專利名稱：亞甲藍光化學(xué)病毒滅活效果質(zhì)量評價方法及其質(zhì)控品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及血液及血液成分病毒滅活效果的質(zhì)量評價方法，及相應(yīng)質(zhì)控品的建立，具體涉及亞甲藍光化學(xué)病毒滅活效果質(zhì)量評價方法及其質(zhì)控品。

背景技術(shù)：
隨著醫(yī)學(xué)科學(xué)的發(fā)展，血液及血液制品的安全性越來越受到重視，血液安全性不僅依賴于合理的獻血員篩選，嚴(yán)格的病毒篩檢，還有賴于安全有效的病毒滅活技術(shù)，它是安全輸血的重要保障。亞甲藍(Methylene blue，MB)光化學(xué)法被認(rèn)為是非常有發(fā)展前景的臨床用單人份血漿病毒滅活方法。由于病毒滅活技術(shù)受多種條件因素影響，如MB的濃度、光照強度、時間及光源波長等，因此建立病毒滅活有效性驗證手段，直接而客觀地評價病原體滅活的有效性是病毒滅活工作的重要組成部分，是確保滅活效果達到預(yù)期的要求，保障血液制品安全性、有效性的重要環(huán)節(jié)。
目前多采用體外培養(yǎng)的細胞病變法或動物模型方法來判斷病毒滅活效果。細胞病變法就是通過病毒接種于細胞懸液中，觀察宿主細胞變化來判定病毒感染的情況。目前除HIV已建立起成熟的實驗室細胞病變方法加以檢測外，HBV、HCV等都不能直接體外繁殖，必須盡可能選擇理化性質(zhì)相似的模型病毒作為指示病毒進行體外培養(yǎng)加以檢測，如以辛德畢斯病毒(Sindbis Virus，SV)作為HCV模型病毒、鴨乙肝病毒(Duck Hepatitis B Virus，DHBV)作為HBV的模型病毒、水皰性口炎病毒(Vesivular Stomatitis Virus，VSV)作為RNA脂質(zhì)包膜病毒的模型病毒。但是體外培養(yǎng)方法對實驗條件有嚴(yán)格的要求，細胞培養(yǎng)、病毒保存有規(guī)范的控制，操作繁瑣，實驗周期長，不利于在基層單位開展此項工作。此外，雖然動物模型方法在從生物體整體水平評價病毒感染性方面具有優(yōu)勢，但價格昂貴，實驗周期長，只適合于研究開發(fā)階段使用，也不適合在常規(guī)工作中開展。因此，建立更簡單易行、更經(jīng)濟、更有效的評價指標(biāo)已成為病毒滅活工作中急需解決問題。
核酸檢測技術(shù)是以檢測感染者體內(nèi)病毒核酸的有無或含量多少來進行病原學(xué)診斷的一種方法，是繼形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)診斷之后的第四代診斷檢測技術(shù)。它具有靈敏度高，特異性強，能采用定量檢測的方法進行質(zhì)量控制，準(zhǔn)確性高，檢測費用少，檢測耗時少，適合于常規(guī)工作中推廣應(yīng)用。PCR是眾多核酸檢測技術(shù)中的經(jīng)典方法，因其簡便快速的特點，目前基層檢驗單位及血站均已具備PCR工作條件。因此發(fā)明人想到了可能可以利用核酸檢測技術(shù)來評價亞甲藍光化學(xué)病毒滅活效果。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種新的利用核酸檢測技術(shù)來評價亞甲藍光化學(xué)病毒滅活效果的方法。
要給出利用核酸檢測技術(shù)來評價亞甲藍光化學(xué)病毒滅活對病毒的滅活效果的方法，有幾個關(guān)鍵 首先，因為PCR檢測的是病毒特異性靶基因片段，所以必須證明亞甲藍對病毒滅活作用位點為病毒核酸，并且病毒這種特異性擴增產(chǎn)物的減少或消失與病毒感染的致病性存在一定的相關(guān)性。
其次，由于常規(guī)采供血工作對環(huán)境的嚴(yán)格要求，引入的質(zhì)控品材料必須保證對操作人員和受血者無感染性，因此，必須選擇對人體不致病，但又能模擬對人體致病的HBV、HCV和HIV在處理過程中動態(tài)變化的模型病毒或相關(guān)病毒的核酸材料作為質(zhì)控品的備選對象。
最后，必須篩選出與亞甲藍光化學(xué)病毒滅活相關(guān)的，能敏感反映病毒感染性的靶基因擴增片段及其引物，以達到該方法有效推廣的目的。
在證實了亞甲藍對病毒滅活作用位點為病毒核酸，并且病毒這種特異性擴增產(chǎn)物的減少或消失與病毒感染的致病性存在一定的相關(guān)性后，本發(fā)明提出了以下技術(shù)方案 一方面，本發(fā)明公開了一種亞甲藍光化學(xué)病毒滅活效果質(zhì)量評價的檢測方法 在對血液或血液制品進行亞甲藍光化學(xué)滅活的同時，對質(zhì)控品進行相同條件的滅活，質(zhì)控品含有SV病毒完整顆?；騍V病毒基因的重組質(zhì)?；騍V病毒基因體外轉(zhuǎn)錄的RNA片段，通過特異性引物，利用PCR技術(shù)擴增質(zhì)控品中SV病毒基因的特定區(qū)域，通過對PCR結(jié)果的監(jiān)測，從分子水平對亞甲藍光化學(xué)病毒滅活效果進行質(zhì)量評價。
SV病毒基因的重組質(zhì)粒是指SV病毒基因組DNA片段與現(xiàn)有載體重組獲得的重組質(zhì)?！，F(xiàn)有載體指的是本領(lǐng)域熟知的細菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他載體。在本發(fā)明中適用的載體包括但不限于pUC系列、pBluescript、pGEM和它們的衍生載體等。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建SV病毒基因的重組質(zhì)粒。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a Laboratory Manual，cold Spring HarborLaboratory.New York，1989)等。
SV病毒基因體外轉(zhuǎn)錄的RNA片段是指經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄獲得的SV病毒基因組RNA片段。體外轉(zhuǎn)錄可以在獲得SV病毒基因組DNA片段后，用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)或者試劑盒完成，例如將SV病毒基因組DNA片段與常用載體重組，獲得SV病毒基因的重組質(zhì)粒，進而在RNA聚合酶的作用下轉(zhuǎn)錄獲得SV病毒基因組RNA片段。
較佳的，上述特異性引物序列選自下組中的一組 1)TGACCGCTATGTCCCAA(SEQ ID NO4)及GAAATGTTAAAAACAAAAT(SEQ ID NO5)； 2)ACCTCCTTGACCAGTAGAG(SEQ ID NO6)及GAAATGTTAAAAACAAAAT(SEQ ID NO5)； 3)CGGAATTCCGTATAGCAACAATGAAACTC(SEQ ID NO18)及CCAAGCTTGGGAAATGTTAAAAACAAAAT(SEQ ID NO19)； 4)CGGAATTCCGTGGAGCTGGTTACTGGCACT(SEQ ID NO22)及CCAAGCTTGGCATTGTTGCTATAGTGCCCG(SEQ ID NO23)； 5)CGGAATTCCGACCGTGCACTTTAGTACCGC(SEQ ID NO26)及CCAAGCTTGGCGCCAAAGAGTGCCAGTAAC(SEQ ID NO27)； 6)CGGAATTCCGCTACGAGCGGTGGACTGTTC(SEQ ID NO30)及CCAAGCTTGGGCGGTACTAAAGTGCACGGT(SEQ ID NO31)； 7)CGGAATTCCGATTGCAAGCACGGACATTAG(SEQ ID NO34)及CCAAGCTTGGTACCGTACGAACAGTCCACC(SEQ ID NO35)。
在本發(fā)明的實施例中，普通PCR列舉了前兩對引物，實時熒光定量PCR列舉了后5對引物。
較佳的，上述SV病毒基因的重組質(zhì)粒含有序列SEQ ID NO1或SEQ ID NO16。重組質(zhì)粒由序列SEQ ID NO1或SEQ ID NO16與現(xiàn)有載體重組獲得。上述重組質(zhì)粒的載體可以是選自pUC系列、pBluescript、pGEM和它們的衍生載體。優(yōu)選的，上述重組質(zhì)粒的載體為pBluescript II SK(+)。
較佳的，上述SV病毒基因體外轉(zhuǎn)錄的RNA片段含有序列SEQ ID NO2或SEQ ID NO17。
較佳的，上述PCR技術(shù)為普通PCR或?qū)崟r熒光定量PCR。
另一方面，本發(fā)明公開了前述亞甲藍光化學(xué)病毒滅活效果質(zhì)量評價檢測方法中使用的質(zhì)控品，質(zhì)控品含有包含序列SEQ ID NO1或SEQ ID NO16的重組質(zhì)粒或包含序列SEQ IDNO2或SEQ ID NO17的RNA，上述質(zhì)粒或RNA的含量一般控制在103copies/ml-108copies/ml。
質(zhì)控品是包含序列SEQ ID NO1或SEQ ID NO16的重組質(zhì)粒或包含序列SEQ ID NO2或SEQ ID NO17的RNA經(jīng)常用稀釋液或緩沖液稀釋獲得的溶液，本領(lǐng)域熟知的常用稀釋液或緩沖液包括但不限于DEPC處理水、用DEPC處理過的PBS緩沖液或代血漿(羥乙基淀粉20(HES20)氯化鈉注射液，HES20)、無菌雙蒸水、無菌水等。
較佳的，上述重組質(zhì)粒為序列SEQ ID NO1或SEQ ID NO16與pBluescript II SK(+)重組獲得的質(zhì)粒。
