專利名稱：一種基于人重組凝血活酶的液體型pt試劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到液體型PT試劑的制備方法，該方法還包括PT 試劑的主要組成部分，人重組凝血活酶在酵母細(xì)胞中的表達(dá)和純化。
背景技術(shù)：
凝血酶原時間(PT)是檢查外源性凝血因子的一種過篩試驗，自1935年此測定方法 創(chuàng)建以來，迄今它仍然是檢查外源凝血系統(tǒng)諸因子及相關(guān)抑制物的重要篩選試驗，是目前 口服抗凝劑治療的主要監(jiān)測手段，也是外科手術(shù)前病人凝血功能的一項重要檢査指標(biāo)。PT測定受多種條件的影響，其臨床檢測的標(biāo)準(zhǔn)化問題日益突出，由于采用不同來源 的組織凝血活酶試劑，可使同一標(biāo)本測定出的凝血酶原時間及其與正常對照的比值相差很 大，致使結(jié)果失去科學(xué)性。為了使同一份標(biāo)本用各種不同的凝血活酶試劑檢測出的PT結(jié) 果具有可比性，國際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(ICSH)和國際血栓與止血委員會(ICTH)推薦 將國際標(biāo)準(zhǔn)化比率(international normalizedratio， INR)作為PT的報告方式，商品 化PT試劑需要提供其國際敏感指數(shù)(International Sensi,tivity Index, ISI)值，1996 年美國的NCCLS也發(fā)表了編號為H47-A的有關(guān)PT測定規(guī)范化的文件。PT試劑的質(zhì)量是影響PT測定標(biāo)準(zhǔn)化的關(guān)鍵因素，長期以來，試劑中的主要組成成 分，凝血活酶多是從兔腦組織中提取而來，如Instrumentation laboratory、 Diagnostia Stago、 上海太陽、陜西方舟等公司的PT試劑，也有的來源于人胎盤，如Dade Behring公司的 PT試劑，而且，為了確保試劑的穩(wěn)定性，都制成凍干品，需要復(fù)溶，不能避免各實驗室 水質(zhì)量問題或體積誤差給測定結(jié)果帶來的偏差。由于組織提取物中所含的凝血活酶濃度不 同，對抗凝藥物所致凝血因子缺乏的反應(yīng)敏感度也就不同，所以生產(chǎn)的PT試劑普遍存在 產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定、敏感性差的問題，致使檢測結(jié)果不穩(wěn)定，不同的臨床檢驗實驗室之間測 得的結(jié)果難以比較，盡管采用WHO標(biāo)準(zhǔn)參照品，但仍難以把誤差降低到可接受的水平。減小實驗室間測定差異的一種有效方法是統(tǒng)一凝血活酶的生物結(jié)構(gòu)和蛋白組成，人源 重組型的凝血活酶分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、蛋白均一，更重要的是，以其為原料制成的PT試劑對 凝血因子具有極高的敏感性，研究表明，重組凝血活酶對維生素K依賴的因子的微小缺乏 具有極高的敏感性，尤其對因子II、 VH的缺乏非常敏感，它能放大因子的微小缺乏造成的 PT結(jié)果差異，而且準(zhǔn)確性好，從而可提高PT試劑的質(zhì)量，因此是臨床檢驗上的新一代標(biāo)準(zhǔn) 化試劑。目前，涉及到利用人重組凝血活酶制備PT試劑的專利中，凝血活酶都來自于大腸桿 菌的表達(dá)，且非全長蛋白，已有研究證實，其活性不及完整凝血活酶分子。與大腸桿菌相 比，酵母非常有利于真核基因的表達(dá)，能有效克服大腸桿菌系統(tǒng)缺乏蛋白翻譯后加工、正 確修飾與折疊的不足。