專利名稱：二氧化碳診斷/測(cè)定試劑盒及二氧化碳濃度測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種二氧化碳診斷/測(cè)定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè) 定二氧化碳濃度的方法，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景血液內(nèi)二氧化碳的含量對(duì)人體內(nèi)酸堿平衡的調(diào)節(jié)起著重要的作用。血液pH的恒定是維持生命活動(dòng)必不可少的條件，血漿中的多種緩 沖系統(tǒng)中以碳酸氫鹽緩沖系統(tǒng)最為重要，直接影響血液的pH。血液內(nèi)二氧化碳的含量變化主要反映代謝性酸堿平衡紊亂。單純 代謝性酸或堿中毒時(shí)，血液碳酸氫根[HC(V]下降或升高，總二氧化碳 也隨之下降或升高。而單純呼吸性酸或堿中毒時(shí)，血液碳酸氫根升高 或下降?？偠趸己吞妓釟涓臏y(cè)定方法較可分為直接測(cè)定和間接推算 兩類。直接測(cè)定主要有量氣法、量壓法、滴定法、比色法、Conway微 量擴(kuò)散法、流動(dòng)注射氣體擴(kuò)散法等。間接推算是利用血?dú)夥治鰞x測(cè)得 的PH與PC02,根據(jù)H-H方程的變換形式 HC03— (m mol /L) =0. 03XPC02(mm Hg) Xantilog(PH-p ka)或 HCXV(m mol/U=0. 225XPC02(k Pa) Xantilog(PH一p Ka) 計(jì)算獲得。式中PH為37。 C時(shí)測(cè)得值，pka在37。 C為6. 10。目前，以間接推算法應(yīng)用較普遍，由血液分析儀的微處理計(jì)算機(jī)并 與血?dú)夥治鼋Y(jié)果一起報(bào)告，準(zhǔn)確性基本可以符合臨床要求。直接測(cè)定法以滴定法應(yīng)用最廣泛，但由于受多種因素影響，測(cè)定誤 差較大。酶法測(cè)定適合自動(dòng)化分析，結(jié)果可靠，應(yīng)當(dāng)是很有前途的測(cè)定方 法，但目前尚有待深入研究。檢索中國(guó)專利發(fā)現(xiàn)，申請(qǐng)?zhí)枮?6190276.0、申請(qǐng)日為1996. 02. 06 的發(fā)明專利申請(qǐng)公開了一種用來導(dǎo)出病人血液中氣體含量的非侵入性 的系統(tǒng)和方法。該系統(tǒng)相應(yīng)于體積測(cè)量呼氣中的二氧化碳濃度。然后 處理該數(shù)據(jù)導(dǎo)出動(dòng)脈血中二氧化碳?xì)怏w水平。若數(shù)據(jù)為時(shí)間域，處理 可將時(shí)間域數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成體積域。該方法也經(jīng)迭代評(píng)估了多個(gè)變量的顯 著性，所得的關(guān)系可供快速和準(zhǔn)確地對(duì)健康人和患肺病病人進(jìn)行血中 氣體含量的測(cè)定。近年來，申請(qǐng)?zhí)枮?2282386. 7、申請(qǐng)日為2002. 10. 29 的實(shí)用新型專利公開了一種醫(yī)用的血液碳酸氫根測(cè)定儀，主要由操作 面板、進(jìn)樣檢測(cè)機(jī)構(gòu)、定滴加液機(jī)構(gòu)、攪拌機(jī)構(gòu)和以單片機(jī)為主控元 件的電器控制部分組成。其操作面板包括有手動(dòng)按鍵、輸入鍵盤和顯 示屏；進(jìn)樣檢測(cè)機(jī)構(gòu)由沿圓周均布樣本孔且在孔內(nèi)放置樣本瓶的樣本 轉(zhuǎn)盤和豎直裝配在轉(zhuǎn)盤下面的驅(qū)動(dòng)電機(jī)及對(duì)應(yīng)于檢測(cè)位樣本孔設(shè)置的 光電檢測(cè)器組成；定滴加液機(jī)構(gòu)由配置電機(jī)的微量泵和設(shè)置于樣本孔 上方的定滴頭及配置在定滴頭滴液口處的計(jì)滴器組成；攪拌機(jī)構(gòu)由設(shè) 置在樣本轉(zhuǎn)盤下方相應(yīng)位置的攪拌電機(jī)和裝配在攪拌電機(jī)軸上的磁盤 及放置于樣本瓶?jī)?nèi)的攪拌棒組成。以上專利均與酶法測(cè)定無關(guān)，這從一個(gè)側(cè)面說明，國(guó)內(nèi)此方面的 實(shí)驗(yàn)研究十分缺乏。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶循環(huán)擴(kuò)增法 (Enzymatic Recycling Method)、酶比色》去(Enzymatic ColorimetricMethod)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，監(jiān)測(cè)還原型煙酰 胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長(zhǎng)處吸光度的變化，得以測(cè)定二氧 化碳濃度的方法，同時(shí)，本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的二氧化碳 診斷/測(cè)定試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全 自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行二氧化碳濃度測(cè)定，而且測(cè)定速度快、準(zhǔn)確度 高，因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。本發(fā)明二氧化碳濃度測(cè)定方法原理如下二氧化碳+過氧化氫+乙酰輔酶A丙酮酸氧化酶丙酮酸+輔酶A十氧丙酮酸+氨離子+還原型輔酶丙氨酸脫氫酶L-丙氨酸+水+輔酶丙氨酸+水+氧甘氨酸氧化酶氨離子+丙酮酸+過氧化氫這種方法應(yīng)用丙酮酸氧化酶(Pyruvate oxidase ; EC 1.2.3.6)酶(偶) 聯(lián)丙氨酸脫氫酶(alanine dehydrogenase ; EC 1.4.1.1)、甘氨酸氧化酶 (glycine oxidase ; EC 1.4.3.19)酶促反應(yīng)連續(xù)監(jiān)測(cè)法。丙酮酸氧化酶 作為作用酶，功能為將二氧化碳酶解產(chǎn)生丙酮酸。丙氨酸脫氫酶的酶 促作用使丙酮酸變成丙氨酸；甘氨酸氧化酶作為循環(huán)酶將丙氨酸再次 變回丙酮酸，使丙酮酸氧化酶酶解二氧化碳產(chǎn)生的丙酮酸不斷地被重 復(fù)循環(huán)利用。丙氨酸脫氫酶同時(shí)作為顯色酶，將還原型輔酶(在340nm 處有吸收峰)氧化成為氧化型輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，從而 得以測(cè)定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的速度，通過測(cè)量340nm處吸光度下降的速度，可以測(cè)算二氧化碳的濃度大小。實(shí)驗(yàn)表明，從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考 慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明二氧化碳診 斷/測(cè)定試劑盒較為理想緩沖液100mmol/L穩(wěn)定劑500 mmol/L還原型輔酶0.25 mmol/L氨離子2 mmol/L過氧化氫 .2 mmol/L乙酰輔酶A10 mmol/L丙酮酸氧化酶10000U/L丙氨酸脫氫酶10000U/L甘氨酸氧化酶畫00U/L本發(fā)明的二氧化碳診斷/測(cè)定試劑盒可以是單劑，包括緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、過氧化氫、乙酰輔酶A、氨離 子、丙酮酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶。 