較佳的，上述RNA片段的序列為SEQ ID NO2或SEQ ID NO17。
有益效果 本發(fā)明在大量研究的基礎(chǔ)上將普通PCR(conventional PCR)和實時熒光定量PCR(Real-Time PCR)技術(shù)應(yīng)用于血液及血液成份病毒滅活的有效性檢測中，即通過對模型病毒SV核酸特異性靶序列的擴增，作定性或定量分析，從病毒滅活前后核酸量的變化判斷病毒滅活對病毒的殺傷作用。
相比現(xiàn)有的判斷病毒滅活效果的方法，本發(fā)明操作簡單，準(zhǔn)確度好，實驗周期短，需要的實驗條件容易達到，更為經(jīng)濟有效。實時熒光定量PCR的使用還可以更進一步動態(tài)的反映MB-P處理效果。



圖1.MB-P處理過程中血漿標(biāo)本HCV RNA隨光照時間動態(tài)變化的定量研究時間單位分鐘 圖2.病人血漿中的HCV與代血漿或PBS緩沖液中體外轉(zhuǎn)錄的RNA在MB-P處理下的降解速率比較 圖3.利用引物I與引物II檢測SV在滅活前后PCR結(jié)果 MMarker DL 2000，Marker DL2000自上而下條帶分別為2000，1000，750，500，250，100bp 1Sindbis病毒加MB未作光照處理標(biāo)本(引物II，擴增片段大小1025bp) 2MB1.0μmol/L 30分鐘(引物II) 3MB1.0μmol/L 60分鐘(引物II) 4Sindbis病毒加MB未作光照處理標(biāo)本(引物I，擴增片段大小323bp) 5MB1.0μmol/L 30分鐘(引物I) 6MB1.0μmol/L 60分鐘(引物I) 圖4.利用引物III與引物IV檢測VSV在滅活前后PCR結(jié)果 MMarker DL 2000 1Sindbis病毒加MB未作光照處理標(biāo)本(引物III，擴增片段大小213bp) 2MB1.0μmol/L 30分鐘(引物III) 3MB1.0μmol/L 60分鐘(引物III) 4Sindbis病毒加MB未作光照處理標(biāo)本(引物IV，擴增片段大小237bp) 5MB1.0μmol/L 30分鐘(引物IV) 6MB1.0μmol/L 60分鐘(引物IV) 圖5.利用引物I檢測SV質(zhì)控品在滅活前后PCR結(jié)果 MMarker DL 2000 1加MB未作光照處理(SV病毒完整顆粒質(zhì)控品) 2MB1.0μmol/L 30分鐘(SV病毒完整顆粒質(zhì)控品) 3MB1.0μmol/L 60分鐘(SV病毒完整顆粒質(zhì)控品) 4加MB未作光照處理(含SV病毒基因的重組質(zhì)粒的質(zhì)控品) 5MB1.0μmol/L 30分鐘(含SV病毒基因的重組質(zhì)粒的質(zhì)控品) 6MB1.0μmol/L 60分鐘(含SV病毒基因的重組質(zhì)粒的質(zhì)控品) 7加MB未作光照處理(含SV病毒基因體外轉(zhuǎn)錄的RNA片段的質(zhì)控品) 8MB1.0μmol/L 30分鐘(含SV病毒基因體外轉(zhuǎn)錄的RNA片段的質(zhì)控品) 9MB1.0μmol/L 60分鐘(含SV病毒基因體外轉(zhuǎn)錄的RNA片段的質(zhì)控品) 圖6.利用引物II檢測SV質(zhì)控品在滅活前后PCR結(jié)果 MMarker DL 2000 1加MB未作光照處理(SV病毒完整顆粒質(zhì)控品) 2MB1.0μmol/L 30分鐘(SV病毒完整顆粒質(zhì)控品) 3MB1.0μmol/L 30分鐘(SV病毒完整顆粒質(zhì)控品) 4未作光照處理(含SV病毒基因的重組質(zhì)粒的質(zhì)控品) 5MB1.0μmol/L 30分鐘(含SV病毒基因的重組質(zhì)粒的質(zhì)控品) 6MB1.0μmol/L 60分鐘(含SV病毒基因的重組質(zhì)粒的質(zhì)控品) 7加MB未作光照處理(含SV病毒基因體外轉(zhuǎn)錄的RNA片段的質(zhì)控品) 8MB1.0μmol/L 30分鐘(含SV病毒基因體外轉(zhuǎn)錄的RNA片段的質(zhì)控品) 9MB1.0μmol/L 60分鐘(含SV病毒基因體外轉(zhuǎn)錄的RNA片段的質(zhì)控品) 圖7.利用引物SV1檢測含SV病毒基因的重組質(zhì)粒(為含有序列SEQ ID NO1重組質(zhì)粒)質(zhì)控品在滅活前后實時熒光定量PCR檢測結(jié)果 按照出峰先后，各條曲線分別為濃度107、106、105、104copies/ml的標(biāo)準(zhǔn)品(克隆片段大小為323bp的重組質(zhì)粒)，加MB未作光照處理(0分鐘)，MB1.0μmol/L照射30分鐘質(zhì)控品，MB1.0μmol/L照射60分鐘質(zhì)控品。
圖8.利用引物SV2檢測含SV病毒基因的重組質(zhì)粒(為含有序列SEQ ID NO16重組質(zhì)粒)的質(zhì)控品在滅活前后實時熒光定量PCR檢測結(jié)果 按照出峰先后，各條曲線分別為濃度107、106、105、104copies/ml的標(biāo)準(zhǔn)品(克隆片段大小為1025bp的重組質(zhì)粒)，加MB未作光照處理(0分鐘)，MB1.0μmol/L照射30分鐘質(zhì)控品，MB1.0μmol/L照射60分鐘質(zhì)控品。
圖9.利用引物SV3檢測含SV病毒基因體外轉(zhuǎn)錄的RNA片段(SEQ ID NO17)的質(zhì)控品在滅活前后實時熒光定量PCR檢測結(jié)果 按照出峰先后，各條曲線分別為濃度107、106、105、104copies/ml的標(biāo)準(zhǔn)品(克隆片段大小為1025bp的重組質(zhì)粒)，加MB未作光照處理(0分鐘)，MB1.0μmol/L照射30分鐘質(zhì)控品，MB1.0照射60分鐘質(zhì)控品。
圖10.利用引物SV4檢測含檢測SV病毒完整顆粒質(zhì)控品在滅活前后實時熒光定量PCR檢測結(jié)果 按照出峰先后，各條曲線分別為濃度107、106、105、104copies/ml的標(biāo)準(zhǔn)品(克隆片段大小為1025bp的重組質(zhì)粒)，加MB未作光照處理(0分鐘)，MB1.0μmol/L照射30分鐘質(zhì)控品，MB1.0照射60分鐘質(zhì)控品。
圖11.利用引物SV5檢測含SV病毒基因的重組質(zhì)粒(為含有序列SEQ ID NO16重組質(zhì)粒)的質(zhì)控品在滅活前后實時熒光定量PCR檢測結(jié)果 按照出峰先后，各條曲線分別為濃度107、106、105、104copies/ml的標(biāo)準(zhǔn)品(克隆片段大小為1025bp的重組質(zhì)粒)，加MB未作光照處理(0分鐘)，MB1.0μmol/L照射30分鐘質(zhì)控品，MB1.0照射60分鐘質(zhì)控品。

具體實施例方式 本發(fā)明是為了將PCR技術(shù)運用于亞甲藍光化學(xué)病毒滅活效果評價領(lǐng)域，首先必須證明病毒核酸是亞甲藍光化學(xué)病毒滅活作用靶位點，即要證實亞甲藍光化學(xué)滅活對病毒核酸有破壞作用，驗證過程如下 1)本發(fā)明設(shè)置不同的MB-P(亞甲藍光化學(xué)病毒滅活)滅活條件，將含病毒陽性血漿及體外轉(zhuǎn)錄獲得的病毒RNA溶液同時進行滅活；滅活后，分別取樣，對樣品進行RNA抽提及逆轉(zhuǎn)錄；利用針對病毒核心片段基因序列的引物，對樣品進行實時熒光定量PCR檢測來測定樣品中病毒RNA的濃度；結(jié)果證實，MB-P處理后，病毒RNA均發(fā)生了降解，且降解程度隨著光照時間的增加而增加。
2)同時，通過對比實驗，本發(fā)明還揭示了血漿中病毒RNA降解速度大于體外轉(zhuǎn)錄獲得的病毒RNA降解速度。
由于本發(fā)明將PCR技術(shù)運用于亞甲藍光化學(xué)病毒滅活效果評價，即通過特異性擴增產(chǎn)物的減少或消失來判斷滅活作用，因此還必須證明病毒核酸的降解與病毒的感染性消失存在一定的相關(guān)性，證明方法如下 1)將病毒血漿進行不同條件的MB-P處理。
2)對不同滅活條件的血漿取樣，通過RT-PCR檢測病毒核酸，與MB-P處理前進行比較，結(jié)果證實滅活后，PCR產(chǎn)物減少，即病毒核酸被降解。
3)同時，對不同滅活條件的血漿取樣，用實時熒光定量PCR檢測，進一步證明隨著滅活過程的進行，PCR產(chǎn)物逐步遞減，即病毒核酸逐步被降解。
4)對不同滅活條件的血漿取樣，進行細胞病變檢測，測定感染性滴度，結(jié)果證實滅活后，病毒感染性消失了。
本發(fā)明的方法是通過對質(zhì)控品的檢測來評價MB-P的效果，為了證實本發(fā)明的質(zhì)控品可以起到評價MB-P的效果的作用，本發(fā)明將制備的質(zhì)控品及含病毒血漿同時進行MB-P處理，結(jié)果證實，隨著MB-P過程的進行，質(zhì)控品中的PCR產(chǎn)物逐步遞減，血漿中病毒感染性也消失了，結(jié)果證實質(zhì)控品真實地反映了MB-P的效果。
下面結(jié)合實施例進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法及未說明配方的試劑均為按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆試驗手冊(New YorkCold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的條件或者制造商建議的條件進行或配置。
