dá)載體的構(gòu)建包括以下操作
1) 將回收得到的目的基因5， AsN經(jīng)EcoRI及Nhel雙酶切，并純化 回收目的片段；
2) 將雙順反子載體pIRES經(jīng)EcoRI及Nhel雙酶切，得到線性化的載
體；
3) 用T4 DNA連接酶對上述產(chǎn)物進(jìn)行粘端連接；
4) 按常規(guī)方法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希氏菌(JM109)，在氨芐抗性 的瓊脂平板上篩選，挑選克隆后，提取質(zhì)粒；
5) 采用酶切、PCR擴(kuò)增方法鑒定(圖3)，得到陽性重組質(zhì)粒pAsN-IR。
6) 目的基因VPl經(jīng)Sal I及Not I雙酶切后，形成帶有粘性末端的目 的基因；
7) 將前面得到的pAsN-IR質(zhì)粒經(jīng)EcoRI及Nhel雙酶切，得到線性化 的載體；
8) 連接、轉(zhuǎn)化、挑選克隆、提取質(zhì)粒，采用酶切、PCR擴(kuò)增及DNA測 序等方法鑒定(圖4)，得到雙效疫苗載體pAsN-IR-VPl。
試驗(yàn)例1雙效疫苗載體pAsN-IR-VP1體外表達(dá)的檢測 一、用雙效疫苗載體pAsN-IR-VPl轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞 1)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的制備按照超純質(zhì)粒DNA制備試劑盒的操作步驟，無
菌提取質(zhì)粒pAsN-IR-VPl。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后鑒定質(zhì)粒正確，分光光
度計(jì)確定DNA的含量及純度；
2 )細(xì)胞轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞用含6X小牛血清的DMEM培養(yǎng)液在37。C、
5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長滿時(shí)挑取生長狀況良好的細(xì)胞經(jīng)胰酶消
化，血細(xì)胞記數(shù)板記數(shù)后接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，用不含抗生素的完全培
養(yǎng)液37X:培養(yǎng)過夜；
3) 將脂質(zhì)體(Lipofectamine 2000)懸液加至DMEM培養(yǎng)液中， 充分將二者混勻，室溫下溫育；在此期間吸棄細(xì)胞原培養(yǎng)液，用DMEM培
養(yǎng)液洗細(xì)胞一次；
4) 待細(xì)胞融合達(dá)50%-80%時(shí)，在Lipofectamine 2000介導(dǎo)下進(jìn)行 轉(zhuǎn)染，往每平皿加DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物，在5%(]02培養(yǎng)箱中溫育后吸棄含 DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物的培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)染4 h后補(bǔ)加含5%血清無抗生素的DMEM 以維持細(xì)胞的正常生長。細(xì)胞對照孔內(nèi)加入含相同濃度Lipofectamine1" 2000的MEM培養(yǎng)液。
5) 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后用轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行穩(wěn)定抗性細(xì)胞系的篩選及雙效質(zhì) 粒體外表達(dá)的檢測等工作。
二、體外表達(dá)的檢測
1、 用RT-PCR法檢測重組質(zhì)粒pAsN-IR-VP1中反義RNA部分在細(xì)胞中 的轉(zhuǎn)錄情況結(jié)果見圖5;
