專利名稱：：通過多重聚合酶鏈式反應進行牛早期胚胎性別鑒定方法
技術領域：
：本發(fā)明創(chuàng)造涉及一種適用于牛早期胚胎性別鑒定的PCR反應技術體系。性別控制及其發(fā)展動態(tài)概述家畜性別控制(SexControl)是一項能顯著提高家畜繁殖效率的生物工程技術，本文簡稱性控技術。性控技術對家畜生產(chǎn)、育種和遺傳疾病的防治均有非常重要的意義。在生產(chǎn)上，通過性別控制不但可以提高畜牧業(yè)的經(jīng)濟效益，還可以節(jié)省懷孕期母畜本繁殖年度的伺料消耗；在育種方面，通過性別控制可以增加選擇家畜遺傳和表型性別的強度，加快遺傳進展；通過性別控制還可以消除不理想的攜帶隱性遺傳病的性別，防止性連鎖疾??；另外，在誘發(fā)牛產(chǎn)雙胎上具有重大意義，一般情況下，如果移植的兩枚胚胎是一雄一雌，就會造成異性孿生母犢不育，通過性別控制，就可以避免這種情況的發(fā)生。近年來，隨著胚胎移植技術的逐步應用，特別是胚胎冷凍技術的不斷完善，國際間的種畜交流逐漸被出售的胚胎所代替，已知性別的胚胎則備受歡迎和重視。細胞遺傳學、組織免疫學、分子生物學等學科的迅速發(fā)展和高精密儀器的研制成功，為性別控制的研究提供了理論依據(jù)和先進手段。在以往的20多年中，對哺乳動物的性別控制進行了大量研究，如應用性激素、改變體液酸堿度、控制受精時間、食物營養(yǎng)、飼喂不同^屬元素、改變生殖道環(huán)境、殺死或滅活帶某種染色體的精子等，但這些方法有些僅能改變一定性比，達不到完全控制性別的目的，并且這些實驗結果常常是不穩(wěn)定的和缺乏重復性。隨著對哺乳動物生殖機理認識的逐步深入，性別控制成為一種可能。現(xiàn)代生物科學理論認為動物的性別在兩性配子完成受精、形成受精卵時就決定下來了，所以性別控制主要可以從兩個方面入手。第一是控制雄性動物僅產(chǎn)生一種類型的精子或分離X、Y精子，然后用特定類型精子進入受精過程來實現(xiàn)對性別的控制。第二是控制胚胎的性別，而懷孕之初可能是控制胚胎性別的最有利時機，因?qū)ν砥谂咛ミM行操作比較困難，而且對已經(jīng)發(fā)生分化的胚胎進行操作可能會造成致命性的傷害。所以，目前性別控制的研究和應用主要集中在配子水平的精子性別鑒定和胚胎水平的胚胎性別鑒定兩個方向上。從目前性別控制研究的范圍和進展情況來看，通過附植前胚胎的性別鑒3定達到性別控制的目的更具現(xiàn)實意義。因此，多年來胚胎性別鑒定的研究極其廣泛。對胚胎性別鑒定方法的要求應是準確、迅速、經(jīng)濟、簡便和無損害的，并應適合任何發(fā)育階段的胚胎。事實上，要求某一方法達到所有條件是極不容易的。若能具備其中某些主要指標，則將是一種較好的方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明創(chuàng)造的目的是建立一種快速、靈敏、準確率高的適用于牛早期胚胎性別鑒定的PCR反應技術體系，建立一套切實可行的顯微操作胚胎徒手分割方法。本發(fā)明創(chuàng)造的目的是這樣實現(xiàn)的通過多重聚合酶鏈式反應進行牛早期胚胎性別鑒定方法，其組成包括胚胎手工分割，提取胚胎細胞DNA(模板)，多重PCR擴增反應，擴增產(chǎn)物的檢測與鑒定，在一個反應體系中，同時加入多對不同的引物，從而獲得最大效率的PCR產(chǎn)物，PCR擴增所用引物包括a.用于特異性鑒定的引物上游弓l物5，AACGAAGACGAAAGGTGGC3';下游弓l物5'CCGCCGAAATCCGTGTAG3';b.