專利名稱：一氧化碳釋放分子在制備抑制凝血活化疾病藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明專利涉及ー氧化碳釋放分子在凝血系統(tǒng)方面的新用途，具體的說，涉及一種早期應(yīng)用ー氧化碳釋放分子治療膿毒癥時(shí)凝血系統(tǒng)的過度活化的方法。
背景技術(shù)：
膿毒癥是嚴(yán)重創(chuàng)傷、休克及感染后常見的并發(fā)癥，即便在基礎(chǔ)與臨床醫(yī)學(xué)研究及重癥監(jiān)護(hù)手段高度發(fā)展的現(xiàn)代，臨床治療仍然收效甚微，死亡率居高不下！統(tǒng)計(jì)表明，全世界超過10%的死亡患者與膿毒癥密切相關(guān)。在膿毒癥復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制中，凝血系統(tǒng)紊亂是病死率増加的ー個(gè)重要原因。凝血系統(tǒng)的異常在膿毒癥的發(fā) 生、發(fā)展過程中具有重要作用。膿毒癥時(shí)由于細(xì)胞因子瀑布樣釋放，激活凝血系統(tǒng)，同時(shí)纖溶系統(tǒng)及生理性的抗凝系統(tǒng)受到不同程度的抑制，血液處于高凝狀態(tài)，微血管內(nèi)微血栓廣泛形成，微循環(huán)障礙，進(jìn)一步發(fā)展可導(dǎo)致膿毒性休克、MODS。膿毒癥時(shí)凝血活化和炎癥反應(yīng)之間存在明顯的交叉反應(yīng)，膿毒癥時(shí)機(jī)體的大量凝血因子被激活，凝血系統(tǒng)活化，使其功能紊亂，并促進(jìn)炎癥反應(yīng)的進(jìn)ー步發(fā)展，后者亦可引起前者的活化，兩者相互影響，共同促進(jìn)膿毒癥的惡化。目前認(rèn)為膿毒癥早期以TNF-a增高、凝血和纖溶激活為特征。膿毒癥時(shí)產(chǎn)生的多種促炎癥因子如TNF-a、IL-1及IL-6等可引起并加重高凝。細(xì)胞因子增高后可見凝血酶生成的標(biāo)志物和纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白的標(biāo)志物顯著升高，提示凝血酶生成増加，凝血系統(tǒng)經(jīng)細(xì)胞因子介導(dǎo)而活化。反之，凝血酶、因子Xa、纖維蛋白等凝血因子又可通過刺激單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞釋放TNF-a、IL-I及IL-6等促進(jìn)炎癥反應(yīng)發(fā)生。因此，凝血活化與細(xì)胞因子形成相互促進(jìn)的循環(huán)，在研究膿毒癥的病理生理及治療時(shí)，必須高度重視凝血系統(tǒng)紊亂問題和抗凝策略。血小板活化是凝血系統(tǒng)激活過程中的重要事件，在膿毒癥的早期階段，即可發(fā)生血小板激活和聚集。血小板在膿毒癥所致的多器官功能障礙綜合綜中扮演了重要角色，在膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸中具有重要作用。血小板活化包括3個(gè)方面黏附、聚集和釋放，三者相互促進(jìn)。研究表明，血小板參與膿毒癥時(shí)血管的痙攣、血栓形成、栓塞的發(fā)生和缺血后組織的遲發(fā)性損害等各個(gè)環(huán)節(jié)。血小板膜糖蛋白在這些過程中起著極其重要的作用。主要的血小板膜糖蛋白GP II b/IIIa(即⑶41/⑶61)、⑶62p等介導(dǎo)了上述病理過程。造血系細(xì)胞特異蛋白-I (HSl)是血小板受刺激后活化過程中的一個(gè)關(guān)鍵信號分子，上述血小板重要的膜糖蛋白的活化信號均經(jīng)HSl而得以傳導(dǎo)。因此，研究ー種能抑制膜糖蛋白的表達(dá)，或者阻斷HSl信號傳導(dǎo)，進(jìn)而抑制血小板的激活，弱化凝血系統(tǒng)的活化的方法對抑制膿毒癥的發(fā)生發(fā)展具有重要作用。