專(zhuān)利名稱(chēng)：一種固定化細(xì)胞聚丙烯酰胺大孔凝膠載體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及固定化細(xì)胞載體及其制備方法，特別是涉及一種用于固定微生物細(xì)胞的聚丙烯酰胺大孔凝膠固定化材料及其制備方法。
背景技術(shù)：
固定化酶技術(shù)是通過(guò)物理或化學(xué)的方法將酶連接在一定的固相載體上成為固定化酶的技術(shù)，而固定化細(xì)胞技術(shù)是在固定化酶技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種生物固定化技術(shù)，是將完整的細(xì)胞連接在固相載體上，既免去了破碎細(xì)胞提取酶的程序，又保持了酶的完整性和活性的穩(wěn)定。相比固定化酶技術(shù)，固定化細(xì)胞技術(shù)不但能夠保持酶的原始狀態(tài)，加強(qiáng)穩(wěn)定性，而且本身是多酶系統(tǒng)，無(wú)需輔酶再生，因而也節(jié)省了酶分離費(fèi)用；此外，固定化細(xì)胞技術(shù)還具有細(xì)胞濃度高、流失少，菌體細(xì)胞易于分離，可多次重復(fù)使用，操作簡(jiǎn)單和浪費(fèi)少等優(yōu)點(diǎn)，在生物工程、環(huán)境工程等領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。目前，常用的細(xì)胞固定化方法主要有吸附法、包埋法、交聯(lián)法和截留法等，可根據(jù)不同的固定對(duì)象和應(yīng)用需求選取不同的固定化方法，其中吸附法和包埋法是固定細(xì)菌(如纖維素降解菌等)的主要方法。表面吸附固定法的優(yōu)點(diǎn)是能有效的保持產(chǎn)酶微生物(主要是真菌)的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶活性，并且載體可以重復(fù)利用。然而，用吸附法固定微生物細(xì)胞時(shí)，pH值、細(xì)胞壁的組分、載體的性質(zhì)等均可影響細(xì)胞與載體之間的相互作用，只有當(dāng)細(xì)胞的性質(zhì)、載體的特征及細(xì)胞與載體間的作用等參數(shù)配合恰當(dāng)時(shí)，才能形成穩(wěn)定的微生物細(xì)胞-載體復(fù)合物，此外，細(xì)胞與載體之間的結(jié)合力較弱，操作的穩(wěn)定性也較差，因而吸附法在實(shí)際應(yīng)用當(dāng)中仍存在一定的技術(shù)問(wèn)題。包埋法是將微生物封閉在天然高分子多糖類(lèi)或合成高分子凝膠的網(wǎng)絡(luò)中。細(xì)菌、酵母等完整細(xì)胞的固定化一般采用聚丙烯酰胺、海藻酸鈉和卡拉膠或聚合物凝膠作為載體，其中聚丙烯酰胺由于傳質(zhì)性能和化學(xué)穩(wěn)定性均相對(duì)較優(yōu)，成為最為常用的固定化材料。然而傳統(tǒng)化學(xué)交聯(lián)聚合法由于聚合過(guò)程放熱，從而對(duì)菌體的活性有較大的影響，并且交聯(lián)劑和殘留的單體如丙烯酰胺，對(duì)包埋的菌體具有毒性作用，因而也將影響到菌體的活性。因此，在傳統(tǒng)常溫聚丙烯酰胺載體制備法的基礎(chǔ)上發(fā)展了冷凍聚丙烯酰胺載體制備技術(shù)，可以明顯降低底物和氧的傳質(zhì)擴(kuò)散阻力，使微生物受丙烯酰胺單體的毒害作用降低，具有更高的產(chǎn)酶活性。但是，冷凍聚丙烯酰胺載體制備技術(shù)中的聚合和交聯(lián)過(guò)程在空間上存在不均勻性，由此導(dǎo)致形成的凝膠孔隙大小和孔隙度的不均勻，并且該技術(shù)對(duì)溫度條件要求嚴(yán)格，聚合反應(yīng)溫度越低，孔徑就越小，傳質(zhì)效率就越低；反之聚合反應(yīng)溫度越高，孔徑就越大，載體的強(qiáng)度就越低。