專利名稱：：線粒體病MELAS和MERRF綜合征相關(guān)mtDNA突變位點(diǎn)檢測(cè)基因芯片及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及線粒體病MELAS和MERRF綜合征相關(guān)mtDNA突變位點(diǎn)的檢測(cè)，特別是一種線粒體病MELAS和MERRF綜合征相關(guān)mtDNA突變位點(diǎn)檢測(cè)基因芯片及其制作方法，及利用該芯片對(duì)患者臨床標(biāo)本中MELAS和MERRF綜合征相關(guān)mtDNA突變位點(diǎn)的檢測(cè)和篩查。
背景技術(shù)：
：現(xiàn)在已經(jīng)知道線粒體腦肌病伴高乳酸血癥和卒中樣發(fā)作(mitochondria]encephalomyopathywithlacticacidosisandstroke-likeepisodes,MELAS)禾口肌陣攣性癲癇伴發(fā)不規(guī)整紅纖維(myoclonic印il印sywithraggedredfibers,MERRF)是兩種常見的線粒體病，主要由mtDNA突變引起。MELAS是一組具有高度臨床變異性和遺傳異質(zhì)性的mtDNA疾病，.大多數(shù)MELAS病例是由mt-tRNA'，自)基因上的異質(zhì)性突變A3243G引起；少數(shù)則是由其它mtDNA點(diǎn)突變(如T3271C)或大片段重組突變所致；還有一些可能由核基因突變引發(fā)。MERRF是一種母系遺傳神經(jīng)肌肉紊亂綜合癥，大多數(shù)與MERRF有關(guān)的mtDNA突變位于tRNA&基因上，其中以A8344G突變最為常見。至今，已有超過(guò)20種mtDNA點(diǎn)突變被報(bào)道與MELAS有關(guān)，有10種左右mtDNA點(diǎn)突變被報(bào)道與MERRF有關(guān)。這些突變位點(diǎn)在國(guó)內(nèi)外已有相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行報(bào)道，總數(shù)約31個(gè)，其中，MELAS綜合征相關(guān)mtDNA突變位點(diǎn)有G583A、G1642A、C3093G、A3243G、G3244A、A3252G、C3256T、T3258C、T3271C、T3291C、G3376A、G3697A、G3946A、T3949C、G4332A、T9957C、A12770G、A13045C、A13084T、G13513A、A13514G、G14453A，MERRF綜合征相關(guān)mtDNA突變位點(diǎn)有G611A、G3255A、A8296G、A8344G、T8356C、G8361A、G8363A、A8431T、G12147A。對(duì)線粒體病MELAS和MERRF綜合征的診斷以往多依賴臨床指征以及病理形態(tài)學(xué)檢測(cè)，但由于這兩種綜合征的早期臨床指征并不明顯，生物化學(xué)與組織化學(xué)檢測(cè)方法特異性不高，因而，應(yīng)用分子生物學(xué)方法對(duì)線粒體病MELAS和MERRF綜合征相關(guān)mtDNA突變位點(diǎn)進(jìn)行篩査，有助于了解疾病的確切性質(zhì)，從而為患者的治療和遺傳學(xué)咨詢提供確鑿證據(jù)。目前雖然建立了不少mtDNA突變體檢測(cè)方法，如限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)、特異引物序列分析(SSP)、構(gòu)象敏感電泳(CSGE)、瞬時(shí)溫度梯度電泳(TTGE)、變性梯度凝膠電泳(DGGE)和變性高效液相色譜(DHPLC)等，但在實(shí)際運(yùn)用方面仍有許多局限性，如RFLP花費(fèi)高、工作量大且有些重要突變位點(diǎn)因不在所使用限制性內(nèi)切核酸酶的識(shí)別范圍而不能被檢測(cè)到，其他方法相對(duì)于RFLP要復(fù)雜。更重要的是，這些方法大多只能針對(duì)一個(gè)或幾個(gè)突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，不能高通量對(duì)基因不同的突變體同時(shí)進(jìn)行篩選，一些方法的結(jié)果仍需依賴分子測(cè)序加以驗(yàn)證?；蛐酒墙陙?lái)迅速發(fā)展起來(lái)的集物理學(xué)、化學(xué)、材料科學(xué)和生命科學(xué)于一體的高新技術(shù)，利用微電子芯片技術(shù)的集約化和平行處理原理，將大量具有生物學(xué)意義的特殊序列的生物樣品有序地固化在玻璃片和硅片等基質(zhì)表面，并利用微量反應(yīng)體積，一次雜交就可以對(duì)許多基因表達(dá)水平、突變和多態(tài)性進(jìn)行特異、快速、精確檢測(cè)，已經(jīng)在基因表達(dá)、基因突變、基因多態(tài)性研究和基因診斷等領(lǐng)域獲得成功應(yīng)用。由于基因芯片具有這些獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)使其在線粒體基因檢測(cè)方面得到一定的運(yùn)用，如利用表達(dá)譜微陣列對(duì)線粒體基因的表達(dá)狀況進(jìn)行檢測(cè)，來(lái)探討線粒體病的發(fā)病機(jī)制，或利用寡核苷酸微陣列上的引物延伸反應(yīng)或直接核酸雜交檢測(cè)線粒體單核苷酸多肽性(SNP)等?？紤]到線粒體病MELAS和MERRF綜合征早期的臨床特征并不典型，有些癥狀可以相互重疊。有時(shí)候，患者可以同時(shí)表現(xiàn)MERRF和MELAS綜合征的臨床癥狀，形成所謂MERRF/MELAS重疊綜合征(MERRF/MELASoverlapsyndrome),例如，mt-A3243G、T8356C和G12147A點(diǎn)突變可以分別引起MERRF/MELAS重疊綜合征。文獻(xiàn)報(bào)道與這兩種綜合征相關(guān)mtDNA突變位點(diǎn)超過(guò)30個(gè)，因而，開發(fā)一種新的集成基因芯片，用于對(duì)線粒體病MELAS和MERRF綜合征相關(guān)mtDNA突變位點(diǎn)的檢測(cè)和篩查，具有重要的社會(huì)效益和臨床價(jià)值。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的之一在于提供一種用于線粒體病MELAS和MERRF綜合征相關(guān)mtDNA突變位點(diǎn)集成檢測(cè)基因芯片及其制作方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種檢測(cè)線粒體病MELAS和MERRF綜合征相關(guān)mtDNA突變位點(diǎn)的方法。本發(fā)明的構(gòu)思如下根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的31種線粒體病MELAS和MERRF綜合征相關(guān)mtDNA突變位點(diǎn)和修正版劍橋mtDNA參考序列(revisedCambridgeReferenceSequence,rCRS)，再利用特異性探針可以鑒定突變體的原理，共設(shè)計(jì)了62個(gè)探針(31對(duì)，每對(duì)探針針對(duì)一個(gè)MELAS或MERRF綜合征相關(guān)突變位點(diǎn))和9對(duì)PCR引物(分成兩組進(jìn)行多重不對(duì)稱PCR擴(kuò)增，能特異性地?cái)U(kuò)增出包含上述31個(gè)MELAS、MERRF綜合征相關(guān)mtDNA突變位點(diǎn)的目的DNA片段)。在一張芯片上固定MELAS和MERRF綜合征相關(guān)mtDNA突變位點(diǎn)檢測(cè)探針，只用PCR和雜交反應(yīng)，就可以在6—8小時(shí)及時(shí)準(zhǔn)確地確認(rèn)被檢者是否存在上述突變，能為治療和遺傳學(xué)咨詢提供確鑿證據(jù)，并可以進(jìn)一步闡明這些突變體在中國(guó)人群中的分布及其對(duì)病因、發(fā)病機(jī)理、臨床治療及預(yù)后的影響。本發(fā)明一方面公開了一種人類線粒體病MELAS和MERRF綜合征相關(guān)的mtDNA突變位點(diǎn)檢測(cè)基因芯片，在基因芯片載體表面點(diǎn)陣固定有人類線粒體病MELAS和MERRF綜合征相關(guān)的mtDNA突變位點(diǎn)的特異性寡核苷酸探針。