用于內(nèi)參照的引物上游引物5'CTAGTAGGCATCCTATTCCATGCC3';下游引物5，ATTCAGGCAAACTGACACCTCCG3。所述的通過多重聚合酶鏈式反應進行牛早期胚胎性別鑒定方法，所述的多重PCR擴增反應為PCR反應體系各組分配比為滅菌三蒸水(ddH20)13nl、10xZ-r"《緩沖液2.0nl、2.5mmol/LdNTP混合物2.0jd、2.5U/nlZ-7ii《DNA聚合酶0.2jil、模板(胚胎細胞DNA提取液)5.0pl、Sl和S2各1.0pl、oil和a2各0.4^U，總計25pl。該反應采用兩步法PCR，反應條件為98.0°C，6sec;62.8°C，10sec共30個循環(huán)。所述的通過多重聚合酶鏈式反應進行牛早期胚胎性別鑒定方法，其特征是所述的胚胎分割過程包括采用玻璃針切割法切割胚胎，將晚期桑椹胚或襄胚移入加有12.5%蔗糖的PBS，當胚胎沉入底部，左手將培養(yǎng)皿把握在實體顯微鏡的視野下，用右手的拇指和食指捏住玻璃切割針，用針尖后部切割，對于桑椹胚和囊胚，由于其細胞數(shù)較多，為了減小對胚胎的傷害，可以只切取10%左右的細胞和一小部分透明帶，剛開始切割時玻璃切割針位于胚胎上部，切割過程中逐漸偏向內(nèi)細胞團對側，使切下的部分越來越小，使得取樣部分約為10%,切下的樣品應為滋養(yǎng)層細胞，這樣可以減小切割對胚胎發(fā)育的影響，切到培養(yǎng)皿底部時輕輕后拉，使之徹底切斷，然后向水平方向橫拉，使之與剩余部分分離，為了防止樣品間交叉污染，每次切割下一個樣品之前用PBS涮洗切割針，切割順利，形態(tài)滿意，定為切割成功。一種通過多重聚合酶鏈式反應進行胚胎性別鑒定方法在牛胚胎性別鑒定中的應用。這個技術方案有以下有益效果1.建立了快速、靈敏、準確率高的適用于牛早期胚胎性別鑒定的PCR反應體系。根據(jù)牛SRY基因序列設計了特異性引物，設立a—乳清蛋白基因作為內(nèi)參照，兩對引物種屬特異性好，擴增靈敏度高。2.此體系采用多重PCR(MuleiplexPCR)，即同一體系內(nèi)同時加入兩對引物，其中一對是作為內(nèi)參照，另一對是作為特異性鑒定的引物。此方法操作簡便，用時較短，更重要的是增加了鑒定的準確率。在一個反應環(huán)境中，同時加入多對不同的引物，從而獲得最大效率的PCR產(chǎn)物，也就是說，在PCR反應體系中，因此隨溫度變化的多次重復，就可使極微量的DNA片段，甚至單拷貝基因復制到108以上拷貝，實現(xiàn)對目的DNA的快速放大。3.本技術首次將Z-rfl《DNA聚合酶用于PCR性別檢測，它是一種用于高速PCR的耐熱性DNA聚合酶，反應速度及保真性能都很高，其反應速度約為/7ii《DNA聚合酶的5倍，其保真性能約為r7ii《DNA聚合酶的3倍。使用z-r"《進行PCR反應可大大節(jié)省反應時間，適合于本實驗中胚胎在體外時間不宜過長的特殊要求的PCR反應。使反應時間從原來的110min減少到28min，縮短了74.5%。4.首次使用了Z—7ii《DNA聚合酶，結合多重PCR技術，使PCR反應時間縮短為原來的1/4,準確率達到100%。反應時間的縮短使胚胎回收、PCR反應、電泳檢測和移植的整個過程縮短為3h左右。5.建立了一套切實可行的顯微操作胚胎徒手分割方法。6.在奶牛生產(chǎn)實踐中，人為控制其性別及比例，一方面能夠加速優(yōu)良品種繁育，擴大優(yōu)良母畜的利用率，節(jié)省妊娠母畜本繁殖年度的飼料消耗，從而成倍地增加畜牧業(yè)的經(jīng)濟效益。