專利名稱：人參真菌及其提取物的制備方法及人參真菌提取物用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，主要涉及一種人參真菌及其提取物的制備方法及用途， 特別是涉及一種野生人參內(nèi)生真菌及其提取物的制備方法及用途。背景技術(shù)：
植物內(nèi)生菌是具有一定轉(zhuǎn)化性的植物共生菌。許多研究表明，內(nèi)生菌與植物長(zhǎng)期共同 進(jìn)化的結(jié)果，形成了與共生植物互惠互利的共生形式和作用機(jī)制。植物內(nèi)生菌是一個(gè)非常 龐大的群體。復(fù)雜的進(jìn)化過(guò)程形成了各種復(fù)雜的代謝調(diào)控機(jī)制。由此推測(cè)植物內(nèi)生菌種存 在提控植物生長(zhǎng)的物質(zhì)。傳統(tǒng)的五大激素都在不同的內(nèi)生菌中發(fā)現(xiàn)。隨著研究?jī)x器設(shè)備技 術(shù)的發(fā)展，人們可以檢測(cè)更為微量的化學(xué)成分，由此為內(nèi)生菌的研究領(lǐng)域進(jìn)一步拓展提供 了條件。本專利提及的內(nèi)生菌人參支鏈孢屬鏈孢菌人參?；彤a(chǎn)生高活性植物生長(zhǎng)促進(jìn)物 質(zhì)此前還未見報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容
1、發(fā)明目的
本發(fā)明提供一種人參真菌、該人參真菌及其提取物的制備方法及人參真菌提取物的用 途，其目的是通過(guò)相關(guān)產(chǎn)品的應(yīng)用，促進(jìn)玉米根系發(fā)育、提高肥料利用效率、提高耐旱能力， 增加玉米產(chǎn)量。2、技術(shù)方案
本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的
一種人參真菌，其特征在于該真菌分類名稱為鏈孢菌人參?；?，拉丁文名稱為 Alternaria sp. Panax ginseng C. A. Mey。在國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局指定的保藏單位保藏，保藏 日期為2010年8月30，保藏單位名稱中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心， 保藏代號(hào)為MF004，保藏編號(hào)為CGMCC. NO. 4065。
該真菌引物SYS4963_SYS4963P1擴(kuò)增DNA序列如下
ACTGCGGAGGGATCATTACACAAATATGAAGGCGGGCTGGAACCTCTCGGGGTTACAGCCTTGCTGAATTAT TCACCCTTGTCTTTTGCGTACTTCTTGTTTCCTTGGTGGGTTCGCCCACCACTAGGACAAACATAAACCTTTTGTAA TTGCAATCAGCGTCAGTAACAAATTAATAATTACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATNAAGAA CGCAGCGAAATGCGATAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTNAACGCACATTGCGCCCTT TGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTGTACCCTCAAGCTTTGCTTGGTGTTGGGCGTCTTGTCTCT AGCTTTGCTGGAGACTCGCCTTAAAGTAATTGGCAGCCGGCCTACTGGTTTCGGAGCGCAGCACAAGTCGCACTCTC TATCAGCAAAGGTCTAGCATCCATTAAGCCTTTTTTTCAACTTTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAAC TTAAGCATATCAATAAGGCGGAGGAAA。該序列是鏈孢菌人參?；头诸惖姆肿右罁?jù)。如上所述的人參真菌的制備方法，其特征在于步驟如下 (1)人參內(nèi)生真菌的分離