因此，利用冷凍技術(shù)制備固定化細(xì)胞載體的操作相對(duì)困難，難以進(jìn)行大規(guī)模制備和應(yīng)用?；谀壳暗难芯?，丙烯酰胺單體用化學(xué)聚合或輻照聚合后得到的凝膠，孔徑一般在0.5μm以下，而具有纖維素降解能力的細(xì)菌直徑在1μm以上，真菌菌絲體則更長(zhǎng)，并且大多分泌的是胞內(nèi)酶，而細(xì)菌的纖維素酶位于細(xì)胞膜上，細(xì)菌需要附著到纖維素上方能對(duì)其進(jìn)行降解，因此按照傳統(tǒng)方法制備的固定化細(xì)菌無(wú)法直接降解纖維素。因此，現(xiàn)有的固定化細(xì)胞載體的制備方法對(duì)菌體活性存在抑制作用、操作過(guò)程難以精確控制、且因載體孔徑過(guò)小還會(huì)阻礙菌體與底物接觸等技術(shù)問(wèn)題，特別是對(duì)纖維素降解菌的細(xì)胞固定化技術(shù)尚不成熟。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是一種既能夠使部分菌體擴(kuò)散與底物充分接觸又能夠使部分菌體固定于載體，且能重復(fù)利用的固定化細(xì)胞聚丙烯酰胺大孔凝膠載體。
本發(fā)明所提供的固定化細(xì)胞聚丙烯酰胺大孔凝膠載體，是先制備含丙烯酰胺單體和N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺(BIS)單體的混合溶液，然后向該混合溶液中加入NaCl至飽和，再將上述溶液移至凝膠載體制備容器中，均勻加入NaCl粉末直至高出液面2-5cm，隨后排除溶液和容器中的氧氣，密封容器，再用放射線(xiàn)輻照使丙烯酰胺單體和N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺單體聚合，最后將經(jīng)輻照聚合后獲得的凝膠進(jìn)行水浴后得到的既可用于液相接種又可用于固相接種的固定化細(xì)胞聚丙烯酰胺大孔凝膠載體。
所述溶液中丙烯酰胺單體的濃度為90-100g/L，N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺單體的濃度為4-6g/L。
所述NaCl粉末的粒徑可根據(jù)所要固定的目的微生物細(xì)胞隨意選擇，如10-1000μm。
所述放射線(xiàn)可為Co60源γ射線(xiàn)或X射線(xiàn)等，優(yōu)選為Co60源γ射線(xiàn)。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種上述固定化細(xì)胞聚丙烯酰胺大孔凝膠載體的制備方法。
本發(fā)明所提供的制備方法，包括以下步驟1)制備含90-100g/L丙烯酰胺單體和4-6g/L N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺單體的混合溶液，再向該混合溶液中加入NaCl至飽和，以NaCl不再溶解為止；2)將步驟1)的NaCl飽和溶液移至凝膠載體制備容器中，均勻加入NaCl粉末直至高出液面2-5cm；3)排除溶液和容器中的氧氣，然后密封容器，以防止空氣進(jìn)入；
4)用放射線(xiàn)輻照，以使丙烯酰胺單體和N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺單體聚合；5)將步驟4)經(jīng)輻照聚合后獲得的凝膠進(jìn)行水浴，以溶去未交聯(lián)聚合的丙烯酰胺單體和/或N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺單體及鹽顆粒模板，得到既可用于液相接種又可用于固相接種的固定化細(xì)胞聚丙烯酰胺大孔凝膠載體。
在上述制備方法中，步驟1)中用于制備丙烯酰胺單體和N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺單體混合溶液的溶劑可為去離子水或蒸餾水等極性溶劑，優(yōu)選為去離子水。