2、 用pAsN-IR-VP1瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的BHK-21或篩選出的穩(wěn)定細(xì)胞系進(jìn)行病 毒抑制試驗(yàn)，以評價(jià)反義RNA轉(zhuǎn)錄子對病毒產(chǎn)生的抑制效果，主要包括以 下操作
①pAsN-IR-VPl轉(zhuǎn)染細(xì)胞后24h按100 TCID50/0. lmL接種FMDV OMIII， 吸附lh后棄去細(xì)胞上清液，用DMEM洗滌細(xì)胞2次后加入含4 % FBS的DMEM繼 續(xù)培養(yǎng)；
8
②于感染的不同時(shí)間取細(xì)胞上清，用BHK-21細(xì)胞檢測不同時(shí)間所收 集細(xì)胞的病毒毒價(jià)(Bigeriego et al. ， 1999; Gutie'rrez et al. ， 1993)。 計(jì)算3次獨(dú)立的病毒抑制試驗(yàn)抑制率的平均值，以空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆作 為空白對照，計(jì)算病毒產(chǎn)生抑制率PI。
3、用pAsN-IR-VPl瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的BHK-21或用所篩選出的穩(wěn)定細(xì)胞系進(jìn) 行蝕斑減少試驗(yàn)，更直觀地了解反義RNA轉(zhuǎn)錄子對病毒產(chǎn)生的抑制效果。 主要包括以下操作
① 按常規(guī)方法培養(yǎng)IBRS-2細(xì)胞；
② 無菌PBS洗滌細(xì)胞，按100 TCID50/0. lmL接種FMDV OMIII (200uL/ 孔，6孔板)，置于二氧化碳培養(yǎng)箱；
③ lh之后按2mL/孔加入overlay培養(yǎng)液(一份2XMEM， 一份1.2% agar)靜置培養(yǎng)24-48h;
④ 吸棄培養(yǎng)液，加入冰冷的固定液(50%丙酮+50%甲醇)，-2(TC固定 lOminj
⑤ 加入結(jié)晶紫染色液約2mL，室溫染色30min;
⑥ 蒸餾水沖洗，自然干燥后計(jì)數(shù)蝕斑數(shù)，獲得病毒毒價(jià)。試驗(yàn)結(jié)果見 圖9。
4、用雙抗體夾心ELISA檢測VP1結(jié)構(gòu)蛋白基因在BHK-21細(xì)胞中的表 達(dá)情況主要包括以下操作
① 用重組雙效質(zhì)粒pAsN-IR-VPl轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)；
② 分別于24及48h時(shí)收取細(xì)胞，用0. 01M PBS液(pH7. 4)洗滌后胰 酶消化，離心后棄上清；細(xì)胞沉淀經(jīng)裂解液裂解并離心，上清用于ELISA 檢測。
③雙抗體夾心ELISA法檢測抗原96孔酶標(biāo)板用FMDV兔陽性血清 (1:1000)包埋，4。C過夜，馬血清封閉后，將FMDV抗原、轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 pAsN-IR-VP1的細(xì)胞裂解液及未轉(zhuǎn)染的空白對照細(xì)胞裂解液以2倍梯度稀 釋，每個(gè)稀釋度設(shè)兩復(fù)孔，37°C溫育lh后，洗滌后加入口蹄疫豚鼠陽性
抗血清(1:800) ， 37°C作用lh，洗滌后加入服P-兔抗豚鼠IgG (1:2000)， 37°C作用lh，加入底物0PD-HA于37°C作用15min，用終止液結(jié)束反應(yīng)， 于入492nm處測定0D值。
5、間接免疫熒光試驗(yàn)檢測VP1結(jié)構(gòu)蛋白基因在BHK-21細(xì)胞中的表達(dá) 主要包括以下操作
① 收取培養(yǎng)皿中轉(zhuǎn)染細(xì)胞生長密度達(dá)90%以上的蓋玻片，0.01 mol/L PBS液(pH7. 4 )漂洗，固定30 min后PBS液漂洗；
② 滴加FMDV兔陽性血清(1:1000)，濕盒孵化30 min后加FITC-羊抗兔 IgG (1:40);