如復(fù)旦大學(xué)的發(fā)明專利"重組可洛性組織因子及其制備方法和應(yīng)用"提供了凝血活酶可溶性胞外部分在大腸桿菌JF1125中的表達(dá)方法，過程繁瑣，產(chǎn)物均一 性和活性都不夠理想，這就是因為在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白質(zhì)不能進(jìn)行正確的折疊從而以 包涵體的形式存在；太原博奧特生物技術(shù)有限公司的發(fā)明專利"人重組組織因子的構(gòu)建表 達(dá)、純化方法及其應(yīng)用"提供了缺失胞內(nèi)區(qū)的截斷型凝血活酶在大腸桿菌MM294中的表 達(dá)方法，也是因為大腸桿菌中難以表達(dá)具有完全活性的完整復(fù)雜蛋白質(zhì)分子，發(fā)酵物需經(jīng) 高壓勻漿、離子交換和抗體免疫親和層析等步驟獲得產(chǎn)物。美國生命掃描有限公司在中國 申請的專利"一種基于組織因子的凝血酶原時間試劑的制備方法"中提供了凝血活酶/磷 脂泡囊混合物的制備方法，該方法還需要另外篩選用于去除混合物中去污劑成分的樹脂， 然后再過濾除去樹脂，過程不夠簡便，最終制成的PT試劑是包被于試紙條上對血液樣本 實現(xiàn)檢測的。發(fā)明內(nèi)容(一) 發(fā)明目的本發(fā)明的目的是提供一種在真核細(xì)胞甲醇酵母中表達(dá)完整凝血活酶分子的方法，進(jìn)而 制備高穩(wěn)定性的液體型PT試劑，最終目的是將應(yīng)用該方法制成的檢測試劑在臨床檢驗上 廣泛應(yīng)用，使PT檢驗實現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化。(二) 發(fā)明的優(yōu)勢本發(fā)明中表達(dá)的人凝血活酶來自于真核細(xì)胞，無包涵體形成，不需對蛋白進(jìn)行變性和 復(fù)性，蛋白分子結(jié)構(gòu)完整，只需一步純化即可獲得高純度、.高活性的凝血活酶；基于該凝 血活酶的液體型PT試劑的制備在臨床應(yīng)用中的優(yōu)勢具體表現(xiàn)在使用方便，不需復(fù)溶， 避免各實驗室使用蒸餾水不同，復(fù)溶體積不準(zhǔn)確而造成的測定偏差，且穩(wěn)定性強(qiáng)，開瓶后 37'C能穩(wěn)定30天以上，既避免了因剩余試劑忘記放回冰箱而造成的測值變化，又有利于 夏季的高溫運輸。(三) 發(fā)明內(nèi)容詳述本發(fā)明包括重組質(zhì)粒的構(gòu)建，酶分子的誘導(dǎo)表達(dá)與純化，和液體型PT的制備。 從人胎盤組織中獲取總RNA，根據(jù)GeneBank中人凝血活酶分子的核苷酸序列設(shè)計 帶有6個組氨酸標(biāo)簽、酶切位點以及終止密碼子的PCR引物，通過RT-PCR方法獲得人 凝血活酶基因。將此基因與酵母表達(dá)質(zhì)粒pPIC9連接，得到重組表達(dá)質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)Sal I線性化后采用電穿孔方法轉(zhuǎn)化入酵母細(xì)胞GS115，首先在MD平板 上篩選含有外源基因的表達(dá)菌株，將其轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)，以甲醇誘導(dǎo)表達(dá)外源蛋白。高表達(dá) 菌株的篩選首先采用immunodotblot方法， 一抗為本公司生產(chǎn)的鼠抗人p32， 二抗為本公 司生產(chǎn)的anti-p32HRP，經(jīng)TBST禾B TBS洗滌后，DAB顯色(顯色底物為本公司生產(chǎn))， 根據(jù)PVDF膜上的印跡選擇出外源蛋白表達(dá)量高的部分克隆。而后結(jié)合凝血活酶活性測定 方法篩選出高表達(dá)菌株。菌生長用BMGY培養(yǎng)基，由1%酵母提取物、2%蛋白胨、1%甘 油、3g/L K2HP04、 11.8 g/L KH2P04、 1.34%YNB和4xlO、Biotin組成，24小時后換成 BMMY培養(yǎng)基，由P/。酵母提取物、2o/。蛋白胨、3g/LK2HP04、11.8 g/L KH2P04、 1.34°/。YNB、 4xlO、Biotin和0.5%甲醇組成，在48小時后補(bǔ)入3%甲醇，72小時后收獲菌體，破碎細(xì) 胞釋放出其中的凝血活酶。