專利名稱：從蝴蝶蘭克隆出的類黃酮-3'5'-羥化酶基因,其編碼序列和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)、基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種在蝴蝶蘭中表達(dá)的類黃酮-3’5’-羥化酶基因的核苷酸編碼序列，包含上述基因的重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)基因植株，以及對蝴蝶蘭此內(nèi)源基因的表達(dá)模式進(jìn)行分析鑒定的方法。

背景技術(shù)：
自然界中花的顏色千變?nèi)f化，這與它復(fù)雜的代謝途徑和多樣的代謝產(chǎn)物是分不開的。早在1664年，Robert Boyle就對酸堿度pH值對植物顏色的影響進(jìn)行了研究?；ㄉ饕深慄S酮、類胡蘿卜素以及生物堿三類物質(zhì)決定。其中類黃酮類色素是一類液泡包素，主要存在液泡中，類黃酮的不同色素在液泡中的積累產(chǎn)生了各種花色，同時色素的組成和濃度的不同也是出現(xiàn)各種花色的原因。而各種色素物質(zhì)的產(chǎn)生又是從苯丙氨酸開始沿著復(fù)雜的代謝途徑由多種酶依次催化形成的。其中花色素和花色素苷是重要的顏色決定物質(zhì)，也是花色生理水平的重要檢測指標(biāo)。而類黃酮-3’5’-羥化酶(F3’5’H)是合成3’-，5’-帶羥基的花色素(例如翠雀素)的關(guān)鍵酶和限速酶，這類色素呈現(xiàn)藍(lán)紫色，是藍(lán)花和紫花形成的原因。因此關(guān)于它的研究就成為花色研究領(lǐng)域中重要的一個組成部分。
F3’，5’H基因?qū)儆诩?xì)胞色素450單加氧酶(P450)超家族。細(xì)胞色素450單加氧酶(P450)是血紅素依賴的氧化酶，廣泛分布與各種生物中，具有非常復(fù)雜的功能，可以催化成千上萬的反應(yīng)。在植物界分布也非常的廣泛，可以催化的反應(yīng)超過50種，也涉及到類黃酮的合成。它在二氫黃酮醇的3’和5’位置選擇性的加入羥基，產(chǎn)生不同的花色素苷從而使得植物顯現(xiàn)出不同的顏色。
目前已經(jīng)克隆得到好幾種植物的F3’5’H基因，如Nielsen&Podiwinsky從草原龍膽Eustoma grandiflorum中(Nielsen KM，1997)，Okinaka從風(fēng)鈴草Campanμla medium中(Okinaka Y，2003)都克隆得到了F3’5’H基因。
S.T.Jeong等通過對色素的分析，發(fā)現(xiàn)葡萄中葉子和果實(shí)的顏色深淺與F3’5’H的表達(dá)正相關(guān)(S.T.Jeong，2005)，Effendi Leonard等從大腸桿菌(Escherichia coli)中表達(dá)了F3’5’H基因(Effendi Leonard，2005)。Yuko Fukui等將F3’5’H基因轉(zhuǎn)入康乃馨中，發(fā)現(xiàn)花色產(chǎn)生了明顯的變化，從粉色變成了紫色(Yuko Fukuia，2002)。YukihisaShimada等也在煙草和矮牽牛中表達(dá)了F3’5’H基因，花色均有明顯的變深(YukihisaShimada，1999)。Nakatsuka T等將轉(zhuǎn)座子插入F3’5’H中，從而導(dǎo)致基因的失活，花色從紫色變成粉色(Nakatsuka T，2006)。S.Mori等將從長春花中克隆得到的F3’5’H基因轉(zhuǎn)入矮牽牛中，有些花的花色發(fā)生了變化，其中檢測到了F3’5’H的表達(dá)(S.Mori，2004)。Christian Seitz等認(rèn)為F3’5’H基因在某些菊科植物中的特異表達(dá)是因?yàn)樗{(lán)紫色的花瓣能夠有效地吸引昆蟲產(chǎn)生的進(jìn)化(Christian Seitz，2006)。
