專利名稱：用于骨髓間充質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)和擴增的無血清培養(yǎng)基的制作方法
用于骨髓間充質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)和擴增的無血清培養(yǎng)基技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域的一種細胞培養(yǎng)基，尤其是一種用于骨髓間充 質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)和擴增的無血清培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)是骨髓基質(zhì)的主要成份，為骨髓的造血功能 提供結(jié)構(gòu)和功能上的支持。目前的研究表明，骨髓間充質(zhì)干細胞能夠促進造 血系統(tǒng)的重建，具有有效的免疫調(diào)節(jié)功能，能夠在體外抑制T-淋巴細胞增殖， 延緩移植組織后出現(xiàn)的免疫排斥反應(yīng)，還可以用于預(yù)防和治療自體干細胞移 植(ASCT)產(chǎn)生的移植物抗宿主疾病(GVHD)，避免在器官移植中產(chǎn)生免疫排 斥反應(yīng)，以及治療自身免疫性疾病，如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。骨髓間充質(zhì)干細胞 具有多向分化的潛能，能夠分化成多種細胞譜系，如成骨細胞、軟骨細胞、 肌細胞、脂肪細胞、肝細胞、腎細胞、心肌細胞和神經(jīng)細胞等等，因而可以 通過組織工程技術(shù)進行組織修復(fù)和再生。由于骨髓間充質(zhì)干細胞能夠分化成 多種細胞類型，并且免疫原性弱，因而可以作為組織工程理想的種子細胞來 源。另外，骨髓間充質(zhì)干細胞易于外源基因的轉(zhuǎn)染和表達，可以廣泛地應(yīng)用 于細胞治療和基因治療，具有十分廣闊的應(yīng)用前景。但是，骨髓間充質(zhì)干細 胞在骨髓中含量極少，大約104 105個骨髓單核細胞中僅含有一個骨髓間充質(zhì) 干細胞，因此，僅僅通過自體或異體分離骨髓間充質(zhì)干細胞顯然無法滿足臨 床需求，需要積極進行在體外培養(yǎng)和擴增骨髓間充質(zhì)干細胞，以滿足人們在 應(yīng)用上需求。
進行體外培養(yǎng)和擴增骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)通常需要在培養(yǎng)基中添 加一定量(10% 20%)的胎牛血清，這曾被認為是培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞的最 佳條件，且能較好地保持其生物學(xué)特性。但是，使用動物血清具有兩面性 一方面，動物血清能很好地支持細胞 的生長 一是，血清中含有的大量的蛋白能夠?qū)毎鸬奖Ｗo作用；二是， 含有的微量元素和大量的營養(yǎng)成分能充實培養(yǎng)基以支持細胞的生長；三是， 含有的多種細胞因子能促進細胞增殖；四是，還能為貼壁依賴細胞提供貼壁 因子。
但在另一方面，對于動物血清生產(chǎn)的細胞產(chǎn)品，其生物安全性受到人們 的普遍質(zhì)疑 一是，由于各批次血清之間的成分差異較大，從而對細胞產(chǎn)品 的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響；二是，成分不明確，大量的未知蛋白給研究工作帶來極 大的干擾；三是，更為嚴重的是，動物血清中可能含有由蛋白質(zhì)構(gòu)成的感染 物和未知的動物傳染病，在生產(chǎn)臨床級別的人用細胞產(chǎn)品時，理論上會導(dǎo)致 這些傳染物的傳播；四是，血清中的蛋白或肽可能在培養(yǎng)過程中被骨髓間充
質(zhì)干細胞整合，這樣，當移植骨髓間充質(zhì)干細胞時將導(dǎo)致宿主產(chǎn)生免疫反應(yīng)。 為了克服動物血清在體外培養(yǎng)和擴增骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)時可能 存在的缺陷，從20世紀九十年代起人們就開始了無血清培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細 胞的研究。1995年，Donald等人開發(fā)了一種化學(xué)成分明確的無血清培養(yǎng)基 RDM-F，用于體外擴增大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞。該培養(yǎng)基以60% DMEM-LG加 40% MCDB-201為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加5Pg/mL的胰島素、0.1% (w/v) LA-BSA、 10ng/mL PDGF-3 P和lng/mL bFGF，大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞在有血清培養(yǎng)基 中貼壁完全后，更換成無血清培養(yǎng)基RDM-F進行培養(yǎng)[Lennon， D. P. ， et al., Exp Cell Res， 219， p. 211—222 (1995)]。