另一方面，還可以消除不理想的攜帶隱性遺傳病的性別，防止性連鎖疾病，加速家畜的遺傳進展，加快奶畜群的更新。附圖1是本發(fā)明方法的PCR擴增產(chǎn)物電泳檢測與鑒定圖。具體實施例方式實施例l:通過多重聚合酶鏈式反應進行牛早期胚胎性別鑒定方法，其組成包括胚胎手工分割，提取胚胎細胞DNA(模板)，多重PCR反應，擴增產(chǎn)物的檢測與鑒定，在一個反應環(huán)境中，同時加入多對不同的引物，從而獲得最大效率的PCR產(chǎn)物，引物設計所用引物分別參照GenBank上牛的性別決定基因(Sex—determiningregionofYChromosome,SRY)、a—乳清蛋白基因(a—lactalbumin,a—LA)序列設計引物，設計軟件為DANMAN、PrimerPremier5.0,由上海博亞生物技術有限公司合成。PCR擴增所用引物:<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>胚胎分割過程采用玻璃針切割法切割胚胎，將晚期桑椹胚或囊胚移入加有12.5%蔗糖的PBS，當胚胎沉入底部，左手將培養(yǎng)皿把握在實體顯微鏡的視野下，用右手的拇指和食指捏住玻璃切割針，用針尖后部切割，對于桑椹胚和囊胚，由于其細胞數(shù)較多，為了減小對胚胎的傷害，可以只切取10%左右的細胞和一小部分透明帶，剛開始切割時玻璃切割針位于胚胎上部，切割過程中逐漸偏向內(nèi)細胞團對側，使切下的部分越來越小，使得取樣部分約為10%,切下的樣品應為滋養(yǎng)層細胞，這樣可以減小切割對胚胎發(fā)育的影響，切到培養(yǎng)皿底部時輕輕后拉，使之徹底切斷，然后向水平方向橫拉，使之與剩余部分分離，為了防止樣品間交叉污染，每次切割下一個樣品之前用PBS涮洗切割針，切割順利，形態(tài)滿意，定為切割成功。制備模板取適當數(shù)量的胚胎細胞(510個)用PBS洗3次，在體視顯微鏡下，用口吸管吸入預先放有5jilDNA提取液的0.2mlEp管中，室溫下放置5min，直接用于PCR擴增。制備PCR的反應液其組成及配比如下滅菌三蒸水(ddH20)13屮、10xZ-Taq緩沖液2.0pl、2.5mmol/LdNTP混合物2.0^1、2.5U/filZ-TaqDNA聚合酶0.2pl、模板(細胞DNA提取液)5.0jil、Sl和S2各1.0jil、al和a2各0.4nl，總計25nl。整個過程在冰上進行，Z-TaqDNA聚合酶最后加入。PCR反應該反應采用兩步法PCR，將混合好的PCR的反應液放入PCR儀，按照反應條件98.0'C，6sec，然后轉到62.8'C，10sec，再轉回到98.0'C，6sec，如此反復在兩組溫度和時間之間共進行30個循環(huán)，進行反應?；驍U增產(chǎn)物電泳檢測與鑒定取PCR產(chǎn)物6ul，力卩l(xiāng)ul6XLoadingBuffer,上樣于0.8%瓊脂糖凝膠，同時加4ulMarker(DL2000)作參照。恒壓180V/cm電泳30min，電泳結束后，雌性牛胚胎樣品出現(xiàn)一條109bp大小的特異性4帶(如下圖中1-4、6泳道)，雄性牛胚胎樣品出現(xiàn)兩條大小分別為109bp和432bp的特異性條帶(如下圖中5泳道)。PCR擴增產(chǎn)物電泳檢測與鑒定見圖1。圖中M:DL2000Marker;泳道1一4:牛胚胎樣品；泳道5:陽性對照，模板為雄性牛組織DNA;泳道6:陽性對照，模板為雌性牛組織DNA;泳道7:沒有添加模板的陰性對照實施例2:一種以上所述的通過多重聚合酶鏈式反應進行胚胎性別鑒定方法在牛胚胎性別鑒定中的應用。