實施例1亞甲藍光化學(xué)滅活對HCV病毒核酸有破壞作用 實驗步驟 1、克隆的建立 根據(jù)GenBank中HCV1b型序列(AY460204)，采用Gene runner軟件設(shè)計覆蓋HCV 5’-NCR及核心區(qū)片段的PCR引物，上游引物序列為5’-CGGAATTCCGACCATAGATACTCCCCT-3’(SEQID NO7)，下游引物序列為5’-CGGGATCC CGGAAGATAGAGAAAGAGCAACCG-3’(SEQ ID NO8)，擴增片段長度為844bp，引物交由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。用Trizol(Gibco BRL)試劑抽取抗HCV及HCV RNA均為陽性的獻血員血漿(上海血液中心)中的HCV RNA后，使用RNA PCR KIT(Takara公司)進行逆轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)。反應(yīng)參數(shù)為42℃逆轉(zhuǎn)錄30分鐘，94℃預(yù)變性2分鐘，94℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，其中變性、退火和延伸循環(huán)30次。將PCR產(chǎn)物純化后以EcoRI、BamHI雙酶切位點克隆到pBluescriptII SK(+)載體(Stratagene公司)中，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli TOP10(Promege公司)，抽提質(zhì)粒進行EcoRI、BamHI雙酶切鑒定和測序鑒定(由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司采用ABI PRISM 3730分析儀完成)。酶切產(chǎn)物電泳，在844bp處有電泳條帶，測序結(jié)果為SEQ ID NO3的片段，結(jié)果符合預(yù)期。
片段序列(SEQ ID NO3) 5’-ACCATAGATACTCCCCTGTGAGGAACTACTGTCTTCACGCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTATGAGTGTTGTGCAGCCTCCAGGACCCCCCCTCCCGGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACACCGGAATTGCCAGGACGACCGGGTCCTTTCTTGGATCAACCCGCTCAATGCCTGGAGATTTGGGCGTGCCCCCGCGAGACTGCTAGCCGAGTAGTGTTGGGTCGCGAAAGGCCTTGTGGTACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAGTGCCCCGGGAGGTCTCGTAGACCGTGCATCATGAGCACAAATCCTAAACCTCAAAGAAAAACCAAACGTAACACCAACCGCCGCCCACAGGACGTTAAGTTCCCGGGCGGTGGTCAGATCGTTGGTGGAGTTTACCTGTTGCCGCGCAGGGGCCCCAGGTTGGGTGTGCGCGCGACTAGGAAGACTTCCGAGCGGTCGCAACCTCGTGGAAGGCGACAACCTATCCCCAAGGCTCGCCGGCCCGAGGGTAGGACCTGGGCTCAGCCCGGGTACCCTTGGCCCCTCTATGGCAACGAGGGTATGGGGTGGGCAGGATGGCTCCTGTCACCCCGTGGCTCTCGGCCTAGTTGGGGCCCCACAGACCCCCGGCGTAGGTCGCGTAATTTGGGTAAGGTCATCGATACCCTTACATGCGGCTTCGCCGACCTCATGGGGTACATTCCGCTTGTCGGCGCCCCCCTAGGGGGCGCTGCCAGGGCCCTGGCACATGGTGTCCGGGTTCTGGAGGACGGCGTGAACTATGCAACAGGGAATCTGCCGCGGTTGCTCTTTCTCTATCTTC-3’ 2、體外轉(zhuǎn)錄 用上述陽性質(zhì)粒作為模板，Not I酶切線性化后在T7聚合酶的作用下體外轉(zhuǎn)錄出含目的片段的RNA，凝膠電泳檢測，在844bp處有目的條帶。純化后定量，分別用DEPC處理過的PBS緩沖液和代血漿(羥乙基淀粉20氯化鈉注射液，HES20)稀釋為106copies/ml(與正常陽性血漿中HCV濃度相近)，-80℃保存?zhèn)溆谩?br> 3、病毒滅活 取含HCV RNA 106copies/ml抗HCV及HCV RNA均為陽性的獻血員血漿標(biāo)本(上海市血液中心)、體外轉(zhuǎn)錄RNA的PBS溶液和代血漿溶液各99ml，分別加入100μmol/L的注射用MB 1ml(MB終濃度為1μmol/L)，混勻后在4℃用30000Lux可見光照射處理。在照射前(0min)，照射后2min、5min、10min、20min、30min、40min和60min分別取樣作進一步檢測，同時用未加MB的這三種溶液在同樣條件下處理作為對照組，也分別在不同照射時間留樣。
4、RNA抽提及逆轉(zhuǎn)錄 滅活后，體外轉(zhuǎn)錄RNA溶液100μl用75％7醇沉淀，而血漿則取100μl加入300μlTrizol中以提取病毒RNA，在沉淀干燥的RNA中加入含隨機引物(200nmol/L)，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(0.1U/μL)，dNTP(300μmol/L)的逆轉(zhuǎn)錄混合物30μl，在42℃條件下進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
5、實時熒光定量PCR檢測及實驗結(jié)果 針對HCV 5’-NCR區(qū)基因序列，設(shè)計熒光定量PCR引物及Taqman探針，上游引物為5’-GAACTACTGTCTTCACGCAGAAAG-3’(SEQ ID NO9)，下游引物為5’-CTGGCAATTCCGGTGTACTCA-3’(SEQ ID NO10)，探針序列為5’-(FAM)CCGCAGACCACTATGGCTCTCCCG(Eclipse)-3’(SEQ ID NO11)。引物及探針由大連寶生物(Takara)公司合成。使用上述引物，在ABI 7500型實時熒光定量擴增儀上進行檢測。循環(huán)參數(shù)為94℃變性30秒，53℃退火30秒，72℃延伸34秒，72℃時收集熒光信號，共進行45個循環(huán)，用前述構(gòu)建的質(zhì)粒，以107copies/ml濃度起，以10倍梯度稀釋作為標(biāo)準(zhǔn)品同時反應(yīng)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定不同滅活條件處理后樣品的HCV RNA濃度，結(jié)果如圖1及圖2所示。結(jié)果說明，MB-P處理后，HCV病毒RNA發(fā)生了降解，且降解程度隨著光照時間的增加而增加。
6、體外轉(zhuǎn)錄HCV RNA在代血漿或PBS緩沖液中MB-P處理后的動態(tài)變化 為進一步確定HCV RNA在MB-P處理下的降解過程，同時也為了驗證病毒包膜蛋白以及血漿中的蛋白成分在MB-P病毒滅活過程中所起的作用，本研究將體外轉(zhuǎn)錄的HCV RNA調(diào)整到106copies/ml，使之與病人血漿中HCV RNA的濃度相同，分別加入到代血漿(HES20)和PBS緩沖液中，并以病人HCV陽性血漿作為對照，按前述方法進行MB-P處理后，用步驟5中的探針及引物進行熒光定量PCR檢測HCV RNA殘留量。將檢測到的不同處理時段HCV RNA殘留量取對數(shù)，計算其所占處理前原有量的對數(shù)的百分比，并以此為縱坐標(biāo)，以光照時間為橫坐標(biāo)，作直線回歸圖，直線的斜率即為MB-P處理時HCV RNA的降解速率(圖2)。圖中結(jié)果為三次實驗的平均值。結(jié)果表明未加MB時，病人血漿中的HCV以及體外轉(zhuǎn)錄的HCV RNA均未發(fā)生降解；而在MB作用下，病人血漿中的HCV以及體外轉(zhuǎn)錄的HCV RNA均迅速降解。通過回歸直線的斜率(K)比較，發(fā)現(xiàn)，體外轉(zhuǎn)錄的HCV RNA在代血漿(HES20)中和PBS緩沖液中的降解速率相似，但二者均低于病人血漿中的HCV降解的速率。
實施例2亞甲藍光化學(xué)滅活對SV病毒核酸有破壞作用 實驗步驟 1、實驗用SV的制備及含病毒血漿的制備 (1)實驗用SV的制備 SV由中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所提供，以BHK細胞為宿主傳3代。收集上清液，測得病毒滴度＞8.51gTCID50/ml，分裝，置-80℃保存，備用。
(2)含病毒血漿的制備 在含100ml抗凝血漿的PVC塑料袋內(nèi)，按血漿∶病毒液＝9∶1的容量比接種病毒，混勻。
2、病毒滅活實驗 在上述含病毒血漿/溶液中，加入亞甲藍(MB)，使終濃度分別為0.5μmol/L，1.0μmol/L，1.5μmol/L，隨即用30000Lux可見光照射，照射時間分別為0’(不照射)，30’，60’。
3、病毒核酸檢測(定性)及結(jié)果 (1)病毒RNA提取用Trizol試劑抽提血漿中的病毒RNA，方法如下 ①Trizol 300ul加血清100ul，強烈振蕩15秒，充分混勻，室溫靜止15分鐘；②加入80ul氯仿，強烈振蕩15秒，充分混勻，室溫靜止5分鐘；③在4℃下離心，12000rpm×15分鐘；④離心結(jié)束后溶液分層，小心吸取上層水相200ul，加入等體積異丙醇；⑤顛倒混勻10次后，-20℃數(shù)小時；⑥在4℃下離心，14000rpm×15分鐘；⑦棄上清，75％預(yù)冷酒精400ul洗滌，顛倒數(shù)次；⑧4℃離心，14000rpm×5分鐘，棄上清，自然揮發(fā)干燥。