蛋白的純化是利用表達(dá)蛋白連接的組氨酸標(biāo)簽，直接將上述粗提液進(jìn)行鎳柱層析，采用pH7.4含0.5mol/LNaCl的0.02 mol/L磷酸鈉緩沖液、含0.3 mol/L 咪唑的上述緩沖液分步洗脫，最后用含0.5mol/L咪唑的上述緩沖液洗柱，收集蛋白，使 用紫外分光光度計測定吸光值測蛋白濃度，用SDS-PAGE方法鑒定蛋白純度，結(jié)果，經(jīng) 上述層析后可獲得純度達(dá)95%以上的人凝血活酶。將獲得的凝血活酶溶液進(jìn)行透析，以除去其中所含的咪唑并進(jìn)行稀釋，而后與含有磷 脂(Sigma公司產(chǎn)品)的pH7.4 10mmol/L的Tris-Cl按比例混合，再加入PTF-G溶液(本 公司設(shè)計)，混合均勻，制成液體型PT試劑。經(jīng)測定，本發(fā)明方法生產(chǎn)的試劑PT時間10.7-14.3s， ISI值為l.O土O. 1，重復(fù)實驗的 變異系數(shù)不超過5%，批間差的變異系數(shù)不超過8%，試劑在2-8'C穩(wěn)定期長于24個月， 開瓶后37'C仍穩(wěn)定30天以上。
具體實施方式
實施例1重組質(zhì)粒的構(gòu)建與表達(dá)從人胎盤組織中獲取總RNA，根據(jù)GeneBank中coagulation factor III的核苷酸序列(圖 l)設(shè)計PCR上游引物MF3和下游引物MR2:MF3: 5、- CCGCTCGAGAAAAGATCAGGCACTACAAATACTGCGGC -3、 MR2:5、- GGCCTAGGTCAATGATGATGATGATGATGTGAAACATTCAGTGGGGA-3' MF3引物含有人凝血活酶C端數(shù)個氨基酸、Xhol酶切保護(hù)基和Xhol酶切位點，MR2 含有人凝血活酶N端數(shù)個氨基酸、AvrII酶切位點、終止子密碼和6個His密碼子。以總RNA為模板，通過RT-PCR方法獲得人凝血活酶基因。將此基因用上述兩個內(nèi) 切酶進(jìn)行處理，然后連接到質(zhì)粒pPIC9上，得到重組表達(dá)質(zhì)粒(圖2)。重組質(zhì)粒經(jīng)線性化后轉(zhuǎn)化酵母GS115，使用MIX平板初篩，PCR方法復(fù)篩，根據(jù)瓊 脂糖凝膠電泳中的目的條帶挑選外源基因拷貝數(shù)多的單克隆，轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基，甲醇誘導(dǎo) 表達(dá)外源蛋白。然后采用immunodotblot方法鑒定目的蛋白， 一抗為本公司生產(chǎn)的鼠抗人 p32， 二抗為本公司生產(chǎn)的anti-p32HRP，經(jīng)TBST禾13 TBS洗滌后，DAB顯色(顯色底物 為本公司生產(chǎn))，根據(jù)PVDF膜上的印跡選擇出外源蛋白表達(dá)量高的部分克隆。最后結(jié)合 凝血活酶活性測定方法篩選出高表達(dá)克隆。實施例2人凝血活酶的純化常規(guī)方法培養(yǎng)篩選出的高表達(dá)株，在48小時時補(bǔ)加3%甲醇以誘導(dǎo)外源蛋白。為避免 培養(yǎng)液成分對純化步驟的影響，簡化純化流程，外源蛋白設(shè)計成胞內(nèi)表達(dá)。離心收集菌體， 用含5%甘油和lmmol/L PMSF的pH7. 4 50mmol/L磷酸鈉緩沖液洗去殘留的培養(yǎng)液。高壓 勻漿破碎細(xì)胞，然后離心收集含目的蛋白的上清液，直接用Ni-NTA Agarose柱層析方法 純化目的蛋白。所用平衡液為含0. 5mol/LNaCl的pH7. 4 0. 02mol/L磷酸鈉緩沖液(Buffer B)，分步洗脫，上樣后依次用Buffer B、含0.3 mol/L咪唑的Buffer B洗去雜蛋白，最 后用含0.5 mol/L咪唑的Buffer B洗脫收集目的蛋白。此過程中上樣需要控制流速在 lml/min以下，以利于目的蛋白的充分結(jié)合。Ni-NTA Agarose層析柱清洗后可多次反復(fù)利用。