本發(fā)明研究了一種從蝴蝶蘭中克隆出的類黃酮-3’5’-羥化酶基因，轉(zhuǎn)入矮牽牛后改變了花色表型。而在發(fā)明公布之前，尚未有任何公開報道過本專利申請中提及的蝴蝶蘭類黃酮-3’5’-羥化酶基因序列，其蛋白序列或在轉(zhuǎn)基因植株中的應(yīng)用。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提出一種從蝴蝶蘭中克隆出的類黃酮-3’5’-羥化酶基因，其編碼序列和應(yīng)用。
本發(fā)明的一方面提供一種新的蝴蝶蘭基因，記為phf3’5’h，該基因是一個類黃酮-3’5’-羥化酶基因，屬于細(xì)胞色素P450家族。已注冊于GenBank/EMBL/DDBJ，登陸號為DQ148458，其核苷酸序列為SEQ ID NO.1所示。
本發(fā)明還提供上述基因編碼翻譯出的蛋白序列，其氨基酸序列為SEQ ID NO.2所示。
本發(fā)明還提供了一種將上述的編碼具有蝴蝶蘭類黃酮-3’5’-羥化酶基因轉(zhuǎn)入矮牽牛以改變花色的方法，具體步驟如下 (1)將編碼蝴蝶蘭類黃酮-3’5’-羥化酶基因的核苷酸序列可操作的連接植物表達(dá)載體，形成含有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的載體；(見圖4) (2)將步驟(1)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，并將菌液與矮牽牛葉片混合培養(yǎng)。(見圖5) (3)通過抗生素篩選，PCR鑒定，獲得轉(zhuǎn)化細(xì)胞并再生轉(zhuǎn)基因植株。
本發(fā)明還提供了一種用于檢測樣品中蝴蝶蘭類黃酮-3’5’-羥化酶基因拷貝數(shù)的方法，其使用前述核苷酸序列SEQ ID NO.1對蝴蝶蘭基因組DNA樣品進(jìn)行Southern雜交，然后檢測目的片段的有無。樣品為蝴蝶蘭的基因組DNA，經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后的核苷酸片段。
本發(fā)明還提供了用于調(diào)取獲得蝴蝶蘭樣品中類黃酮-3’5’-羥化酶基因核苷酸引物系列。首先使用F，R引物獲取目的基因的部分片段，然后使用AP，AUAP，3GSP1，3GSP2，36SP3，3GSP4引物獲得與片段相連的3’末端序列，再使用5-1a，5-2，5-3，5-4，5-5，5-6，5-7，5-8，3-1b，3-2，3-3引物系列獲得5’末端序列。各引物序列具體如SEQ ID NO.3中所示。
最后，本發(fā)明內(nèi)容還包含了轉(zhuǎn)基因矮牽牛花瓣色素苷含量的檢測方法 1.花色素苷的提取 (1)準(zhǔn)備液氮，研缽和鑷子。將編好號的離心管稱重。
(2)將花瓣放入液氮中研磨充分，移入離心管中，稱重。
(3)每管加入1ml配制好的酸性甲醇(甲醇∶HCl＝24∶1)，在振蕩器上充分振蕩使花瓣碎塊分散。
(4)4℃，100rpm，搖床振搖2天，其間在振蕩器上振蕩兩次。
2.花色素苷的測量 (1)取振搖液800μl稀釋至2ml。
(2)用分光光度計分別測量A530和A657的吸光度。
(3)計算花色素苷含量。



圖1蝴蝶蘭phf35h的Southern雜交。基因組DNA各15μg分別用Bgl II(B)，EcoR V(E)and Hind III(H)消化。右邊數(shù)字代表分子量大小(bp)。結(jié)果顯示phf35h為單拷貝。
圖2 RT-PCR檢測蝴蝶蘭中phf35h的表達(dá)模式。A，花的五個開放階段；B，phf35h在這五個開放階段的表達(dá)情況；C，phf35h在白花(W)，黃花(Y)和紫花(P)花瓣中的表達(dá)；D，phf35h在蝴蝶蘭花瓣(Pe)，葉(L)，根(R)中的表達(dá)。圖左邊條帶為DL2000分子量標(biāo)記。
圖3 F3’5’H蛋白結(jié)構(gòu)。由8個β-折疊17個α-螺旋組成。其分成兩個結(jié)構(gòu)域，α-結(jié)構(gòu)域和β-結(jié)構(gòu)域。α-結(jié)構(gòu)域包含了大部分的α-螺旋和3個小的β-折疊，β-結(jié)構(gòu)域包含了大部分的β-折疊α-螺旋和3個小的α-螺旋。