(2)引物設(shè)計根據(jù)Sindbis病毒XJ-160序列設(shè)計引物，本研究設(shè)計了2套引物，共3條，2套引物的負(fù)鏈相同，擴增片段產(chǎn)物I是323bp，II是1025bp(見下表)。由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。
(3)病毒核酸RT-PCR用TaKaRa RNA PCR kit，購自寶生物工程有限公司。具體操作參照試劑說明書進行。熱循環(huán)參數(shù)如下42℃逆轉(zhuǎn)錄30分鐘，94℃預(yù)變性2分鐘，94℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共計30個循環(huán)，最后72℃延伸5分鐘。
(4)PCR產(chǎn)物的檢測用1.5％瓊脂糖凝膠電泳法進行檢測，經(jīng)照射后的樣品均未擴增出片段，其中MB終濃度為1.0μmol/L的電泳結(jié)果見圖3。
(5)結(jié)果表明MB-P處理后，SV病毒RNA發(fā)生了降解。
實施例3亞甲藍光化學(xué)滅活對VSV病毒核酸有破壞作用 實驗步驟 1、實驗用VSV的制備及含病毒血漿的制備 (1)實驗用VSV的制備 VSV由中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所提供，以Vero細胞為宿主傳3代。收集上清液，測得病毒滴度＞8.51gTCID50/ml，分裝，置-80℃保存，備用。
(2)含病毒血漿的制備 在含100ml抗凝血漿的PVC塑料袋內(nèi)，按血漿∶病毒液＝9∶1的容量比接種病毒，混勻。
2、病毒滅活實驗 在上述含病毒血漿/溶液中，加入亞甲藍(MB)，使終濃度分別為0.5μmol/L，1.0μmol/L，1.5μmol/L，隨即用30000Lux可見光照射，照射時間分別為0’(不照射)，30’，60’。
3、病毒核酸檢測(定性)及結(jié)果 (1)病毒RNA提取用Trizol試劑抽提血漿中的病毒RNA，方法如下 ①Trizol 300ul加血清100ul，強烈振蕩15秒，充分混勻，室溫靜止15分鐘；②加入80ul氯仿，強烈振蕩15秒，充分混勻，室溫靜止5分鐘；③在4℃下離心，12000rpm×15分鐘；④離心結(jié)束后溶液分層，小心吸取上層水相200ul，加入等體積異丙醇；⑤顛倒混勻10次后，-20℃數(shù)小時；⑥在4℃下離心，14000rpm×15分鐘；⑦棄上清，75％預(yù)冷酒精400ul洗滌，顛倒數(shù)次；⑧4℃離心，14000rpm×5分鐘，棄上清，自然揮發(fā)干燥。
(2)引物設(shè)計根據(jù)VSV病毒序列設(shè)計引物，本文設(shè)計了2套引物(見下表)。由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。
(3)病毒核酸RT-PCR用TaKaRa RNA PCR kit，購自寶生物工程有限公司。具體操作參照試劑說明書進行。熱循環(huán)參數(shù)如下42℃逆轉(zhuǎn)錄30分鐘，94℃預(yù)變性2分鐘，94℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共計30個循環(huán)，最后72℃延伸5分鐘。
(4)PCR產(chǎn)物的檢測用1.5％瓊脂糖凝膠電泳法進行檢測，經(jīng)照射后的樣品均未擴增出片段。其中MB終濃度為1.0μmol/L的電泳檢驗結(jié)果如圖4。結(jié)果說明MB-P處理后，VSV病毒RNA發(fā)生了降解。
實施例4病毒核酸的降解與病毒的感染性消失存在一定的相關(guān)性 實驗步驟 1.將實施例2中經(jīng)步驟2滅活的產(chǎn)物分別取樣，接種BHK細胞，用細胞病變法(《醫(yī)用實驗病毒學(xué)》，人民軍醫(yī)出版社(第1版)P102-109杜平)，測定感染性滴度(TCID50/ml)，結(jié)果如下表 不同濃度、不同接觸時間SV感染性滅活結(jié)果
*表示所用方法已測不到病毒滴度 結(jié)果證實滅活后，病毒感染性消失了。
2.將實施例3中經(jīng)步驟2滅活的產(chǎn)物分別取樣，接種Vero細胞，用細胞病變法測定感染性滴度(TCID50/ml)，結(jié)果如下表 不同濃度、不同接觸時間VSV感染性滅活結(jié)果
*表示所用方法已測不到病毒滴度 結(jié)果證實滅活后，病毒感染性消失了。
3.結(jié)果分析由實施例2及實施例3可知，在MB-P處理下，SV病毒及VSV病毒RNA發(fā)生了降解，而本實驗又證明了MB-P處理后，SV病毒及VSV病毒感染性消失了，由此證實了病毒核酸的降解與病毒的感染性消失存在一定的相關(guān)性。
實施例5質(zhì)控品的制備 1.含SV病毒完整顆粒質(zhì)控品的制備 (1)實驗用SV的制備 SV由中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所提供，以BHK細胞為宿主傳3代。收集上清液，測得病毒滴度＞8.51gTCID50/ml，分裝，置-80℃保存，備用。
(2)含病毒血漿的制備 在含100ml抗凝血漿的PVC塑料袋內(nèi)，按血漿∶病毒液＝9∶1的容量比接種病毒，混勻。
2.含SV病毒基因的重組質(zhì)粒的質(zhì)控品的制備 (1)根據(jù)GenBank中SV序列，采用Gene runner軟件設(shè)計了兩套特異性PCR引物， 引物交由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。用Trizol(Gibco BRL)試劑抽取SVRNA后，分別使用RNA PCR KIT(Takara公司)進行逆轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)。反應(yīng)參數(shù)為42℃逆轉(zhuǎn)錄30分鐘，94℃預(yù)變性2分鐘，94℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，其中變性、退火和延伸循環(huán)30次。將PCR產(chǎn)物純化后以EcoRI、HindIII雙酶切位點克隆到pBluescript II SK(+)載體中，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli TOP10，抽提質(zhì)粒進行EcoRI、HindIII雙酶切鑒定和測序鑒定(由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司采用ABI PRISM3730分析儀完成)。酶切產(chǎn)物電泳，與第I套引物對應(yīng)的產(chǎn)物在323bp處有條帶顯示，測序結(jié)果包括SEQ ID NO1的片段，結(jié)果符合預(yù)期；與第II套引物對應(yīng)的產(chǎn)物在1025bp處有條帶顯示，測序結(jié)果包括SEQ ID NO16的片段，結(jié)果符合預(yù)期。
序列(SEQ ID NO1) 5’-tgaccgctatgtcccaatgacccgaccagcaaaactcgacgtatttccgaggaactgatgtgcataatgcatcaggctggtatattagatccccgctcatcgcgggcactatagcaacaatgaaactcgatgtatttccgaggaagcgcagtgcataatgctgcgccgtgttgccatataatcattttattaatcaactatttagcagacgctaaaactcaatgtatttctgaggaagcgtggtgcataatgccatgcagcgtctgtataatttcttttattattcttttatcaattaaccaaaattttgtttttaacatttc-3’ 序列(SEQ ID NO16) 5’-acctccttgaccagtagagaccttattgcaagcacggacattagattgcttaagccttccgttaaaaacgtgcacgtcccgtacacgcaagctgcttcaggattcgagatgtggaagaacaactcaggtcgaccactgcaggaaaccgctccttttgggtgtaagattgcagtcaacccgctacgagcggtggactgttcgtacggtaatattcctatctccatcgatatcccaaatgccgccttcattaggatatcggatgcgccgctagtttcgacggttaaatgtgaggtcagcggatgtacctattcagctgattttggtggtatggcaaccctgcagtatgtgtcggaccgcgaaggacaatgccccgtgcactctcactcaagcacagcaacacttcaggaatcgacagtgcatgtcctggagaaaggggcggtgaccgtgcactttagtaccgccagcccacaggctaatttcattatatcgctgtgtggcaagaaaacaacatgcaacgcggaatgtaagccacctgcggaccacattgtgagtacaccgcacaaaatcgatcaggagttccaaaccgctatttcaaaaacatcatggagctggttactggcactctttggcggcgcctcgtcgctattaattataggactcatgatttttacttgcagcatgttgctgacaagcacccggagatgaccgctatgtcccaatgacccgaccagcaaaactcgacgtatttccgaggaactgatgtgcataatgcatcaggctggtatattagatccccgctcatcgcgggcactatagcaacaatgaaactcgatgtatttccgaggaagcgcagtgcataatgctgcgccgtgttgccatataatcattttattaatcaactatttagcagacgctaaaactcaatgtatttctgaggaagcgtggtgcataatgccatgcagcgtctgtataatttcttttattattcttttatcaattaaccaaaattttgtttttaacatttc-3’ (2)質(zhì)控品的配制抽提質(zhì)粒，-20℃保存?zhèn)溆?。臨用前以滅菌雙蒸水稀釋，將質(zhì)粒濃度分別調(diào)至103copies/ml，104copies/ml，105copies/ml，106copies/ml，107copies/ml及108copies/ml，配制成質(zhì)控品。上述濃度的樣品既可單獨作為一個質(zhì)控品使用，也可作為質(zhì)控品系列聯(lián)合使用。
