專利名稱：基于Phi BT1整合酶及Phi C31整合酶的基因克隆質(zhì)粒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)和基因治療技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于Phi BT1整合酶及Phi C31 整合酶的質(zhì)粒(pBCFX+和pBCFX-)及其基因克隆方法和應(yīng)用。
技術(shù)背景基因操作是現(xiàn)代生物科學(xué)與生物技術(shù)的基礎(chǔ)。使用特定的限制序列，同源序列進(jìn)行基 因操作為目前廣泛應(yīng)用的基因操作方法。但是隨著基因操作發(fā)展，上述技術(shù)表現(xiàn)出了一系 列的問題。如使用限制酶技術(shù)，在操作基因的過程中一旦遇到基因內(nèi)部具有對應(yīng)的位點(diǎn)就 會使基因操作變得十分復(fù)雜甚至變得不可能。另外，實(shí)驗(yàn)室配置大量繁雜的內(nèi)切酶也影響 了實(shí)驗(yàn)室的操作成本及效率。大量低效率和特別反應(yīng)條件的限制酶使得實(shí)驗(yàn)變得更加復(fù)雜 和低效。同源重組技術(shù)在近年來也開始用于基因操作領(lǐng)域，從早期在基因knockout技術(shù)中的應(yīng) 用到最近用于基因文庫的構(gòu)建，多個(gè)方面均具有應(yīng)用價(jià)值。但是在廣泛的基因操作領(lǐng)域， 為了包裝基因的忠實(shí)性， 一般采用重組缺陷的細(xì)胞作為宿主，從而使得該技術(shù)的應(yīng)用與目 前的主流操作平臺不相容。并且依賴同源重組的效率以及可能的非預(yù)期重組限制了該技術(shù) 的廣泛應(yīng)用。位點(diǎn)特異性噬菌體整合酶可以位點(diǎn)特異性的轉(zhuǎn)移基因片段，因?yàn)榭赏岣呋蛑委煹?安全性而被引入基因操作領(lǐng)域。較早使用的噬菌體C31整合酶和最近報(bào)道的噬菌體BT1 整合酶都在疾病模型生物和細(xì)胞水平表現(xiàn)出較好的應(yīng)用前景。在自然情況下，噬菌體位點(diǎn) 特異性整合酶作用于兩個(gè)分別含有attP和attB的分子，結(jié)果是造成噬菌體環(huán)狀分子插入宿 主基因組。在基因治療和轉(zhuǎn)基因的操作中也可以采用類似的操作把含有目的基因的環(huán)狀分 子插入宿主基因組。但是在體外基因操作體系中，更常見的情況是把一個(gè)線性分子插入基 因組中，然后再完成其它操作。使用單一的噬菌體位點(diǎn)特異性整合酶對于該情況就變得十 分困難。聯(lián)合使用和先后使用不同的噬菌體整合酶及其對應(yīng)的位點(diǎn)，理論上可以建立定向 克隆線性目的基因到載體基因組的目的。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是設(shè)計(jì)并制備基于Phi BT1整合酶及Phi C31整合酶及其對應(yīng)ATT位點(diǎn) 的質(zhì)粒(pBCFX+和pBCFX-)基因操作體系和應(yīng)用。本發(fā)明提供聯(lián)合使用Phi BT1整合酶及 Phi C31整合酶對應(yīng)的att位點(diǎn)制作質(zhì)?；蜉d體(pBCFX+和pBCFX-)克隆位點(diǎn)和目的基因 識別序列接頭的方法與應(yīng)用。使用本發(fā)明進(jìn)行基因操作可以避免基因內(nèi)在限制性位點(diǎn)對基因操作的干擾限制，同時(shí) 本操作體系比傳統(tǒng)的限制連接體系具有簡單快速的優(yōu)點(diǎn)，并且可以操作大片段序列。本發(fā)明提出的上述體系制備與應(yīng)用具體如下1、 制備含Phi BT1整合酶及Phi C31整合酶對應(yīng)att克隆位點(diǎn)的質(zhì)粒(pBCFX+和 pBCFX-);以pBCPB為模板，用Sal I切除phi C31整合酶特異性attB;制備線性質(zhì)粒骨架；用 引物1 (SEQ Nsl)和引物2 (SEQNq2)從Phi BT中擴(kuò)增含有Phi BT特異性attP的序歹u， 并且用SalI酶切，制備phiBTattP插入序列。將線性質(zhì)粒骨架與phi BT attP插入序列用 T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化細(xì)菌并抽取質(zhì)粒，測序確定質(zhì)粒中phiBTattP插入序列的方向，以插 入方向不同可以形成含兩個(gè)phi BT attP插入序列的載體，正向插入的為pBCFX+(SEQ 和反向插入的為pBCFX-(SEQ 。2、 在pBCFX+禾卩pBCFX-定向插入目的DNA片段在目的DNA片段希望插入方向5、通過PCR引物附加PhiC31整合酶特異性attB核心 序列(SEQW5) ,3、則按照使用pBCFX+和pBCFX-不同，分別使用Phi BTl attB核心序 列正反向附加序列(SEQW26, SEQW7)引物，在引物3'端為目的基因特異性序列。使用 上述引物擴(kuò)增的目的基因可以與pBCFX+禾卩pBCFX-在phi C31整合酶和Phi BT整合酶作 用下發(fā)生定向框架交換，插入目的基因的克隆可以用藍(lán)白篩選獲得。