一氧化碳(CO)常溫常壓下是ー種雙原子、小分子的氣態(tài)物質(zhì)，由于ー氧化碳可與機(jī)體內(nèi)血紅蛋白結(jié)合生成碳氧血紅蛋白(ffico)，使得血液運(yùn)輸氧的能力發(fā)生障礙，高濃度時(shí)還可與還原性細(xì)胞色素氧化酶的兩價(jià)鐵結(jié)合，抑制組織呼吸，故CO在以往被認(rèn)為是有毒氣體，對CO的研究僅局限于它的生物學(xué)毒性。近年來，大量的研究證實(shí)ー氧化碳(CO)與一氧化氮(NO)相類似，也是ー種重要的氣體細(xì)胞信使分子，在細(xì)胞功能和通訊的調(diào)節(jié)カー面發(fā)揮信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要作用。到1990年代初，Snyder等提出至少在ー種類型的神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)，CO將不僅僅是副產(chǎn)物且作為CGMP的調(diào)節(jié)分子，它將和NO —樣激活生物信號。Snyder等研究證明，cGMP在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的嗅覺信號傳導(dǎo)中起了重要的作用，而這種作用可被HO的抑制劑阻斷，從而提出了 CO的分子信號作用。既往常采用“吸入CO”作為外源性CO的來源，發(fā)現(xiàn)弊端較多，裝置復(fù)雜，吸入濃度較難控制和維持，難以在實(shí)驗(yàn)需要時(shí)追加劑量，易導(dǎo)致高HbCO(—氧化碳血紅蛋白)血癥等。外源性一氧化碳釋放分子(Carbon monoxide-releasing molecules,CORMs)是近年來新合成的一種ー氧化碳復(fù)合物，可以通過適當(dāng)溶劑溶解后持續(xù)釋放CO，發(fā)揮生理作用，在一定生理劑量時(shí)并不提高動物體內(nèi)HbCO的濃度。該ー氧化碳復(fù)合物的制備方法和理化性能參數(shù),在Motterlini R等所著文獻(xiàn)(Curr. Pharm. 2003; 9:2525 - 39)中有詳細(xì)的報(bào)道，該ー氧化碳復(fù)合物通常可用于制備緩釋的ー氧化碳。我們的前期研究證明，外源性一氧化碳對膿毒血癥時(shí)炎性介質(zhì) 和細(xì)胞因子的釋放具有有效的抑制作用，可有效保護(hù)細(xì)胞、維持器官功能。如能夠?qū)⑺龅末`氧化碳釋放分子用于抑制膿毒癥時(shí)凝血系統(tǒng)過度活化反應(yīng)中，將為研究開發(fā)凝血系統(tǒng)紊亂問題和抗凝策略開辟新的途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供ー氧化碳釋放分子在制備抑制凝血活化疾病藥物中的應(yīng)用，以滿足臨床應(yīng)用的需要。將所述ー氧化碳釋放分子溶解在溶劑中，然后將其置于細(xì)胞培養(yǎng)液或生物體內(nèi)，以可以持續(xù)性釋放CO，作為ー種外源性CO供體；通過體內(nèi)動物試驗(yàn)和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，所述外源性一氧化碳能夠明顯降低膿毒癥時(shí)凝血因子FIB、D-D的表達(dá)；同時(shí)降低血漿中血小板膜糖蛋白⑶61、⑶62p的表達(dá)，從而下調(diào)了血小板粘附和聚集功能，同時(shí)抑止膿毒癥小鼠血小板HSl的磷酸化水平，最終抑制了膿毒癥凝血系統(tǒng)的過度活化。