Gronthos和Simmons等人以a-MEM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加了 10 Pg/mL牛 胰島素、2% (w/v) BSA、 4 Pg/mL人低密度脂蛋白、200 Pg/mL飽和人轉(zhuǎn)鐵蛋 白、2 mmol/L L-谷氨酰胺、10nM地塞米松磷酸鈉、100141抗壞血酸(L-ascorbic acid 2-phosphate， ASAP)， 50144 P-巰基乙醇[Gronthos， S. ， Si,ns， P. J. Blood， 85， p. 929-940 (1995)]。
臺灣長庚大學(xué)的劉繼賢等人開發(fā)了用于體外擴增臍血間充質(zhì)干細胞的無血清培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基以IMDM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加了人血清白蛋白、氫化可 的松、SITE (SITE為商品名，是四種物質(zhì)的簡稱Selenite硒酸鹽、Insulin 胰島素、Transferrin轉(zhuǎn)鐵蛋白、Ethanolamine乙醇胺)和bFGF (堿性成纖 維細胞生長因子)[Chi-Hsien Liu， et al., Biochem Eng J， 33， p. 1-9 (2007)]。
此外，美國專利USP 5，908，782以IMDM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加了 BSA、人 脂蛋白、飽和人轉(zhuǎn)鐵蛋白、重組人胰島素、維生素、氨基酸、微量元素以及 重組人PDGF-P P (血小板衍生生長因子)和5-羥色胺作為培養(yǎng)骨髓間充質(zhì) 干細胞的無血清培養(yǎng)基。美國專利USP 7, 109， 032以F12 (Coon's modified Ham'sF12)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加了 HAS、轉(zhuǎn)鐵蛋白、抗壞血酸、P-巰基乙醇、 膽固醇、硒、維生素H、泛酰巰基乙胺鈉、地塞米松以及EGF (表皮生長因子) /PDGF (血小板衍生生長因子)/FGF-2 (成纖維細胞生長因子)/ IGF-I (胰 島素樣生長因子-I) / LIF (白血病抑制因子)/ SCF (干細胞因子)等細胞 因子。
以上研究和開發(fā)的無血清培養(yǎng)基都是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上添加純化的蛋白、 激素、生長因子、微量元素、維生素等物質(zhì)，其特點是化學(xué)成分明確，能較 好地維持骨髓間充質(zhì)干細胞的生長，保持骨髓間充質(zhì)干細胞的多向分化潛能。 但是，這些無血清培養(yǎng)基均不能促進骨髓間充質(zhì)干細胞貼壁。在體外培養(yǎng)時， 骨髓間充質(zhì)干細胞需要在含血清培養(yǎng)基中貼壁完全后，再更換成無血清培養(yǎng) 基進行培養(yǎng)，這樣會造成在培養(yǎng)基中殘留一定量的動物血清，在嚴格的意義 上說，并未達到真正的無血清培養(yǎng)，在臨床應(yīng)用中仍可能具有很大的風(fēng)險。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是，克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，為體外培養(yǎng)和擴增骨髓間 充質(zhì)干細胞(MSCs)提供一種化學(xué)成分明確的無血清培養(yǎng)基，避免含血清培 養(yǎng)基生產(chǎn)的產(chǎn)品在臨床應(yīng)用中可能存在的風(fēng)險。用于骨髓間充質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)和擴增的無血清培養(yǎng)基是由各種營養(yǎng)成 分，包括氨基酸、碳水化合物、無機鹽、維生素、激素、生長因子、微量元 素等眾多成分組成的。在培養(yǎng)基組分的研究中必須關(guān)注到 一、在培養(yǎng)過程 中任何一種營養(yǎng)物質(zhì)的耗竭都會影響細胞的生長，嚴重的會導(dǎo)致細胞的死亡; 反過來，如果營養(yǎng)物質(zhì)過剩的話，也會在培養(yǎng)環(huán)境中積累大量的副產(chǎn)物，對 細胞產(chǎn)生毒性，嚴重的會引起細胞的死亡；因此，培養(yǎng)基中各種營養(yǎng)成分要 合理均衡，以滿足細胞生長、代謝和維持功能的需求。二、骨髓間充質(zhì)干細 胞具有多向分化的潛能，在體外擴增過程中要保持其多向分化的潛能，因而 在培養(yǎng)基中要添加堿性成纖維細胞生長因子、表皮生長因子等，在促進增殖 的同時維持骨髓間充質(zhì)干細胞的多向分化的潛能。三、骨髓間充質(zhì)干細胞是 貼壁細胞，需要在無血清培養(yǎng)基中添加貼壁因子以促進其貼壁，使骨髓間充 質(zhì)干細胞能夠直接在無血清培養(yǎng)基中貼壁生長。