蛋白濃度通過紫外分光光度計測定樣品稀釋液的280nm和260nm吸光值來計算，蛋 白純度通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，Pharmacia Inagemaster VDS掃描來確定。實施例3 PT試劑盒的制備1. PT試劑盒的組成成分磷脂化人凝血活酶(1%)，緩沖劑和穩(wěn)定劑(PTF-G).2. PTF隱G配方40mmol/LTris-HCl， pH7.0糖膠，終濃度4% 聚乙烯二醇，終濃度0.5% CaCl2，終濃度llmmoI/L, NaCl ，終濃度30mmol/L， 甘露醇，終濃度2% 疊氮鈉，終濃度0.1% 明膠，終濃度0.25%3. 檢測方法PT試劑37。C預(yù)熱20分鐘，取100W，待測血漿37。C孵育3分鐘，取5(^1，混勻后計時，使用Sysmex公司的CA-530血凝儀測定，記錄血漿凝固時間。4. 產(chǎn)品技術(shù)指標(biāo)1) 外觀無色透明液體。2) PT測量正常值范圍10.7 14.3秒。3) ISI值l.O土O. 05。 -4) 精密度檢測連續(xù)小量生產(chǎn)三批試劑盒，每批隨機(jī)抽取6瓶測定其PT，每瓶做10個重復(fù)，對測驗結(jié)果所做分析見下表S為標(biāo)準(zhǔn)偏差，X為平均值，誤差CV-S/X。批號均值(s) X標(biāo)準(zhǔn)偏差 S誤差 cv06081612. 230.181.5%瓶060910」11. 760.141.2%內(nèi)06101912.70.110.9%12.20.3953.2%批 間5)敏感性檢測包括肝素敏感性和乏因子血漿敏感性試驗。隨機(jī)抽取本發(fā)明制備的PT試劑一盒，分別對不同濃度肝素血漿進(jìn)行PT測試，對 照試劑購自DadeBerhing公司，測定結(jié)果統(tǒng)計學(xué)分析表明，本發(fā)明制備的試劑與Dade Berhing PT試劑對肝素化血漿測定有很好的相關(guān)性，Y =0.984。采用美國Fisher公司乏因子血漿(V、 VD、 VII、 IX、 X、 XI)，活性均小于1%， 分別用DADE試劑和本發(fā)明制備的試劑對每種乏因子血漿進(jìn)行PT測定，測定本發(fā)明試 劑與Dade Berhing PT試劑對乏因子血漿測定有較好相關(guān)性，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析Y = 0. 986，6說明對缺乏因子血漿測定兩試劑有很好的相關(guān)性。6)穩(wěn)定性檢測包括開封后穩(wěn)定性、模擬運輸條件穩(wěn)定性、未開封加速破壞試驗、 長時穩(wěn)定性試驗(含批間差及重現(xiàn)性分析)。開封后穩(wěn)定性實驗結(jié)果顯示，60天之內(nèi)正常質(zhì)控血漿測值在正常值范圍內(nèi)， 且變化不大，異常質(zhì)控血漿偏差在5%以內(nèi)，開封后置于25'C， 37'C條件下穩(wěn)定 30天以上，好于進(jìn)口試劑。高溫運輸條件下，IO天之內(nèi)正常質(zhì)控血漿測值在正常值范圍內(nèi)；異常質(zhì)控血 漿偏差在5%以內(nèi)，與進(jìn)口試劑相當(dāng)。37'C加速破壞條件下，正常質(zhì)控血漿測值在2個月保持基本穩(wěn)定，處于正常 值范圍；異常質(zhì)控血槳測值變化趨勢與正常質(zhì)控血漿基本相同，因此在37'C加速 破壞條件下，本試劑可以穩(wěn)定2個月以上，與進(jìn)口試劑穩(wěn)定性具有可比性。在4。C條件下產(chǎn)品貯存24個月時三批試劑的PT值一直穩(wěn)定處于正常范圍內(nèi)， 對24個月數(shù)據(jù)進(jìn)行重現(xiàn)性和批間差分析，4t條件下產(chǎn)品貯存同樣時間后(24個 月內(nèi))其批間差變異系數(shù)在0.5%-2.9%之間，符合標(biāo)準(zhǔn)條款PT試劑盒批間差變 異系數(shù)不應(yīng)超過8%的要求；其三批試劑的重現(xiàn)性分別為1.1%、 0.8%和0.8%， 符合標(biāo)準(zhǔn)條款PT試劑盒重現(xiàn)性的變異系數(shù)不應(yīng)超過5X的要求。4'C條件下產(chǎn)品貯 存24個月內(nèi)，異常質(zhì)控血漿測值偏差在2%以內(nèi)，低于5%，所以在產(chǎn)品貯存穩(wěn)定 期長于24個月。