因此，所述的外源性ー氧化碳釋放分子C0RM-2，可以用于制備治療膿毒癥時(shí)凝血系統(tǒng)的過度活化疾病的藥物；本研究即采用小鼠盲腸結(jié)扎和穿孔術(shù)(CLP)膿毒癥模型，將所述的外源性ー氧化碳釋放分子2 (C0RM-2)作為ー種抑制膿毒癥時(shí)凝血系統(tǒng)過度活化的藥物，由醫(yī)師決定，進(jìn)行早期干預(yù)，進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)ー氧化碳釋放分子對膿毒癥時(shí)凝血系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用。采用所述的ー氧化碳釋放分子在抑制膿毒癥時(shí)凝血系統(tǒng)的過度活化疾病吋，使用C0RM-2,劑量為8mg/kg ;使用方法如下5. 125mg C0RM-2溶于250 u I DMSO中，獲得40mM的C0RM-2溶液，根據(jù)8. 0mg/kg的劑量，取上述母液8 加入152 U I生理鹽水中，配置成160 u I C0RM-2溶液，在小鼠CLP術(shù)后立即尾靜脈注射。采用所述的ー氧化碳釋放分子抑制膿毒癥時(shí)凝血系統(tǒng)的過度活化疾病時(shí)，其濃度控制相對容易且正確，長期使用時(shí)追加方便，能夠滿足臨床應(yīng)用的需要。


圖I為C0RM-2對CLP小鼠血漿中血小板膜糖蛋白⑶61水平的影響。圖2為C0RM-2對CLP小鼠血漿中血小板膜糖蛋白⑶62p水平的影響。
圖3為C0RM-2對CLP小鼠血漿中血小板膜糖蛋白⑶41水平的影響。圖4為C0RM-2對CLP小鼠血液中凝血因子FIB水平的影響。圖5為C0RM-2對CLP小鼠血液中凝血因子D-D含量的影響。圖6為C0RM-2對CLP小鼠血小板粘附功能的影響。圖7為C0RM-2對CLP小鼠血小板聚集功能的影響。圖8為C0RM-2對CLP小鼠血小板HSl蛋白磷酸化的影響。圖9為C0RM-2對CLP小鼠不同時(shí)間血小板HSl蛋白 磷酸化的影響。圖10為C0RM-2對人血小板凝血酶刺激后HSl蛋白磷酸化的影響。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I外源性ー氧化碳釋放分子(CO-RMs)對膿毒癥時(shí)血小板膜糖蛋白以及血小板活化的抑制作用試驗(yàn)方法I CLP動物模型6-8周大小的C57BL/6小鼠，體重20±2g，均為雄性。予以2%異氟烷吸入麻醉小鼠，腹壁中線偏下方行1-1. 5cm切ロ，尋找到盲腸，在盲腸全長的1/2處運(yùn)用3-0的線進(jìn)行結(jié)扎，小心勿引起腸梗阻，勿破壞回腸動脈。運(yùn)用20號針在盲腸壁進(jìn)行単獨(dú)的穿孔，輕輕擠壓盲腸，使得穿孔位置有少量的腸內(nèi)容物溢出，以確保完全穿孔，密切注意保持小腸和大腸之間的連續(xù)性。CLP后在腸道不同部位檢查小鼠并未顯示有腸梗阻的存在。然后將盲腸放回至腹腔內(nèi)，外科縫合切ロ。假手術(shù)組小鼠進(jìn)行麻酔和腹中線剖腹手木，將盲腸由腹部取出再放回腹腔，外科縫合傷ロ。傷ロ立即腹腔注射Iml生理鹽水抗休克，保持室溫22°C，單籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食，足量飲水，切ロ涂以碘酊抗感染。2實(shí)驗(yàn)分組2. I按不同時(shí)段分組C57BL/6小鼠60只(6-8周大小)，體重20±2g，均為雄性。隨機(jī)均分到三個(gè)時(shí)間段里，每時(shí)間段再分3個(gè)組6 小時(shí)組A 組SHAM 組(n = 5)；B 組CLP 組(n = 5);C 組CLP+C0RM-2 (n = 5)，C0RM-2 8mg/kg ；12 小時(shí)組A 組SHAM 組(n = 5)；B 組CLP 組(n = 5);C 組CLP+C0RM-2 (n = 5)，C0RM-2 8mg/kg ；24 小時(shí)組A 組SHAM 組(n = 5)；B 組CLP 組(n = 5);C 組CLP+C0RM-2 (n = 5)，C0RM-2 8mg/kg ；2. 