為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明用于骨髓間充質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)和擴增的 無血清培養(yǎng)基，其特征在于，為一種水溶液，其組分(包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基)如 下
基礎(chǔ)培養(yǎng)基10 18g/L
堿性成纖維細胞生長因子1 20 ng/mL
表皮生長因子1 10 ng/mL
血清白蛋白1 20 mg/mL
胰島素1 20 (ig/mL
轉(zhuǎn)鐵蛋白1 20 )ng/mL
乙醇胺0. 01 0. 05 mM
腐胺200
維生素c10 100 (^M
氫化可的松10 |ig/mL
地塞米松10 nMFeS04 7H20 0. 834 mg/mL
CuS04 5H20 0. 0025 mg/mL
ZnS04 7H20 0. 863 mg/mL
抗氧化劑巰基乙醇 0. 01 0. 05mM
貼壁因子纖粘連蛋白 5 10 pg/cm2
所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為a-MEM、 DMEM、 IMDM、 DMEM與Ham， s F12按l: 1 混合的培養(yǎng)基中的一種。
所述的抗氧化劑為巰基乙醇、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、亞硒酸鈉 的一種或多種。所述組分中的0.01 0.05 mM的巰基乙醇可用50-150 U/mL 的氧化氫酶、或50-150 U/mL的超氧化物歧化酶、或O. 01 0. 05 mM的亞硒 酸鈉替代，或多種組合使用。
所述的貼壁因子為纖粘連蛋白、明膠、I型膠原蛋白的一種或多種。所述 組分中的5 10 pg/cm2的纖粘連蛋白可用50 100 )ug/cm2的明膠、或100 200 )Lig/cn^的I型膠原蛋白替代，或多種組合使用。
所述組分中的維生素C為L-ascorbic acid，或可用L-ascorbic acid 2-phosphate (維生素C磷酸鹽)替代。
所述組分中的貼壁因子需預(yù)鋪于培養(yǎng)介質(zhì)(如培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶等的)表 面，或者直接添加至培養(yǎng)基中。
所述的a -MEM、 DMEM、 IMDM、按1: 1混合的DMEM與Ham's F12基礎(chǔ)培 養(yǎng)基的組分在己有的文獻中已有公開報道，這里不再贅述。
利用本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基進行骨髓間充質(zhì)干細胞的體外培養(yǎng)和擴增， 由于添加了維生素、激素、生長因子、微量元素、抗氧化劑和貼壁因子，因 此不需要預(yù)先在含血清培養(yǎng)基中先進行貼壁，而后更換無血清培養(yǎng)基，最大 可能地減少了血清的殘留，同時較好地維持了骨髓間充質(zhì)干細胞的生長，保 持了骨髓間充質(zhì)干細胞的多向分化潛能。

附圖1是采用本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞至匯合的照
片；
附圖2是采用oc-MEM+l(^FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細胞至匯合的照
片；
附圖3是兔骨髓間充質(zhì)干細胞在本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基與含10%胎牛血清
培養(yǎng)基中生長曲線的對比附圖4是兔骨髓間充質(zhì)干細胞在本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基與含10%胎牛血清
培養(yǎng)基中擴增后經(jīng)誘導(dǎo)成骨分化后胞外鈣基質(zhì)沉積的對比附圖5是兔骨髓間充質(zhì)干細胞在本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基和含10%胎牛血清 培養(yǎng)基中擴增后誘導(dǎo)成脂肪分化后分化程度的對比圖。