步驟2)中所用的NaCl粉末的粒徑可根據(jù)所要固定的目的微生物細(xì)胞隨意選擇，如10-1000μm。所述NaCl顆?？赏ㄟ^(guò)均勻研磨和過(guò)篩等常規(guī)方法控制粒徑大小。
步驟3)中可用通入氮?dú)獾姆椒ㄅ懦芤汉腿萜髦械难鯕?，具體方法為將氮?dú)馄拷由舷鹉z管一端，所述橡膠管另一端與玻璃管一端連接(如需批量制備，可先將氮?dú)馄拷由蠚馀?，再通過(guò)橡膠管將氣排與若干根玻璃管子連接)，再將玻璃管另一端插入所述凝膠載體制備容器中，伸入所述丙烯酰胺單體和N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺單體混合溶液液面下的靠近NaCl粉末處，然后打開(kāi)氣閥并緩慢調(diào)節(jié)氮?dú)饬魉?，使氮?dú)鈮毫Σ恢掠谶^(guò)大噴出溶液，同時(shí)又能起到排除氧氣的作用；所述通氮除氧時(shí)間可為20-30min，通氮之后關(guān)閉氣閥。
步驟4)中所述放射線(xiàn)可為Co60源γ射線(xiàn)或X射線(xiàn)等，優(yōu)選為Co60源γ射線(xiàn)；所述輻照劑量可為20-30KGy，放射線(xiàn)輻照處理后凝膠載體的機(jī)械性能得到有效提高。
步驟5)中將步驟4)經(jīng)輻照聚合后獲得的凝膠進(jìn)行水浴，水浴溫度優(yōu)選為65-85℃，水浴時(shí)間優(yōu)選為60-72小時(shí)。
本發(fā)明提供了一種固定化細(xì)胞聚丙烯酰胺大孔凝膠載體及其制備方法。本發(fā)明是從保持固定菌體活性和菌體與底物有效接觸相結(jié)合的角度，提出的固定化細(xì)胞聚丙烯酰胺大孔凝膠載體的常溫制備技術(shù)，具有以下特點(diǎn)1)采用聚丙烯酰胺水凝膠作為基材，并添加BIS作為改性物質(zhì)，能夠有效提高載體的機(jī)械強(qiáng)度；2)針對(duì)化學(xué)聚合中聚合程度不均勻的缺點(diǎn)，本發(fā)明采用輻照聚合的方法，從而可以在體系中均勻產(chǎn)生自由基，并且不受所添加的NaCl粉末制孔劑的影響；3)針對(duì)傳統(tǒng)方法制備的聚丙烯酰胺載體表面光滑致密，沒(méi)有多孔結(jié)構(gòu)存在的缺點(diǎn)，本發(fā)明采用鹽顆粒-飽和鹽溶液作為制孔模板，通過(guò)控制NaCl粉末制孔劑的粒徑，可以隨意調(diào)節(jié)聚丙烯酰胺凝膠載體的孔徑(幾十-幾百μm)，從而可以得到大孔凝膠載體，非常適合于需要協(xié)同作用的復(fù)合纖維素分解菌群，尤其是細(xì)菌-真菌復(fù)合體的定殖和生長(zhǎng)；4)針對(duì)化學(xué)聚合中殘留雜質(zhì)影響載體性質(zhì)的缺點(diǎn)，在本發(fā)明的制備過(guò)程中聚丙烯酰胺凝膠經(jīng)致孔、交聯(lián)、輻照聚合后，洗滌除去所有致孔劑和未交聯(lián)的丙烯酰胺和N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺單體，再放入菌液中吸附菌體，從而能夠完全克服傳統(tǒng)聚丙烯酰胺包埋處理對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生的毒性影響，同時(shí)又能夠充分發(fā)揮聚丙烯酰胺凝膠優(yōu)良的生物兼容性；5)本發(fā)明載體的機(jī)械性能易于通過(guò)輻照劑量控制，提高輻照劑量不僅能夠提高載體的彈性模量，還可增強(qiáng)其機(jī)械強(qiáng)度；但輻照劑量過(guò)高，彈性模量增加并不明顯，反而會(huì)因產(chǎn)生的氣體量增多而影響其強(qiáng)度，因此，輻照劑量?jī)?yōu)選為5-20KGy；6)本發(fā)明的聚丙烯酰胺大孔凝膠載體對(duì)生物體的親和性和兼容性好，又具有多孔結(jié)構(gòu)和通透性，能夠使部分菌體吸附生長(zhǎng)在載體上，另一部分?jǐn)U散到液態(tài)底物中，并吸附到固態(tài)底物表