3.含SV病毒基因體外轉(zhuǎn)錄的RNA片段的質(zhì)控品的制備 用上述步驟2中(1)獲得的陽性質(zhì)粒作為模板，Not I酶切線性化后在T7聚合酶的作用下體外轉(zhuǎn)錄出含目的片段的RNA，電泳結(jié)果為分別在323bp及1025bp處有目的條帶。RNA序列(SEQ ID NO2) 5’-gaaauguuaaaaacaaaauuuugguuaauugauaaaagaauaauaaaagaaauuauacagacgcugcauggcauuaugcaccacgcuuccucagaaauacauugaguuuuagcgucugcuaaauaguugauuaauaaaaugauuauauggcaacacggcgcagcauuaugcacugcgcuuccucggaaauacaucgaguuucauuguugcuauagugcccgcgaugagcggggaucuaauauaccagccugaugcauuaugcacaucaguuccucggaaauacgucgaguuuugcuggucgggucauugggacauagcgguca-3’ RNA序列(SEQ ID NO17) 5’-gaaauguuaaaaacaaaauuuugguuaauugauaaaagaauaauaaaagaaauuauacagacgcugcauggcauuaugcaccacgcuuccucagaaauacauugaguuuuagcgucugcuaaauaguugauuaauaaaaugauuauauggcaacacggcgcagcauuaugcacugcgcuuccucggaaauacaucgaguuucauuguugcuauagugcccgcgaugagcggggaucuaauauaccagccugaugcauuaugcacaucaguuccucggaaauacgucgaguuuugcuggucgggucauugggacauagcggucaucuccgggugcuugucagcaacaugcugcaaguaaaaaucaugaguccuauaauuaauagcgacgaggcgccgccaaagagugccaguaaccagcuccaugauguuuuugaaauagcgguuuggaacuccugaucgauuuugugcgguguacucacaaugugguccgcagguggcuuacauuccgcguugcauguuguuuucuugccacacagcgauauaaugaaauuagccugugggcuggcgguacuaaagugcacggucaccgccccuuucuccaggacaugcacugucgauuccugaaguguugcugugcuugagugagagugcacggggcauuguccuucgcgguccgacacauacugcaggguugccauaccaccaaaaucagcugaauagguacauccgcugaccucacauuuaaccgucgaaacuagcggcgcauccgauauccuaaugaaggcggcauuugggauaucgauggagauaggaauauuaccguacgaacaguccaccgcucguagcggguugacugcaaucuuacacccaaaaggagcgguuuccugcaguggucgaccugaguuguucuuccacaucucgaauccugaagcagcuugcguguacgggacgugcacguuuuuaacggaaggcuuaagcaaucuaauguccgugcuugcaauaaggucucuacuggucaaggaggu-3’ 用RNA純化試劑盒(QIAGEN，RNeasy Mini Handbook)純化RNA，分別用DEPC處理水或用DEPC處理過的PBS緩沖液或代血漿(羥乙基淀粉20(HES20)氯化鈉注射液，HES20)稀釋為103copies/ml，104copies/ml，105copies/ml，106copies/ml，107copies/ml及108copies/ml，-80℃保存?zhèn)溆谩?br> 實施例6對MB-P病毒滅活效果的質(zhì)量評價 在實施例2步驟1獲得的含病毒血漿中，加入亞甲藍(MB)，使終濃度分別為0.5μmol/L，1.0μmol/L，1.5μmol/L，隨即用30000Lux可見光照射，照射時間分別為0’(不照射)，30’，60’。
在對上述血漿進行MB-P處理的同時，采用相同的條件，對實施例5獲得的質(zhì)控品進行滅活，滅活結(jié)束后，質(zhì)控品取樣。
1.普通PCR檢測(結(jié)果表明經(jīng)照射后的樣品均未擴增出片段。其中MB終濃度為1.0μmol/L的電泳結(jié)果如圖5和圖6) 1)對實施例5中含SV病毒完整顆粒質(zhì)控品，用實施例2步驟3反轉(zhuǎn)錄后進行病毒核酸檢測。照射時間為0’的質(zhì)控品可以擴增出產(chǎn)物，其余未擴增出產(chǎn)物。說明MB-P處理后達到了病毒滅活的效果。
2)對實施例5中含SV病毒基因的重組質(zhì)粒的質(zhì)控品，抽提質(zhì)粒，EcoRI、HindIII雙酶切后作為PCR模板，以實施例2步驟3的(2)中引物，對用相應(yīng)引物擴增產(chǎn)物克隆獲得的重組質(zhì)粒質(zhì)控品進行PCR進行病毒核酸檢測。擴增系統(tǒng)模板5μl，10mM dNTP0.5μl，Taq酶0.25μl，5×Buffer 5μl，Mg2+(250mM)終濃度2.5mM，引物及模板終濃度200mM，滅菌雙蒸水補充體積至25μl。實時熒光定量PCR反應(yīng)程序95℃預(yù)變性5分鐘，94℃變性30秒，53℃退火30秒，72℃延伸34秒，其中變性、退火和延伸循環(huán)35次。照射時間為0分鐘(即不光照)的質(zhì)控品可以擴增出產(chǎn)物，其余未擴增出產(chǎn)物。說明MB-P處理后達到了病毒滅活的效果。
3)對實施例5中含SV病毒基因體外轉(zhuǎn)錄的RNA片段的質(zhì)控品，用實施例2步驟3反轉(zhuǎn)錄后進行病毒核酸檢測。以實施例2步驟3的(2)中引物，對用相應(yīng)引物擴增產(chǎn)物克隆獲得的重組質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄的RNA片段的質(zhì)控品進行PCR進行病毒核酸檢測。照射時間為0’的質(zhì)控品可以擴增出產(chǎn)物，其余未擴增出產(chǎn)物。說明MB-P處理后達到了病毒滅活的效果。
2.實時熒光定量PCR檢測及結(jié)果 1)對實施例5中含SV病毒完整顆粒質(zhì)控品，用實施例2的方法提取病毒RNA，用實施例1步驟4的方法反轉(zhuǎn)錄成DNA，作為PCR模板。
2)對實施例5中含SV病毒基因的重組質(zhì)粒的質(zhì)控品，抽提質(zhì)粒，EcoRI、HindIII雙酶切后作為PCR模板。
3)對實施例5中含SV病毒基因體外轉(zhuǎn)錄的RNA片段的質(zhì)控品，用實施例2的方法提取病毒RNA，用實施例1步驟4的方法反轉(zhuǎn)錄成DNA，作為PCR模板。