①健康的野生人參樣品采集后立即處理、洗凈，然后將根切成小段，用75%的酒精沖洗，用10%巴氏消毒液洗15 20分鐘，最后用無(wú)菌水沖洗3 5次；
②將上述消毒過(guò)的根在無(wú)菌條件下分別切割成0. 5cm長(zhǎng)的小段接種于孟加拉紅培養(yǎng) 基平板上，置于度培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 8天后，即可見樣品切割過(guò)的邊緣長(zhǎng)出菌絲，經(jīng)平板 反復(fù)分離、純化；
(2)人參內(nèi)生真菌液體發(fā)酵培養(yǎng)
將“②”步驟中分離的真菌接到平板PDA培養(yǎng)基上，25°C培養(yǎng)5-7天，用打孔器瓊脂挖 塊接種于裝有50mL種子培養(yǎng)液的250mL三角燒瓶，于，120r/min下旋轉(zhuǎn)搖床上培養(yǎng)3 天作為種子，以10%量接種入裝有150mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，同樣條件下培養(yǎng)5 天，終止發(fā)酵，放入4°C冰箱中保存?zhèn)溆?。上述步驟(2)中種子培養(yǎng)液與發(fā)酵培養(yǎng)基相同，均為PDA培養(yǎng)基。
人參真菌提取物的制備方法，其特征在于將上述“(2)”步驟中的菌絲體洗滌后60°C 下烘干，稱重，然后經(jīng)高速粉碎機(jī)粉碎，用同體積乙醇浸提Mh，浸提3次，用磁力攪拌器將 其混勻，超聲波震蕩lh，真空抽濾，收集濾液備用。人參真菌的提取物的用途，其特征在于所述的人參真菌提取物用于促進(jìn)包括玉 米等主要農(nóng)作物生長(zhǎng)、提高抗逆性和提高產(chǎn)量。3、優(yōu)點(diǎn)及效果
本發(fā)明涉及一株來(lái)源于長(zhǎng)白山野生人參根內(nèi)的一株真菌，從該真菌人工培養(yǎng)的菌絲內(nèi) 可提取出能夠促進(jìn)玉米等主要農(nóng)作物生長(zhǎng)、提高耐旱、耐澇、促進(jìn)根際微生物生長(zhǎng)、促進(jìn)開 花、提高產(chǎn)量的作用的活性成分。提取的活性成分可以播種前與少量的根際促生長(zhǎng)細(xì)菌聯(lián) 合使用處理玉米等作物種子，在開花授粉后噴施作物葉面，可明顯促進(jìn)作物抗旱和產(chǎn)量的 提高，大幅度提高作物栽培的經(jīng)濟(jì)效益。本發(fā)明提出了利用液體有氧發(fā)酵技術(shù)大量生產(chǎn)該 菌菌絲及提取其中活性成分的方法以及田間應(yīng)用技術(shù)。四

圖1為人參內(nèi)生真菌醇提取物lOng/ml對(duì)玉米催芽后各種指標(biāo)的影響； 圖2為內(nèi)生菌菌絲醇提取物高壓毛細(xì)管電泳獲得成分指紋圖譜； 照片1為利用本發(fā)明人參中分離真菌平板照片2為人參內(nèi)生真菌提取物lng/ml和lOng/ml對(duì)玉米的催芽效果圖； 照片3為人參內(nèi)生真菌提取物對(duì)玉米3-5天催芽情況； 照片4為從內(nèi)生真菌中擴(kuò)增DNA序列圖。專利菌種說(shuō)明
本專利所涉及的菌種已在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)保 藏，單位地址中國(guó)北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院，該真菌分類名稱為細(xì)極鏈格孢，拉丁文 名稱為Alternaria tenuissima，保藏代號(hào)為MF004，保藏編號(hào)為4065，保藏日期為2010 年8月18。五具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明 人參真菌及提取物的制備方法 人參內(nèi)生真菌的制備 (1)野生人參內(nèi)生真菌的分離①健康的野生人參樣品采集后立即處理、洗凈后，將根切成小段，用75%的酒精沖洗， 用10%巴氏消毒液洗15-20分鐘，最后用無(wú)菌水沖洗3-5次。②將上述消毒過(guò)的根在無(wú)菌條件下分別切割成0. 5cm長(zhǎng)的小段接種于孟加拉紅 培養(yǎng)基平板上，置于觀度培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-8天后，即可見樣品切割過(guò)的邊緣長(zhǎng)出菌絲，經(jīng)平板 劃線法和平板稀釋法反復(fù)分離、純化；