上述特異性寡核苷酸探針的設(shè)計(jì)原則為根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的31種MELAS和MERRF相關(guān)ratDNA突變位點(diǎn)和修正版劍橋mtDNA參考序列(revisedCambridgeReferenceSequence,rCRS)，使不同探針的Tm值盡量位于(45±5)bC，使探針長(zhǎng)度位于14-19bp，使每對(duì)探針?biāo)鶛z測(cè)的突變位點(diǎn)位于探針序列中部或其附近，使探針與相應(yīng)單鏈靶基因的結(jié)合部位盡量靠近單鏈靶基因的5'端至中部區(qū)域之間以保障雜交效率。特異性寡核苷酸探針可特異性識(shí)別人類線粒體病MELAS和MERRF綜合征相關(guān)的mtDNA突變位點(diǎn)。上述特異性寡核苷酸探針選自序列為SEQIDNO.162的寡核苷酸探針中的一個(gè)或多個(gè)。較佳的，基因芯片載體表面點(diǎn)陣固定有序列為SEQIDNO.144的寡核苷酸探針，該芯片可用于特異檢測(cè)MELAS綜合征相關(guān)的所有己知突變。同樣較佳的，基因芯片載體表面點(diǎn)陣固定有序列為SEQIDNO.4562的寡核苷酸探針，該芯片可用于特異檢測(cè)MERRF綜合征相關(guān)的所有已知突變。更佳的，基因芯片載體表面點(diǎn)陣固定有序列為SEQIDNO.162的寡核苷酸探針，該芯片可只用一次PCR和一次雜交反應(yīng)，同時(shí)檢測(cè)人類線粒體病MELAS和MERRF綜合征相關(guān)的所有已知mtDNA突變位點(diǎn)，效率更高。優(yōu)選的，上述寡核苷酸探針的5'端有氨基修飾基團(tuán)，以便與醛基修飾芯片相結(jié)合，探針5'端加上一段15聚的PolyT，以減少雜交時(shí)的空間位阻。上述基因芯片載體可以為載玻片，優(yōu)選醛基修飾的載玻片。本發(fā)明第二方面，公開了上述人類線粒體病MELAS和MERRF綜合征相關(guān)的mtDNA突變位點(diǎn)檢測(cè)基因芯片的制備方法，包括下列步驟將選自序列為SEQIDNO.162的寡核苷酸探針5，端加上一段15聚的PolyT，并對(duì)5'端進(jìn)行氨基修飾，用去離子水將各探針分別稀釋，并分別與點(diǎn)樣液等體積混合，獲得終濃度為12.550uM的寡核苷酸探針溶液，釆用常規(guī)的方法將寡核苷酸探針溶液與陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照一起點(diǎn)陣于載玻片表面，并固定4872小時(shí)。載玻片優(yōu)選醛基修飾的載玻片。上述點(diǎn)樣液的作用在于優(yōu)化芯片制作的質(zhì)量，可選用各種市售或自行配置的點(diǎn)樣液。上述陰性對(duì)照為點(diǎn)樣液。陽(yáng)性對(duì)照為所選的各寡核苷酸探針的等量混合液。較佳的，上述寡核苷酸探針的終濃度為12.5ul固定的條件為將點(diǎn)樣好的芯片置于70%濕度下固定的時(shí)間以48小時(shí)。優(yōu)選的，在上述步驟中，將序列為SEQIDNO.144或SEQIDNO.4562的寡核苷酸探針點(diǎn)樣于芯片上。更優(yōu)選的，將序列為SEQIDNO.162的寡核苷酸探針點(diǎn)全部點(diǎn)樣于芯片上。本發(fā)明的第三方面，公開了一種檢測(cè)人類線粒體病MELAS和MERRF綜合征相關(guān)的mtDNA突變位點(diǎn)的方法，包括下列步驟1)抽取樣本DNA;2)樣本DNA的PCR擴(kuò)增和標(biāo)記以樣本DNA為模板，選擇合適引物PCR擴(kuò)增并標(biāo)記待測(cè)的突變相關(guān)序列；3)采用前述基因芯片于樣本PCR產(chǎn)物變性后進(jìn)行雜交檢測(cè)將樣本PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與雜交液以l:21:l的體積比混合獲得混合液，混合液中PC財(cái)廣增產(chǎn)物變性后將混合液點(diǎn)于芯片上上進(jìn)行雜交，雜交后用洗液洗滌，再通過(guò)檢測(cè)標(biāo)記信號(hào)的強(qiáng)度判斷是否發(fā)生相應(yīng)突變。上述雜交液為常規(guī)用于核酸雜交反應(yīng)的雜交液，可選用各種市售或自行配置的雜交液。上述混合液中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物變性可采用常規(guī)的變性方法，如95。C變性。洗液用于將未完全匹配的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物從芯片上除去，可選用本領(lǐng)域常規(guī)的用于核酸雜交的洗液。較佳的，上述步驟3中，雜交溫度為35-4(TC;雜交時(shí)間為30-60分鐘。洗液洗滌時(shí)，先用一次洗液洗5-15分鐘，再用二次洗液洗5-15分鐘。優(yōu)選的，一次洗液為2xSSC+0.1%SDS;二次洗液為O.2xSSC+0.1%xSDS;二次洗脫條件為3(TC洗滌5分鐘。改進(jìn)的，上述步驟2中的引物選自序列為SEQIDN0.6380的核苷酸序列。每對(duì)正反引物中，至少有一個(gè)被標(biāo)記，標(biāo)記可釆用常規(guī)的標(biāo)記，如熒光標(biāo)記等，本發(fā)明實(shí)施例中使用了Cy5熒光分子標(biāo)記，并使用激光共聚集掃描儀掃描熒光信號(hào)強(qiáng)度。更佳的，上述步驟2中的PCR擴(kuò)增為多重不對(duì)稱PCR擴(kuò)增將序列為1DN0.6372的核苷酸序列作為一組五重不對(duì)稱PCR的引物，序列為IDNO.7380的核苷酸序列作為一組四重不對(duì)稱PCR的引物，分別以樣本DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。多重不對(duì)稱PCR擴(kuò)增即為PCR擴(kuò)增時(shí)，不同引物對(duì)之間濃度不等，同一引物對(duì)，正向引物與反向引物的濃度也不同。本發(fā)明的基因芯片可用于檢測(cè)所有與人類線粒體病MELAS和MERRF綜合征相關(guān)的mtDNA突變位點(diǎn)，優(yōu)選方案可一次同時(shí)檢測(cè)所有的mtDNA突變位點(diǎn)。本發(fā)明的基因芯片從樣本制備到PCR擴(kuò)增，得到檢測(cè)結(jié)果，可在6—8小時(shí)內(nèi)完成，大大縮短了對(duì)患者的診斷時(shí)間，可以對(duì)臨床上疑似MELAS或MERRF患者的mtDNA進(jìn)行初步篩查，以確定有無(wú)己知突變體，從而為疾病的治療或遺傳學(xué)咨詢提供一定的線索，具有較好的臨床推廣價(jià)值。此外，本發(fā)明的基因芯片還具有很高的靈敏度、特異性和可重復(fù)性；與傳統(tǒng)分子生物學(xué)方法相比，檢測(cè)時(shí)間大大縮短，達(dá)到MELAS和MERRF綜合征臨床診斷與鑒別診斷的目的。而本發(fā)明構(gòu)建的芯片平臺(tái)還可能用于其他人類遺傳疾病的臨床診斷。圖1線粒體病MELAS和MERRF綜合征相關(guān)mtDNA突變位點(diǎn)集成檢測(cè)基因芯片的點(diǎn)陣圖圖中方塊內(nèi)的阿拉伯?dāng)?shù)字為檢測(cè)探針編號(hào)(每一種探針重復(fù)點(diǎn)3個(gè)點(diǎn))，英文字母'P'為陽(yáng)性對(duì)照探針(各種探針的混合物)，'N'為陰性對(duì)照探針(點(diǎn)樣液)。對(duì)于每個(gè)人類線粒體DNA樣本來(lái)說(shuō)，陽(yáng)性對(duì)照探針都應(yīng)該有較強(qiáng)的信號(hào)，陰性對(duì)照探針都應(yīng)該沒有信號(hào)或有很微弱的信號(hào)，否則意味著PCR擴(kuò)增或雜交失敗。