③ 染色30 min后PBS液漂洗，自然干燥后甘油封片于熒光顯微鏡下 觀察，拍照。試驗(yàn)結(jié)果見圖7。
試驗(yàn)例2穩(wěn)定抗性細(xì)胞株的篩選與鑒定
穩(wěn)定抗性細(xì)胞株的篩選過程包括以下操作DG418的濃度確定G418 的最適用量通過建立細(xì)胞死亡曲線獲得，即將細(xì)胞稀釋至1000 cell/mL， 每孔按100pL加入含有培養(yǎng)基的24孔板，將每孔中的G418濃度稀釋至0， 100， 200， 300， 400， 500， 600， 700， 800， 900， 1000， 1100pg/mL等 12個(gè)級別，繼續(xù)培養(yǎng)3-4周，每3-4d換一次培養(yǎng)液，以最低細(xì)胞全部死亡 濃度為基準(zhǔn)，建立細(xì)胞死亡曲線， 一般為400-800嗎/mL左右，篩選時(shí)比 該濃度再高一個(gè)級別。選取B服-21細(xì)胞全部死亡孔G418的濃度為篩選 穩(wěn)定抗性B服-21細(xì)胞的最適用量，最后篩選濃度確定為500|ig/mL，維持時(shí) 使用篩選濃度的一半即可。
2)穩(wěn)定抗性細(xì)胞系的篩選:轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞后待細(xì)胞生長接近融合 時(shí)按1:4密度傳代，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞密度至50%-70%時(shí)棄培養(yǎng)液，更換為 500y g/mL的G418培養(yǎng)液進(jìn)行篩選，同時(shí)用未經(jīng)轉(zhuǎn)染的正常細(xì)胞作對照， 當(dāng)對照細(xì)胞大部分死亡時(shí)再更換一次篩選液，G418濃度可以降至 250 u g/mL，以維持篩選作用。約10-20d后，可見有抗性克隆形成，待其逐 漸增大后在鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞，以細(xì)胞套管套住單克隆細(xì)胞島后進(jìn)行消化，將
消化下的細(xì)胞轉(zhuǎn)移入96孔板培養(yǎng)細(xì)胞，每孔加100 u L完全培養(yǎng)液置C02 培養(yǎng)箱中孵育24 h后，每孔加入100uL工作濃度的G418選擇培養(yǎng)液。 按此條件，每隔3-4d換液培養(yǎng)，14 21d后， 一些孔內(nèi)可見細(xì)胞集落形 成。挑取集落轉(zhuǎn)移至6孔板中培養(yǎng)，生長良好后，再轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中培 養(yǎng)。
3)穩(wěn)定抗性細(xì)胞系的RT-PCR鑒定對經(jīng)G418多次篩選后的BHK-21 細(xì)胞用胰酶消化后4000 r/min離心5min，棄上清后沉淀用細(xì)胞裂解液裂解 后反復(fù)凍融，再次離心后取上清進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)提取BHK-21細(xì)胞的DNA 也進(jìn)行PCR擴(kuò)增，看是否有目的基因的存在。對擴(kuò)增得到的基因經(jīng)純化后 與Teasy載體連接，轉(zhuǎn)化后挑斑提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR及酶切鑒定后陽性克隆 測序，分析序列變異情況。
試驗(yàn)結(jié)果對用雙效質(zhì)粒pAsN-IR-VPl轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆經(jīng)G418多 次篩選后得到了穩(wěn)定抗性細(xì)胞株，經(jīng)RT-PCR及蝕斑減少試驗(yàn)等檢測表明 雙效質(zhì)粒能在BHK-21細(xì)胞中能穩(wěn)定傳代。對轉(zhuǎn)染雙效質(zhì)粒pAsN-IR-VP1 的BHK-21細(xì)胞克隆經(jīng)G418多次篩選后得到了穩(wěn)定抗性細(xì)胞株，經(jīng)RT-PCR 檢測表明雙效質(zhì)粒能在BHK-21細(xì)胞中穩(wěn)定傳代。
