專利名稱：根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)zeocin抗性基因轉(zhuǎn)化工業(yè)化產(chǎn)甘油假絲酵母的方法
根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)ZS0">2抗性基因轉(zhuǎn)化工業(yè)化產(chǎn)甘油假絲酵母的方法 技術(shù)領(lǐng)域根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)抗性基因轉(zhuǎn)化工業(yè)化產(chǎn)甘油假絲酵母，將外源基因 整合到宿主染色體上，屬于基因工程中轉(zhuǎn)化技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景轉(zhuǎn)化是酵母基因操作技術(shù)中的重要步驟之一。由于酵母細(xì)胞不像大腸桿菌和枯草芽胞桿菌等原核微生物那樣具有可以將外源DNA攝入細(xì)胞內(nèi)的特殊生理 狀態(tài)(感受態(tài))'，因此酵母轉(zhuǎn)化曾是酵母基因工程研究的一大限制因素。目前廣 泛采用的酵母轉(zhuǎn)化方法主要有原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法、醋酸鋰轉(zhuǎn)化法、電擊轉(zhuǎn)化法等。 這些方法在釀酒酵母的遺傳轉(zhuǎn)化研究上已取得了巨大的成功。由于工業(yè)應(yīng)用酵母菌株和實(shí)驗(yàn)室用的酵母菌株在細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)、生理生化特 性、遺傳背景及生長(zhǎng)環(huán)境等方面存在巨大的差異，在轉(zhuǎn)化工業(yè)應(yīng)用酵母時(shí)需要 建立相對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)化體系。但是，上面所述的轉(zhuǎn)化方法在轉(zhuǎn)化一些工業(yè)酵母菌株 時(shí)往往存在轉(zhuǎn)化率低、轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定性差、難以重復(fù)等困難，有些菌株甚至無(wú)法 轉(zhuǎn)化。針對(duì)這一問(wèn)題，研究人員提出了不同的改進(jìn)方法以及新的轉(zhuǎn)化方法。其 中，根癌農(nóng)桿菌(JgraZwcten'MW ^me/"c/era)介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法是有效的方法 之一。1995年Bundock等首次成功進(jìn)行了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)酵母菌的遺傳轉(zhuǎn)化。進(jìn) 一步研究發(fā)現(xiàn)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法具有轉(zhuǎn)化低拷貝、高頻率轉(zhuǎn)移、成 本低、穩(wěn)定性好、操作方便和重復(fù)性好、能轉(zhuǎn)化大片段DNA (大到50Kb的外 源DNA)、能明顯提高轉(zhuǎn)化率獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子等優(yōu)點(diǎn)，在應(yīng)用領(lǐng)域中具有很大 的潛能。產(chǎn)甘油假絲酵母是目前我國(guó)用于工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)甘油的優(yōu)良菌株之一，它 具有甘油產(chǎn)率高、耐高滲壓、發(fā)酵條件粗放、菌體生長(zhǎng)速度及發(fā)酵速度快、轉(zhuǎn) 化率高、發(fā)酵原料簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。除了甘油，產(chǎn)甘油假絲酵母還能產(chǎn)生多種其他 多元醇，如赤蘚醇、D-阿拉伯醇和甘露醇等，因此是一株具有很高的潛在應(yīng)用 價(jià)值的酵母。采用基因工程手段構(gòu)建重組菌是進(jìn)一步改進(jìn)產(chǎn)甘油假絲酵母性能 的途徑，實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)首先要獲得有效的載體和轉(zhuǎn)化方法，在此基礎(chǔ)上才有可 能對(duì)產(chǎn)甘油假絲酵母代謝途徑進(jìn)行有目的的改造，以達(dá)到提高甘油產(chǎn)量和改善 工藝的目的。成功建立其遺傳轉(zhuǎn)化體系能改進(jìn)甘油生產(chǎn)，還可以為通過(guò)代謝工 程進(jìn)一步構(gòu)建高產(chǎn)其他多元醇的重組菌創(chuàng)造條件，所采用的轉(zhuǎn)化方法和載體構(gòu) 建方法也能為其他耐高滲酵母的基因工程改造提供借鑒。因此，建立產(chǎn)甘油假 絲酵母的遺傳轉(zhuǎn)化體系具有重要意義。