面，不僅能夠彌補(bǔ)傳統(tǒng)固定化細(xì)胞載體制備的不足，使載體性質(zhì)均勻，孔徑大小適宜菌體的吸附生長(zhǎng)和擴(kuò)散，可實(shí)現(xiàn)固態(tài)底物、液態(tài)底物和載體的三相平衡，既能充分發(fā)揮菌體降解作用，又能使固定化菌體重復(fù)利用，擴(kuò)散出載體的部分菌體起到真菌的胞外酶作用，能夠?qū)Φ孜镞M(jìn)行降解，而附著在載體上或者內(nèi)部的菌體即為固定化菌體，可以進(jìn)行移植重復(fù)使用；7)本發(fā)明的大孔凝膠載體適合于各種微生物，特別是對(duì)能夠以酶作用加速纖維素降解的纖維素降解菌的固定，擴(kuò)散出載體的部分菌體起到真菌胞外纖維素酶的作用，附著在載體上或者內(nèi)部的菌體即為固定化真菌菌體，釋放出的游離細(xì)菌可起到纖維素降解作用，吸附在載體上的部分菌體可隨載體移入其它培養(yǎng)體系重復(fù)使用；8)本發(fā)明固定化細(xì)胞聚丙烯酰胺大孔凝膠載體的常溫制備技術(shù)操作簡(jiǎn)單、實(shí)用，成本低廉，制備條件易于控制，產(chǎn)品機(jī)械強(qiáng)度適宜，對(duì)菌體無(wú)毒性，應(yīng)用方便。本發(fā)明的固定化細(xì)胞聚丙烯酰胺大孔凝膠載體及其制備方法將在固定化微生物(特別是細(xì)菌，如纖維素降解菌)的制備中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法。
實(shí)施例1、固定化細(xì)胞聚丙烯酰胺大孔凝膠載體的制備及其微生物固定化效果的檢測(cè)一、制備固定化細(xì)胞聚丙烯酰胺大孔凝膠載體本發(fā)明固定化細(xì)胞聚丙烯酰胺大孔凝膠載體的制備方法，包括以下步驟1)在200mL去離子水中溶解19g丙烯酰胺(分析純)，再加入1g N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺(分析純)，待充分溶解后，得到含95g/L丙烯酰胺單體和5g/L N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺單體的混合溶液，再向該混合溶液中加入NaCl顆粒(分析純)至飽和，以NaCl不再溶解為止；2)將步驟1)的NaCl飽和溶液移入輻照管(20mm×200mm玻璃試管)中，用小勺緩慢向輻照管中均勻加入用研缽研磨均勻的NaCl粉末(粒徑約為180-300μm)，NaCl密度較大會(huì)沉到管底，添加NaCl粉末直至高度約5cm；
3)用通入氮?dú)獾姆椒ㄅ懦芤汉腿萜髦械难鯕?，具體方法為將氮?dú)馄拷由舷鹉z管一端，所述橡膠管另一端與玻璃管一端連接，再將玻璃管另一端插入所述輻照管中，伸入所述丙烯酰胺單體和N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺單體混合溶液液面下的靠近NaCl粉末處，然后打開(kāi)氣閥并緩慢調(diào)節(jié)氮?dú)饬魉?，使氮?dú)鈮毫Σ恢掠谶^(guò)大噴出溶液，同時(shí)又能起到排除氧氣的作用，通氮除氧20min后關(guān)閉氣閥，然后立即用硅膠塞封住所述輻照管口，以防止空氣進(jìn)入；4)將所述輻照管置于Co60源γ輻照?qǐng)鲞M(jìn)行輻照，輻照劑量為10KGy(5-20Kgy均可)，使丙烯酰胺單體和N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺單體聚合；5)輻照完畢后，將所述輻照管包上厚紙，用鐵錘隔紙敲碎玻璃，同時(shí)又保障不會(huì)損傷里邊的凝膠，取出凝膠，將已制孔凝膠分離開(kāi)，置于去離子水中，在80℃(65-85℃均可)下水浴72小時(shí)，以溶去未交聯(lián)聚合的丙烯酰胺單體和N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺單體及鹽顆粒模板，得到固定化細(xì)胞聚丙烯酰胺大孔凝膠載體。