圖4載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌PCR結(jié)果，1-5為任意挑取的五個菌落PCR結(jié)果。轉(zhuǎn)化率為80％。
圖5穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌PCR結(jié)果，1-8為任意挑取的八個菌落PCR結(jié)果。轉(zhuǎn)化率為50％。
圖6轉(zhuǎn)基因矮牽牛的組培生長狀況。
圖7轉(zhuǎn)基因矮牽?；蚪MKm基因的PCR結(jié)果。野生型的矮牽牛Km抗性很差，擴(kuò)增出特異性條帶說明植株被成功轉(zhuǎn)基因。圖中1-8均為轉(zhuǎn)基因矮牽牛以Km引物(此引物為根據(jù)一般文獻(xiàn)參考獲得，非本專利保護(hù)內(nèi)容)PCR結(jié)果，都有特異性條帶。說明轉(zhuǎn)基因成功。
圖8轉(zhuǎn)基因植株較野生型花色變化比較圖。

具體實(shí)施例方式 下面結(jié)合具體實(shí)施實(shí)例進(jìn)一步闡釋本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)例僅以用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)例中未注明具體的實(shí)驗(yàn)方法，均可按照常規(guī)方法進(jìn)行。如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(New YorkCold Spring Harbor Labortary Press，1989)中所述條件，或按照制造生產(chǎn)廠商的使用說明。
實(shí)施例1 蝴蝶蘭類黃酮-3’5’-羥化酶基因的克隆 1蝴蝶蘭(Phalaenopsis hybrida)材料采自上海農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜園藝研究所，品種為Formosa rosa，花色為紫色，白色，黃色。植物材料在溫室正常條件下生長(L/D，16h/8h；25-28℃)。
2 RNA提取。取100毫克左右新鮮的材料，液氮充分研磨。加1mL TriBlue試劑，用力搖15s，室溫放置5min。加0.2mL氯仿，去蛋白，上清轉(zhuǎn)移至新的離心管，加等體積異丙醇，充分混勻，室溫放置10min。用DEPC配制的75％乙醇1mL洗滌沉淀，重復(fù)一次。室溫干燥5～10min，溶于20μLDEPC水中，測OD值，電泳檢測。
3基因的克隆。通過對已發(fā)表的F3’5’H基因序列進(jìn)行同源性比較，根據(jù)保守區(qū)設(shè)計兼并引物F和R，進(jìn)行RT-PCR。引物序列見SEQ ID NO.3。
由于基因片段過大，前述步驟無法獲得完全基因序列，以3’RACE獲得F3’5’H基因的3’端。提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。依次使用多輪引物包括AP，AUAP，3GSP1，3GSP2，3GSP3，3GSP4進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增。引物序列見SEQ ID NO.3 RACE引物系列表。
5’端及其上游序列以IPCR方法獲得。將基因組DNA以市售的XbaI、XhoI和SphI三種酶進(jìn)行酶切。再酶切產(chǎn)物自連，以反式PCR擴(kuò)增。進(jìn)行三輪擴(kuò)增反應(yīng)，每一輪均使用前一輪的產(chǎn)物作為模版。最后得到的特異PCR特異產(chǎn)物連接到pGEM-T載體，克隆、測序。使用的引物包括5-1a，5-2，5-3，5-4，5-5，5-6，5-7，5-8，3-1b，3-2，3-3，具體引物序列見SEQ ID NO.3反式PCR引物表。