本發(fā)明采用根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)來(lái)轉(zhuǎn)化產(chǎn)甘油假絲酵母，實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)甘油假 絲酵母的遺傳轉(zhuǎn)化體系的成功建立。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)MOC/"抗性基因轉(zhuǎn)化工業(yè)化產(chǎn)甘 油假絲酵母的方法，構(gòu)建雙元載體成功地實(shí)現(xiàn)了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)產(chǎn)甘油假絲酵 母的轉(zhuǎn)化。并針對(duì)產(chǎn)甘油假絲酵母生長(zhǎng)快的特點(diǎn)對(duì)轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了適當(dāng)?shù)膬?yōu)化。 為進(jìn)一步研究產(chǎn)甘油假絲酵母打下了良好的基礎(chǔ)。本發(fā)明的技術(shù)方案根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)抗性基因轉(zhuǎn)化工業(yè)化產(chǎn)甘油假絲酵母的方法，是以質(zhì)粒pPICZB為模板通過(guò)PCR技術(shù)獲得2eocf"抗性基因， 再與線性化質(zhì)粒pCAM 3300連接，獲得重組質(zhì)粒pCAM 3300- zeoc// ;質(zhì)粒 pCAM 3300—zeo"'"轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌LBA4404，再和產(chǎn)甘油假絲酵母共培養(yǎng)， 根癌農(nóng)桿菌LBA4404/pCAM 3300—zeoc/w質(zhì)粒轉(zhuǎn)化工業(yè)化產(chǎn)甘油假絲酵母；(1) 基因的克隆 根據(jù)M0"'T7基因的特異性設(shè)計(jì)引物弓i物R: 5'醒GTCAGTCCTGCTCCTCGGCCACGAAG-3'; 弓1物F: 5，- ATGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTTC-3 ，；PCR擴(kuò)增zeo"Vz基因得到300bp的特異條帶；PCR方法如下取質(zhì)粒pPICZB模板1 jiL， 10 xPCR緩沖液2 (iL，引物R、 F各lpL， dNTPs2(iL， Taq DNA聚合酶0.5 pL，總反應(yīng)體積為20 |_iL;循環(huán)參 數(shù)94 。C預(yù)變性5 min， 94 。C 45 s， 56°C 90 s， 72 °C卯s， 35個(gè)循環(huán)，72 °C 延伸10min;通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析反應(yīng)產(chǎn)物，在加樣泳道出現(xiàn)目標(biāo)條帶，用PCR片 斷膠回收試劑盒純化出0.3kb的目標(biāo)片斷，純化好的目標(biāo)片斷與pEGM-T-Easy vector連接保存；再用相應(yīng)五coi I酶切，膠回收zeoc^目標(biāo)基因，￡caR I酶切 線性化質(zhì)粒pCAM 3300;在T4連接酶的作用下連接得到pCAM 3300-zeoc&;(2) 質(zhì)粒pCAM3300—zeoc&轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌LBA4404將重組質(zhì)粒pCAM 3300—zeocZ"通過(guò)電擊直接轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404， 在卡那霉素抗性平板上挑取抗性轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒酶切驗(yàn)證，得到重組菌 LBA4404/pCAM 3300—，c〖Vz;(3) 根癌農(nóng)桿菌LBA4404/pCAM 3300—zeocz'"質(zhì)粒轉(zhuǎn)化工業(yè)化產(chǎn)甘油假絲酵母將重組菌LBA4404/pCAM3300—zeoc/"于LB培養(yǎng)基(卡那霉素50 pg/mL，