針對SV基因序列，設(shè)計熒光定量PCR引物及Taqman探針， 產(chǎn)物序列(5’-3’)SEQ ID NO20 CGGAATTCCGTATAGCAACAATGAAACTCGATGTATTTCCGAGGAAGCGCAGTGCATAATGCTGCGCCGTGTTGCCATATAATCATTTTATTAATCAACTATTTAGCAGACGCTAAAACTCAATGTATTTCTGAGGAAGCGTGGTGCATAATGCCATGCAGCGTCTGTATAATTTCTTTTATTATTCTTTTATCAATTAACCAAAATTTTGTTTTTAACATTTCCCAAGCTTGGProbe(5’-3’)SEQ ID NO21CAT TAT GCA CTG CGC TTC CTC G 產(chǎn)物序列(5’-3’)SEQID NO24 CGGAATTCCGTGGAGCTGGTTACTGGCACTCTTTGGCGGCGCCTCGTCGCTATTAATTATAGGACTCATGATTTTTACTTGCAGCATGTTGCTGACAAGCACCCGGAGATGACCGCTATGTCCCAATGACCCGACCAGCAAAACTCGACGTATTTCCGAGGAACTGATGTGCATAATGCATCAGGCTGGTATATTAGATCCCCGCTCATCGCGGGCACTATAGCAACAATGCCAAGCTTGG Probe(5’-3’)SEQ ID NO25TTT GCT GGT CGG GTC ATT GGG A 產(chǎn)物序列(5’-3’)SEQ ID NO28 CGGAATTCCGACCGTGCACTTTAGTACCGCCAGCCCACAGGCTAATTTCATTATATCGCTGTGTGGCAAGAAAACAACATGCAACGCGGAATGTAAGCCACCTGCGGACCACATTGTGAGTACACCGCACAAAATCGATCAGGAGTTCCAAACCGCTATTTCAAAAACATCATGGAGCTGGTTACTGGCACTCTTTGGCGCCAAGCTTGG Probe(5’-3’)SEQ ID NO29TGG CTT ACA TTC CGC GTT GCA T 產(chǎn)物序列(5’-3’)SEQ ID NO32 CGGAATTCCGCTACGAGCGGTGGACTGTTCGTACGGTAATATTCCTATCTCCATCGATATCCCAAATGCCGCCTTCATTAGGATATCGGATGCGCCGCTAGTTTCGACGGTTAAATGTGAGGTCAGCGGATGTACCTATTCAGCTGATTTTGGTGGTATGGCAACCCTGCAGTATGTGTCGGACCGCGAAGGACAATGCCCCGTGCACTCTCACTCAAGCACAGCAACACTTCAGGAATCGACAGTGCATGTCCTGGAGAAAGGGGCGGTGACCGTGCACTTTAGTACCGCCCAAGCTTGG Probe(5’-3’)SEQ ID NO33AAG GCG GCA TTT GGG ATA TCG A 產(chǎn)物序列(5’-3’)SEQ ID NO36 CGGAATTCCGATTGCAAGCACGGACATTAGATTGCTTAAGCCTTCCGTTAAAAACGTGCACGTCCCGTACACGCAAGCTGCTTCAGGATTCGAGATGTGGAAGAACAACTCAGGTCGACCACTGCAGGAAACCGCTCCTTTTGGGTGTAAGATTGCAGTCAACCCGCTACGAGCGGTGGACTGTTCGTACGGTACCAAGCTTGG Probe(5’-3’)SEQ ID NO37AAG CAG CTT GCG TGT ACG GGA C 引物及探針由大連寶生物(Takara)公司合成。模板5μl，10mM dNTP 0.5μl，Taq酶0.25μl，5×Buffer 5μl，Mg2+(250mM)終濃度2.5mM，引物及模板終濃度200mM，滅菌雙蒸水補充體積至25μl。在ABI 7500型實時熒光定量擴增儀上進行檢測。循環(huán)參數(shù)為94℃變性30秒，53℃退火30秒，72℃延伸34秒，72℃時收集熒光信號，共進行45個循環(huán)，用實施例5中2(1)構(gòu)建的質(zhì)粒，以107copies/ml濃度起，以10倍梯度稀釋作為標(biāo)準(zhǔn)品同時反應(yīng)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定不同滅活條件處理后樣品的SV濃度。其中MB終濃度為1.0μmol/L的實時熒光定量PCR電泳結(jié)果如圖7-9。結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著滅活過程的進行，PCR產(chǎn)物逐步遞減，即病毒核酸逐步被降解。結(jié)果動態(tài)反映了MB-P滅活的效果。
3.MB-P處理后SV細胞病變檢測 用實施例4的方法對本例中經(jīng)MB-P處理的血漿取樣進行細胞病變檢測，結(jié)果如下 不同濃度、不同接觸時間SV感染性滅活結(jié)果

*表示所用方法已測不到病毒滴度 本步驟的目的是以現(xiàn)有技術(shù)來評價MB-P的效果，結(jié)果可見，與前述質(zhì)控品檢測結(jié)果一樣，MB-P處理后達到了病毒滅活的效果。本步驟進一步驗證了可以采用本發(fā)明的方法來評價MB-P滅活效果。
SEQUENCE LISTING
<110>上海市血液中心
<120>亞甲藍光化學(xué)病毒滅活效果質(zhì)量評價方法及其質(zhì)控品
<130>PCNXY070109
<160>37
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>323
<212>DNA
<213>Sindbis virus
<400>1
tgaccgctat gtcccaatga cccgaccagc aaaactcgac gtatttccga ggaactgatg 60
tgcataatgc atcaggctgg tatattagat ccccgctcat cgcgggcact atagcaacaa 120
tgaaactcga tgtatttccg aggaagcgca gtgcataatg ctgcgccgtg ttgccatata 180
atcattttat taatcaacta tttagcagac gctaaaactc aatgtatttc tgaggaagcg 240
tggtgcataa tgccatgcag cgtctgtata atttctttta ttattctttt atcaattaac 300
caaaattttg tttttaacat ttc 323
<210>2
<211>323
<212>RNA
<213>Sindbis virus
<400>2
gaaauguuaa aaacaaaauu uugguuaauu gauaaaagaa uaauaaaaga aauuauacag 60
acgcugcaug gcauuaugca ccacgcuucc ucagaaauac auugaguuuu agcgucugcu 120
aaauaguuga uuaauaaaau gauuauaugg caacacggcg cagcauuaug cacugcgcuu 180
ccucggaaau acaucgaguu ucauuguugc uauagugccc gcgaugagcg gggaucuaau 240
auaccagccu gaugcauuau gcacaucagu uccucggaaa uacgucgagu uuugcugguc 300
gggucauugg gacauagcgg uca 323
<210>3
<211>844
<212>DNA
<213>Hepatitis C virus
<400>3
accatagata ctcccctgtg aggaactact gtcttcacgc agaaagcgtc tagccatggc60
gttagtatga gtgttgtgca gcctccagga ccccccctcc cgggagagcc atagtggtct120
gcggaaccgg tgagtacacc ggaattgcca ggacgaccgg gtcctttctt ggatcaaccc180
gctcaatgcc tggagatttg ggcgtgcccc cgcgagactg ctagccgagt agtgttgggt240
cgcgaaaggc cttgtggtac tgcctgatag ggtgcttgcg agtgccccgg gaggtctcgt300
agaccgtgca tcatgagcac aaatcctaaa cctcaaagaa aaaccaaacg taacaccaac360
cgccgcccac aggacgttaa gttcccgggc ggtggtcaga tcgttggtgg agtttacctg420
ttgccgcgca ggggccccag gttgggtgtg cgcgcgacta ggaagacttc cgagcggtcg480
caacctcgtg gaaggcgaca acctatcccc aaggctcgcc ggcccgaggg taggacctgg540
gctcagcccg ggtacccttg gcccctctat ggcaacgagg gtatggggtg ggcaggatgg600
ctcctgtcac cccgtggctc tcggcctagt tggggcccca cagacccccg gcgtaggtcg660
cgtaatttgg gtaaggtcat cgataccctt acatgcggct tcgccgacct catggggtac720
attccgcttg tcggcgcccc cctagggggc gctgccaggg ccctggcaca tggtgtccgg780
gttctggagg acggcgtgaa ctatgcaaca gggaatctgc cgcggttgct ctttctctat840
cttc 844
<210>4
<211>17
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>4
tgaccgctat gtcccaa 17
<210>5
<211>19
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>5
gaaatgttaa aaacaaaat 19
<210>6
<211>19
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>6
acctccttga ccagtagag 19
<210>7
<211>27
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>7
cggaattccg accatagata ctcccct27
<210>8
<211>32
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>8