權利要求1.一種通過多重聚合酶鏈式反應進行牛早期胚胎性別鑒定方法，其組成包括胚胎手工分割，提取胚胎細胞DNA(模板)，多重PCR擴增反應，擴增產(chǎn)物的檢測與鑒定，其特征是在一個反應體系中，同時加入多對不同的引物，從而獲得最大效率的PCR產(chǎn)物，PCR擴增所用引物包括a.用于特異性鑒定的引物上游引物5′AACGAAGACGAAAGGTGGC3′；下游引物5′CCGCCGAAATCCGTGTAG3′；b.用于內(nèi)參照的引物上游引物5′CTAGTAGGCATCCTATTCCATGCC3′；下游引物5′ATTCAGGCAAACTGACACCTCCG3′。2.根據(jù)權利要求1所述的通過多重聚合酶鏈式反應進行牛早期胚胎性別鑒定方法，其特征是所述的多重PCR擴增反應為PCR反應體系各組分配比為滅菌三蒸水(ddH20)13^1、10xZ-7ii《緩沖液2.0jil、2.5mmol/LdNTP混合物2.0jd、2.5U/plZ-7ii《DNA聚合酶0.2jd、模板(胚胎細胞DNA提取液)5.0fil、Sl和S2各1.0nl、al和a2各0.4jd，總計25jU，該反應采用兩步法PCR，反應條件為98.0°C，6sec;62.8'C，10sec共30個循環(huán)。3.根據(jù)權利要求1或2所述的通過多重聚合酶鏈式反應進行牛早期胚胎性別鑒定方法，其特征是所述的胚胎分割過程包括釆用玻璃針切割法切割胚胎，將晚期桑椹胚或囊胚移入加有12.5%蔗糖的PBS，當胚胎沉入底部，左手將培養(yǎng)皿把握在實體顯微鏡的視野下，用右手的拇指和食指捏住玻璃切割針，用針尖后部切割，對于桑椹胚和囊胚，由于其細胞數(shù)較多，為了減小對胚胎的傷害，可以只切取10%左右的細胞和一小部分透明帶，剛開始切割時玻璃切割針位于胚胎上部，切割過程中逐漸偏向內(nèi)細胞團對側，使切下的部分越來越小，使得取樣部分約為10%，切下的樣品應為滋養(yǎng)層細胞，這樣可以減小切割對胚胎發(fā)育的影響，切到培養(yǎng)皿底部時輕輕后拉，使之徹底切斷，然后向水平方向橫拉，使之與剩余部分分離，為了防止樣品間交叉污染，每次切割下一個樣品之前用PBS涮洗切割針，切割順利，形態(tài)滿意，定為切割成功。4.一種通過多重聚合酶鏈式反應進行胚胎性別鑒定方法在牛胚胎性別鑒定中的應用。全文摘要通過多重聚合酶鏈式反應進行牛早期胚胎性別鑒定方法。性控技術對家畜生產(chǎn)、育種和遺傳疾病的防治均有非常重要的意義。本方法的組成包括胚胎手工分割，提取胚胎細胞DNA(模板)，多重PCR擴增反應，擴增產(chǎn)物的檢測與鑒定，在一個反應體系中，同時加入多對不同的引物，從而獲得最大效率的PCR產(chǎn)物，PCR擴增所用引物包括a.用于特異性鑒定的引物上游引物5′AACGAAGACGAAAGGTGGC3′；下游引物5′CCGCCGAAATCCGTGTAG3′；b.用于內(nèi)參照的引物上游引物5′CTAGTAGGCATCCTATTCCATGCC3′；下游引物5′ATTCAGGCAAACTGACACCTCCG3′。本方法用于牛胚胎的性別鑒定。文檔編號C12Q1/68GK101260425SQ20071007184公開日2008年9月10日申請日期2007年3月7日優(yōu)先權日2007年3月7日發(fā)明者娣劉,野袁申請人:黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院畜牧研究中心