二、檢測(cè)本發(fā)明固定化細(xì)胞聚丙烯酰胺大孔凝膠載體的微生物固定化效果以以產(chǎn)黃纖維單胞菌(Cellulomonas flavigena)中國(guó)科學(xué)院微生物所No.1.1002為例，檢測(cè)步驟一制備的固定化細(xì)胞聚丙烯酰胺大孔凝膠載體的微生物固定化效果，具體方法為首先配制LB液體培養(yǎng)基，并將步驟一制備的固定化細(xì)胞大孔凝膠載體剪裁成合適大小，置于LB液體培養(yǎng)基中，封口后一同滅菌，然后向經(jīng)滅菌的LB液體培養(yǎng)基中接種復(fù)壯后的產(chǎn)黃纖維單胞菌，在30℃下恒溫振蕩(振蕩頻率120rpm)培養(yǎng)20小時(shí)，即可完成產(chǎn)黃纖維單胞菌在所述聚丙烯酰胺大孔凝膠載體上的固定，菌體密度可達(dá)4.4×107cfu/cm2，表明產(chǎn)黃纖維單胞菌可以本發(fā)明的聚丙烯酰胺大孔凝膠載體為支持物密集附著生長(zhǎng)，并可達(dá)到一定的動(dòng)態(tài)平衡。用上述相同的方法還對(duì)大腸桿菌(Escherichia coli)、臘狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)、綠色木霉(Trichodermaviride)和里氏木霉(Trichoderma reesei)進(jìn)行了固定化效果檢測(cè)，結(jié)果均獲得了較好的固定效果，菌體密度可達(dá)107cfu/cm2以上，表明本發(fā)明的固定化細(xì)胞聚丙烯酰胺大孔凝膠載體具有較好的生物兼容性。
此外，還對(duì)上述聚丙烯酰胺大孔凝膠載體進(jìn)行了壓縮強(qiáng)度試驗(yàn)和電鏡掃描觀察，檢測(cè)結(jié)果表明，該載體具有較好的機(jī)械性能，抗壓強(qiáng)度大。
實(shí)施例2、固定化細(xì)胞聚丙烯酰胺大孔凝膠載體的制備及其微生物固定化效果的檢測(cè)一、制備固定化細(xì)胞聚丙烯酰胺大孔凝膠載體本發(fā)明固定化細(xì)胞聚丙烯酰胺大孔凝膠載體的制備方法，包括以下步驟
1)在200mL去離子水中溶解20g丙烯酰胺(分析純)，再加入1.2g N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺(分析純)，待充分溶解后，得到含100g/L丙烯酰胺單體和6g/L N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺單體的混合溶液，再向該混合溶液中加入NaCl顆粒(分析純)至飽和，以NaCl不再溶解為止；2)將步驟1)的NaCl飽和溶液移入輻照管(20mm×200mm玻璃試管)中，用小勺緩慢向輻照管中均勻加入用研缽研磨均勻的NaCl粉末(粒徑約為180-300μm)，NaCl密度較大會(huì)沉到管底，添加NaCl粉末直至高度約5cm；3)用通入氮?dú)獾姆椒ㄅ懦芤汉腿萜髦械难鯕?，具體方法為將氮?dú)馄拷由舷鹉z管一端，所述橡膠管另一端與玻璃管一端連接，再將玻璃管另一端插入所述輻照管中，伸入所述丙烯酰胺單體和N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺單體混合溶液液面下的靠近NaCl粉末處，然后打開(kāi)氣閥并緩慢調(diào)節(jié)氮?dú)饬魉?，使氮?dú)鈮毫Σ恢掠谶^(guò)大噴出溶液，同時(shí)又能起到排除氧氣的作用，通氮除氧30min后關(guān)閉氣閥，然后立即用硅膠塞封住所述輻照管口，以防止空氣進(jìn)入；4)將所述輻照管置于Co60源γ輻照?qǐng)鲞M(jìn)行輻照，輻照劑量為20KGy(5-20Kgy均可)，使丙烯酰胺單體和N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺單體聚合；5)輻照完畢后，將所述輻照管包上厚紙，用鐵錘隔紙敲碎玻璃，同時(shí)又保障不會(huì)損傷里邊的凝膠，取出凝膠，將已制孔凝膠分離開(kāi)，置于去離子水中，在70℃(65-85℃均可)下水浴85小時(shí)，以溶去未交聯(lián)聚合的丙烯酰胺單體和N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺單體及鹽顆粒模板，得到固定化細(xì)胞聚丙烯酰胺大孔凝膠載體。