圖1:人凝血活酶核苷酸序列和氨基酸序列 圖2:重組pPIC9-TF表達(dá)質(zhì)粒圖對以上各技術(shù)指標(biāo)的考察結(jié)果證明，本發(fā)明方法生產(chǎn)的試劑盒操作簡單、使用方便、 敏感性好，穩(wěn)定性強(qiáng)，與國外試劑盒具有可比性'適合臨床應(yīng)用'可作為新一代標(biāo)準(zhǔn)化PT試劑替代進(jìn)口試劑。人凝血活酶核苷酸序列和氨基酸序列:TCAGGCACTACAAATACTGTGGCAGCATATAATTTAACTTGGAAASerGlyThrThrAsnThrValAlaAlaTyrAsnLeuThrTrpLysTCAACTAATTTCAAGACAATTTTGGAGTGGGAACCCAAACCCGTCSerThrAsnPheLysThrlieLeuGluTrpGluProLysProValAATCAAGTCTACACTGTTCAAATAAGCACTAAGTCAGGAGATTGGAsnGinValTyrThrValGluIleSerThrLysSerGlyAspTrpAAAAGCAAATGCTTTTACACAACAGACACAGAGTGTGACCTCACCLysSerLysLysPheTyrThrThrAspThrGluCysAspLeuThrGACGAGATTGTGAAGGATGTGAAGCAGACGTACTTGGCACGGGTCAspGlulieValLysAspValLysGinThrTyrLeuAlaArgValTTCTCCTACCCGGCAGGGAATGTGGAGAGCACCGGTTCTGCTGGGPheSerTyrProAlaGlyAsnValGluSerThrGlySerAlaGlyGAGCCTCTGTATGAGAACTCCCCAGAGTTCACACCTTACCTGGAGGluProLeuTyrGluAsnSerProGluPheThrProTyrLeuGluACAAACCTCGGACAGCCAACAATTCAGAGTTTTGAACAGGTGGGAThrAsnLeuGlyGinProThrlieGinSerPheGluGlvValGlyACAAAAGTGAATGTGACCGTAGAAGATGAACGGACTmGTCAGAThrLysValAsnValThrValGluAspGlu.ArgThrLeuValArgAGGAACAACACTTTCCTAAGCCTCCGGGATGTTTTTGGCAAGGACArgAsnAsnThrPheLeuSerLeuArg.AspValPheGlyLysAspTTAATTTATACACTTTATTATTGGAAA'TCTTCAAGTTCAGGAAAGLeulieTyrThrLeuTyrTyrTrpLysSerSerSerSerGlyLysAAAACAGCCAAAACAAACACTAATGAGTTTTTGATTGATGTGGATLysThrAlaLysThrAsnThrAsnGluPheLeuIleAspValAspMAGGAGAAAACTACTGTTTCAGTGTTCAAGCAGTGATTCCCTCCLysGlyGluAsnTyrCysPheSerValGinAlaVallieProSerCGAACAGTTAACCGGAAGAGTACAGACAGCCCGGTAGAGTGTATGArgthrvalasnarglysS6rthraspserprovalglucysmetGGCCAGGAGAAAGGGGAATTCAGAGAAATATTCTACATCATTGGAGlyginglulysglygluphesrggluilephetyrileileglyGCTGTGGTATTTGTGGTCATCATCCTTGTCATCATCCTGGCTATAAlavalvalpheVEllvalileileleuvalileileleualaileTCTCTACACAAGTGTAGAAAGGCAGGAGTGGGGCAGAGCTGGAAGSerLeuHisLysCysArgLysAlaGlyValGlyGinSerTrpLysGAGAACTCCCCACTGAATGTTTCAGluAsnSerProLeuAsnValSer