利富霉素50嗎/mL，鏈霉素30|Lig/mL)中，30°C， 200 r/min搖床培養(yǎng)36 h，離 心收集菌體；用等體積的IM培養(yǎng)基重懸，培養(yǎng)6h;接種產(chǎn)甘油假絲酵母 WL2002-5于YPD培養(yǎng)基中，30°C、 200 r/min搖床培養(yǎng)過(guò)夜；產(chǎn)甘油假絲酵母 的YPD培養(yǎng)液按1:5稀釋到Y(jié)PD新鮮培養(yǎng)基中，培養(yǎng)6h;分別離心收集根癌 農(nóng)桿菌菌體和產(chǎn)甘油假絲酵母，用生理鹽水清洗一次，用IM培養(yǎng)基重懸菌體， 產(chǎn)甘油假絲酵母細(xì)胞終濃度達(dá)到109個(gè)/mL，根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞終濃度達(dá)到1011個(gè) /mL，各取50fiL加入20mLIM培養(yǎng)基(乙酰丁香酮200 pmol/L，卡那霉素50 1Lig/mL，利富霉素50|iig/mL)中30。C、 200 r/min共培養(yǎng)過(guò)夜；取200 |iL培養(yǎng) 液涂布鋪有玻璃紙的IM+AS固體培養(yǎng)基平板置于25T:培養(yǎng)24h;將玻璃紙轉(zhuǎn)接 到SM培養(yǎng)基(頭孢噻月虧200|amol/L， zoec/w 150 mg/L)上培養(yǎng)兩天，篩選陽(yáng) 性酵母轉(zhuǎn)化子。重組根癌農(nóng)桿菌LBA4404/pCAM3300—zeoc/"介導(dǎo)轉(zhuǎn)化產(chǎn)甘油假絲酵母 WL2002-5的優(yōu)化轉(zhuǎn)化條件(1) IM固體培養(yǎng)基誘導(dǎo)時(shí)間優(yōu)化優(yōu)化的共培養(yǎng)時(shí)間為24h;(2) 共培養(yǎng)根癌農(nóng)桿菌菌體濃度優(yōu)化產(chǎn)甘油假絲酵母比根癌農(nóng)桿菌菌體細(xì)胞比例為1:500-1000時(shí)，最高轉(zhuǎn)化率達(dá)到2個(gè)轉(zhuǎn)化子/104個(gè)酵母細(xì)胞。zeoc&是一種屬于爭(zhēng)光霉素家族的糖蛋白抗生素，在體內(nèi)能作用于大多數(shù) 細(xì)菌(包括:￡."http://)和真菌(如酵母菌)。為了高效挑選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，從質(zhì)粒pPICZB 上獲得zeo"'w抗性基因插入質(zhì)粒pCAM 3300，獲得重組質(zhì)粒pCAM 3300- zeo"'n。通過(guò)電擊直接轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404。在卡那霉素抗性平板上挑取抗性 轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒酶切驗(yàn)證。本發(fā)明的有益效果根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化酵母系統(tǒng)具有操作簡(jiǎn)單(不需要制備 原生質(zhì)體)、轉(zhuǎn)化效率高、易于得到轉(zhuǎn)化子、轉(zhuǎn)化子遺傳穩(wěn)定等優(yōu)良的特點(diǎn)。耐 高滲產(chǎn)甘油假絲酵母(C朋^^g&cm^gewM) WL2002-5是江南大學(xué)工業(yè)微生 物研究中心的科技工作者經(jīng)過(guò)三十年的潛心研究得到的優(yōu)良菌株微生物學(xué)報(bào) Vol.39 No. 1 1999.2。產(chǎn)甘油假絲酵母具有甘油產(chǎn)率高、耐高滲、生長(zhǎng)快、發(fā) 酵原料簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。除了甘油，耐高滲酵母還能產(chǎn)生多種其他多元醇，如赤蘚 醇、D-阿拉伯醇和甘露醇等，因此是一類具有很高的潛在應(yīng)用價(jià)值的酵母。采 用基因工程手段構(gòu)建重組菌是進(jìn)一步改進(jìn)產(chǎn)甘油假絲酵母性能的重要途徑，實(shí) 現(xiàn)這一目標(biāo)首先要獲得有效的載體和轉(zhuǎn)化方法，在此基礎(chǔ)上才有可能對(duì)產(chǎn)甘油 假絲酵母代謝途徑進(jìn)行有目的的改造，以達(dá)到提高甘油產(chǎn)量和改善工藝的目的。 成功建立其遺傳轉(zhuǎn)化體系除可以改進(jìn)甘油生產(chǎn)外還可以為通過(guò)代謝工程進(jìn)一步 研究產(chǎn)甘油假絲酵母，以及構(gòu)建高產(chǎn)其他多元醇的重組菌創(chuàng)造條件。因此，建 立產(chǎn)甘油假絲酵母的遺傳轉(zhuǎn)化體系具有重要意義。


圖1重組質(zhì)粒pCAM 3300-zeocz'"的構(gòu)建圖2質(zhì)粒pCAM 3300-zeocz'"酶切驗(yàn)證Lane 1 T-zeoc/"/五coR I ; Lane 2 DNA Marker: DL20002; Lane 3 zeo"'"/ ￡coR I ; Lane 4 pCAM 3300/￡coR I ; Lane 5 pCAM 3300-磨"感coR I ; Lane 6. pCAM 3300-zeo"惑awh I ; Lane 7 DNA Marker: XDNA/歷"dIII。圖3陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子PCR驗(yàn)證 Lane 1 zoecz'"基因的特異擴(kuò)增；Lane2 DNA Marker DL2000; Lane 3、 4、 5、 6陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子zoec/"基因特異擴(kuò)增；Lane 7產(chǎn) 甘油假絲酵母加ec^基因特異擴(kuò)增；Lane 8產(chǎn)甘油假絲酵母18S rDNA擴(kuò)增。