將上述消毒過(guò)的根在無(wú)菌條件下分別切割成0. 5cm長(zhǎng)的小段接種于孟加拉紅培養(yǎng)基 平板上，即可見樣品切割過(guò)的邊緣長(zhǎng)出菌絲，經(jīng)平板劃線法和平板稀釋法反復(fù)分離、純化， 培養(yǎng)觀察菌落的形態(tài)，并對(duì)菌落的生長(zhǎng)情況及特征作相應(yīng)的記錄(包括影像記錄)。然后對(duì) 菌株進(jìn)行編號(hào)，在進(jìn)入“(2)”步驟，將真菌轉(zhuǎn)移到PDA斜面上培養(yǎng)5-7天，放入4°C冰箱中保 存。為檢查表面消毒是否徹底，進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)。將上述同樣消毒處理過(guò)的根切段不作 切割直接接種于孟加拉紅培養(yǎng)基平板上，置于相同條件下培養(yǎng)，結(jié)果對(duì)照用的根周圍無(wú)任 何菌長(zhǎng)出，證明得到的真菌是植物組織內(nèi)的，而不是表面的附生菌。( 2 )、人參內(nèi)生真菌液體發(fā)酵培養(yǎng)
將②中分離的真菌接到平板PDA培養(yǎng)基上，25°C培養(yǎng)5-7天，用打孔器瓊脂挖塊接種 于裝有50mL種子培養(yǎng)液(PD培養(yǎng)基)的250mL三角燒瓶，于^°C，120r/min下旋轉(zhuǎn)搖床上 培養(yǎng)3天作為種子，以10%量接種入裝有150mL發(fā)酵培養(yǎng)基(同種子培養(yǎng)液)的500mL三 角瓶中，同樣條件下培養(yǎng)5天，終止發(fā)酵，放入4°C冰箱中保存?zhèn)溆茫?人參內(nèi)生菌菌絲醇提取物的制備
將上述“(2)”步驟中的菌絲體洗滌后60°C下烘干，稱重，然后高速粉碎機(jī)粉碎，用同體 積乙醇浸提Mh，浸提3次，用磁力攪拌器將其混勻，超聲波震蕩lh，真空抽濾，收集濾液備 用。然后將濾液制備成樣品進(jìn)行試驗(yàn)和測(cè)試；樣品溶液的配制將處理好的代謝物粗品用 適量的甲醇溶解，并用0. 22 μ m孔徑的有機(jī)濾膜濾過(guò)，棄去初濾液，收集續(xù)濾液作為樣品溶 液。對(duì)上述樣品進(jìn)行人參內(nèi)生菌菌絲醇提取物高壓毛細(xì)管檢測(cè)，高壓毛細(xì)管電泳條件 如下未涂層石英毛細(xì)管(50 μ mX57cm,有效檢測(cè)長(zhǎng)度48cm)；運(yùn)行緩沖液20mmol/L硼砂 緩沖液(pH 9. 0) ；20mmol/L硼酸溶液；檢測(cè)波長(zhǎng)214nm ；分離電壓20kV ；溫度28 V ；壓力 進(jìn)樣10s。毛細(xì)管柱使用前用0. 1 mol/L的NaOH、水和電泳緩沖液分別沖洗lmin，2min和 3min。對(duì)上述人參內(nèi)生菌菌絲醇提取物的活性測(cè)定
將上述人參內(nèi)生菌菌絲醇提取物配制成不同的濃度，對(duì)玉米，大豆，黃瓜，油菜進(jìn)行催 芽試驗(yàn)測(cè)試人參內(nèi)生菌菌絲醇提取物對(duì)玉米、大豆等種子萌發(fā)階段的促進(jìn)作用，如照片2 所示醇提取物對(duì)玉米催芽最適濃度為lOng/ml。將上述人參內(nèi)生菌菌絲醇提取物配成0. lng/ml、lng/ml、10ng/ml、30ng/ml、 lOOng/ml不同濃度對(duì)玉米和大豆等種子進(jìn)行催芽試驗(yàn)，玉米在溫浴lh，然后在無(wú)菌的 培養(yǎng)皿里放雙層濾紙，每皿放20粒，加IOml蒸餾水，培養(yǎng)3-5天。觀察每天的發(fā)芽情況如 照片3所示，及時(shí)補(bǔ)充等量水分。從上述數(shù)據(jù)可以看出人參內(nèi)生菌菌絲醇提取物對(duì)玉米和 大豆的種子有明顯的催芽效果。人參內(nèi)生真菌菌絲醇提取物組分鑒定