2用藥途徑與劑量各時(shí)間段A組在開腹找到盲腸后不予結(jié)扎，放回腹腔后關(guān)腹，余與B組處理相同；C組以DMSO溶解C0RM-2配制成40M母液，給藥濃度8mg/kg，即每只小鼠在CLP模型制成后，立即取40M母液8iil，配以生理鹽水152iU，尾靜脈注射160 ill CORM-2稀釋液。3檢測指標(biāo)3. I血小板膜糖蛋白CD41、CD61、CD62-p水平檢測流式細(xì)胞儀分析PRP中血小板膜糖蛋白⑶41、⑶61、⑶62-p水平，具體方法如下(I)姆只小鼠PRP分裝于6支BD試管,姆管50 U I ;(2)將羊抗鼠CD41、CD61、CD62-p及IgG對照各10 U I分別加入對應(yīng)的6支BD試
管中；(3)各BD試管置于微型渦旋混合器上混勻0. 5s后，室溫、 避光20min ；(4)各BD試管中加2ml生理鹽水，潤旋混合器上混勻0. 5s后，1500r/min, 5min離心,棄上清；(5)各BD試管中加250 U I生理鹽水，488nm氬離子激光燈下FCM檢測熒光標(biāo)記陽性的血小板百分?jǐn)?shù)。3. 2CLP小鼠血中凝血因子纖維蛋白原(FIB)、D ニ聚體(D-D)水平檢測小鼠在各時(shí)間段后用大劑量異氟烷麻醉滿意后，用3. 8%檸檬酸鈉潤過的注射器通過心臟穿刺取血至少1ml，用3. 8%檸檬酸鈉(1:9)抗凝后裝于EP管中，即刻全自動凝血分析儀檢測全血中凝血因子FIB、D-D水平。3. 3血小板粘附功能(PAdT)、血小板聚集功能(PAgT)檢測小鼠在各時(shí)間段后用大劑量異氟烷麻醉滿意后，用3. 8%檸檬酸鈉潤過的注射器通過心臟穿刺取血至少1ml，用3. 8%檸檬酸鈉(1:9)抗凝后裝于EP管中，即刻進(jìn)行血小板粘附功能(PAdT)、血小板聚集功能(PAgT)檢測。玻球法檢測血小板粘附功能(I)取靜脈血4. 5ml，置于含有0. 109mol/L枸櫞酸鈉溶液0. 5ml的離心管(ニ甲基ニ氯硅烷處理過)中輕輕混勻。(2)立即以注射器(ニ甲基ニ氯硅烷處理過)取血標(biāo)本I. 5ml置于球形瓶中，將球形瓶固定于轉(zhuǎn)動裝置，3rpm, 15min。(3)再用2個(gè)注射器分別從離心管中(接觸前)和球形瓶(接觸后)取血I. 0ml，置于2個(gè)大試管(ニ甲基ニ氯硅烷處理過)中，然后各加入0. 109mol/L枸櫞酸鈉溶液19ml，以塑料膜蓋試管ロ，輕輕傾倒3次，混勻，即刻送檢。(4)用全自動血細(xì)胞分析儀檢測血小板數(shù)。(5)每ー標(biāo)本測定2次，取平均值。
(6)計(jì)算 血小板粘附率％ =接觸前二歷辱座土■數(shù)X100%
接觸前血小板數(shù)全血電阻法檢測血小板聚集功能(I)將血小板聚集儀用連接器(link)與電腦連接，并選擇電阻法。(2)將帶有磁棒的反應(yīng)杯插入育溫孔,育溫IOmin,設(shè)置磁棒旋轉(zhuǎn)速度1200rpm。(3)加入0. 5ml抗凝血和0. 5ml生理鹽水到育溫好的反應(yīng)杯中混合，再放到檢測位溫育5分鐘。(4)溫育時(shí)間到把電極插入反應(yīng)杯，電極連到聚集儀上。
(5)在Aggregoment菜單內(nèi)選擇Run test,輸入有關(guān)標(biāo)本信息,選擇電阻法后點(diǎn)擊0K，出現(xiàn)運(yùn)行曲線。(6)使用Impedence Zero Knob重新設(shè)置曲線的基線在0%,按Calibraten鈕，使聚集曲線的電阻増加為標(biāo)準(zhǔn)20ohm，同時(shí)旋轉(zhuǎn)Gain按紐使聚集曲線位于50%位置后，松開旋鈕，那么姆50個(gè)小格為20ohm。此即為在程序里面設(shè)置Gain為20/5的原因。(7)加入聚集試劑ADPlOul，(無塵吸水紙擦拭槍頭，加時(shí)槍頭一定貼著杯壁插到底打出去，而且不要放開迅速抬起，此過程一定注意不要觸碰電極)，讓曲線運(yùn)行6-9分鐘至其比較平穩(wěn)時(shí)在Aggregoment菜單內(nèi)選擇Stop test。