圖2:探針濃度對(duì)熒光強(qiáng)度的影響圖3:包被時(shí)間對(duì)熒光強(qiáng)度的影響圖4:雜交溫度對(duì)熒光強(qiáng)度的影響圖5:雜交時(shí)間對(duì)熒光強(qiáng)度的圖6:洗脫緩沖液對(duì)熒光強(qiáng)度的影響圖7:洗脫時(shí)間對(duì)熒光強(qiáng)度的影響圖8:洗脫溫度對(duì)熒光強(qiáng)度的影響圖9:重復(fù)性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)圖圖10:靈敏度實(shí)驗(yàn)檢測(cè)圖圖ll多重不對(duì)稱PCR產(chǎn)物電泳圖圖中M為100bpDNAladder(從下往上分別為lOObp-lOOObp的條帶，每個(gè)條帶間隔100bp);5x為第一組五重不對(duì)稱PCR;4x為第二組四重不對(duì)稱PCR。圖12:健康人樣本與患者樣本芯片掃描圖示例。黑色箭頭指向處為發(fā)生突變的位點(diǎn)。a:健康對(duì)照(Nl)b:MELAS患者(Pl)(mt-A3243G異質(zhì)性突變)c:MERRF患者(P2)(mt-A8344G均質(zhì)性突變)d:MERRF患者(P3)(mt-T8356C異質(zhì)性突變)圖13:3種MELAS和MERRF相關(guān)mtDNA突變位點(diǎn)的野生型與突變型樣本的測(cè)序圖。a:mtDNA-3243位點(diǎn)野生型(Nl)與A〉G異質(zhì)性突變體(Pl)測(cè)序圖b:mtDNA-8344位點(diǎn)野生型(Nl)與A〉G均質(zhì)性突變體(P2)測(cè)序圖c:mtDNA-8356位點(diǎn)野生型(Nl)與T〉C異質(zhì)性突變體(P3)測(cè)序圖具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法及未說(shuō)明配方的試劑均為按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆試驗(yàn)手冊(cè)(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件或者制造商建議的條件進(jìn)行或配置。實(shí)施例1探針設(shè)計(jì)和芯片的制備(1)芯片上探針的設(shè)計(jì)根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的31種MELAS和MERRF綜合征相關(guān)mtDNA點(diǎn)突變和修正版劍橋mtDNA參考序列(revisedCambridgeReferenceSequence,rCRS)，用Oligo6.0軟件設(shè)i十62條寡核苷酸探針，使不同探針的Tm值盡量位于(45±5)flC,使探針長(zhǎng)度位于14-19bp，使每對(duì)探針?biāo)鶛z測(cè)的突變位點(diǎn)位于探針序列中部或其附近，使探針與相應(yīng)單鏈靶基因的結(jié)合部位盡量靠近單鏈靶基因的5'端到中部區(qū)域之間以保障雜交效率。探針的5'端有氨基修飾基團(tuán)，以便與醛基修飾芯片相結(jié)合；不同探針的綜合參數(shù)(探針長(zhǎng)度、GCX及Tm值)盡量接近，為了減少雜交時(shí)的空間位阻，合成時(shí)，在62條探針的寡核苷酸5'端加上一段15聚的PolyT(連接臂)。陽(yáng)性對(duì)照探針選取各個(gè)探針的等量混合物，陰性對(duì)照探針選取點(diǎn)樣液(TeleChemInternation)。62條探針如下表所列序列編號(hào)探針名稱所在鏈序列(5'-NH2-(T)15-xxxxxxxxxxxxxxx-3')SEQIDNO.583w1GGTAAGCTAgATAAACTG583m2LGGTAAGCTAIATAAACTG1642w3LTGAAATCTgCTAAGTGT1642m4TGAAATCTICTAAGTGT3093w5LAGAAACCCTGG3093m6AGAAACCCTGG3243w7ACCGGGC工CTGCCAT3243m8LACCGGGTGCCA3244w9ACCGGGgrcTGCCAT3244m10ACCGGGTGCCA3252w1.TTATGCGAITACCG3252m12LTTATGCTACCG3256w13GTTTTATgCGATTACC3256m14LGTTTTAGATTACCG3258w15GTTTT僉TGCGATTACC3258Hi16LAGTTTTgreCGATTAC3271w17CTGACTGTAA厶GTTTTAA3271m181」GACTGTAA&GTTTTAAGT3291w19I」GAAGAGG^ATTGAACC3291m20LAGAAGAGG&ATTGAAC3376w21LTTCGTTgGGTAAGC3376m22TTTCGTT工GGTAAGC3697w23HCCTGATCGCAC3697m24HCCTGATC^GCGCAC3946w25GGCGTATTQGATGTT3946m26LGCGTATT工GATGTTG3949w27GGCGTATTCGATGTT3949m28GGCGTQTTCGATGT4332w29HTTATTTCTACTATGA4332m30HTTATTTCTAAGACTATGA9957w31L,CATACAGAAGTCAAA9957m32CATACAGAAgrAGTCAAA12770w33CTACGCcciCTCAG12770m34IjCTACGCccgCTCAG13045w35LCTTCTAIGGCTGAGG13045m36CCTTCTGCTGA13084w37TATAGTGCITGAGTGGA13084m38LTATAGTTGAGTGGA13513w39HCTCCAAAgACCACATC13513m40HCTCCAAA^ACCACAT13514w41HCTCCAAAC4CCACATC13514ra42HTCCAAAGgCCACATC14453w43LGCGATGGgTATTGA14453m44gcgatggitattga611w45AAACATTTTgAGTGTATT611m46TAAACATTTtpGTGTAT3255w47I.GTTTTATG旦GATTACC3255m48TTTTATG工GATTACCG8296w49TTACAG工GGGCTCTA8296m50TTTACAG旦GGGCTC8344w51GGTGTTGG工TCTCTT8344ra52ggtgttgggtctct8356w53LTTCACTGTA△AGAGGT8356m54L.TTTCACTGTGAGG8361w55GGCATTTCAgrcTAA8361m56LGGCATTTCATTGTAA8363w57GGCATTTfACTGTAA8363m58LGGGCATTTIACTGT8431w59LGGTGATQAGGAATAGT8431m60GGGTGAT厶AGGAATAG12147w61HGTAAATATAQTTTAACCAA12147m62HGTAAATATA△TTTAACCAA探針名稱'欄中的數(shù)字代表mtDNA突變位點(diǎn)，w代表野生型探針，m代表突變型探針；'編號(hào)，欄中的數(shù)字1-44為MELAS探針，45-62為MERRF探針；'所在鏈，欄中，H表示探針位于nitDNA分子重鏈上，L表示探針位于mtDNA分子輕鏈上；'序列欄，每個(gè)探針序列中部或中部附近的下畫線指示突變位點(diǎn)所在部位。(2)芯片的制備點(diǎn)樣液為Micro-SpottingSolution(2X)，購(gòu)自TeleChemInternation公司,室溫保存。探針由Takara公司負(fù)責(zé)合成，用去離子水將探針稀釋，并與點(diǎn)樣液等體積混合，使探針終濃度為12.5uM，通過(guò)CartesianTech.,PROSYS55iOA芯片制作系統(tǒng)點(diǎn)陣于醛基修飾的載玻片表面，置于70%的相對(duì)濕度、室溫條件下48-72小時(shí)進(jìn)行固定。取出后于沸水浴中30秒，空氣中充分干燥，化保存，即制成了具有62條探針的線粒體病MELAS和MERRF綜合征相關(guān)mtDNA突變位點(diǎn)集成檢測(cè)基因芯片，見圖l。實(shí)施例2芯片檢測(cè)條件的摸索與優(yōu)化靶分子與在片寡核苷酸探針的雜交效率和熱穩(wěn)定性與探針的序列和反應(yīng)條件的嚴(yán)格控制有很大關(guān)系。比如探針序列的長(zhǎng)度，G+C含量，Tm值；探針和耙分子的濃度，間隔臂的長(zhǎng)度，雜交與洗漆的溫度、時(shí)間、pH及鹽離子濃度等。