具體實施方式
以下以6個實施例給出本發(fā)明用于骨髓間充質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)和擴增的 無血清培養(yǎng)基的具體實施方式
，但本發(fā)明不限于這些實施例。 實施例1
以a-MEM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其組分如下 a-MEM 10.2g/L
堿性成纖維細胞生長因子10 ng/mL表皮生長因子10 ng/mL
牛血清白蛋白2 mg/mL
牛胰島素10 pg/mL
轉(zhuǎn)鐵蛋白5. 5 |ag/mL
乙醇胺0. 02mM
腐胺200 |uM
維生素C100 |uM氫化可的松
10 |LXg/mL
地塞米松
FeS04 7H20
0. 834 mg/mL
CuS04 5H20
0. 0025 mg/mL
ZnS04 7H20
0. 863 mg/mL
巰基乙醇
0. 05 mM
亞硒酸鈉
0. OlmM
將上述組分在常溫下溶于三蒸水或超純水中，攪拌溶解，即為本發(fā)明所 說的無血清培養(yǎng)基；經(jīng)0.2um過濾膜過濾除菌后，即可用于骨髓間充質(zhì)干細 胞體外培養(yǎng)和擴增。
將I型鼠尾膠原溶解于0. 02N的醋酸溶液中，膠原濃度為50mg/mL。將此 膠原溶液稀釋10倍，經(jīng)0. 2 u m過濾膜過濾除菌后，以100)tig/cm2鋪于無菌的 培養(yǎng)皿中，并在無菌環(huán)境中室溫風(fēng)干，用PBS潤洗預(yù)鋪了膠原的平皿兩遍， 該平皿即可用于骨髓間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)。
以空氣栓塞法處死l月齡新西蘭大白兔，解剖，分離出股骨、脛骨、尺 骨、撓骨，并浸泡入75%乙醇中5分鐘。PBS沖洗3 5遍，用碎骨鉗將骨頭 剪碎，轉(zhuǎn)入兩個離心管中，加入15 30mL PBS，震蕩，取上清。在1000rpm 條件下離心5分鐘，棄上清。加入30mLPBS，混合均勻后，在1000rpm條件 下離心5分鐘，棄上清。加入10mL PBS混合均勻，經(jīng)150目篩網(wǎng)過濾，收集 濾液，離心，無血清的a-MEM培養(yǎng)基重新懸浮。將該骨髓提取物沿離心管壁緩 慢加至等體積Ficoll分離液上，在3000rpm條件下水平離心30分鐘。用尖 吸管吸取中間霧層，加PBS離心洗滌。用a-MEM+l(F。FBS培養(yǎng)液將細胞懸浮， 臺盼藍拒染法計數(shù)。然后將細胞懸液稀釋至1X106 cells/mL，接種至10cm 培養(yǎng)皿中，于C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 48小時后觀察細胞貼壁，換液除去懸浮
實施例2
實施例3細胞。每隔3 4天更換培養(yǎng)基。原代細胞經(jīng)7 10天長滿了培養(yǎng)皿底部后， 可進行傳代培養(yǎng)。
原代培養(yǎng)后的骨髓間充質(zhì)干細胞加3mL 0. 025%胰酶/0. 02% EDTA進行消 化，當細胞變圓、脫落后在1200rpm條件下離心5分鐘，棄消化液，加入2 3mL 10mg/mL大豆胰酶抑制劑中和胰酶活性。在1200rpm條件下離心5分鐘后 倒去上清，PBS清洗兩遍，加入實施例1所述的無血清培養(yǎng)基懸浮細胞，以 lxl()4cells/cm2接種于實施例2所述的預(yù)鋪了 I型膠原蛋白的培養(yǎng)皿中。
參見附圖1，采用本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞至匯合的 照片；參見附圖2，采用a-MEM+10y。FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細胞至匯 合的照片。
實施例4
將無血清培養(yǎng)至匯合的骨髓間充質(zhì)干細胞加3mL 0. 025%胰酶/0. 02% EDTA 進行消化，當細胞變圓、脫落后在1200rpm條件下離心5分鐘，棄消化液， 加入2~3mL 10mg/mL大豆胰酶抑制劑中和胰酶活性。在1200rpm條件下離心5 分鐘后倒去上清，PBS清洗兩遍，加入實施例1的無血清培養(yǎng)基懸浮，以0.5 X 104cells/孔接種于預(yù)鋪了 I型膠原蛋白的24孔板中，每個孔加入lmL本發(fā) 明的無血清培養(yǎng)基，每天取樣計數(shù)。
參見附圖3。附圖3比較了兔骨髓間充質(zhì)干細胞在實施例1所述的無血清 培養(yǎng)基與含10%胎牛血清培養(yǎng)基中的生長曲線。
實施例5