(8)在Edit菜單中選擇set start time and stop time之后選擇預(yù)編輯的通道，然后在圖形中用光標(biāo)點(diǎn)住左邊線左鍵點(diǎn)住拖動此線到開始 加試劑的位置，之后光標(biāo)點(diǎn)住右邊線同樣拖動至曲線開始趨于平穩(wěn)的位置，最后Done —下。(9)在Edit菜單中選擇comput，確認(rèn)時(shí)間后便可計(jì)算出聚集率和坡度(坡度代表單位時(shí)間內(nèi)聚集率的變化)。(10)得到的結(jié)果可以通過File菜單中的Save進(jìn)行保存。(11)檢測完畢后將電極取出，先用次氯酸鈉洗液洗，再用生理鹽水沖洗，并用無塵吸水紙擦干，放入下一標(biāo)本中。4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)用X土s差表示，各組間均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)。P <0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。差異顯著性檢驗(yàn)采用SPSS13. 0統(tǒng)計(jì)軟件。結(jié)果如下I C0RM-2對CLP小鼠血漿中血小板膜糖蛋白⑶61水平的影響圖Ia和圖Ib顯示CLP組小鼠全血中CD61的含量在6h組中較假手術(shù)組明顯增加(P〈0. 01)，12h、24h組的亦是如此(P〈0. 05);在各時(shí)間段中CLP+C0RM-2組表達(dá)同樣低于CLP組(P〈0. 05)。2 C0RM-2對CLP小鼠血漿中血小板膜糖蛋白⑶62p水平的影響圖2示各時(shí)間段中CLP組小鼠全血中⑶62p的含量較假手術(shù)組明顯增加(P〈0. 01)；02+CLP+C0RM-2 組表達(dá)明顯低于 CLP 組(P〈0. 05)。3 C0RM-2對CLP小鼠血漿中血小板膜糖蛋白⑶41水平的影響圖3示各時(shí)間段中各組間小鼠血漿中⑶41的水平無明顯變化。(P > 0. 05)。4 C0RM-2對CLP小鼠血液中凝血因子FIB水平的影響圖4示6h時(shí)間段各組間無顯著性差異；12h、24h時(shí)間段CLP組小鼠全血中FIB的含量較假手術(shù)組明顯增加(P < 0.01), CLP+C0RM-2組表達(dá)明顯低于CLP組(P < 0. 01)。5C0RM-2對CLP小鼠血液中凝血因子D-D含量的影響圖5示6h、12h時(shí)間段CLP組小鼠全血中D-D的含量較假手術(shù)組明顯增加(P〈0. 01)，CLP+C0RM-2組表達(dá)明顯低于CLP組(P〈0. 01) ;24h組各組間雖有變化趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0. 05)。6 C0RM-2對CLP小鼠血小板粘附功能的影響圖6示6h、12h、24h各時(shí)間段CLP組小鼠血小板粘附率較假手術(shù)組明顯増加(P< 0. 01)，CLP+C0RM-2 組情況明顯低于 CLP 組(P < 0. 01)。
7 C0RM-2對CLP小鼠血小板聚集功能的影響圖7a示24h時(shí)間段CLP組小鼠血小板聚集后電阻值較假手術(shù)組明顯增加(P〈0. 01)，CLP+C0RM-2 組情況明顯低于 CLP 組(P〈0. 01)。圖7示各組小鼠血小板聚集率變化a.各組血小板電阻值，*與對照組比較，P〈0. 01 ；#與CLP組比較，P〈0. 05。b. 24h時(shí)間點(diǎn)CLP組小鼠血小板聚集增加導(dǎo)致電阻曲線下降幅度最大，斜率最大，CORM干預(yù)組曲線變化較CLP組明顯平滑，聚集率降低；C0RM2為外源性ー氧化碳釋放分子2。實(shí)施例2外源性ー氧化碳釋放分子(CO-RMs)對膿毒癥時(shí)血 小板HSl磷酸化的影響膿毒癥時(shí)凝血系統(tǒng)的過度激活促進(jìn)了膿毒癥的發(fā)展，進(jìn)ー步發(fā)展為膿毒癥休克，血小板在此復(fù)雜的相互作用過程中起著非常重要的作用，主要體現(xiàn)在血小板過度活化，發(fā)生大量的粘附與聚集，導(dǎo)致病理性血栓形成。