本發(fā)明重點(diǎn)對(duì)探針的點(diǎn)樣濃度、探針的包被時(shí)間、雜交溫度和時(shí)間、及洗脫條件(包括洗脫緩沖液的濃度、洗脫溫度和洗脫時(shí)間)等方面進(jìn)行了摸索和優(yōu)化，現(xiàn)敘述如下芯片的制備雜交液為DIGEasyHyb，購(gòu)自Roche公司a.探針濃度的優(yōu)化選擇MERRF相關(guān)mtDNA比較有代表性且較常見的突變位點(diǎn)T8344C的野生型探針(SEQ工DNO.51)作為芯片的探針，用去離子水將探針稀釋，并與點(diǎn)樣液(TeleChemInternation)等體積混合，使探針終濃度為0—50uM，通過(guò)CartesianTech.，PROSYS5510A芯片制作系統(tǒng)點(diǎn)陣于醛基修飾的載玻片表面，在同一張芯片上用不同濃度的探針分別點(diǎn)上20個(gè)點(diǎn)，置于70%的相對(duì)濕度、室溫條件下48小時(shí)進(jìn)行固定。取出后于沸水浴中30秒，空氣中充分干燥，4t保存。取5ulPCR產(chǎn)物(引物為SEQIDNO.67和68，DNA模板為健康人N1)與10ul雜交液混合點(diǎn)于芯片上，37。C雜交30min,30°C2xSSC+0.1%SDS洗10min，0.2xSSC+0.1%SDS洗5min,用激光共聚集掃描儀(GenePix4000B,AxonInstruments,Inc,)在635nm處掃描上述雜交芯片；通過(guò)圈點(diǎn)過(guò)濾背景信號(hào)，提取各點(diǎn)平均熒光信號(hào)強(qiáng)度值。制作探針濃度與熒光強(qiáng)度的坐標(biāo)圖(圖2)。結(jié)果表明，探針濃度在12.5uM時(shí)可以獲得最佳的探針濃度與熒光強(qiáng)度比。b.包被時(shí)間的優(yōu)化選擇MERRF相關(guān)mtDNA比較有代表性且較常見的突變位點(diǎn)T8344C的野生型和突變型探針(SEQIDNO.51和52)來(lái)作為芯片的探針，探針點(diǎn)樣濃度為12.5uM。通過(guò)CartesianTech.，PROSYS5510A芯片制作系統(tǒng)點(diǎn)陣于醛基修飾的載玻片表面，每張芯片上每種探針分別點(diǎn)上20個(gè)點(diǎn)，置于70%的相對(duì)濕度、室溫條件下分別固定不同的時(shí)間。取出后于沸水浴中30秒，空氣中充分干燥，4t保存。取5ulPCR產(chǎn)物(引物為SEQIDNO.67和68，DNA模板為健康人N1)與lOul雜交液混合，95。C變性10分鐘，后立即冰浴35分鐘。將混合液點(diǎn)于芯片上，37。C雜交30min,30°C2xSSC+0.1%SDS洗10min,0.2xSSC+0.1%SDS洗5min，用激光共聚集掃描儀(GenePix幼00B,AxonInstruments,Inc.)在635nm處掃描上述雜交芯片；通過(guò)圈點(diǎn)過(guò)濾背景信號(hào)，提取各點(diǎn)平均熒光信號(hào)強(qiáng)度值。制作包被時(shí)間與熒光強(qiáng)度的坐標(biāo)圖(圖3)。結(jié)果表明，點(diǎn)樣好的芯片置于70%濕度下固定時(shí)間以48小時(shí)最好，時(shí)間過(guò)短或過(guò)長(zhǎng)都會(huì)導(dǎo)致熒光強(qiáng)度的降低。c.雜交溫度和時(shí)間的優(yōu)化選擇MERRF相關(guān)mtDNA比較有代表性且較常見的突變位點(diǎn)T8344C的野生型和突變型探針(SEQIDNO.51和52)來(lái)作為芯片的探針，探針點(diǎn)樣濃度為12.5uM。通過(guò)CartesianTech.，PROSYS5510A芯片制作系統(tǒng)點(diǎn)陣于醛基修飾的載玻片表面，每張芯片上每種探針分別點(diǎn)上20個(gè)點(diǎn)，置于70%的相對(duì)濕度、室溫條件下48小時(shí)進(jìn)行固定。取出后于沸水浴中30秒，空氣中充分干燥，4。C保存。取5ulPCR產(chǎn)物(引物為SEQIDNO.67和68，DNA模板為健康人N1)與10ul雜交液混合點(diǎn)于芯片上，不同溫度下分別雜交30min，30°C2xSSC+0.16SDS洗10min,0.2xSSC+0.1%SDS洗5min，用激光共聚集掃描儀(GenePix4000B,AxonInstruments,Inc.)在635nm處掃描上述雜交芯片；通過(guò)圈點(diǎn)過(guò)濾背景信號(hào)，提取各點(diǎn)平均熒光信號(hào)強(qiáng)度值。制作雜交溫度與熒光強(qiáng)度的坐標(biāo)圖(圖4)。取5u].PCR產(chǎn)物(引物為SEQIDNO.67和68，DNA模板為健康人N1)與10ul雜交液混合點(diǎn)于芯片上，37。C雜交不同的時(shí)間，3(TC2xSSC+0.1%SDS洗10min,0.2xSSC+0.1%SDS洗5min，用激光共聚集掃描儀(GenePix4000B,AxonInstruments,Inc.)在635nm處掃描上述雜交芯片；通過(guò)圈點(diǎn)過(guò)濾背景信號(hào)，提取各點(diǎn)平均熒光信號(hào)強(qiáng)度值。制作雜交時(shí)間與熒光強(qiáng)度的坐標(biāo)圖(圖5)。結(jié)果表明，在35-40。C雜交30-60分鐘的情況下，可以獲得較高的野生型與突變型比，更易于分辨特異性的雜交信號(hào)。d.洗脫條件的優(yōu)化選擇MERRF相關(guān)mtDNA比較有代表性且較常見的突變位點(diǎn)T8344C的野生型和突變型探針(SEQIDNO.51和52)來(lái)作為芯片的探針，探針點(diǎn)樣濃度為12.5uM。通過(guò)CartesianTech.,PROSYS5510A芯片制作系統(tǒng)點(diǎn)陣于醛基修飾的載玻片表面，每張芯片上每種探針分別點(diǎn)上20個(gè)點(diǎn)，置于70%的相對(duì)濕度、室溫條件下48小時(shí)進(jìn)行固定。取出后于沸水浴中30秒，空氣中充分干燥，4。C保存。取5ulPCR產(chǎn)物(引物為SEQIDNO.67和68，DNA模板為健康人N1)與l()ul雜交液混合點(diǎn)于芯片上，37。C雜交30min，3(TC2xSSC+0.1%SDS洗10min，再用不同濃度的二次洗液洗5min,用激光共聚集掃描儀(GenePix4000B，AxonInstruments,Inc.)在635nm處掃描上述雜交芯片；通過(guò)圈點(diǎn)過(guò)濾背景信號(hào)，提取各點(diǎn)平均熒光信號(hào)強(qiáng)度值。制作二次洗脫緩沖液濃度與熒光強(qiáng)度的坐標(biāo)圖(圖6)。結(jié)果表明，隨著SSC濃度的增加，熒光強(qiáng)度也增強(qiáng)，但是同時(shí)也降低了芯片信號(hào)的特異性，因此，選取了兩者綜合指數(shù)均較高的0.2xSSC+0.1%xSDS溶液作為二次洗滌的緩沖液。取5ulPCR產(chǎn)物(引物為SEQIDNO.67和68，DNA模板為健康人N1)與10ul雜交液混合點(diǎn)于芯片上，37。C雜交30min,不同溫度下2xSSC+0.1%SDS洗]Omin，0.2xSSC+0.1%SDS洗5min，用激光共聚集掃描儀(GenePix4000B,AxonInstruments,Inc.)在635nm處掃描上述雜交芯片；通過(guò)圈點(diǎn)過(guò)濾背景信號(hào)，提取各點(diǎn)平均熒光信號(hào)強(qiáng)度值。制作洗脫溫度與熒光強(qiáng)度的坐標(biāo)圖(圖7)。取5ulPCR產(chǎn)物(引物為SEQIDNO.67和68,DNA模板為健康人N1)與10ul雜交液混合點(diǎn)于芯片上，37。C雜交30min，30°C2xSSC+0.1%SDS洗lOmin,0.2xSSC+0.1%SDS洗不同的時(shí)間，用激光共聚集掃描儀(GenePix4000B,AxonInstruments,Inc.)在635nm處掃描上述雜交芯片；通過(guò)圈點(diǎn)過(guò)濾背景信號(hào)，提取各點(diǎn)平均熒光信號(hào)強(qiáng)度值。制作洗脫時(shí)間與熒光強(qiáng)度的坐標(biāo)圖(圖8)。結(jié)果表明，30。C下，2xSSC+0.1%SDS洗10min，0.2xSSC+0.1%SDS洗5min是較佳的洗脫條件，因?yàn)樵谶@個(gè)條件下我們可以在保證有較高信號(hào)強(qiáng)度的同時(shí)，更完全地洗脫掉非特異結(jié)合的靶分子。