圖4不同誘導(dǎo)時(shí)間轉(zhuǎn)化子生長(zhǎng)情況 1.誘導(dǎo)培養(yǎng)0h;2.誘導(dǎo)培養(yǎng)12h; 3.誘導(dǎo)培養(yǎng)18h; 4.誘導(dǎo)培養(yǎng)24h; 5.誘導(dǎo)培養(yǎng)30h; 6.誘導(dǎo)培養(yǎng)36h。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1 構(gòu)建重組質(zhì)粒pCAM 3300-以質(zhì)粒pPICZB為模板通過(guò)PCR技術(shù)獲得z "'"抗性基因，再與線性化質(zhì) 粒pCAM 3300連接，獲得重組質(zhì)粒pCAM 3300- zeoc/",zeoc/w基因的克隆根據(jù)Zeo"Vz基因的特異性設(shè)計(jì)引物引物R: 5'-GTCAGTCCTGCTCCTCGGCCACGAAG -3，； 弓1物F: 5,- ATGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTTC-3 ，；PCR擴(kuò)增zeo"'"基因得到300bp的特異條帶；PCR方法如下取質(zhì)粒pPICZB模板1 |iL， 10xPCR緩沖液2jiL，引物R、 F各lpL， dNTPs2^iL， Taq DNA聚合酶0.5 pL，總反應(yīng)體積為20 (iL;循環(huán)參 數(shù)94。C預(yù)變性5min， 94 。C 45 s， 56°C 90 s， 72 °C 90 s， 35個(gè)循環(huán)，72 °C 延伸10 min。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析反應(yīng)產(chǎn)物，在加樣泳道出現(xiàn)目標(biāo)條帶，用PCR片 斷膠回收試劑盒純化出0.3kb的目標(biāo)片斷，純化好的目標(biāo)片斷與pEGM-T-Easy vector連接保存；再用相應(yīng)五co/H酶切，膠回收zeoc^目標(biāo)基因，五coiM酶切 線性化質(zhì)粒pCAM 3300;在T4連接酶的作用下連接得到pCAM 3300-zeo"'"。實(shí)施例2質(zhì)粒pCAM 3300—zeoc/"轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌LBA4404將重組質(zhì)粒pCAM 3300—zeoc/"通過(guò)電擊直接轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404， 在卡那霉素抗性平板上挑取抗性轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒酶切驗(yàn)證，得到重組菌LBA4404/pCAM 3300—z固,"。實(shí)施例3 根癌農(nóng)桿菌LBA4404/pCAM 3300—zeo"'w質(zhì)粒轉(zhuǎn)化工業(yè)化產(chǎn)甘 油假絲酵母 接種含有質(zhì)粒pCAM 3300-2eoc/"的根癌農(nóng)桿菌LBA4404于LB培養(yǎng)基(卡 那霉素50嗎/mL，利福霉素50嗎/mL，鏈霉素30昭/mL)中，3(TC， 200 r/min 搖床培養(yǎng)36h，離心收集菌體，用等體積的IM培養(yǎng)基重懸，培養(yǎng)6h;接種產(chǎn) 甘油假絲酵母于YPD培養(yǎng)基中，30°C、 200 r/min搖床培養(yǎng)過(guò)夜；產(chǎn)甘油假絲 酵母的YPD培養(yǎng)液按1:5稀釋到Y(jié)PD新鮮培養(yǎng)基中，培養(yǎng)6 h。分別離心收 集釀酒酵母和根癌農(nóng)桿菌菌體，用生理鹽水清洗一次，用IM培養(yǎng)基重懸菌體， 釀酒酵母細(xì)胞終濃度達(dá)到109個(gè)/mL，根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞終濃度達(dá)到1011個(gè)/mL， 各取50 pL加入20 mL IM培養(yǎng)基(乙酰丁香酮200 (imol/L，卡那霉素50 嗎/mL，利富霉素50嗎/mL)中3(TC， 200 r/min共培養(yǎng)過(guò)夜。取200 fiL培養(yǎng) 液涂布鋪有玻璃紙的IM+AS固體培養(yǎng)基平板置于25'C培養(yǎng)24 h;將玻璃紙轉(zhuǎn) 接到SM培養(yǎng)基(頭孢噻躬200 jimol/L，150 mg/L)上培養(yǎng)兩天，篩選 陽(yáng)性酵母轉(zhuǎn)化子。