主要的血小板膜糖蛋白GP II b/IIIa(即⑶41/⑶61)、⑶62p等介導(dǎo)了上述病理過程。造血系細(xì)胞特異蛋白-I (HSl)是血小板受刺激后活化過程中的一個(gè)關(guān)鍵信號分子，上述血小板重要的膜糖蛋白的活化信號均經(jīng)HSl而得以傳導(dǎo)。因此，抑制膜糖蛋白的表達(dá)，或者阻斷HSl信號傳導(dǎo)，進(jìn)而抑制血小板的激活，弱化凝血系統(tǒng)的活化對抑制膿毒癥的發(fā)生發(fā)展具有重要作用。試驗(yàn)方法I動物模型與分組120只雄性BALB/c小鼠(江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心)，6 8周齡，體質(zhì)量(20±2) g，于普通實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)I周。按照隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分為對照組30只、CLP組30只、CLP + iC0RM-2 組 30 只、CLP + C0RM-2 組 30 只，每組均設(shè) 6h、12h、24h 三個(gè)時(shí)間點(diǎn)。CLP組小鼠吸入異氟烷麻酔后行CLP ；CLP + C0RM-2組小鼠同CLP組處理后，立即經(jīng)尾靜脈注射C0RM-2 (8. Omg/kg)。CLP + iCORM-2組小鼠除注射無活性的C0RM-2タト，處理同CLP +C0RM-2 組。2蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測總HSl和p_HSl按本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法，收集24h組各組小鼠血小板經(jīng)裂解后冰浴靜置lh，然后4°C、14000r/min (離心半徑為6. 0cm)離心25min，提取各組胞質(zhì)蛋白，采用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)濃度(mg/mL),-80°C保存。姆個(gè)樣品取50 y g總蛋白，電泳后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，90V低溫條件下電轉(zhuǎn)移2h，封閉后分別加入兔抗HSl單克隆抗體，兔抗p_HSl多克隆抗體，抗體均I : 500稀釋，4°C過夜。PBST漂洗4次后，加入HRP耦聯(lián)的山羊抗兔IgG(l 5000稀釋)，4°C孵育過夜。PBST漂洗4次后，用ECL試劑盒顯色，蛋白條帶用圖像分析系統(tǒng)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差表示。3免疫沉淀分析(I)每I毫升預(yù)處理的蛋白溶液加50微升正常兔血清或IgG，冰上孵育2小時(shí)；(2)將蛋白A微球懸浮于洗脫緩沖液中，攪拌后IOOOOg離心，棄洗液，置于冰上；(3)將蛋白溶液與蛋白A微球混合，冰上30分鐘，4000g3分鐘。小心將上清移至另一管中(増加蛋白A的濃度，徹底去除用于預(yù)處理的非特異性抗體)；(4)預(yù)處理的蛋白溶液置于適當(dāng)數(shù)量的I. 5毫升的管中(0. 5/管)，加入抗血清I U I作為起始用量(滴定抗體量范圍0. 5-5 u I)，冰上孵育2小時(shí)；