cgggatcccg gaagatagag aaagagcaac cg32
<210>9
<211>24
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>9
gaactactgt cttcacgcag aaag 24
<210>10
<211>21
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>10
ctggcaattc cggtgtactc a21
<210>11
<211>24
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>探針
<400>11
ccgcagacca ctatggctct cccg24
<210>12
<211>28
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>12
cggaattccg aaaggctcag gagaaact28
<210>13
<211>28
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>13
ccaagcttgg tttgaggcct tggtagac28
<210>14
<211>28
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>14
cggaattccg ctaccaaggc ctcaaatc28
<210>15
<211>28
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>15
ccaagcttgg aaccatttgt catctgcg28
<210>16
<211>1025
<212>DNA
<213>Sindbis virus
<400>16
acctccttga ccagtagaga ccttattgca agcacggaca ttagattgct taagccttcc60
gttaaaaacg tgcacgtccc gtacacgcaa gctgcttcag gattcgagat gtggaagaac120
aactcaggtc gaccactgca ggaaaccgct ccttttgggt gtaagattgc agtcaacccg180
ctacgagcgg tggactgttc gtacggtaat attcctatct ccatcgatat cccaaatgcc240
gccttcatta ggatatcgga tgcgccgcta gtttcgacgg ttaaatgtga ggtcagcgga300
tgtacctatt cagctgattt tggtggtatg gcaaccctgc agtatgtgtc ggaccgcgaa360
ggacaatgcc ccgtgcactc tcactcaagc acagcaacac ttcaggaatc gacagtgcat420
gtcctggaga aaggggcggt gaccgtgcac tttagtaccg ccagcccaca ggctaatttc480
attatatcgc tgtgtggcaa gaaaacaaca tgcaacgcgg aatgtaagcc acctgcggac540
cacattgtga gtacaccgca caaaatcgat caggagttcc aaaccgctat ttcaaaaaca600
tcatggagct ggttactggc actctttggc ggcgcctcgt cgctattaat tataggactc660
atgattttta cttgcagcat gttgctgaca agcacccgga gatgaccgct atgtcccaat720
gacccgacca gcaaaactcg acgtatttcc gaggaactga tgtgcataat gcatcaggct780
ggtatattag atccccgctc atcgcgggca ctatagcaac aatgaaactc gatgtatttc840
cgaggaagcg cagtgcataa tgctgcgccg tgttgccata taatcatttt attaatcaac900
tatttagcag acgctaaaac tcaatgtatt tctgaggaag cgtggtgcat aatgccatgc960
agcgtctgta taatttcttt tattattctt ttatcaatta accaaaattt tgtttttaac1020
atttc1025
<210>17
<211>1025
<212>RNA
<213>Sindbis virus
<400>17
gaaauguuaa aaacaaaauu uugguuaauu gauaaaagaa uaauaaaaga aauuauacag60
acgcugcaug gcauuaugca ccacgcuucc ucagaaauac auugaguuuu agcgucugcu120
aaauaguuga uuaauaaaau gauuauaugg caacacggcg cagcauuaug cacugcgcuu180
ccucggaaau acaucgaguu ucauuguugc uauagugccc gcgaugagcg gggaucuaau240
auaccagccu gaugcauuau gcacaucagu uccucggaaa uacgucgagu uuugcugguc300
gggucauugg gacauagcgg ucaucuccgg gugcuuguca gcaacaugcu gcaaguaaaa360
aucaugaguc cuauaauuaa uagcgacgag gcgccgccaa agagugccag uaaccagcuc420
caugauguuu uugaaauagc gguuuggaac uccugaucga uuuugugcgg uguacucaca480
augugguccg cagguggcuu acauuccgcg uugcauguug uuuucuugcc acacagcgau540
auaaugaaau uagccugugg gcuggcggua cuaaagugca cggucaccgc cccuuucucc600
aggacaugca cugucgauuc cugaaguguu gcugugcuug agugagagug cacggggcau660
uguccuucgc gguccgacac auacugcagg guugccauac caccaaaauc agcugaauag720
guacauccgc ugaccucaca uuuaaccguc gaaacuagcg gcgcauccga uauccuaaug780
aaggcggcau uugggauauc gauggagaua ggaauauuac cguacgaaca guccaccgcu840
cguagcgggu ugacugcaau cuuacaccca aaaggagcgg uuuccugcag uggucgaccu900
gaguuguucu uccacaucuc gaauccugaa gcagcuugcg uguacgggac gugcacguuu960
uuaacggaag gcuuaagcaa ucuaaugucc gugcuugcaa uaaggucucu acuggucaag1020
gaggu1025
<210>18
<211>29
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>18
cggaattccg tatagcaaca atgaaactc29
<210>19
<211>29
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>19
ccaagcttgg gaaatgttaa aaacaaaat29
<210>20
<211>234
<212>DNA
<213>Sindbis virus
<400>20
cggaattccg tatagcaaca atgaaactcg atgtatttcc gaggaagcgc agtgcataat60
gctgcgccgt gttgccatat aatcatttta ttaatcaact atttagcaga cgctaaaact120
caatgtattt ctgaggaagc gtggtgcata atgccatgca gcgtctgtat aatttctttt180
attattcttt tatcaattaa ccaaaatttt gtttttaaca tttcccaagc ttgg 234
<210>21
<211>22
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>探針
<400>21
cattatgcac tgcgcttcct cg22
<210>22
<211>30
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>22
cggaattccg tggagctggt tactggcact30
<210>23
<211>30
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>23
ccaagcttgg cattgttgct atagtgcccg30
<210>24
<211>241
<212>DNA
<213>Sindbis virus
<400>24
cggaattccg tggagctggt tactggcact ctttggcggc gcctcgtcgc tattaattat60