5高效毛細(xì)管電泳儀菌株指紋圖譜的建立
利用高效毛細(xì)管電泳對(duì)菌絲體醇提取物進(jìn)行指紋圖譜的建立，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的組分中含 有微量的吲哚乙酸和赤霉素等植物激素，并且對(duì)吲哚乙酸和赤霉素等植物激素的電泳圖進(jìn) 行比對(duì)，對(duì)比情況如圖1所示。人參內(nèi)生真菌生物學(xué)分類
如照片2所示，利用CTAB法對(duì)篩選的真菌進(jìn)行基因組DNA的提取，并且用ITS4與ITS5 一對(duì)通用引物進(jìn)行基因的擴(kuò)增和測(cè)序。DNA的濃度和純度的檢測(cè)是利用紫外光吸收和瓊脂 糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)的。照片2為從內(nèi)生真菌中擴(kuò)增DNA序列圖；從照片4中可以看出人 參內(nèi)生真菌基因組片段大小約為500bp左右。另外，人參內(nèi)生真菌提取物在促進(jìn)玉米生長(zhǎng)和提高抗逆性方面的應(yīng)用，具體實(shí)施 如下
取兩塊距離不遠(yuǎn)的地作為對(duì)比試驗(yàn)田，分別為對(duì)比組和實(shí)驗(yàn)組，兩塊地距離不遠(yuǎn)會(huì)盡 量的滿足兩塊地的生長(zhǎng)環(huán)境一致，每塊地為一畝，實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)為北方普通的適于玉米生長(zhǎng)的 田地，然后取北方黃玉米的種子，對(duì)對(duì)比組的種子進(jìn)行常規(guī)的播種，對(duì)實(shí)驗(yàn)組的種子利用本 發(fā)明的人參內(nèi)生真提取物進(jìn)行處理，處理步驟為人參內(nèi)生真提取物5ng/ml-10ng/ml對(duì)玉 米種子進(jìn)行浸泡1-2天；將兩塊地的種子同時(shí)進(jìn)行播種，在開花前2周左右對(duì)實(shí)驗(yàn)組噴施作 物葉面，或在結(jié)實(shí)初期噴施作物葉面；噴施過(guò)程選擇晴天的傍晚進(jìn)行，以免雨水或陽(yáng)光的因 素，影響作物對(duì)噴施物的吸收，噴施的標(biāo)準(zhǔn)是盡量使葉面均勻的布滿噴施物。待進(jìn)入成熟期后分別對(duì)兩組進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)對(duì)比組的成熟期為150天，而實(shí)驗(yàn)組 的成熟期為145天，由此可以看出，實(shí)驗(yàn)組的玉米生長(zhǎng)期較對(duì)比組提前十五天左右；產(chǎn)量方 面，對(duì)比組為近1350斤的畝產(chǎn)量，而實(shí)驗(yàn)組的產(chǎn)量則接近1525斤的畝產(chǎn)量，也就是說(shuō)應(yīng)用 本發(fā)明的人參內(nèi)生真菌提取物的實(shí)驗(yàn)組可以明顯的提前玉米的成熟時(shí)間和提高畝產(chǎn)量。實(shí)施例1
人參內(nèi)生真菌的制備方法，其特征在于步驟如下
(1)人參內(nèi)生真菌的分離
①健康的野生人參樣品采集后立即處理、洗凈，然后將根切成小段，用75%的酒精沖 洗，用10%巴氏消毒液洗15分鐘，最后用無(wú)菌水沖洗3次；
②將上述消毒過(guò)的根在無(wú)菌條件下分別切割成0.5cm長(zhǎng)的小段接種于孟加拉紅培養(yǎng) 基平板上，置于度培養(yǎng)箱培養(yǎng)2天后，即可見樣品切割過(guò)的邊緣長(zhǎng)出菌絲，經(jīng)平板反復(fù) 分離、純化；
(2)人參內(nèi)生真菌液體發(fā)酵培養(yǎng)