權(quán)利要求
1.人重組凝血活酶的構(gòu)建表達(dá)方法，其特征是從人胎盤組織獲取RNA，通過PCR方法得到人凝血活酶基因，將其與酵母表達(dá)質(zhì)粒重組，線性化后轉(zhuǎn)化甲醇酵母GS115，篩選獲得穩(wěn)定高表達(dá)基因工程菌株，經(jīng)發(fā)酵誘導(dǎo)，得到含人凝血活酶的菌體。
2. 權(quán)力要求1所述人重組凝血活酶的構(gòu)建表達(dá)-方法，其特征是表達(dá)的重組凝血活酶包括胞外 區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)。
3. 權(quán)力要求1所述人重組凝血活酶的構(gòu)建表達(dá)方法，其特征是所述載體不限于特定的酵母表 達(dá)載體，只要可以與人凝血活酶cDNA連接，形成表達(dá)質(zhì)粒。
4. 權(quán)力要求1所述人重組凝血活酶的構(gòu)建表達(dá)方法，其特征是所述宿主細(xì)胞不局限于某種特 定的酵母細(xì)胞，只要能夠適合表達(dá)所述重組載體。
5. 權(quán)力要求1所述人重組凝血活酶的構(gòu)建表達(dá)方法，其特征是高表達(dá)菌株的篩選方法為 immunodot blot， 一抗為鼠抗人p32， 二抗為anti-p32 HRP，經(jīng)TBST和TBS洗滌后 DAB顯色，印跡的強(qiáng)弱可反映蛋白的表達(dá)量。
6. 權(quán)力要求1所述人重組凝血活酶的構(gòu)建表達(dá)方法，其特征是菌株表達(dá)的人重組凝血活酶由 甲醇誘導(dǎo)產(chǎn)生。
7. 權(quán)力要求2所述人重組凝血活酶，其純化方法是Ni-NTA Agarose柱層析，特征是層析柱 平衡液為含0.5mol/LNaCl的pH7.4 0.02mol/L磷酸鈉緩沖液(Buffer B)，分步洗脫， 上樣后依次用Buffer B、含0.3 mol/L咪唑的Buffer B洗去雜蛋白，最后用含0.5 mol/L 咪唑的Buffer B洗脫收集目的蛋白。
8. —種新型PT試劑盒，其特征是人重組凝血活酶經(jīng)脂化后，'與緩沖劑和穩(wěn)定劑混合制成液 體產(chǎn)品。
9. 權(quán)力要求8所述的PT試劑盒，其特征是緩沖劑和f定劑由4%糖膠，0.5%聚乙烯二醇， llmmol/LCaCl2， 30mmol/LNaCl ， 2%甘露醇，0.1%疊氮鈉，0.25%明膠組成。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，發(fā)明的目的在于解決PT測定的臨床標(biāo)準(zhǔn)化問題。PT試劑的質(zhì)量是PT實驗的關(guān)鍵影響因素，減少各實驗室測定結(jié)果差異的一種有效方法是統(tǒng)一試劑中凝血活酶的化學(xué)組成和生化特性，采用基因工程方法制備的重組凝血活酶分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、蛋白均一，可以提高實驗的敏感度、精密度、準(zhǔn)確度。本發(fā)明應(yīng)用酵母細(xì)胞表達(dá)全長人凝血活酶，一步純化即可獲得高純度、高活性的目的蛋白，發(fā)明中還提供了基于重組型凝血活酶制備液體型PT試劑的方法，該試劑具有良好的敏感性和穩(wěn)定性，各項技術(shù)指標(biāo)均合格，經(jīng)實驗證實適合臨床使用。
文檔編號C12N1/19GK101294163SQ20071003979
公開日2008年10月29日 申請日期2007年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月23日
發(fā)明者肖國偉 申請人:上海長島生物技術(shù)有限公司