aggactcatg atttttactt gcagcatgtt gctgacaagc acccggagat gaccgctatg120
tcccaatgac ccgaccagca aaactcgacg tatttccgag gaactgatgt gcataatgca 180
tcaggctggt atattagatc cccgctcatc gcgggcacta tagcaacaat gccaagcttg 240
g 241
<210>25
<211>22
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>探針
<400>25
tttgctggtc gggtcattgg ga22
<210>26
<211>30
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>26
cggaattccg accgtgcact ttagtaccgc30
<210>27
<211>30
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>27
ccaagcttgg cgccaaagag tgccagtaac30
<210>28
<211>210
<212>DNA
<213>Sindbis virus
<400>28
cggaattccg accgtgcact ttagtaccgc cagcccacag gctaatttca ttatatcgct60
gtgtggcaag aaaacaacat gcaacgcgga atgtaagcca cctgcggacc acattgtgag120
tacaccgcac aaaatcgatc aggagttcca aaccgctatt tcaaaaacat catggagctg180
gttactggca ctctttggcg ccaagcttgg 210
<210>29
<211>22
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>探針
<400>29
tggcttacat tccgcgttgc at22
<210>30
<211>30
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>30
cggaattccg ctacgagcgg tggactgttc30
<210>31
<211>30
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>31
ccaagcttgg gcggtactaa agtgcacggt30
<210>32
<211>301
<212>DNA
<213>Sindbis virus
<400>32
cggaattccg ctacgagcgg tggactgttc gtacggtaat attcctatct ccatcgatat60
cccaaatgcc gccttcatta ggatatcgga tgcgccgcta gtttcgacgg ttaaatgtga120
ggtcagcgga tgtacctatt cagctgattt tggtggtatg gcaaccctgc agtatgtgtc180
ggaccgcgaa ggacaatgcc ccgtgcactc tcactcaagc acagcaacac ttcaggaatc240
gacagtgcat gtcctggaga aaggggcggt gaccgtgcac tttagtaccg cccaagcttg300
g301
<210>33
<211>22
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>探針
<400>33
aaggcggcat ttgggatatc ga22
<210>34
<211>30
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>34
cggaattccg attgcaagca cggacattag30
<210>35
<211>30
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>35
ccaagcttgg taccgtacga acagtccacc30
<210>36
<211>204
<212>DNA
<213>Sindbis virus
<400>36
cggaattccg attgcaagca cggacattag attgcttaag ccttccgtta aaaacgtgca60
cgtcccgtac acgcaagctg cttcaggatt cgagatgtgg aagaacaact caggtcgacc120
actgcaggaa accgctcctt ttgggtgtaa gattgcagtc aacccgctac gagcggtgga180
ctgttcgtac ggtaccaagc ttgg 204
<210>37
<211>22
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>探針
<400>37
aagcagcttg cgtgtacggg ac2權(quán)利要求
1. 一種亞甲藍光化學(xué)病毒滅活效果質(zhì)量評價的檢測方法，包括以下步驟在對血液或血液制品進行亞甲藍光化學(xué)滅活的同時，對質(zhì)控品進行相同條件的滅活，質(zhì)控品含有SV病毒完整顆?；騍V病毒基因的重組質(zhì)?；騍V病毒基因體外轉(zhuǎn)錄的RNA片段，通過特異性引物，利用PCR技術(shù)擴增質(zhì)控品中SV病毒基因的特定區(qū)域，通過對PCR結(jié)果的監(jiān)測，從分子水平對亞甲藍光化學(xué)病毒滅活效果進行質(zhì)量評價。
2. 如權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征為，所述特異性引物序列選自下組中的一組
1)TGACCGCTATGTCCCAA及GAAATGTTAAAAACAAAAT；
2)ACCTCCTTGACCAGTAGAG及GAAATGTTAAAAACAAAAT；
3)CGGAATTCCGTATAGCAACAATGAAACTC及CCAAGCTTGGGAAATGTTAAAAACAAAAT
4)CGGAATTCCGTGGAGCTGGTTACTGGCACT及CCAAGCTTGGCATTGTTGCTATAGTGCCCG；
5)CGGAATTCCGACCGTGCACTTTAGTACCGC及CCAAGCTTGGCGCCAAAGAGTGCCAGTAAC；
6)CGGAATTCCGCTACGAGCGGTGGACTGTTC及CCAAGCTTGGGCGGTACTAAAGTGCACGGT；
7)CGGAATTCCGATTGCAAGCACGGACATTAG及CCAAGCTTGGTACCGTACGAACAGTCCACC。
3. 如權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征為，所述SV病毒基因的重組質(zhì)粒含有序列SEQID NO1或SEQ ID NO16。
4. 如權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征為，所述SV病毒基因體外轉(zhuǎn)錄的RNA片段含有序列SEQ ID NO2或SEQ ID NO17。
5. 如權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征為，所述PCR技術(shù)為普通PCR或?qū)崟r熒光定量PCR。
6. 一種如權(quán)利要求1所述的檢測方法中使用的質(zhì)控品，其特征在于，質(zhì)控品含有包含序列SEQ ID NO1或SEQ ID NO16的重組質(zhì)?；虬蛄蠸EQ ID NO2或SEQ ID NO17的RNA。
7. 如權(quán)利要求6所述的質(zhì)控品，其特征在于，所述重組質(zhì)粒為序列SEQ ID NO1或SEQ IDNO16與pBluescript II SK(+)重組獲得的質(zhì)粒。
8. 如權(quán)利要求6所述的質(zhì)控品，其特征在于，所述RNA片段的序列為SEQ ID NO2或SEQID NO17。
全文摘要
本發(fā)明涉及血液病毒滅活效果質(zhì)量評價領(lǐng)域。本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)中MB-P滅活效果質(zhì)量評價方法價格貴，周期長，不適合在常規(guī)工作中開展的問題，公開了一種新的亞甲藍光化學(xué)病毒滅活效果質(zhì)量評價檢測方法，包括以下步驟在對血液或血液制品進行滅活的同時，對質(zhì)控品進行相同條件的滅活，質(zhì)控品含SV病毒完整顆?；蚝琒V病毒基因的重組質(zhì)?；蚝琒V病毒基因體外轉(zhuǎn)錄的RNA片段，通過特異性引物，利用PCR技術(shù)擴增質(zhì)控品中SV病毒基因的特定區(qū)域，通過對PCR結(jié)果的監(jiān)測，從分子水平對亞甲藍光化學(xué)病毒滅活效果進行質(zhì)量評價。同時還公開了其質(zhì)控品。本發(fā)明操作簡單，準(zhǔn)確度好，實驗周期短，需要的實驗條件容易達到，更為經(jīng)濟有效。
文檔編號C12N15/11GK101285091SQ200710039358
公開日2008年10月15日 申請日期2007年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月11日
發(fā)明者嵐 鄭, 黃宇聞, 迅 王, 琴 莫, 劉曉穎, 錢開誠 申請人:上海市血液中心