將“②”步驟中分離的真菌接到平板PDA培養(yǎng)基上，25°C培養(yǎng)5天，用打孔器瓊脂挖塊 接種于裝有50mL種子培養(yǎng)液的250mL三角燒瓶，于，120r/min下旋轉(zhuǎn)搖床上培養(yǎng)3天 作為種子，以10%量接種入裝有150mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，同樣條件下培養(yǎng)5天， 終止發(fā)酵，放入4°C冰箱中保存?zhèn)溆?。上述步驟(2)中種子培養(yǎng)液與發(fā)酵培養(yǎng)基相同，均為PDA培養(yǎng)基。
人參內(nèi)生真菌提取物的制備方法，其特征在于將上述“(2)”步驟中的菌絲體洗滌后 60°C下烘干，稱重，然后經(jīng)高速粉碎機(jī)粉碎，用同體積乙醇浸提Mh，浸提3次，用磁力攪拌 器將其混勻，超聲波震蕩lh，真空抽濾，收集濾液備用。
得到的人參內(nèi)生真菌的提取物可用于促進(jìn)包括玉米等主要農(nóng)作物生長(zhǎng)、提高抗逆 性和提高產(chǎn)量等方面。實(shí)施例2
人參內(nèi)生真菌的制備方法，其特征在于步驟如下
(1)人參內(nèi)生真菌的分離
①健康的野生人參樣品采集后立即處理、洗凈，然后將根切成小段，用75%的酒精沖 洗，用10%巴氏消毒液洗20分鐘，最后用無(wú)菌水沖洗5次；
②將上述消毒過(guò)的根在無(wú)菌條件下分別切割成0. 5cm長(zhǎng)的小段接種于孟加拉紅培養(yǎng) 基平板上，置于度培養(yǎng)箱培養(yǎng)8天后，即可見樣品切割過(guò)的邊緣長(zhǎng)出菌絲，經(jīng)平板反復(fù) 分離、純化；
(2)人參內(nèi)生真菌液體發(fā)酵培養(yǎng)
將“②”步驟中分離的真菌接到平板PDA培養(yǎng)基上，25°C培養(yǎng)7天，用打孔器瓊脂挖塊 接種于裝有50mL種子培養(yǎng)液的250mL三角燒瓶，于，120r/min下旋轉(zhuǎn)搖床上培養(yǎng)3天 作為種子，以10%量接種入裝有150mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，同樣條件下培養(yǎng)5天， 終止發(fā)酵，放入4°C冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｉ鲜霾襟E(2)中種子培養(yǎng)液與發(fā)酵培養(yǎng)基相同，均為PDA培養(yǎng)基。
人參內(nèi)生真菌提取物的制備方法，其特征在于將上述“(2)”步驟中的菌絲體洗滌后 60°C下烘干，稱重，然后經(jīng)高速粉碎機(jī)粉碎，用同體積乙醇浸提Mh，浸提3次，用磁力攪拌 器將其混勻，超聲波震蕩lh，真空抽濾，收集濾液備用。得到的人參內(nèi)生真菌的提取物可用于促進(jìn)包括玉米等主要農(nóng)作物生長(zhǎng)、提高抗逆 性和提高產(chǎn)量等方面。實(shí)施例3
人參內(nèi)生真菌的制備方法，其特征在于步驟如下
(1)人參內(nèi)生真菌的分離
①健康的野生人參樣品采集后立即處理、洗凈，然后將根切成小段，用75%的酒精沖 洗，用10%巴氏消毒液洗18分鐘，最后用無(wú)菌水沖洗4次；
②將上述消毒過(guò)的根在無(wú)菌條件下分別切割成0.5cm長(zhǎng)的小段接種于孟加拉紅培養(yǎng) 基平板上，置于度培養(yǎng)箱培養(yǎng)5天后，即可見樣品切割過(guò)的邊緣長(zhǎng)出菌絲，經(jīng)平板反復(fù) 分離、純化；
(2)人參內(nèi)生真菌液體發(fā)酵培養(yǎng)
將“②”步驟中分離的真菌接到平板PDA培養(yǎng)基上，25°C培養(yǎng)6天，用打孔器瓊脂挖塊 接種于裝有50mL種子培養(yǎng)液的250mL三角燒瓶，于，120r/min下旋轉(zhuǎn)搖床上培養(yǎng)3天 作為種子，以10%量接種入裝有150mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，同樣條件下培養(yǎng)5天， 終止發(fā)酵，放入4°C冰箱中保存?zhèn)溆?。上述步驟(2)中種子培養(yǎng)液與發(fā)酵培養(yǎng)基相同，均為PDA培養(yǎng)基。