實(shí)施例3重復(fù)性實(shí)驗(yàn)芯片靈敏度實(shí)驗(yàn)選擇MERRF相關(guān)mtDNA比較有代表性且較常見的突變位點(diǎn)T8344C的野生型和突變型探針(SEQIDN0.51和52)來(lái)作為芯片重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的探針，探針點(diǎn)樣濃度為12.5uM。通過(guò)CartesianTech.，PROSYS5510A芯片制作系統(tǒng)點(diǎn)陣于醛基修飾的載玻片表面，每張芯片上每種探針分別點(diǎn)上20個(gè)點(diǎn)，置于70%的相對(duì)濕度、室溫條件下48小時(shí)進(jìn)行固定。取出后于沸水浴中30秒，空氣中充分干燥，4t保存。以五天中的同一時(shí)間，取5ul相同濃度的PCR產(chǎn)物(引物為SEQIDNO.67和68，DNA模板為健康人N1)與10ul雜交液混合點(diǎn)于芯片上，37卩雜交30min，30°C2xSSC+0.1%SDS洗10min，0.2xSSC+0.1%SDS洗5min，用激光共聚集掃描儀(GenePix4000B，AxonInstruments,Inc.)在635nm處掃描上述雜交芯片；通過(guò)圈點(diǎn)過(guò)濾背景信號(hào)，提取各點(diǎn)平均熒光信號(hào)強(qiáng)度值。制作不同天數(shù)與熒光強(qiáng)度的坐標(biāo)圖(圖9)。結(jié)果表明，同一批次點(diǎn)樣芯片在五天內(nèi)雜交，結(jié)果差異不明顯，重復(fù)性較好，可以滿足MERRF和MELAS相關(guān)mtDNA突變體檢測(cè)芯片的要求。實(shí)施例4靈敏度實(shí)驗(yàn)芯片靈敏度實(shí)驗(yàn)選擇MERRF相關(guān)mtDNA比較有代表性且較常見的突變位點(diǎn)T8344C的野生型探針(SEQIDNO.51)來(lái)作為芯片靈敏度實(shí)驗(yàn)的探針，探針點(diǎn)樣濃度為12.5uM。通過(guò)CartesianTech.,PROSYS5510A芯片制作系統(tǒng)點(diǎn)陣于醛基修飾的載玻片表面，每張芯片點(diǎn)上20個(gè)點(diǎn)，置于70%的相對(duì)濕度、室溫條件下48小時(shí)進(jìn)行固定。取出后于沸水浴中30秒，空氣中充分干燥，4"C保存。取5ul不同濃度的PCR產(chǎn)物(引物為SEQIDN0.67和68，DNA模板為健康人N1)與10ul雜交液混合點(diǎn)于芯片上，37。C雜交30min，30°C2xSSC+0.1%SDS洗10min，0.2xSSC+0.1%SDS洗5m丄n，用激光共聚集掃描儀(GenePix4000B,AxonInstruments,Inc.)在635nm處掃描上述雜交芯片；通過(guò)圈點(diǎn)過(guò)濾背景信號(hào)，提取各點(diǎn)平均熒光信號(hào)強(qiáng)度值。制作靶分子量與熒光強(qiáng)度的坐標(biāo)圖(圖10a)。電泳靈敏度實(shí)驗(yàn)取5ul不同濃度的PCR產(chǎn)物分別與lul的6xloadingbuffer混合，用2%瓊脂糖凝膠電泳，得到電泳圖譜(圖10b)，并利用凝膠成像系統(tǒng)的分析軟件計(jì)算出圖lb中各條帶的灰度值，制作靶分子量與熒光強(qiáng)度的坐標(biāo)圖(圖10c)。結(jié)果表明，芯片的靈敏度在O.llng，為pg級(jí)；瓊脂糖電泳的靈敏度在2.84ng，為ng級(jí)。芯片檢測(cè)比電泳檢測(cè)具有更高的靈敏度。實(shí)施例5樣本的突變檢測(cè)1.樣本來(lái)源健康對(duì)照(外周靜脈血)20例來(lái)自于安徽醫(yī)科大學(xué)在校學(xué)生，體檢無(wú)相關(guān)線粒體DNA疾病病史；MELAS和MERRF患者(肌肉活體組織或外周靜脈血)ll例其中，6例為MELAS-mt-A3243G異質(zhì)性突變體，4例為MERRF-mt-A8344G均質(zhì)性突變體，1例為MERRF-mt-T8356C異質(zhì)性突變體，均由安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科提供。2.樣本的處理和標(biāo)記將上述組織標(biāo)本(肌肉活體組織或外周血)用Qiagen公司DNA抽提試劑盒提取線粒體DNA，備用。樣本的PCR擴(kuò)增和標(biāo)記處理通過(guò)兩組多重不對(duì)稱PCR來(lái)擴(kuò)增9條耙基因(目的DNA片段)，這9條靶基因涵蓋與MELAS和MERRF綜合征相關(guān)的31個(gè)mtDNA突變位點(diǎn)，引物由Takara公司合成，其中，12條引物的5'端用cy5熒光分子標(biāo)記，6條引物為普通引物。PCR引物如下所列<table>complextableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>注F表示正向引物，R表示反向引物；Cy5表示一種熒光分子。其中第一組為一個(gè)五重不對(duì)稱PCR,在25ulPCR反應(yīng)體系中(擴(kuò)增體系包括2.5ul10*PCRbuffer,各200uM的dATP、dGTP、dCTP、dTTP，1.5mMMgCl2，1.5(JDNATagE(Takara)，和介于0.04-0.4uM之間不等的引物PlF、P1R、P2F、P2R、P3F、P3R、P4F、P4R、P5F、P5R)，加入100-300ng樣本DNA，通過(guò)以下熱循環(huán)過(guò)程制備5條熒光標(biāo)記的樣本DNA目的片段首先在94。C變性5min，以94°C，35s,61°C，45s，72°C，2min循環(huán)40次，最后在72"C延伸10min。第二組為一個(gè)四重不對(duì)稱PC.R，在25ulPCR反應(yīng)體系中(擴(kuò)增體系包括2.5uli0*PCRbuffer,各200uMdATP、dGTP、dCTP、dTTP，1.5mMMgCl2，1.5UDNATagE(Takara)，和介于0.04-0,4uM之間不等的引物P6F、P6R、P7F、P7R、P8F、P8R、P9F、P9R、P10F、P10R)，加入100-300ng同一樣本DNA，通過(guò)以下熱循環(huán)過(guò)程制備5條熒光標(biāo)記的樣本DNA目的片段首先在94(>C變性5rain，以94°C，35s，50°C，45s，72')C，2min循環(huán)40次，最后在72°C延伸lOmin。通過(guò)2%瓊脂糖凝膠電泳得到健康對(duì)照或患者樣本DNA的多重不對(duì)稱PCR電泳圖譜(圖11)。從圖ll可以看出，PCR產(chǎn)物所對(duì)應(yīng)的條帶均清晰可辨，無(wú)非特異性擴(kuò)增產(chǎn)生。3.PCR產(chǎn)物序列測(cè)定樣本DNAPCR產(chǎn)物送與上?；瞪锛夹g(shù)有限公司(GeneCore)進(jìn)行測(cè)序。4.芯片檢測(cè)取同一樣本經(jīng)兩組多重不對(duì)稱PCR擴(kuò)增并標(biāo)記的目的DNA片段溶液等體積混勻，取7u]靶基因混合液與等體積雜交液(DIGEasyHyb,Roche)混勻，95°C變性lOmin，迅速冰浴3-5min，然后取10ul雜交混合液滴于用實(shí)施例1制備的線粒體病MELAS和MERRF綜合征相關(guān)mtDNA突變位點(diǎn)集成檢測(cè)基因芯片表面的點(diǎn)陣區(qū)域，蓋上蓋玻片，置于37"C濕盒中雜交45min，然后30QC于洗液1(2XSSC，0.1%SDS)中蕩洗10min，再于洗液2(0.2XSSC，0.1%SDS)中蕩洗5min，氮?dú)獯蹈?。用激光共聚集掃描儀(GenePix4000B,AxonInstruments,Inc.)在635nra處掃描上述第(3)步雜交芯片，掃描強(qiáng)度設(shè)為700(最大為920);通過(guò)圈點(diǎn)過(guò)濾背景信號(hào)，提取各點(diǎn)平均熒光信號(hào)強(qiáng)度值。配合其配套軟件分析，最終獲得芯片檢測(cè)結(jié)果。