試驗(yàn)例3動物免疫試驗(yàn)
1) 用0MEGA公司的E. Z. N. AFastfilterEndo-freePlasmidMaxi Kit 大量提取質(zhì)粒pAsN-IR-VPl，方法參見試劑盒的操作步驟，分光光度計(jì)確 定DNA的含量及純度。
2) 將24只5-6日齡小鼠隨機(jī)分為4組(6只/組)，分為雙效質(zhì)粒 pAsN-IR-VPl免疫組、雙效質(zhì)粒pAsN-IR-VPl+利多卡因組、滅活疫苗組及 緩沖液對照組。第一次免疫后第四周加強(qiáng)免疫一次，第二次免疫后四周處 死小鼠。利多卡因組為注射質(zhì)粒前一周注射利多卡因(4rag/Kg體重)，以 提高細(xì)胞對質(zhì)粒DNA的攝取量，免疫后不同時(shí)間經(jīng)尾靜脈采血。
3)分離血清后以LBP-ELISA法檢測小鼠血清抗體的產(chǎn)生情況，結(jié)果 見表l。
表l VP1特異性抗體的檢測組別21天28 天14天(二21天(二28天(二
(一免)(一免)免)免)免)
本發(fā)明雙效質(zhì)1:2 1:21:41:8<1:4
粒
本發(fā)明雙效質(zhì)1:4 1:41:161:321:16
粒+
利多卡因
0型滅活疫苗1:4 1:12l:卯1:60<1:16
組
PBS<1:2 <1:2<1:2<1:2<1:2
4)于小鼠免疫前、 一免后28d及二免后21d采集小鼠脾臟淋巴細(xì)胞， 按MTT法進(jìn)行T淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)。
無菌制備小鼠淋巴細(xì)胞懸液，將細(xì)胞稀釋成2xl(y個(gè)/mL的單細(xì)胞懸 液，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入50uL。然后加入50uLPHA溶液 (濃度500y g/mL)，設(shè)三復(fù)孔，另設(shè)對照孔，對照孔中不加單細(xì)胞懸液， 只加入RPMI 1640培養(yǎng)液，其余同單細(xì)胞懸液孔。細(xì)胞置40。C、 5% C02飽 和濕度條件下培養(yǎng)45h，然后每孔加MTT溶液(5 mg/mL) 10uL，繼續(xù)培 養(yǎng)3h。取出后每孔加入10% SDS-O. Olmol/L HC1溶液100 yL，混勻后置 細(xì)胞培養(yǎng)箱中2h后取出，以對照孔調(diào)零，在X570nm處，測定每孔OD值， 結(jié)果以三個(gè)孔平均值表示，結(jié)果見圖IO。
試驗(yàn)結(jié)果大量提取質(zhì)粒pAsN-IR-VPl試制雙效疫苗免疫小鼠后采血 經(jīng)LBP-ELISA檢測表明本發(fā)明雙效疫苗pAsN-IR-VPl能剌激機(jī)體產(chǎn)生抗體， 二免3周時(shí)不同批次的抗體效價(jià)達(dá)1: 32-1: 64; MTT法檢測表明本發(fā)明 雙效質(zhì)粒pAsN-IR-VP1能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生脾臟T淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)；免疫 小鼠有效抗體的產(chǎn)生及T淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)，證實(shí)了本發(fā)明雙效質(zhì)粒pAsN-IR-VPl的基因免疫作用。
試驗(yàn)例3 乳鼠攻毒試驗(yàn)
用重組菌大量提取雙效質(zhì)粒pAsN-IR-VPl制成疫苗免疫動物或用 篩選出的穩(wěn)定含有雙效質(zhì)粒pAsN-IR-VPl的BHK-21細(xì)胞制成疫苗進(jìn)行動 物免疫。