人參內(nèi)生真菌提取物的制備方法，其特征在于將上述“(2)”步驟中的菌絲體洗滌后 60°C下烘干，稱重，然后經(jīng)高速粉碎機(jī)粉碎，用同體積乙醇浸提Mh，浸提3次，用磁力攪拌 器將其混勻，超聲波震蕩lh，真空抽濾，收集濾液備用。 得到的人參內(nèi)生真菌的提取物可用于促進(jìn)包括玉米等主要農(nóng)作物生長(zhǎng)、提高抗逆
7性和提高產(chǎn)量等方面。 本發(fā)明充分的利用了真菌與植物的關(guān)系，而真菌與植物的關(guān)系可產(chǎn)生調(diào)控植物生 長(zhǎng)物質(zhì)的真菌，包括有益真菌和病原真菌、這是未來(lái)技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)。 本發(fā)明從野生人 參中分離的能產(chǎn)生促進(jìn)玉米等作物生長(zhǎng)的內(nèi)生菌，該菌為支鏈孢，從該菌的菌絲提取物成 分分析發(fā)現(xiàn)含有微量的吲哚乙酸和赤霉素以及一些未知的成分。但從其活性來(lái)分析由于 其活性非常高，推測(cè)不是現(xiàn)有已知的五大類激素。而此前還沒(méi)有關(guān)于從人參支鏈孢屬鏈孢 菌人參專化型內(nèi)生菌產(chǎn)生高活性植物生長(zhǎng)促進(jìn)物質(zhì)的報(bào)道，尤其是這些活性成分除促進(jìn)根 系生長(zhǎng)外，還具有誘導(dǎo)植物耐旱、耐低溫、促進(jìn)根際微生物生長(zhǎng)等功能。本發(fā)明的人參內(nèi)生 真菌可與植物共生進(jìn)化來(lái)促進(jìn)植物的生長(zhǎng)發(fā)育，植物內(nèi)生菌在與植物共生進(jìn)化的過(guò)程中， 形成了互惠的機(jī)制，這些機(jī)制通過(guò)對(duì)內(nèi)生菌產(chǎn)生的活性成分的分析會(huì)逐步清楚。通過(guò)人工 生產(chǎn)大量植物內(nèi)生菌來(lái)獲得有益作物生長(zhǎng)的活性物質(zhì)是一項(xiàng)經(jīng)濟(jì)有效環(huán)境友好的產(chǎn)業(yè)。
權(quán)利要求
1.一種人參真菌，其特征在于該真菌分類名稱為細(xì)極鏈格孢，拉丁文名稱為 Alternaria tenuissima，在國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局指定的保藏單位保藏，保藏日期為2010年8月 18，保藏單位名稱中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏代號(hào)為MF004， 保藏編號(hào)為4065。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人參真菌，其特征在于該真菌引物SYS4963_SYS4963P1擴(kuò) 增DNA序列如下ACTGCGGAGGGATCATTACACAAATATGAAGGCGGGCTGGAACCTCTCGGGGTTACAGCCTTGCTGAATTAT TCACCCTTGTCTTTTGCGTACTTCTTGTTTCCTTGGTGGGTTCGCCCACCACTAGGACAAACATAAACCTTTTGTAA TTGCAATCAGCGTCAGTAACAAATTAATAATTACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATNAAGAA CGCAGCGAAATGCGATAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTNAACGCACATTGCGCCCTT TGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTGTACCCTCAAGCTTTGCTTGGTGTTGGGCGTCTTGTCTCT AGCTTTGCTGGAGACTCGCCTTAAAGTAATTGGCAGCCGGCCTACTGGTTTCGGAGCGCAGCACAAGTCGCACTCTC TATCAGCAAAGGTCTAGCATCCATTAAGCCTTTTTTTCAACTTTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAAC TTAAGCATATCAATAAGGCGGAGGAAA。