將初步確認(rèn)的產(chǎn)甘油假絲酵母陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子接中于YPD液體培養(yǎng)基中3(TC ， 200r/min培養(yǎng)18h,提取染色體進(jìn)行PCR鑒定，同時(shí)作陰性對(duì)照，由于產(chǎn)甘油假 絲酵母內(nèi)不含有zeodn基因，根據(jù)zeod"基因和產(chǎn)甘油假絲酵母染色體的差異 設(shè)計(jì)的引物，產(chǎn)甘油假絲酵母染色體無(wú)法擴(kuò)增出z "力基因，而陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子可 以擴(kuò)增得到2 "Vz基因，這說(shuō)明轉(zhuǎn)化子中已含有了zeoci"基因。PCR鑒定的結(jié) 果初步表明了通過(guò)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的方法已實(shí)現(xiàn)了^oc/"基因?qū)Ξa(chǎn)甘油假絲酵母轉(zhuǎn)化。實(shí)施例4 重組根癌農(nóng)桿菌LBA4404/pCAM3300—^ocz'"介導(dǎo)轉(zhuǎn)化產(chǎn)甘油假 絲酵母WL2002-5的優(yōu)化轉(zhuǎn)化條件(1) IM固體培養(yǎng)基誘導(dǎo)時(shí)間優(yōu)化取培養(yǎng)過(guò)夜的IM培養(yǎng)液，適當(dāng)稀釋涂布IM固體培養(yǎng)基，共培養(yǎng)0、 12、 18、 24、 30、 36、 40 h將玻璃紙平行轉(zhuǎn)移到SM固體培養(yǎng)基進(jìn)行篩選培養(yǎng)，觀 察SM平板上轉(zhuǎn)化子的生長(zhǎng)情況。同時(shí)對(duì)IM培養(yǎng)液進(jìn)行酵母菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算 轉(zhuǎn)化率，優(yōu)化的共培養(yǎng)時(shí)間為24h。(2) 共培養(yǎng)根癌農(nóng)桿菌菌體濃度優(yōu)化取109個(gè)/mL的酵母細(xì)胞10 pL，和1011個(gè)/mL的根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞1、 10、 50、 100、 200、 500 pL混勻共培養(yǎng)，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子并計(jì)算轉(zhuǎn)化率。以50 100 pL混勻共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化率最佳，折算為產(chǎn)甘油假絲酵母比根癌農(nóng)桿菌菌體細(xì)胞比例 為1:500-1000時(shí)，最高轉(zhuǎn)化率達(dá)到2個(gè)轉(zhuǎn)化子/104個(gè)酵母細(xì)胞。
權(quán)利要求
1、根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)zeocin抗性基因轉(zhuǎn)化工業(yè)化產(chǎn)甘油假絲酵母的方法，其特征是以質(zhì)粒pPICZB為模板通過(guò)PCR技術(shù)獲得zeocin抗性基因，再與線性化質(zhì)粒pCAM 3300連接，獲得重組質(zhì)粒pCAM 3300-zeocin；質(zhì)粒pCAM 3300-zeocin轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌LBA4404，再和產(chǎn)甘油假絲酵母共培養(yǎng)，根癌農(nóng)桿菌LBA4404/pCAM 3300-zeocin質(zhì)粒轉(zhuǎn)化工業(yè)化產(chǎn)甘油假絲酵母；(1)zeocin基因的克隆根據(jù)zeocin基因的特異性設(shè)計(jì)引物引物R5’-GTCAGTCCTGCTCCTCGGCCACGAAG-3’；引物F5’-ATGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTTC-3’；PCR擴(kuò)增zeocin基因得到300 bp的特異條帶；PCR方法如下取質(zhì)粒pPICZB模板1μL，10×PCR緩沖液2μL，引物R、F各1μL，dNTPs 2μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，總反應(yīng)體積為20μL；循環(huán)參數(shù)94℃預(yù)變性5min，94℃45s，56℃ 90s，72℃ 90s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min；通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析反應(yīng)產(chǎn)物，在加樣泳道出現(xiàn)目標(biāo)條帶，用PCR片斷膠回收試劑盒純化出0.3kb的目標(biāo)片斷，純化好的目標(biāo)片斷與pEGM-T-Easyvector連接保存；再用相應(yīng)EcoR I酶切，膠回收zeocin目標(biāo)基因，EcoR I酶切線性化質(zhì)粒pCAM 3300；在T4連接酶的作用下連接得到pCAM 3300-zeocin；(2)質(zhì)粒pCAM 