(5)加入100 Ul蛋白A微球(10%的懸液)，4度搖動I小吋，10000gl5秒，收集微球；(6)將0. 5倍體積的PH3. 5的甘氨酸-鹽酸洗脫液與沉淀復(fù)合物顛倒混勻15分鐘，離心收集上清，重復(fù)2-3次；(7)各管，SDS-PAGE 鑒定組份。4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)用x±s表示，各組間均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)。P〈0. 05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。差異顯著性檢驗(yàn)采用SPSS 13. 0統(tǒng)計(jì)軟件。 結(jié)果如下I C0RM-2對CLP小鼠血小板HSl蛋白磷酸化的影響圖8示CLP組、CLP+iCORM組小鼠血小板磷酸化HSl蛋白相對表達(dá)量(0. 85±0. 18，0. 93±0. 16)較正常對照組(0. 40±0. 07)增加(P〈0. 01) ；CLP+C0RM-2 組小鼠血小板磷酸化HSl蛋白相對表達(dá)量(0.38±0.09)下降(P〈0.05)。(圖中I.正常對照組、2. CLP組、3. CLP+iC0RM-2組、4. CLP+C0RM-2組；C0RM2為外源性ー氧化碳釋放分子2，iC0RM-2 為無活性 C0RM-2)2 C0RM-2對CLP小鼠不同時(shí)間血小板HSl蛋白磷酸化的影響圖9示膿毒癥(CLP)小鼠模型并用CORM-2 (8mg/kg)干預(yù)，按不同時(shí)間點(diǎn)收集血小板?？笻Sl抗體免疫沉淀后采用抗磷酸化Tyr抗體行Western blot檢測。等量免疫沉淀樣本采用抗HSl抗體行Western blot檢測。結(jié)果顯示，C0RM-2能明顯抑止膿毒癥小鼠血小板HSl的磷酸化水平。3 C0RM-2對人血小板凝血酶刺激后HSl蛋白磷酸化的影響圖10示人血小板凝血酶刺激并用CORM-2 (IO-IOOiiM)干預(yù)3min，抗HSl抗體免疫沉淀后采用抗磷酸化Tyr行Western blot檢測。等量免疫沉淀樣本采用抗HSl抗體行Western blot檢測。結(jié)果顯示，CORM-2能明顯抑止HSl的磷酸化水平。
權(quán)利要求
1.一氧化碳釋放分子在制備抑制凝血活化疾病藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于，使用C0RM-2，劑量為8mg/kg。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，使用方法如下5.125mg C0RM-2溶于.250 μ I DMSO中，獲得40mM的C0RM-2溶液，根據(jù)8. Omg/kg的劑量，取上述母液8 μ I加入.152 μ I生理鹽水中，配置成160 μ I C0RM-2溶液，靜脈注射。
全文摘要
本發(fā)明公開了一氧化碳釋放分子在制備抑制凝血活化疾病藥物中的應(yīng)用。通過體內(nèi)動物試驗(yàn)和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，所述外源性一氧化碳能夠明顯降低膿毒癥時(shí)凝血因子FIB、D-D的表達(dá)；同時(shí)降低血漿中血小板膜糖蛋白CD61、CD62p的表達(dá)，從而下調(diào)了血小板粘附和聚集功能，同時(shí)抑止膿毒癥小鼠血小板HS1的磷酸化水平，最終抑制了膿毒癥凝血系統(tǒng)的過度活化。采用所述的一氧化碳釋放分子抑制膿毒癥時(shí)凝血系統(tǒng)的過度活化疾病時(shí)，其濃度控制相對容易且正確，長期使用時(shí)追加方便，能夠滿足臨床應(yīng)用的需要。
文檔編號A61P7/00GK102813925SQ201210268100
公開日2012年12月12日 申請日期2012年7月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月30日
發(fā)明者孫炳偉, 孫艷, 王旭 申請人:江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院