3.—種如權(quán)利要求1所述的人參真菌的制備方法，其特征在于步驟如下(1)人參內(nèi)生真菌的分離①健康的野生人參樣品采集后立即處理、洗凈，然后將根切成小段，用75%的酒精沖 洗，用10%巴氏消毒液洗15 20分鐘，最后用無(wú)菌水沖洗3 5次；②將上述消毒過(guò)的根在無(wú)菌條件下分別切割成0.5cm長(zhǎng)的小段接種于孟加拉紅培養(yǎng) 基平板上，置于度培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 8天后，即可見樣品切割過(guò)的邊緣長(zhǎng)出菌絲，經(jīng)平板 反復(fù)分離、純化；(2)人參內(nèi)生真菌液體發(fā)酵培養(yǎng)將“②”步驟中分離的真菌接到平板PDA培養(yǎng)基上，25°C培養(yǎng)5-7天，用打孔器瓊脂挖 塊接種于裝有50mL種子培養(yǎng)液的250mL三角燒瓶，于，120r/min下旋轉(zhuǎn)搖床上培養(yǎng)3 天作為種子，以10%量接種入裝有150mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，同樣條件下培養(yǎng)5 天，終止發(fā)酵，放入4°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> 4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的人參真菌的制備方法，其特征在于步驟(2)中種子培養(yǎng)液與 發(fā)酵培養(yǎng)基相同，均為PDA培養(yǎng)基。
5.一種人參真菌提取物的制備方法，其特征在于將上述“(2)”步驟中的菌絲體洗滌 后60°C下烘干，稱重，然后經(jīng)高速粉碎機(jī)粉碎，用同體積乙醇浸提Mh，浸提3次，用磁力攪 拌器將其混勻，超聲波震蕩lh，真空抽濾，收集濾液備用。
6.一種人參真菌的提取物的用途，其特征在于所述的人參真菌提取物用于促進(jìn)包括 玉米等主要農(nóng)作物生長(zhǎng)、提高抗逆性和提高產(chǎn)量。
全文摘要
本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，主要是涉及一種從長(zhǎng)白山野生人參須根中分離獲得的一株內(nèi)生菌及人工培養(yǎng)條件下的菌絲提取物及其在促進(jìn)玉米生長(zhǎng)、提高抗逆性和提高產(chǎn)量方面的作用。該菌種已在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，該真菌分類名稱為細(xì)極鏈格孢Alternaria tenuissima。本發(fā)明的目的是通過(guò)相關(guān)產(chǎn)品的應(yīng)用，促進(jìn)玉米根系發(fā)育、提高肥料利用效率、提高耐旱能力，增加玉米產(chǎn)量。
文檔編號(hào)A01N63/04GK102086439SQ201010548989
公開日2011年6月8日 申請(qǐng)日期2010年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月18日
發(fā)明者楊濤, 楊鎮(zhèn), 王娜, 王紅, 肇瑩, 肖軍, 胡文繡, 陳珣, 陶承光, 馬曉穎, 龔娜 申請(qǐng)人:遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院