以診斷比值(野生型探針信號(hào)強(qiáng)度平均值與相應(yīng)位點(diǎn)突變型探針信號(hào)強(qiáng)度平均值的比值)作為分析突變是否存在的標(biāo)準(zhǔn)，如果診斷比值在3以上為野生型，在0.3以下為均質(zhì)性突變，介于0.3和3之間為異質(zhì)性突變。(比值衡量標(biāo)準(zhǔn)參考DuW，MarsacC，KruschinaM，0rtigaoF，F(xiàn)lorentzC.Functiona.lizedself-assembledmonolayerongoldfordetectionofhumanmitochondrialtRNAgenemutations.AnalBiochem,2003，322(1):14-25獲得)用實(shí)施例1制備的線粒體病MELAS和MERRF綜合征相關(guān)mtDNA突變位點(diǎn)集成檢測(cè)基因芯片分別對(duì)各樣本按上述方法進(jìn)行檢測(cè)20份健康對(duì)照所有位點(diǎn)診斷比值均大于3;11例含MELAS/MERRF相關(guān)mtDNA突變位點(diǎn)的患者發(fā)生突變的位點(diǎn)處診斷比值〈3(其中均質(zhì)性突變?cè)\斷比值〈0.3，異質(zhì)性突變?cè)\斷比值介于0.3和3之間)，正常位點(diǎn)診斷比值大于3。芯片檢測(cè)結(jié)果與PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果符合率為100%。1例健康對(duì)照和3例患者樣本的芯片掃描圖示例如圖12，野生型與相應(yīng)突變體的測(cè)序結(jié)果如圖13所示，對(duì)應(yīng)位點(diǎn)的芯片診斷比值如下表所列<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>w/m指野生型探針熒光信號(hào)強(qiáng)度平均值與相應(yīng)位點(diǎn)突變型探針熒光信號(hào)強(qiáng)度平均值的比值結(jié)果表明芯片的檢測(cè)結(jié)果與DNA測(cè)序結(jié)果很好地吻合，本發(fā)明的芯片可以用于高效地檢測(cè)線粒體病MELAS和MERRF綜合征相關(guān)mtDNA突變位點(diǎn)。序列表<uo>安徽醫(yī)科大學(xué)中國(guó)科學(xué)院上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所〈120〉線粒體病MELAS和MERRF綜合征相關(guān)mtDNA突變位點(diǎn)檢測(cè)基因芯片及檢測(cè)方法〈130〉PCNWX071126〈160〉80<170〉Patentlnversion3.1〈210〉〗—〈211〉18〈212>DNA〈213〉A(chǔ)rtificialsequence〈220〉〈223〉探針〈400〉1ggtaagctacataaactg18〈210〉2<211>18〈212>腿<213>Artificialsequence〈220〉〈223〉探針<400>2ggtaagctatat.aaactg18<210>3〈211〉17〈212〉DNA〈213〉A(chǔ)rtificialsequence<220><223〉探針〈400〉3tgaaatctcctaagtgt17〈210〉4〈211〉17〈212〉腿〈213〉A(chǔ)rtificialsequence〈220〉〈223〉探針〈400〉4tgaaatcttctaag'tgt17<210〉5〈211>14〈212〉DNA〈213〉A(chǔ)rtificialsequence<220>〈223〉探針〈400>5agaaaccgacctgg14〈210>6<211〉14〈212>腿〈213〉A(chǔ)rtificialsequence<220><223>探針〈400〉6agaaacccacctgg丄4〈210〉7〈211〉15<212〉腿<213〉A(chǔ)rtificialsequence<220>〈223>探針〈400〉7accgggctctgccat15<210〉8<2丄1〉14<212>DNA〈213〉A(chǔ)rtificialsequence〈220〉<223>探針〈400〉8accgggccctgcca14<210〉9〈211〉15<212〉DNA〈213〉A(chǔ)rtificialsequence<220〉<223>探針〈400>9accgggctctgccat15〈210〉10<211〉14〈212〉DNA〈213>artificialsequence〈220〉<223>探針〈400〉10accgggttctgcca14<210>11<211〉14<212>DNA〈213〉A(chǔ)rtificialsequence〈220〉〈223〉探針〈400〉〗1ttatgcgattaccg14<210>12<211>14<212>DNA〈213〉A(chǔ)rtificialsequence<220〉<223〉探針<400〉12t'tatgcgactaccg14〈210〉13<211>16〈212〉DNA<213>Artificialsequence<220><223〉探針〈■〉13gttttatgcgattacc16<210>14〈21〗〉17<212>DNA〈213〉A(chǔ)rtificialsequence〈220〉'〈223〉探針〈400〉14gttttatacgattaccg17〈2〗0>15〈211〉16<212〉DNA<213〉A(chǔ)rtificialsequence<220〉<223〉探針<400>15gttttatgcgattacc16〈210〉16〈211>16〈212〉DNA<213>Artificialsequence<220><223〉探針〈400>16agttttgtgcgattac〈210〉17<211>19〈2i2>DNA《213〉A(chǔ)rtificialsequence〈220〉〈223〉探針<400>17ctgactgt.肪agttttaag〈210>18〈211〉18〈212〉DNA<213>Artificialsequence〈220〉〈223〉探針<400〉18gactgtaaggttttaagt<210〉19〈211〉16〈212〉DNA〈213〉A(chǔ)rtificialsequence<220><223>探針〈400〉19g助ga.ggeuittg朋cc<210>2016191816〈211〉16<212〉DNA<213>Artificialsequence〈220〉〈223〉探針<400〉20卿卿gggattg幼c16〈210〉21<211〉14〈212〉DNA〈213〉A(chǔ)rtificialsequence〈220〉<223>探針<400>21ttcgttcggtaagc14<210>22〈211〉15〈212>DNA<213>Artificialsequence〈220〉〈223〉探針<400>22tttcgtttggtaagc15<210>23<2丄1〉14〈212〉DNA<213〉A(chǔ)rtificialsequence<220><223>探針〈400〉23cctgatcggcgcac14〈210〉24〈211〉14<2丄2>DNA〈213〉A(chǔ)rtificialsequence〈220〉〈223〉探針〈400〉24cctgatcagcgcac14〈210〉25<211>15〈212〉DNA〈213>Artificialsequence〈220〉〈223〉探針〈400〉25ggcgtattcgatgtt15〈210〉26〈211〉15〈212>賺<213〉A(chǔ)rtificialsequence<220〉<223〉探針<400〉26gcgtatttgat.gttg〈210>27<211〉15〈212〉DNA<213〉A(chǔ)rtificialsequence<22()〉〈223〉探針〈400>27ggcgtattcgatgt.t〈210〉28〈211〉14<212>DNA〈213>Artificialsequence〈220〉<223>探針〈400>28ggcgtgttcgatgt<210>29《211〉19〈212〉DNA<213〉A(chǔ)rtificialsequence<220><223>探針<400>29ttatttctaggactatgag<21_0>3015151419<211>19<212〉DNA〈213〉A(chǔ)rtificialsequence〈220><223〉探針〈■〉30ttatttctaagactatgag19<210>31〈211〉18〈212〉DNA<213〉A(chǔ)rtificialsequence〈220〉<223>探針〈400>31catacagaaatagtcaaa18<210>32〈211〉18<212>DNA<213〉A(chǔ)rtificialsequence〈220>〈223〉探針<400>32catacagaagtagtcaaa18<210>33〈211〉14〈212>DNA<213>Artificialsequence<220>〈223>探針<■>33ctacgccctctcag14〈210〉34〈211〉14〈212〉DNA<2丄3〉A(chǔ)rtificialsequence〈220>〈223>探針〈400>34ctacgccccctcag14〈210〉35<211〉15<212>DNA〈213〉A(chǔ)rtificialsequence〈220〉<223〉探針〈400〉35cttctatggctgagg15<210>36《m〉14〈2丄2〉廳<213〉A(chǔ)rtificialsequence《220>〈223〉探針<400〉36ccttctagggctga<210〉37《211>17<2J2〉DNA〈213>Artificialsequence〈220〉<223>探針<400>37tatagtgcttg3gtgga〈210〉38〈211>17《212>腿〈213>Artificialsequence〈220>〈223〉探針<400>38tatagtgcatgagtgga<210>39<21丄>16〈212>DNA〈213>Artificialsequence〈220>〈223>探針<400>39ctccaaagaccacatc〈210〉4014171716〈211〉15<212〉DNA〈213〉A(chǔ)rtificialsequence〈220>〈223>探針〈400〉40clxcaaaaaccacat15<210>41<211〉16〈212〉腿<213〉A(chǔ)rtificialsequence〈220〉〈223>探針<4()0>41ctccaaagaccacatc16<210>42〈211>15〈212〉DNA〈213>Artificialsequence〈220>〈223〉探針〈400〉42tccaaaggccacatc15〈210>43〈211〉14<212>腿〈213>Artificialsequence〈220〉<223>探針〈400〉43gcgatggctattga14<210>44〈211〉14<212〉腿<213〉A(chǔ)rtificialsequence〈220>〈223>探針〈400〉44gcgatggttattga14〈210〉45〈211〉20〈212〉腿<213>Artificialsequence<22()>〈223>探針〈400〉45aaacattttcagtgtattgc20<210>46〈211〉20〈212〉廳<213>Artificialsequence《220〉<223>探針<400〉46taaacatttttagtgtattg20〈210〉47<2丄1〉16<212〉DNA<213〉A(chǔ)rtificialsequence〈220><223>探針〈400〉47gttttatgcgattacc16<210>48〈211〉16〈212〉DNA〈213〉A(chǔ)rtificialsequence<220〉〈223>探針〈400〉48ttttatgtgattaccg16〈210〉49<211>15<212>DNA<213>Artificialsequence<220〉<223>探針<4()0>49ttacagtgggctcta15<210>50〈211〉〗4〈212〉腿〈2J3〉A(chǔ)rtificialsequence〈220〉〈223〉探針<400>50tttacagcgggctc'14〈210>51〈211>15〈212〉脆〈213〉A(chǔ)rtificialsequence〈220〉〈223〉探針〈400〉51ggtgttggttctcU15〈210>52〈2丄1>14〈212〉DM〈213〉A(chǔ)rtificialsequence<220〉〈223〉探針〈400〉52ggtgttggctctct14〈210〉53〈211〉16〈212〉DNA<213〉A(chǔ)rtificialsequence<220>〈223〉探針〈400〉53■ttcactgtaaagaggt16〈210〉54〈211〉16<2〗2>腿<213>Artificialsequence<220〉<223〉探針〈400〉54tttcactgtag卿gg16〈210〉55〈211〉15<212>腿〈213>Artificialsequence〈220〉〈223〉探針〈400〉55ggcatttcactgt朋15《210>56〈2U〉15《212〉DNA《213>Artificialsequence<2.20>〈223〉探針<400>ggcatttcattgtaa〈210〉57<211>15〈212〉DNA<213>Artificialsequence〈220〉〈223〉探針<■〉57ggcattt,cactgtaa〈210〉58<2]1〉]4〈212〉薩〈213〉A(chǔ)rtificialsequence〈220〉<223>探針〈400〉58gggcattttactgt〈2]()>59<211>16〈212>DNA〈213>Artificialsequence<220>〈223〉探針〈400〉59ggtgatgaggaatagt〈210〉6015151416〈211〉16〈212〉DNA<213〉A(chǔ)rtificialsequence〈220〉<223〉探針〈400〉60gggtgataaggaatag16<210>61<2]1>19〈212>DNA〈213〉A(chǔ)rtificialsequence〈220〉〈223〉探針〈400〉61gtaaatatagtttaaccaa19<210>62<211>19〈212>DM〈213>Artificialsequence〈220〉〈223〉探針〈400〉62gtaaatataatttaaccaa19《210〉63〈211〉21<212〉DNA〈213〉A(chǔ)rtificialsequence〈220〉〈223〉引物〈400〉63ttggcggtatgcacttttaac21〈2]0>64<211〉21<212〉DNA〈213〉A(chǔ)rtificialsequence〈220〉〈223〉引物〈400〉64tgtttatggggtgatgtgagc21<210>65〈211〉21<2]2〉DNA<213>Artificialsequence<220〉<223〉引物〈400〉65cagccgctattaaaggttcgt21<2丄0〉66〈211〉21〈212>DNA<213〉A(chǔ)rtificialsequence〈220〉<223〉引物，〈400〉66tggc鄉(xiāng)agtaatc卿ggtg〈210〉67〈211〉21〈212〉DNA<213>Artificialsequence<220><223>引物<4()0〉67ctgaaatctgtggagcaaacc〈210>68〈211〉20〈212〉DM〈2)3〉A(chǔ)rtificialsequence〈220〉<223〉引物〈400〉68gcaatgaatgaagcgaacag<210>69〈211〉21〈212〉腿〈213>Artificialseciuence〈220><223〉引物<4()0>69tcttcaatcagccacatagcc〈210〉70<211>21〈212〉腿〈213〉A(chǔ)rtificialsequence〈220>〈223〉引物〈400〉70tctcggtaaataaggggtcgt21〈210〉71〈211>19〈212>DNA<213>Artificialsequence<220>〈223>引物〈400〉71accaatcctacctccatcg19<210>72〈211〉19〈212〉DNA<213>Artificialsequence〈220〉<223>引物<400〉72cca鄉(xiāng)agtgagccgaagt19〈210〉73<211>19〈212>DNA〈213〉A(chǔ)rtificialsequence<220〉〈223>引物<400〉73agtcgtaacatggtaagtg19<21.0>74〈211〉19〈212〉腿〈213>Artificialsequence〈220〉<223〉引物〈400>74gttgtctggtagtaaggtg19〈210>75《211〉19<212〉DNA<213>Artificialsequence<220><223>引物〈400〉75tcatcttcctaattaccat19〈210〉76〈211〉19〈212〉DNA<213〉A(chǔ)rtificialsequence<220〉<223>引物〈400〉76ag肌ttattcgagtgctat<210>77<211>19〈212〉DNA〈213〉A(chǔ)rtificialsequence〈220><223〉引物<400>77actaataagtggctccttt〈210〉78〈211〉19<212〉DNA〈213〉A(chǔ)rtificialsequence<220>〈223>引物〈400〉78atggtagagt卿tgacgg<210>79<211>19〈212〉腿<213〉A(chǔ)rtificialsequence〈220〉<223〉引物<400>79cactttacatccaaacatc<2丄0〉8019191919〈211〉19〈212>腿〈213>Artificialsequence<220>〈223〉引物〈400〉80gttgtggtagtcaaaatgt19權(quán)利要求1.