專利名稱：一種從貼底生長的細(xì)胞系獲得細(xì)胞克隆球的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細(xì)胞克隆球培養(yǎng)方法，特別是指一種從貼底生長的細(xì)胞系獲得細(xì)胞克隆球的方法。
背景技術(shù)：
細(xì)胞培養(yǎng)是許多生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和藥學(xué)研究中的基本步驟，在干細(xì)胞研究中，有時(shí)希望快速獲得大量的克隆球。目前從貼底生長的細(xì)胞系獲得干細(xì)胞克隆球的方法必須要用消化酶消化貼底細(xì)胞，使細(xì)胞懸浮，再用機(jī)械方法制得單細(xì)胞懸液。其缺點(diǎn)是，該方法中使用消化酶和機(jī)械方法，都可能對細(xì)胞造成損傷，且步驟繁瑣。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種從貼底生長的細(xì)胞系獲得細(xì)胞克隆球的方法，其操作簡便，且不易損傷細(xì)胞，培養(yǎng)效果好。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種從貼底生長的細(xì)胞系獲得細(xì)胞克隆球的方法，包括如下步驟步驟一、將細(xì)胞置于常規(guī)有血清培養(yǎng)基中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，讓細(xì)胞貼底生長；步驟二、培養(yǎng)7～20天后，當(dāng)懸浮的細(xì)胞中，完整的單個(gè)細(xì)胞達(dá)到一定數(shù)量時(shí)，收集懸浮細(xì)胞；步驟三、離心處理懸浮細(xì)胞，棄去上清液，再用HBSS液清洗剩余物；步驟四、將清洗后的剩余物置于至少添加有生長因子的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)；步驟五、培養(yǎng)10～20天后，即可獲得直徑在50～100微米的克隆球，克隆球部分呈懸浮狀，部分為貼底生長，把懸浮的克隆球和貼底的克隆球和貼底細(xì)胞分開培養(yǎng)，并定期更換培養(yǎng)基以維持培養(yǎng)基中有效成分的含量，培養(yǎng)瓶中即會持續(xù)不斷地生長出來新的克隆球。
優(yōu)選地，步驟一所用的常規(guī)有血清培養(yǎng)基通過在市售基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加質(zhì)量百分比為5～15％的胎牛血清制得。
優(yōu)選地，步驟三中，離心機(jī)轉(zhuǎn)速為1500～2000轉(zhuǎn)/分鐘，離心處理時(shí)間為3～5分鐘。
優(yōu)選地，步驟三中，采用HBSS液清洗剩余物2～4次。
優(yōu)選地，步驟四中，所述無血清培養(yǎng)基為市售的基礎(chǔ)干細(xì)胞培養(yǎng)基。
優(yōu)選地，步驟四中，所述生長因子采用bFGF、EGF、PDGF中的至少任意兩種，添加量為20～25ug/ml。
優(yōu)選地，步驟五中，克隆球采用手工方式取出。
優(yōu)選地，步驟五中，5～15天需更換一次培養(yǎng)基。
本發(fā)明的有益效果是傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，貼底生長的細(xì)胞若失去貼底能力，呈懸浮態(tài)，則被認(rèn)為是死亡或者將要死亡的細(xì)胞。而經(jīng)研究及通過多次實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)這些懸浮細(xì)胞并不都是死亡的細(xì)胞，相反里面含有高增殖能力的細(xì)胞亞群。而本發(fā)明方法比現(xiàn)有干細(xì)胞克隆球培養(yǎng)方法簡便，且不用消化酶，也不用機(jī)械方法制得單細(xì)胞懸液，在一個(gè)培養(yǎng)瓶中，克隆球可持續(xù)不斷地生長出來，從而可大量利用懸浮細(xì)胞，持續(xù)地獲得遺傳背景完全一致的干細(xì)胞克隆球；可廣泛應(yīng)用于干細(xì)胞理論研究、再生醫(yī)學(xué)、新藥開發(fā)等領(lǐng)域。


圖1為本發(fā)明方法的流程示意圖。
下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步描述。