先用3-4日齡的清潔級的乳鼠測定FMDV OM III毒的LD5()。隨后 選用24只乳鼠進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，將乳鼠隨機(jī)分為4組，本發(fā)明雙效質(zhì)粒 pAsN-IR-VPl免疫組及PBS對照組，按20LDso及1000)5()兩個(gè)劑量攻毒。 對雙效質(zhì)粒pAsN-IR-VPl免疫組乳鼠先背部肌肉100pg/只的雙效質(zhì)粒 pAsN-IR-VPl， 6-12h后按20LD5()及100 LD5q的量經(jīng)乳鼠背部皮下接種 lOOpL的OM III株細(xì)胞毒(g卩104及l(fā)(T3的病毒)，對照組也按兩個(gè)攻毒劑 量攻毒，觀察10天，計(jì)算乳鼠的保護(hù)率，試驗(yàn)結(jié)果見表2。
_表2乳鼠攻毒試驗(yàn)結(jié)果
組別 攻毒劑量(100pL)
率
緩沖液 10—3 本發(fā)明雙效質(zhì)粒免疫組 10—3
50%
緩沖液 10—4
本發(fā)明雙效質(zhì)粒免疫組 10—4 83%_
試驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明雙效質(zhì)粒pAsN-IR-VP1對乳鼠的保護(hù)率達(dá)到50 %-83%，表明本發(fā)明雙效疫苗對口蹄疫病毒具有顯著的基因治療作用。
死亡比率 保護(hù)
權(quán)利要求
1、O型口蹄疫病毒雙效疫苗載體，主要由雙順反子表達(dá)載體序列組成，其特征在于含有能夠與口蹄疫病毒基因組5’非編碼區(qū)RNA結(jié)合的反義基因序列和完整的口蹄疫病毒VP1結(jié)構(gòu)蛋白基因序列。
2、 按照權(quán)利要求l的O型口蹄疫病毒雙效疫苗載體，其特征在于所述的雙 順反子表達(dá)載體為pIRES;所述的能夠與口蹄疫病毒基因組5'非編碼區(qū)RNA結(jié)合 的反義基因序列是口蹄疫病毒基因片段AsN。
3、 按照權(quán)利要求l的O型口蹄疫病毒雙效疫苗載體，其特征在于所述的雙 順反子表達(dá)載體是pAsN-IR-VPl。
4、 權(quán)利要求l的O型口蹄疫病毒雙效疫苗載體的構(gòu)建方法，包括將針對口 蹄疫病毒5'非編碼區(qū)RNA的基因片段反向插入雙順反子表達(dá)載體的一個(gè)多克隆位 點(diǎn)上，將完整的VP1結(jié)構(gòu)蛋白基因正向插入該雙順反子表達(dá)載體的另一個(gè)多克隆位 點(diǎn)上。
5、 權(quán)利要求3的0型口蹄疫病毒雙效疫苗載體pAsN-IR-VPl的構(gòu)建方法，包 括將針對口蹄疫病毒5'非編碼區(qū)RNA的基因片段AsN反向插入雙順反子表達(dá)載 體pIRES的多克隆位點(diǎn)A，將完整的VP1結(jié)構(gòu)蛋白基因正向插入雙順反子表達(dá)載體 pIRES多克隆位點(diǎn)B中。
6、 一種治療和預(yù)防口蹄疫病毒的分子疫苗，含有免疫或治療上有效量的權(quán)利 要求1的0型口蹄疫病毒雙效疫苗載體和藥學(xué)上可接受的載體或輔料。
7、 權(quán)利要求1-3任意一種所述的0型口蹄疫病毒雙效疫苗載體在制備口蹄疫 病毒藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種口蹄疫病毒雙效疫苗載體以及該雙效疫苗載體的構(gòu)建方法和用途。本發(fā)明口蹄疫病毒雙效疫苗載體主要由雙順反子表達(dá)載體序列組成，其中含有能夠與口蹄疫病毒基因組5’非編碼區(qū)RNA結(jié)合的反義基因序列和完整的口蹄疫病毒VP1結(jié)構(gòu)蛋白基因序列。動物試驗(yàn)表明，本發(fā)明口蹄疫病毒雙效疫苗在動物口蹄疫的防制方面具有基因治療及基因免疫雙重功效。
文檔編號C12N15/63GK101195831SQ20071010308
公開日2008年6月11日 申請日期2007年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月28日
發(fā)明者喜 蘭, 劉兆弼, 方玉萍, 李學(xué)瑞, 李寶玉, 李志勇, 彬 楊, 柳紀(jì)省, 殷相平, 韓曉榮 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所