一種人類線粒體病MELAS和MERRF綜合征相關(guān)的mtDNA突變位點(diǎn)檢測(cè)基因芯片，其特征在于，在基因芯片載體表面點(diǎn)陣固定有人類線粒體病MELAS和MERRF綜合征相關(guān)的mtDNA突變位點(diǎn)的特異性寡核苷酸探針。2.如權(quán)利要求1所述人類線粒體病MELAS和MERRF綜合征相關(guān)的mtDNA突變位點(diǎn)檢測(cè)基因芯片，其特征在于，所述特異性寡核苷酸探針選自序列為SEQIDNO.162的寡核苷酸探針中的一個(gè)或多個(gè)。3.如權(quán)利要求1所述人類線粒體病MELAS和MERRF綜合征相關(guān)的mtDNA突變位點(diǎn)檢測(cè)基因芯片，其特征在于，所述基因芯片載體表面點(diǎn)陣固定有序列為SEQIDNO.144的寡核苷酸探針和/或序列為SEQIDNO.4562的寡核苷酸探針。4.如權(quán)利要求1一3中任一權(quán)利要求所述人類線粒體病MELAS和MERRF綜合征相關(guān)的mtDNA突變位點(diǎn)檢測(cè)基因芯片，其特征在于，所述寡核苷酸探針的5'端有氨基修飾基團(tuán)，且寡核苷酸探針5'端有一段15聚的PolyT。5.如權(quán)利要求1一3中任一權(quán)利要求所述人類線粒體病MELAS和MERRF綜合征相關(guān)的mtDNA突變位點(diǎn)檢測(cè)基因芯片，其特征在于，所述基因芯片載體為載玻片。6.如權(quán)利要求5所述人類線粒體病MELAS和MERRF綜合征相關(guān)的mtDNA突變位點(diǎn)檢測(cè)基因芯片，其特征在于，所述基因芯片載體為醛基修飾的載玻片。7.--種權(quán)利要求16中任一權(quán)利要求所述人類線粒體病MELAS和MERRF綜合征相關(guān)的mtDNA突變位點(diǎn)檢測(cè)基因芯片的制備方法，包括下列步驟將選自序列為SEQIDNO.162的寡核苷酸探針5'端加上一段15聚的PolyT，并對(duì)5'端進(jìn)行氨基修飾，用去離子水將各探針分別稀釋，并分別與點(diǎn)樣液等體積混合，獲得終濃度為12.550uM的寡核苷酸探針溶液，采用常規(guī)的方法將寡核苷酸探針溶液與陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照一起點(diǎn)陣于載玻片表面，并固定。8.如權(quán)利要求7所述人類線粒體病MELAS和MERRF綜合征相關(guān)的mtDNA突變位點(diǎn)檢測(cè)基因芯片的制備方法，其特征在于，所述固定的條件為將點(diǎn)樣好的芯片置于70%濕度下固定48-72小時(shí)。9.如權(quán)利要求7所述人類線粒體病MELAS和MERRF綜合征相關(guān)的mt副A突變位點(diǎn)檢測(cè)基因芯片的制備方法，其特征在于，所述載玻片表面點(diǎn)樣有序列為SEQIDNO.144的寡核苷酸探針和/或序列為SEQIDNO.4562的寡核苷酸探針。10.—種檢測(cè)人類線粒體病MELAS和MERRF綜合征相關(guān)的mtDNA突變位點(diǎn)的方法，包括下列步驟a)抽取樣本DNA;b)樣本DNA的PCR擴(kuò)增和標(biāo)記以樣本DNA為模板，選擇合適引物PCR擴(kuò)增并標(biāo)記待測(cè)的突變相關(guān)序列；c)采用權(quán)利要求16中任一權(quán)利要求所述人類線粒體病MELAS和MERRF綜合征相關(guān)的mtDNA突變位點(diǎn)檢測(cè)基因芯片進(jìn)行雜交檢測(cè)將樣本PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與雜交液以1:21:l的體積比混合獲得混合液，混合液中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物變性后將混合液點(diǎn)于芯片上進(jìn)行雜交，雜交后用洗液洗滌，再通過(guò)檢測(cè)標(biāo)記信號(hào)的強(qiáng)度判斷是否發(fā)生相應(yīng)突變。11.如權(quán)利要求10所述檢測(cè)人類線粒體病MELAS和MERRF綜合征相關(guān)的mtDNA突變位點(diǎn)的方法，其特征在于，所述步驟c中，雜交溫度為35-4(TC，雜交時(shí)間為30-60分鐘。12.如權(quán)利要求10所述檢測(cè)人類線粒體病MELAS和MERRF綜合征相關(guān)的mtDNA突變位點(diǎn)的方法，其特征在于，所述步驟c中，一次洗液為2xSSC+0.1%SDS，二次洗液為().2xSSC+0.1%xSDS，二次洗脫條件為3(TC洗滌5分鐘。13.如權(quán)利要求10所述檢測(cè)人類線粒體病MELAS和MERRF綜合征相關(guān)的mtDNA突變位點(diǎn)的方法，其特征在于，所述步驟b中，所述引物選自序列為SEQIDN0.63S0的核苷酸序列，且每對(duì)正反引物中，至少有一個(gè)被標(biāo)記。14.如權(quán)利要求10所述檢測(cè)人類線粒體病MELAS和MERRF綜合征相關(guān)的mtDNA突變位點(diǎn)的方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增為多重不對(duì)稱PCR擴(kuò)增將序列為IDNO.6372的核苷酸序列作為一組五重不對(duì)稱PCR的引物，序列為IDNO.7380的核苷酸序列作為一組四重不對(duì)稱PCR的引物，分別以樣本DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。全文摘要本發(fā)明涉及線粒體病MELAS和MERRF綜合征相關(guān)mtDNA突變位點(diǎn)的檢測(cè)，公開了一種人類線粒體病MELAS和MERRF綜合征相關(guān)的mtDNA突變位點(diǎn)檢測(cè)基因芯片，其中，在基因芯片載體表面點(diǎn)陣固定有可檢測(cè)人類線粒體病MELAS和MERRF綜合征相關(guān)的mtDNA突變位點(diǎn)的特異性寡核苷酸探針。本發(fā)明還進(jìn)一步公開了上述基因芯片的制備及使用方法。本發(fā)明的基因芯片可用于檢測(cè)所有與人類線粒體病MELAS和MERRF綜合征相關(guān)的mtDNA突變位點(diǎn)，且靈敏度高、特異性強(qiáng)和可重復(fù)性好；與傳統(tǒng)分子生物學(xué)方法相比，檢測(cè)時(shí)間大大縮短，達(dá)到MELAS和MERRF綜合征臨床診斷與鑒別診斷的目的。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101177702SQ200710047349公開日2008年5月14日申請(qǐng)日期2007年10月23日優(yōu)先權(quán)日2007年10月23日發(fā)明者張學(xué)軍,曹慧敏,偉李,杜衛(wèi)東,趙建龍,剛陳申請(qǐng)人:安徽醫(yī)科大學(xué);中國(guó)科學(xué)院上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所