專利名稱：植物內(nèi)生菌的制備方法
所屬領域本發(fā)明涉及一種從植物材料中富集內(nèi)生微生物的方法，也就是涉及一種植物內(nèi)生菌的制備方法。
背景技術：
植物個體無論是一粒種子還是一棵參天大樹，都是一種相對復雜的生態(tài)環(huán)境，種類和豐度不同的微生物棲息其中；對于生活在活的植物組織內(nèi)部而對植物不產(chǎn)生直接負面影響的微生物，被統(tǒng)稱為植物內(nèi)生菌。植物內(nèi)生菌普遍存在于植物體而且種類繁多，除少部分內(nèi)生菌集中群居在植物的某些特定部位比如根瘤和冠癭瘤以外，絕大多數(shù)植物內(nèi)生菌通常在植物體內(nèi)分散而居，人們對這些內(nèi)生菌的棲息部位和種類多樣性知之甚少。不僅如此，大部分環(huán)境微生物包括為數(shù)眾多的植物內(nèi)生菌難以人工培養(yǎng)成活，因而不能通過純培養(yǎng)進行分離鑒定以及產(chǎn)物化學研究。為了運用內(nèi)生菌宏基因組的研究策略發(fā)掘植物內(nèi)生菌的基因資源并開發(fā)其化合物產(chǎn)生的潛能，首要步驟是從植物材料富集植物內(nèi)生菌并去除大量植物遺傳物質(zhì)的干擾。相關的報道僅有富集土壤微生物的方法，其原理是通過密度梯度離心去除土壤雜質(zhì)，本發(fā)明人曾采用此種原理的方法卻不能從植物組織有效富集到內(nèi)生菌，這是因為所要去除的雜質(zhì)存在本質(zhì)不同，前者是土壤顆粒而后者是植物遺傳物質(zhì)。為了達到從植物材料富集內(nèi)生菌的目的，本申請的發(fā)明人在2006年曾報道用纖維素酶和離析酶從植物葉片和種子富集內(nèi)生菌的方法(Journal of Applied Microbiology 100830-837)。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)該方法存在缺點，即酶作用時間較長，可能因某些微生物的滋生而造成富集樣品內(nèi)生菌豐度偏差。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服上述已有技術的局限，提供一種新的植物內(nèi)生菌制備方法。
為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術方案植物內(nèi)生菌的制備方法，取植物材料經(jīng)高速組織搗碎機勻漿，低速離心，取上清液加入鹵鹽至終濃度0.1％～3.0％，以重量/體積為單位，再加入表面活性劑至終濃度0.01～2.0％，以重量/體積為單位，混勻，靜置1-2小時，取上清液離心，得到沉淀為植物內(nèi)生菌。
上述方法所使用的鹵鹽優(yōu)選用一價陽離子鹵鹽，或二價陽離子鹵鹽。
上述方法所使用的表面活性劑優(yōu)選用離子型表面活性劑或非離子型表面活性劑。
本發(fā)明的方法是基于一定量的植物材料和無菌水用高速組織搗碎機處理，勻漿液經(jīng)低速離心分離之后，用一定濃度的鹵鹽和表面活性劑清除植物來源雜質(zhì)包括細胞核、細胞器和膠質(zhì)等，自然沉降后取上清液經(jīng)高速離心收集沉淀就可得到內(nèi)生菌豐富而植物遺傳干擾物質(zhì)甚少的富集樣品。
具體實施例方式
下面結合本發(fā)明的實施例進一步來說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明。
實施例1取滑桃樹莖皮40克，用自來水和蒸餾水洗凈，加入300毫升無菌水，用高速組織搗碎機18000rpm勻漿；用無菌紗布過濾去除未破碎的組織與纖維，濾液用低速離心(200g×5min)分離去除沉淀；往上清液中加入氯化鈉至終濃度1.0％(w/v)以及十二烷基磺酸鈉至終濃度0.05％(w/v)，顛倒混勻并靜置1小時，此時會有大量絮狀沉淀產(chǎn)生，不要擾動沉淀；小心吸取上清液至一新的滅菌離心管，5000g離心10分鐘，得到的沉淀即為內(nèi)生菌富集樣品。
實施例2取云南美登木新鮮葉片20克，用自來水和蒸餾水洗凈，加入400毫升無菌水，用高速組織搗碎機15000rpm勻漿；用無菌紗布過濾去除未破碎的組織與纖維，濾液用低速離心(200g×5min)分離沉淀；往上清液中加入氯化鋰至終濃度0.6％(w/v)以及Triton X-100至終濃度0.15％(w/v)，顛倒混勻并靜置2小時，此時會有大量絮狀沉淀產(chǎn)生，不要擾動沉淀；小心吸取上清液至一新的滅菌離心管，5000g離心10分鐘，得到的沉淀即為內(nèi)生菌富集樣品。
實施例3取實施例1或2所得到的內(nèi)生菌富集樣品，進行內(nèi)生菌富集效果的檢測。運用不依賴于培養(yǎng)的16S rRNA基因技術，提取內(nèi)生菌富集樣品的DNA，以2克葉片或莖皮的DNA作為對照，建立16S rDNA文庫；隨機挑取至少100個克隆進行16S rDNA擴增片段的Pvu II酶切，不能被Pvu II酶切的克隆可能來源于原核微生物；對這部分克隆進行RFLP分型以及DNA測序，根據(jù)16S rDNA序列推測該序列來源于植物葉綠體還是內(nèi)生菌的原核細胞。與對照相比，富集樣品中，原核微生物來源的16S rDNA克隆的比例和序列多樣性明顯增加(見表1)，說明本發(fā)明方法能夠得到豐富多樣的植物內(nèi)生菌，而植物遺傳物質(zhì)干擾明顯減少，從而達到了從植物材料富集內(nèi)生菌的目的。
表1 本發(fā)明植物內(nèi)生菌富集效果的檢測結果

*克隆的分子系統(tǒng)類型用pro表示原核細胞來源；原核細胞16S rDNA克隆占總檢測克隆的百分數(shù)。
權利要求
1.植物內(nèi)生菌的制備方法，其特征在于植物材料經(jīng)高速組織搗碎機勻漿，低速離心，取上清液加入鹵鹽至終濃度0.1％～3.0％，以重量/體積為單位，再加入表面活性劑至終濃度0.01～2.0％，以重量/體積為單位，混勻，靜置1-2小時，取上清液離心，得到沉淀為植物內(nèi)生菌。
2.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于鹵鹽優(yōu)選用一價陽離子鹵鹽，或二價陽離子鹵鹽。
3.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于表面活性劑優(yōu)選用離子型表面活性劑或非離子型表面活性劑。
全文摘要
提供一種植物內(nèi)生菌的制備方法，即從植物材料富集內(nèi)生微生物的方法，包括植物組織勻漿液經(jīng)低速離心去除未充分破碎的植物細胞團和部分細胞核之后，進一步用鹵鹽和表面活性劑清除植物來源雜質(zhì)包括細胞核、細胞器和膠質(zhì)等，高速離心收集沉淀得到植物內(nèi)生菌富集樣品。運用不依賴于培養(yǎng)的16S rRNA基因技術檢測原核微生物，證實內(nèi)生菌的富集效果明顯。
文檔編號C12N1/00GK101050424SQ20071006572
公開日2007年10月10日 申請日期2007年3月19日 優(yōu)先權日2007年3月19日
發(fā)明者王浩鑫, 曾英, 沈月毛 申請人:中國科學院昆明植物研究所