圖1: pBCFX+結(jié)構(gòu)圖。其中fl(+)ori :135-441 ;phiBTlattP: 515-736 ;LacZ : 764-4265 ;phiC31 attP: 4260-4489;LacZ promotor: 4576-4693;pUCori: 4917-5584;ChloR+: 5905-6561.箭頭代表元件方向圖2: pBCFX-結(jié)構(gòu)圖。其中fl(+)ori: 135-441; phiBTl attP : 515-736; LacZ: 764-4265; phiC31 attP: 4260-4489; LacZ promotor: 4576-4693; pUCori: 4917-5584; ChloR+: 5卯5-6561. 箭頭代表元件方向具體實(shí)施方式
1、 制備含Phi BT1整合酶及Phi C31整合酶對應(yīng)ATT克隆位點(diǎn)的質(zhì)粒(pBCFX+和 pBCFX-)載體(1)制備質(zhì)粒骨架反應(yīng)體系(pBCPB+ 10ug(5ul)， Sal I 5u (Bio lab. lul)， 10X Sal I buffer 5ul(Bio lab.)， H20 39ul) 37°C 12h,采用Qiagen PCR extract kit純化(反應(yīng)物加PB Buffer (Qiagen) 500ul并混勻，混合物加到PCR extract column (Qiagen) 1200rpm離心lmin， 用0.5ml PE buffer (Qiagen) 1200rpm離心lmin清洗一次，再1200rpm離心lmin —次，PCR extract column加50ul Elute buffer (Qiagen)， 1200rpm離心lmin洗脫)收集產(chǎn)物為質(zhì)粒骨 架。(2)制備PhiBTl特異性attP片段PCR體系(引物(SEQW2l;SEQMb2)， Pfu DNA polymerase lu(lul, Sagon), Pfu DNA polymerase buffer 5ul (Sagon), Phi BT基因組DNA lul, H20 39ul) ,PCR循環(huán)(94°C lmin, 94°C 30sec-55°C 30sec-72。C lmin循環(huán)25次，72°C 5min),產(chǎn)物用Qiagen PCR extract kit純化(如上述)；酶切(PCR純化產(chǎn)物44ul， Sal I 5u (Bio lab. lul), 10X Sal I buffer 5ul(Bio lab.)， 37°C 12h)，采用Qiagen PCR extract kit純化(如上述) 獲得Phi BT特異性attP片段。(3) 連接如l)制備的質(zhì)粒骨架4ul，如2)制備的PhiBTl特異性attP片段4ul， T4 ligase lul (Bio Lab.), 10X T4 ligase buffer lul, 16°C, 12h。(4) 轉(zhuǎn)化與質(zhì)粒抽提連接產(chǎn)物用分子克隆所提供的常規(guī)方法轉(zhuǎn)化DH5 alpha感受態(tài) 細(xì)胞，篩選陽性(抗氯霉素)克隆10個(gè)，使用分子克隆所描述的常規(guī)方法抽提相應(yīng)的質(zhì) 粒。(5) 質(zhì)粒測序鑒定采用引物1和引物2作為引物對上述質(zhì)粒在ABI3700上測序分 析，所得序列結(jié)果常規(guī)作Blastn分析確定插入序列(Phi BTl特異性attP片段)方向，正 向插入為載體質(zhì)粒pBCFX+，反向插入為載體質(zhì)粒pBCFX-。2、 在pBCFX+和pBCFX-定向插入目的DNA片段(1)5、引物合成按常規(guī)方法設(shè)計(jì)基因特異性引物，在設(shè)計(jì)的基因特異性引物5'附加
序列(SEQW5)，常規(guī)合成引物。(2)3'引物合成按常規(guī)方法設(shè)計(jì)基因特異性引物，在設(shè)計(jì)的基因特異性引物3'附加 序列(SEQW6， pBCFX+; SEQW7，pBCFX-)，常規(guī)合成引物。(3)制備插入目的基因片段使用上述1)/2)所描述的引物和適當(dāng)?shù)哪０澹珼NA聚合 酶以及PCR條件常規(guī)擴(kuò)增插入片段，采用QiagenPCR extract kit純化(同上述)。(4)框架交換維持pBCFX+或pBCFX-與插入片段的分子數(shù)約1:1，每種分子質(zhì)量 不少于100ng，在50 ul整合酶反應(yīng)物(50 mM glycine-NaOH, pH 8.5, 100 mM KC1, 10 mM DTT， 0.01 % bovine serum albumin, and 0.1 <DC31 integrase禾卩0.1 |aM OBTl integase) 22 'C作用30 min -12h。