3300-zeocin轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌LBA4404將重組質(zhì)粒pCAM 3300-zeocin通過(guò)電擊直接轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404，在卡那霉素抗性平板上挑取抗性轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒酶切驗(yàn)證，得到重組菌LBA4404/pCAM 3300-zeocin ；(3)根癌農(nóng)桿菌LBA4404/pCAM 3300-zeocin質(zhì)粒轉(zhuǎn)化工業(yè)化產(chǎn)甘油假絲酵母將重組菌LBA4404/pCAM 3300-zeocin于LB培養(yǎng)基中，30℃，200 r/min搖床培養(yǎng)36 h，離心收集菌體；用等體積的IM培養(yǎng)基重懸，培養(yǎng)6h；接種產(chǎn)甘油假絲酵母WL2002-5于YPD培養(yǎng)基中，30℃、200r/min搖床培養(yǎng)過(guò)夜；產(chǎn)甘油假絲酵母的YPD培養(yǎng)液按1∶5稀釋到Y(jié)PD新鮮培養(yǎng)基中，培養(yǎng)6h；分別離心收集根癌農(nóng)桿菌菌體和產(chǎn)甘油假絲酵母，用生理鹽水清洗一次，用IM培養(yǎng)基重懸菌體，產(chǎn)甘油假絲酵母細(xì)胞終濃度達(dá)到109個(gè)/mL，根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞終濃度達(dá)到1011個(gè)/mL，各取50μL加入20mL IM培養(yǎng)基中30℃200r/min共培養(yǎng)過(guò)夜；取200μL培養(yǎng)液涂布鋪有玻璃紙的IM+AS固體培養(yǎng)基平板置于25℃培養(yǎng)24h；將玻璃紙轉(zhuǎn)接到SM培養(yǎng)基上培養(yǎng)兩天，篩選陽(yáng)性酵母轉(zhuǎn)化子。
2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征是重組根癌農(nóng)桿菌LBA4404/pCAM 3300—zeocz'n介導(dǎo)轉(zhuǎn)化產(chǎn)甘油假絲酵母WL2002-5的優(yōu)化轉(zhuǎn)化條件(1) IM固體培養(yǎng)基誘導(dǎo)時(shí)間優(yōu)化優(yōu)化的共培養(yǎng)時(shí)間為24h;(2) 共培養(yǎng)根癌農(nóng)桿菌菌體濃度優(yōu)化產(chǎn)甘油假絲酵母比根癌農(nóng)桿菌菌體細(xì)胞比例為1:500-1000時(shí)，最高轉(zhuǎn)化率達(dá)到2個(gè)轉(zhuǎn)化子/104個(gè)酵母細(xì)胞。
全文摘要
根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)zeocin抗性基因轉(zhuǎn)化工業(yè)化產(chǎn)甘油假絲酵母，將外源基因整合到宿主染色體上，屬于基因工程中轉(zhuǎn)化技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明通過(guò)構(gòu)建質(zhì)粒pCAM 3300-zeocin，將其電擊轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌。通過(guò)將含有目的質(zhì)粒pCAM3300-zeocin的根癌農(nóng)桿菌和產(chǎn)甘油假絲酵母共培養(yǎng)，利用zeocin抗性基因?yàn)楹Y選標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)了pCAM 3300-zeocin對(duì)產(chǎn)甘油假絲酵母的轉(zhuǎn)化。根據(jù)根癌農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)特性，對(duì)轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了優(yōu)化，在共培養(yǎng)時(shí)間為24h，細(xì)胞比例為1∶500-1000時(shí)最高轉(zhuǎn)化率達(dá)到2個(gè)轉(zhuǎn)化子/10⁴個(gè)酵母細(xì)胞。初步建立了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化工業(yè)化產(chǎn)甘油假絲酵母的轉(zhuǎn)化方法，為進(jìn)一步研究產(chǎn)甘油假絲酵母打下基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N15/31GK101130781SQ20071002414
公開(kāi)日2008年2月27日 申請(qǐng)日期2007年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月23日
發(fā)明者張君勝, 徐美娟, 方慧英, 微 沈, 諸葛健, 饒志明 申請(qǐng)人:江南大學(xué)