實(shí)施例2 蝴蝶蘭類黃酮-3’5’-羥化酶基因的拷貝數(shù)分析 用CTAB法抽取蝴蝶蘭基因組，取10μgDNA分別用Bgl II，EcoR V和Hind III三種市售的酶進(jìn)行消化，37℃酶切過夜。以0.8％瓊脂糖凝膠將酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離。轉(zhuǎn)移DNA并固定于尼龍膜上。探針雜交確定其為但拷貝。(見圖1) 實(shí)施例3 蝴蝶蘭類黃酮-3’5’-羥化酶基因在矮牽牛植株中的真核表達(dá)及轉(zhuǎn)基因植株的表型鑒定。
1表達(dá)載體的構(gòu)建。首先擴(kuò)增出完整編碼閱讀框，并在正反向引物上分別引入限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)(視選用的載體而定)，以便構(gòu)建表達(dá)載體。以實(shí)施例1中獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將蝴蝶蘭類黃酮-3’5’-羥化酶基因正向克隆到載體p2301中。
2轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌。制備農(nóng)桿菌感受態(tài)，利用熱激轉(zhuǎn)化法將質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌。
3農(nóng)桿菌葉盤法轉(zhuǎn)化矮牽牛。
(1)矮牽牛葉片切成0.8×0.8cm(1cm)方塊，放進(jìn)含農(nóng)桿菌的MSO液中，190rpm搖床，10min。
(2)吸干葉片放在加蓋一層濾紙的MS1上，封口膜封好，22℃暗培養(yǎng)。
(3)洗菌，吸干多余水分，轉(zhuǎn)移至MS2(葉片背面朝下)。
(4)光照培養(yǎng)，愈傷組織形成，20d分化芽。
(5)轉(zhuǎn)生根培養(yǎng)基，2～7d生根。
(6)組培苗移栽入土，溫室培養(yǎng)。(見圖6) 4轉(zhuǎn)基因矮牽牛花瓣花色素苷的測定 花色素苷的提取 (1)準(zhǔn)備液氮，研缽和鑷子。將編好號的離心管稱重。
(2)將花瓣放入液氮中研磨充分，移入離心管中，稱重。
(3)每管加入1ml配制好的酸性甲醇(甲醇∶HCl＝24∶1)，在振蕩器上充分振蕩，花瓣碎塊分散。
(4)4℃，100rpm，搖床振搖2天，其間在振蕩器上振蕩兩次。
花色素苷的測量 (1)取振搖液800μl稀釋至2ml。
(2)用分光光度計分別測量A530和A657的吸光度。
(3)計算花色素苷含量(U/g)。
不同樣品編號的具體結(jié)果見表1和表2所示(轉(zhuǎn)基因植株花色素含量與花色表型鑒定比較) 表1 轉(zhuǎn)基因矮牽牛花瓣花色素苷的提取測量平均值 WT為野生型，其花色素苷含量(U/g)經(jīng)測處于6-8之間；低于5為偏低，如樣品1，25-4；高于10為偏高，如樣品25-2。
表2 轉(zhuǎn)基因矮牽牛花色素含量變化與花色深淺關(guān)系統(tǒng)計
序列表
SEQ ID NO.1
1GCATGAACATCCTTCCTTCTGCTTATTCAAACTGCTGCAACTGCGCCAAAA
52 ATACTTAGTTGTTAAATATAAAAAATTTAAAGAAAATGATTTTTGATCGAA
103 AATATAAGAAAATGTAATTCTATTTTAAAATATCCAATTTTTAAAATGCCC
154 ATCACTCGACCTATATAAAACGCAGAACGAAATACTCCCGATCATCACAGA
205 ACCATGTCCATCTTCCTCATCGCAACCCTCTTCCTCTCTCTTTCCCTCCAC
256 CTCCTACTCCGCCGCTTCCGCCGCCGCCGCCGCATCCTCCCCCTCCCTCCC
307 GGACCCCTCAACTTCCCCATCGTCGGCGCACTCCCCTTCATCGGCTCCATG
358 CCCCACTCAGGCCTCGCCCTCCTCTCCCGCCGCTACGGCCCCATTATGTTC
409 CTCAAAATGGGCATCCGCCAAGTGGTCGTCGCCTCCTCCTCCTCCGCCGCA