也可以常規(guī)用插入片段與pBCFX+或pBCFX-以及OC31 integrase和 OBTl共轉(zhuǎn)染實(shí)現(xiàn)框架交換。(5)陽性克隆篩選10ul框架交換產(chǎn)物常規(guī)轉(zhuǎn)化DH5 alpha感受態(tài)細(xì)胞，涂布含X-gal 和氯霉素的LB細(xì)菌培養(yǎng)板，37'C生長12-20h，常規(guī)藍(lán)白篩選陽性克隆。含插入片段的克隆 由于丟失LacZ而表現(xiàn)為白色克隆，常規(guī)抽提質(zhì)粒繼序列測定確定重組子的正確性。 本發(fā)明所涉及的序列 SEQ. Nsl:ACGCGTCGACATGCTGGCGCCGGACGGG SEQ.他2:ACGCGTCGACCGCGCGTACAGGAAGACG SEQ. Ns3:<image>image see original document page 8</image>TCGAGATTTTCAGGAGCTAAGGAAGCTAAAATGGAGAAAAAAATCACTgGAATGGAGAAAAAAATCACTGGATATAC<formula>formula see original document page 10</formula><formula>formula see original document page 11</formula><formula>formula see original document page 12</formula> TTTCCCCGAAAAGTGCCAC SEQ. Ns5:CCGCGGTGCGGGTGCCAGGGCGTGCCCTTGGGCTCCCCGGGCGCGTACTCC SEQ. N26:
權(quán)利要求
1、一種含Phi BT1整合酶和Phi C31整合酶對應(yīng)att克隆位點(diǎn)的質(zhì)粒，包括pBCFX+和pBCFX-，前者序列為SEQ №3，后者序列為SEQ №4。
2、 一種制備Phi BT1整合酶和Phi C31整合酶對應(yīng)att克隆位點(diǎn)的質(zhì)粒的方法，具體 步驟如下以pBCPB為模板，用Sal I切除phi C31整合酶特異性attB;制備線性質(zhì)粒骨架；用 SEQ Nsl引物1和SEQ Na2引物2從Phi BT中擴(kuò)增含有Phi BT特異性attP的序列，并且 用Sal I酶切，制備phi BT attP插入序列；將線性質(zhì)粒骨架與phi BT attP插入序列用T4連 接酶連接，轉(zhuǎn)化細(xì)菌并抽取質(zhì)粒，測序確定質(zhì)粒中phiBTattP插入序列的方向，以插入方 向不同可以形成含兩個(gè)phiBTattP插入序列的載體，正向插入的為pBCFX+，序列為SEQ W23，反向插入的為pBCFX-，序列為SEQW24。
3、 一種如權(quán)利要求1所述質(zhì)粒的應(yīng)用，在所述質(zhì)粒pBCFX+和pBCFX-定向插入目的 DNA片斷，具體步驟如下在目的DNA片段希望插入方向5'通過PCR引物附加PhiC31整合酶特異性attB核心 序列SEQ 3、則按照使用pBCFX+禾卩pBCFX-不同，分別使用Phi BT1 attB核心序列正 反向附加序列SEQJ^6和SEQW7引物，在引物3'端為目的基因特異性序列；使用上述引 物擴(kuò)增的目的基因與pBCFX+和pBCFX-在phi C31整合酶和Phi BT整合酶作用下發(fā)生定 向框架交換，插入目的基因的克隆用藍(lán)白篩選獲得。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術(shù)和基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于Phi BT1整合酶及Phi C31整合酶的基因克隆質(zhì)粒(pBCFX+和pBCFX-)及其應(yīng)用。該質(zhì)粒使用含有Phi BT1整合酶及PhiC31整合酶對應(yīng)attP位點(diǎn)串連序列的中間插入LacZ表達(dá)框架作為質(zhì)粒載體(pBCFX+和pBCFX-)置換克隆位點(diǎn)，采用插入失活作藍(lán)白篩選。基于該質(zhì)粒的克隆方法主要包括使用PhiBT1整合酶及Phi C31整合酶混合物作為定點(diǎn)整合催化酶，插入DNA片段依據(jù)目的要求可以通過PCR等技術(shù)在兩側(cè)附加對應(yīng)的attB序列，從而決定插入片段方向性。該克隆體系可以方便操作含有特別內(nèi)切酶位點(diǎn)的插入DNA，在大片段基因操作方面有獨(dú)到優(yōu)勢，因?yàn)樵擉w系不需要限制性酶，磷酸酶和連接酶操作，可以簡化重組DNA操作方法。在基因工程中有廣泛應(yīng)用前景。
文檔編號C12N15/63GK101157934SQ20071004617
公開日2008年4月9日 申請日期2007年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月20日
發(fā)明者姚紀(jì)花, 李智慧, 聆 田, 薛京倫, 陳金中 申請人:復(fù)旦大學(xué)