將使用實施例1所述的無血清培養(yǎng)基擴增的兔骨髓間充質(zhì)干細胞以 lxl()5cells/孔接種于6孔板中，在實施例1所述的無血清培養(yǎng)基中補充 10網(wǎng)/cm2的纖粘連蛋白和5(^g/cm2的明膠，加入6孔板中，以培養(yǎng)骨髓間充 質(zhì)干細胞。當細胞生長至50%匯合時，更換成成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基進行誘導(dǎo)。成骨 誘導(dǎo)培養(yǎng)基為DMEM-LG添加10%FBS、 0. I)liM地塞米松、50|ug/mL抗壞血酸 (L-ascorbic acid 2-phosphate) 、 lOmM 甘油磷酸鈉。誘導(dǎo)2周后用PBS潤洗孔板中的對照細胞和成骨誘導(dǎo)細胞，之后加入 200叱的0. 1M鹽酸，反應(yīng)20分鐘后將鹽酸反應(yīng)液轉(zhuǎn)入冷凍離心管中在-20"C 的條件下凍存。測定時取出離心管解凍，在漩渦混合器上充分振蕩混勻，用 鈣測定試劑盒測定鈣離子濃度。
參見附圖4。附圖4對比了用實施例1所述的無血清培養(yǎng)基與含10%胎牛 血清培養(yǎng)基擴增后的兔骨髓間充質(zhì)干細胞經(jīng)誘導(dǎo)成骨分化后胞外鈣基質(zhì)的沉 積。
實施例6
將使用實施例1所述的無血清培養(yǎng)基擴增的兔骨髓間充質(zhì)干細胞以 lxl()5cells/孔接種于實施例2所述的預(yù)鋪了膠原的6孔板中，加入實施例1 所述的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，當細胞生長至80%匯合時，更換成脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)基 進行誘導(dǎo)。脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)基為DMEM-LG添加10%FBS、 1一地塞米松、10|ug/mL 胰島素、0. 5mMIBMX、 200,消炎痛。誘導(dǎo)2周后，用10%甲醛固定，0. 5%油 紅染色。脂肪細胞內(nèi)的脂滴將被染成紅色。用異丙醇將胞內(nèi)的油紅萃取出， 用分光光度計在波長510nm處測吸光度，可反映脂肪分化程度。
參見附圖5。附圖5對比了用實施例1所述的無血清培養(yǎng)基與含10%胎牛 血清培養(yǎng)基擴增后的兔骨髓間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)成脂肪分化后的分化程度。
權(quán)利要求
1、一種用于骨髓間充質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)和擴增的無血清培養(yǎng)基，其特征在于，為一種水溶液，其組分，包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基如下基礎(chǔ)培養(yǎng)基 10～18g/L堿性成纖維細胞生長因子 1～20ng/mL表皮生長因子1～10ng/mL血清白蛋白 1～20mg/mL胰島素 1～20μg/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白1～20μg/mL乙醇胺 0.01～0.05mM腐胺200μM維生素C 10～100μM氫化可的松 10μg/mL地塞米松10nMFeSO4·7H2O 0.834mg/mLCuSO4·5H2O 0.0025mg/mLZnSO4·7H2O 0.863mg/mL抗氧化劑巰基乙醇 0.01～0.05mM貼壁因子纖粘連蛋白5～10μg/cm2
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于骨髓間充質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)和擴增的無血清培養(yǎng)基，其特征在于，所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為a-MEM、 DMEM、 IMDM、 DMEM與 Ham's F12按l: l混合的培養(yǎng)基中的一種。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于骨髓間充質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)和擴增的無血 清培養(yǎng)基，其特征在于，所述的抗氧化劑為巰基乙醇、過氧化氫酶、超氧化 物歧化酶、亞硒酸鈉的一種或多種。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于骨髓間充質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)和擴增的無血 清培養(yǎng)基，其特征在于，所述組分中的0.01 0.05 mM的巰基乙醇可用50 .150 U/mL的氧化氫酶、或50 150 U/mL的超氧化物歧化酶、或0. 01 0. 05 mM 的亞硒酸鈉替代，或多種組合使用。