460 CGCTCCTTTCTCAAAACTCACGACTCCCGCTTCTCCGACCGCCCTCTCGAC
511 ATCATCTCGAAGCAAGTCAGCTACAACGGCCAGAACATGGTCTTCGCCGAC
562 TACGGTCCCAAGTGGAAGCTCCTCCGCAAAGTCTCCAATCTCCATCTCTTT
613 GGCCCCAAGGCCATGTCCCGTTGGGCCGACGTGCGGCGGGACGAAGCTTTC
664 TCCATGTCCCACTTCCTGAAGAAACAGAGCGATTCCAAAAACCCTGTTTTG
715 CTTTCCAACTTGCTGGTTTGTTCCATGGCGAATGTGATTGGGAGAATTTCG
766 ATGAGCAAGAGGGTGTTCGATGAGGAGGGGAAGGAGGCGAAGGAGTTTAAG
817 GAGATAATTAAGGAGCTTTTGGTCGGGCAGGGGGCTTCGAATATTGGGGAT
868 TTGGTGCCGGCGATGAGGTGGCTGGATCCGCAGGGGGCGAGGAAGAAGCTG
919 CTGGGATTGAATCAGAGGTTTGTTAGGATGATAAGTAAGTTCTTGGCGGAG
970 CACGGTGAGAGTAGAGGGGAGCGGGAGGGGAATCCTGATCTGCTTGATCTT
1021 ATTGTGGCTGATAAGATCGCCGGCGACGACGGGGAAGGGCTTTCTGAGGAG
1072 AACATCAAGGGCTTCATATCTGATCTATTCGTGGCGGGCACAGACACATCC
1123 GCTATGGTCATCGAGTGGGCGATGGCTGAGATGCTAAAAAATCCGGCGATC
1174 CTCCGCCGAGTACAGGAAGAAACCGACCGCATCGTCGGCCGCGATCGCCTT
1225 CTCGAAGAATCCGACATACCAAATCTCCCCTACCTCCAAGCCATATGCAAG
1276 GAAGCTCTGCGCAAGCATCCCCCAACTCCTCTCAGCATACCTCACTACGCT
1327 AGCGAGCCCTGCGAGGTAGAAGGTTACCACATTCCCGGCAAGACCTGGCTT
1378 TTGGTCAACATATGGGCCATCGGGCGAGACCCAGAGGTGTGGGAGAAGCCA
1429 TTGGAGTTCGATCCGGAGAGGTTTATGGAAGGGAAGATGGCGAGGATTGAT
1480 CCGATGGGGAACGATTTTGAGCTGATACCGTTCGGCGCTGGGAGGAGGATT
1531 TGCGCGGGGAAGTTGATGGGGATGGTTATGGTGCAGTACTTTTTGGGAGTG
1582 TTGGTGCAGGGTTTTGACTGGAGTTTGCCGGAAGGGGTGGTGGAGCTGGAC
1633 ATGGAGGAGGGGCCGGGATTGGTGTTGCCGAAGGCGGTGCCGCTGTTGGTG
1684 ACGGCGAGGCCGCGGCTGCCGGCGGCGGCGTATGGGGTTGTTTGATAAAGG
1735 AGAGTTTTTTCTAGTTTATGTACTGCGTGTTAAGAGTTTTGAATAATGAAT
1786 AATTAATCTATTTCGATGTAAAAAAAAAAAAAA
SEQ ID NO. 2
MSIFLIATLFLSLSLHLLLRRFRRRRRILPLPPGPLNFPIVGALPFIGSMPHSGLALLSRRYGPIMFLKMG
IRQVVVASSSSAARSFLKTHDSRFSDRPLDIISKQVSYNGQNMVFADYGPKWKLLRKVSNLHLFGPKAMSRWAD
VRRDEAFSMSHFLKKQSDSKNPVLLSNLLVCSMANVIGRISMSKRVFDEEGKEAKEFKEIIKELLVGQGASNIG
DLVPAMRWLDPQGARKKLLGLNQRFVRMISKFLAEHGESRGEREGNPDLLDLIVADKIAGDDGEGLSEENIKGF