具體實(shí)施例方式
如圖1所示，本發(fā)明提供一種從貼底生長的細(xì)胞系獲得細(xì)胞克隆球的方法，其包括如下步驟步驟一、將細(xì)胞置于常規(guī)有血清培養(yǎng)基中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞貼底生長，所述常規(guī)有血清培養(yǎng)基可在市售基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加質(zhì)量百分比為5～15％的胎牛血清制得，胎牛血清優(yōu)選添加質(zhì)量百分比為10％；步驟二、培養(yǎng)7～20天后，當(dāng)懸浮的細(xì)胞中，完整的單個(gè)細(xì)胞達(dá)到一定數(shù)量時(shí)，收集懸浮細(xì)胞，在一般情況下，這些懸浮細(xì)胞被認(rèn)為是失去活力，已死或者即將死亡的細(xì)胞；步驟三、離心處理懸浮細(xì)胞，離心處理一定時(shí)間后后棄去上清液，再用清洗液清洗剩余物，優(yōu)選HBSS液并清洗2次，離心機(jī)轉(zhuǎn)速優(yōu)選設(shè)定為1500轉(zhuǎn)/分鐘，優(yōu)選處理5分鐘；步驟四、將清洗后的剩余物置于至少添加有生長因子的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，所述無血清培養(yǎng)基優(yōu)選市售的基礎(chǔ)干細(xì)胞培養(yǎng)基，所述生長因子優(yōu)選采用bFGF、EGF、PDGF中的任意兩種，添加量為20～25ug/ml，當(dāng)然，也可視情況只采用其中一種或同時(shí)加入三種，但一般而言，若只采用其中一種，效果并不十分理想，而同時(shí)采用三種則費(fèi)用太高。
步驟五、培養(yǎng)10～20天后，可見到直徑在50～100微米的克隆球，有些呈懸浮狀，有些為貼底生長，把懸浮的克隆球分離出來單獨(dú)培養(yǎng)，而貼底的克隆球、貼底細(xì)胞仍一起培養(yǎng)，并定期更換培養(yǎng)基以維持培養(yǎng)基中有效成分的含量，由于懸浮克隆球沒有機(jī)會長出新的克隆球，因此，重點(diǎn)培養(yǎng)貼底的克隆球和細(xì)胞，原培養(yǎng)瓶中會持續(xù)不斷地生長出來新的克隆球，從而即可持續(xù)地獲得所需要的細(xì)胞克隆球，可供取出用于各項(xiàng)用途?？寺∏蚩刹捎檬止し绞讲粩嗳〕?，而不必使用消化酶。由于培養(yǎng)基中的生長因子耗盡時(shí)，克隆球?qū)饾u委頓，失去立體形狀，因此需經(jīng)常更換培養(yǎng)基，一般7～15天換一次，如果克隆球密度很大，如大于300個(gè)/cm2，甚至還可5天即更換一次培養(yǎng)基。
下面通過一個(gè)本發(fā)明的應(yīng)用例與一對比例進(jìn)行對比，來進(jìn)一步說明本發(fā)明方法的功效。
應(yīng)用例采用上述方法培養(yǎng)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251MG，第10天即見到克隆球，克隆球最高密度達(dá)到400個(gè)/cm2，在同一個(gè)培養(yǎng)瓶連續(xù)培養(yǎng)6個(gè)月，未見任何異常。在這6個(gè)月中，因其它實(shí)驗(yàn)需要，5次取出克隆球，每次取出的數(shù)量在500個(gè)左右。
對比例采用常規(guī)方法培養(yǎng)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251MG克隆球時(shí)，在10～15天，會有大量的細(xì)胞死亡，清除細(xì)胞碎片的工作比較繁瑣?？寺∏虻拿芏纫话阍?00個(gè)/cm2以下。
權(quán)利要求