二、檢測(cè)本發(fā)明固定化細(xì)胞聚丙烯酰胺大孔凝膠載體的微生物固定化效果以產(chǎn)黃纖維單胞菌(Cellulomonas flavigena)中國(guó)科學(xué)院微生物所No.1.1002為例，檢測(cè)步驟一制備的固定化細(xì)胞聚丙烯酰胺大孔凝膠載體的微生物固定化效果，具體方法為首先配制LB液體培養(yǎng)基，并將步驟一制備的固定化細(xì)胞聚丙烯酰胺大孔凝膠載體剪裁成合適大小，置于LB液體培養(yǎng)基中，封口后一同滅菌，然后向經(jīng)滅菌的LB液體培養(yǎng)基中接種復(fù)壯后的產(chǎn)黃纖維單胞菌，在30℃下恒溫振蕩(振蕩頻率120rpm)培養(yǎng)20小時(shí)，即可完成產(chǎn)黃纖維單胞菌在所述聚丙烯酰胺大孔凝膠載體上的固定，菌體密度可達(dá)4.4×107cfu/cm2，表明產(chǎn)黃纖維單胞菌可以本發(fā)明的聚丙烯酰胺大孔凝膠載體為支持物密集附著生長(zhǎng)，并可達(dá)到一定的動(dòng)態(tài)平衡。用上述相同的方法還對(duì)大腸桿菌(Escherichia coli)、臘狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)、綠色木霉(Trichoderma viride)和里氏木霉(Trichoderma reesei)進(jìn)行了固定化效果檢測(cè)，結(jié)果均獲得了較好的固定效果，菌體密度可達(dá)107cfu/cm2以上，表明本發(fā)明的固定化細(xì)胞聚丙烯酰胺大孔凝膠載體具有較好的生物兼容性。
此外，還對(duì)上述聚丙烯酰胺大孔凝膠載體進(jìn)行了壓縮強(qiáng)度試驗(yàn)和電鏡掃描觀察，檢測(cè)結(jié)果表明，該載體具有較好的機(jī)械性能，抗壓強(qiáng)度大。
權(quán)利要求
1.一種固定化細(xì)胞聚丙烯酰胺大孔凝膠載體，是先制備含丙烯酰胺單體和N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺單體的混合溶液，然后向該混合溶液中加入NaCl至飽和，再將上述溶液移至凝膠載體制備容器中，均勻加入NaCl粉末直至高出液面2-5cm，隨后排除溶液和容器中的氧氣，密封容器，再用放射線(xiàn)輻照使丙烯酰胺單體和N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺單體聚合，最后將經(jīng)輻照聚合后獲得的凝膠進(jìn)行水浴后得到的固定化細(xì)胞聚丙烯酰胺大孔凝膠載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化細(xì)胞聚丙烯酰胺大孔凝膠載體，其特征在于所述混合溶液中丙烯酰胺單體的濃度為90-100g/L，N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺單體的濃度為4-6g/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化細(xì)胞聚丙烯酰胺大孔凝膠載體，其特征在于所述NaCl粉末的粒徑為10-1000μm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的固定化細(xì)胞聚丙烯酰胺大孔凝膠載體，其特征在于所述放射線(xiàn)為Co60源γ射線(xiàn)或X射線(xiàn)。