ISDLFVAGTDTSAMVIEWAMAEMLKNPAILRRVQEETDRIVGRDRLLEESDIPNLPYLQAICKEALRKHPPTPL
SIPHYASEPCEVEGYHIPGKTWLLVNIWAIGRDPEVWEKPLEFDPERFMEGKMARIDPMGNDFELIPFGAGRRI
CAGKLMGMVMVQYFLGVLVQGFDWSLPEGVVELDMEEGPGLVLPKAVPLLVTARPRLPAAAYGVV
SEQ ID NO.3
兼并引物
F5’-GCC ATG GC(A/G/C)AA(C/T)ATG(A/T)T(A/C)GG-3’
R5’-CTC T(T/C)C C(A/G)A T(T/G/A)G CCC ATA TG-3’。
RACE引物系列表
反式PCR引物表
權(quán)利要求
1.一種分離出的類黃酮-3’5’-羥化酶基因，其特征在于為具有特定序列的DNA分子，包含兩個長分別為885bp和636bp的外顯子，及兩個外顯子之間長為213bp的內(nèi)含子，其核苷酸序列為SEQ ID NO.1。
2.一種由如權(quán)利要求1所述的類黃酮-3’5’-羥化酶基因編碼的蛋白質(zhì)分子，其特征在于長507個氨基酸殘基，其氨基酸序列為SEQ ID NO.2。
3.一種用于檢測樣品中蝴蝶蘭類黃酮-3’5’-羥化酶基因拷貝數(shù)的方法，其特征在于使用如權(quán)利要求1所述核苷酸序列SEQ ID NO.1對蝴蝶蘭基因組DNA樣品進(jìn)行southern雜交，然后檢測目的片段的有無，樣品為蝴蝶蘭的基因組DNA，經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后的核苷酸片段。
4.用于調(diào)取獲得蝴蝶蘭樣品中類黃酮-3’5’-羥化酶基因核苷酸引物序列，包括根據(jù)權(quán)利要求1所述類黃酮-3’5’-羥化酶基因家族保守區(qū)域設(shè)計的兼并引物，一系列RACE引物和反式PCR引物，這些引物序列如SEQ ID NO.3所示。
5.一種將如權(quán)利要求1所述的編碼具有蝴蝶蘭類黃酮-3’5’-羥化酶基因的核苷酸序列轉(zhuǎn)入矮牽牛以改變花色的方法，具體步驟如下
(1)將編碼蝴蝶蘭類黃酮-3’5’-羥化酶基因的核苷酸序列SEQ ID NO.1可操作的連接于植物表達(dá)載體，形成含有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的載體；
(2)將步驟(1)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，并將菌液與矮牽牛葉片混合培養(yǎng)；
(3)通過抗生素篩選，PCR鑒定，獲得轉(zhuǎn)化細(xì)胞并再生轉(zhuǎn)基因植株。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)、基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種在蝴蝶蘭中表達(dá)的類黃酮-3'5'-羥化酶基因的核苷酸編碼序列及其在改變花色方面的應(yīng)用。本發(fā)明涉及包含上述基因的重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)基因植株，獲得此基因的核苷酸引物系列，用于檢測內(nèi)源表達(dá)模式的寡核苷酸序列探針，以及對蝴蝶蘭此內(nèi)源基因的表達(dá)模式進(jìn)行分析鑒定的方法。將本發(fā)明所說基因轉(zhuǎn)入矮牽牛，所獲得的轉(zhuǎn)基因植株類黃酮-3'5'-羥化酶基因發(fā)生差異表達(dá)，進(jìn)而影響其花色的深淺。
文檔編號C12N15/52GK101165186SQ20071004651
公開日2008年4月23日 申請日期2007年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月27日
發(fā)明者鳳 明, 王敬文, 劉啟昆, 石金磊 申請人:復(fù)旦大學(xué)