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于骨髓間充質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)和擴增的無血 清培養(yǎng)基，其特征在于，所述的貼壁因子為纖粘連蛋白、明膠、I型膠原蛋白 的一種或多種。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于骨髓間充質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)和擴增的無血 清培養(yǎng)基，其特征在于，所述組分中的5 10 )Lig/cm2的纖粘連蛋白可用50 100 ng/cii^的明膠、或100 200 pg/ci/的I型膠原蛋白替代，或多種組合使 用。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于骨髓間充質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)和擴增的無血 清培養(yǎng)基，其特征在于，所述組分中的維生素C可用維生素C磷酸鹽替代。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于骨髓間充質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)和擴增的無血 清培養(yǎng)基，其特征在于，所述組分中的貼壁因子需預(yù)鋪于培養(yǎng)介質(zhì)的表面， 或直接添加至培養(yǎng)基中。
9、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于骨髓間充質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)和擴增的無血 清培養(yǎng)基，其特征在于，以ot-MEM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其組分如下a-MEM10. 2g/L堿性成纖維細胞生長因子10 ng/mL表皮生長因子10 ng/mL牛血清白蛋白2 mg/mL牛胰島素10 |xg/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白5. 5 (ig/mL乙醇胺0. 02mM腐胺200 ,維生素C100 ,氫化可的松10 |ug/mL地塞米松FeS04 7H20 0. 834 mg/mLCuS04 5H20 0. 0025 mg/mLZnS04 7H20 0.863 mg/mL巰基乙醇0. 05 mM亞硒酸鈉0. OlmM
10、根據(jù)權(quán)利要求l，或9所述的用于骨髓間充質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)和擴增 的無血清培養(yǎng)基，其特征在于，將I型鼠尾膠原溶解于0.02N的醋酸溶液中， 膠原濃度為50mg/mL;將此膠原溶液稀釋10倍，經(jīng)0. 2 u m過濾膜過濾除菌后， 以100^ig/cm2鋪于無菌的培養(yǎng)皿中，并在無菌環(huán)境中室溫風(fēng)干，用PBS潤洗預(yù) 鋪了膠原的平皿兩遍，該平皿即可用于骨髓間充質(zhì)干細胞的無血清培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，為一種用于骨髓間充質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)和擴增的、化學(xué)成分明確的無血清培養(yǎng)基。本發(fā)明通過在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、乙醇胺、亞硒酸鈉、生長因子、貼壁因子、激素、腐胺、無機鹽、維生素、白蛋白和抗氧化劑，能使骨髓間充質(zhì)干細胞在無血清條件下貼附于培養(yǎng)介質(zhì)，實現(xiàn)體外培養(yǎng)和擴增，并維持多向分化的潛能，擴增后的細胞能夠在體外誘導(dǎo)成成骨細胞和脂肪細胞。本發(fā)明的積極作用是，用本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基生產(chǎn)的臨床級別的人用細胞產(chǎn)品可有效地避免使用含血清培養(yǎng)基生產(chǎn)的細胞產(chǎn)品可能存在的風(fēng)險。附圖為采用本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞至匯合的照片。
文檔編號C12N5/0775GK101412985SQ20071004703
公開日2009年4月22日 申請日期2007年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月15日
發(fā)明者偉 吳, 燕 周, 譚文松 申請人:華東理工大學(xué)