1.一種從貼底生長的細(xì)胞系獲得細(xì)胞克隆球的方法，其特征在于，其包括如下步驟步驟一、將細(xì)胞置于常規(guī)有血清培養(yǎng)基中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，讓細(xì)胞貼底生長；步驟二、培養(yǎng)7～20天后，當(dāng)懸浮的細(xì)胞中，完整的單個(gè)細(xì)胞達(dá)到一定數(shù)量時(shí)，收集懸浮細(xì)胞；步驟三、將收集的懸浮細(xì)胞離心，棄去上清液，再用HBSS液清洗剩余物(含有具有較強(qiáng)增殖能力的單個(gè)細(xì)胞)；步驟四、將清洗后的剩余物置于至少添加有生長因子的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)；步驟五、培養(yǎng)10～20天后，即可獲得直徑在50～100微米的克隆球，克隆球部分呈懸浮狀，部分為貼底生長，把懸浮的克隆球和貼底的克隆球及貼底細(xì)胞分開培養(yǎng)，并定期更換培養(yǎng)基以維持培養(yǎng)基中有效成分的含量，培養(yǎng)瓶中即會持續(xù)不斷地生長出來新的克隆球。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從貼底生長的細(xì)胞系獲得細(xì)胞克隆球的方法，其特征在于步驟一所用的常規(guī)有血清培養(yǎng)基通過在市售基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加質(zhì)量百分比為5～15％的胎牛血清制得。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從貼底生長的細(xì)胞系獲得細(xì)胞克隆球的方法，其特征在于步驟三中，離心機(jī)轉(zhuǎn)速為1500～2000轉(zhuǎn)/分鐘，離心處理時(shí)間為3～5分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從貼底生長的細(xì)胞系獲得細(xì)胞克隆球的方法，其特征在于步驟三中，采用HBSS液清洗剩余物2～4次。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從貼底生長的細(xì)胞系獲得細(xì)胞克隆球的方法，其特征在于步驟四中，所述無血清培養(yǎng)基為市售的基礎(chǔ)干細(xì)胞培養(yǎng)基。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的一種從貼底生長的細(xì)胞系獲得細(xì)胞克隆球的方法，其特征在于步驟四中，所述生長因子采用bFGF、EGF、PDGF中的至少任意兩種，添加量為20～25ug/ml。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從貼底生長的細(xì)胞系獲得細(xì)胞克隆球的方法，其特征在于步驟五中，克隆球采用手工方式取出。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或7所述的一種從貼底生長的細(xì)胞系獲得細(xì)胞克隆球的方法，其特征在于步驟五中，5～15天需更換一次培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明公開一種從貼底生長的細(xì)胞系獲得細(xì)胞克隆球的方法，包括如下步驟將細(xì)胞置于常規(guī)有血清培養(yǎng)基中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，讓細(xì)胞貼底生長；培養(yǎng)7～20天后，收集懸浮細(xì)胞；離心處理懸浮細(xì)胞，棄去上清液，再用HBSS液清洗剩余物；將清洗后的剩余物置于至少添加有生長因子的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)；培養(yǎng)10～20天后，即可獲得克隆球，把懸浮的克隆球分離出來單獨(dú)培養(yǎng)，貼底的克隆球和貼底細(xì)胞仍在一起培養(yǎng)，并定期更換培養(yǎng)基，即會持續(xù)不斷地生長出新的克隆球。本發(fā)明方法簡便，且不用消化酶，也不用機(jī)械方法制得單細(xì)胞懸液，可持續(xù)地獲得遺傳背景完全一致的干細(xì)胞克隆球；可廣泛應(yīng)用于干細(xì)胞理論研究、再生醫(yī)學(xué)、新藥開發(fā)等領(lǐng)域。
文檔編號C12N5/08GK101092607SQ200710074498
公開日2007年12月26日 申請日期2007年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月17日
發(fā)明者金剛, 代建國 申請人:深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院