5.一種制備權(quán)利要求1所述的固定化細(xì)胞聚丙烯酰胺大孔凝膠載體的方法，包括以下步驟1)制備含90-100g/L丙烯酰胺單體和4-6g/L N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺單體的混合溶液，再向該混合溶液中加入NaCl至飽和；2)將步驟1)的NaCl飽和溶液移至凝膠載體制備容器中，均勻加入NaCl粉末直至高出液面2-5cm；3)排除溶液和容器中的氧氣，然后密封容器；4)用放射線(xiàn)輻照，以使丙烯酰胺單體和N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺單體聚合；5)將步驟4)經(jīng)輻照聚合后獲得的凝膠進(jìn)行水浴，得到既可用于液相接種又可用于固相接種的固定化細(xì)胞聚丙烯酰胺大孔凝膠載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于所述步驟1)中用于制備丙烯酰胺單體和N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺單體混合溶液的溶劑為去離子水或蒸餾水；
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于所述步驟2)中所用NaCl粉末的粒徑為10-1000μm。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于所述步驟3)中用通入氮?dú)獾姆椒ㄅ懦芤汉腿萜髦械难鯕?，具體方法為將氮?dú)馄拷由舷鹉z管一端，所述橡膠管另一端與玻璃管一端連接，再將玻璃管另一端插入所述凝膠載體制備容器中，伸入所述丙烯酰胺單體和N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺單體混合溶液液面下的靠近NaCl粉末處，然后打開(kāi)氣閥并緩慢調(diào)節(jié)氮?dú)饬魉伲沟獨(dú)鈮毫Σ恢掠谶^(guò)大噴出溶液，同時(shí)又能起到排除氧氣的作用；所述通氮除氧時(shí)間可為20-30min，通氮之后關(guān)閉氣閥。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于所述步驟4)中所述放射線(xiàn)為Co60源γ射線(xiàn)或X射線(xiàn)；所述輻照劑量為20-30KGy。
10.根據(jù)權(quán)利要求5-9任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于所述步驟5)中將步驟4)經(jīng)輻照聚合后獲得的凝膠進(jìn)行水浴，水浴溫度為65-85℃，水浴時(shí)間為60-72小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種固定化細(xì)胞聚丙烯酰胺大孔凝膠載體及其制備方法。該固定化細(xì)胞聚丙烯酰胺大孔凝膠載體是先制備含丙烯酰胺單體和N，N’－亞甲基雙丙烯酰胺單體的混合溶液，然后向該混合溶液中加入NaCl至飽和，再將上述溶液移至凝膠載體制備容器中，均勻加入NaCl粉末直至高出液面2－5cm，隨后排除溶液和容器中的氧氣，密封容器，再用放射線(xiàn)輻照使丙烯酰胺單體和N，N’－亞甲基雙丙烯酰胺單體聚合，最后將經(jīng)輻照聚合后獲得的凝膠進(jìn)行水浴后得到的固定化細(xì)胞聚丙烯酰胺大孔凝膠載體。本發(fā)明的固定化細(xì)胞聚丙烯酰胺大孔凝膠載體及其制備方法將在固定化微生物(特別是細(xì)菌和真菌的混合菌劑，如纖維素降解復(fù)合菌)的制備中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號(hào)C12N11/04GK101050456SQ200710065019
公開(kāi)日2007年10月10日 申請(qǐng)日期2007年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月30日
發(fā)明者陸文靜, 王洪濤, 趙巖, 劉晉文 申請(qǐng)人:清華大學(xué)