試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成 液體試劑，直接使用。也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、過氧化氫、乙酰輔酶A、氨離子。試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧 化酶。還原型輔酶、過氧化氫、乙酰輔酶A、氨離子、丙酮酸氧化酶、丙 氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試 劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體 試劑，直接使用。還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑l緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、過氧化氫、乙酰輔酶A、氨 離子、。 試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶。 試劑3緩沖液、穩(wěn)定劑、過丙酮酸氧化酶。還原型輔酶、過氧化氫、乙酰輔酶A、氨離子、丙酮酸氧化酶、丙 氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以 不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配 制成液體試劑，直接使用。無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測(cè)定二氧化碳濃度的方法，其 還原型輔酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一種。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。 實(shí)施例一本實(shí)施例的二氧化碳診斷/測(cè)定試劑為單試劑: 三(羧甲基)氨基甲烷—鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑 還原型輔酶過氧化氫乙酰輔酶A 丙酮酸氧化酶包括 100 mmol/L 500 mmol/L 0.25 mmol/L 2 mmol/L 2 mmol/L 10 mmol/L 10000U/L 10000U/L甘氨酸氧化酶 10000 U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37。C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始 吸光度1.8±0.7,測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)二氧 化碳樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))， 延遲時(shí)間大約l分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化 分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的速度，從而測(cè)算出二氧化 碳的濃度大小。 實(shí)施例二本實(shí)施例的二氧化碳診斷/測(cè)定試劑為雙試劑，包括: 試劑1三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液穩(wěn)定劑還原型輔酶過氧化氫乙酰輔酶A畫mmol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L 2 mmol/L 2 mmol/L 10 mmol/L試劑2三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑丙酮酸氧化酶甘氨酸氧化酶100 mmol/L 500 mmol/L10000U/L10000U/L10000 U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37。C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始 吸光度1.8±0.7，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)二氧 化碳樣品與試劑1、試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下 降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約l分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化 分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的速度，從而測(cè)算出二氧化 碳的濃度大小。實(shí)施例三本實(shí)施例的二氧化碳診斷/測(cè)定試劑為三試劑，包括: 試劑1三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液穩(wěn)定劑還原型輔酶過氧化氫乙酰輔酶A畫mmol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L 2 mmol/L 2 mmol/L 10 mmol/L試劑2三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L10000U/L 10000U/L甘氨酸氧化酶試劑3三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液穩(wěn)定劑還原型輔酶丙酮酸氧化酶100mmol/L 500 mmol/L 0.25 mmol/L 10000U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測(cè)定二氧化碳濃度時(shí)，在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37°C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)二氧化碳樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例 為4/40/5/5，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約1分鐘左 右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化 分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的速度，從而測(cè)算出二氧化 碳的濃度大小。申請(qǐng)人經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他各種還原 型色原體組合均能達(dá)到本發(fā)明的目的，鑒于測(cè)定步驟等情況與以上實(shí) 施例類同，不另一一例舉?？傊?，實(shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明的測(cè)定方法完全可以通過一般生化分 析儀器得出所需的測(cè)定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，便于推廣應(yīng) 用。
權(quán)利要求
1.一種利用酶循環(huán)擴(kuò)增法、酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的二氧化碳濃度測(cè)定方法，其方法原理如下二氧化碳+過氧化氫+乙酰輔酶A 丙酮酸氧化酶丙酮酸 +輔酶A+氧丙酮酸+氨離子+還原型輔酶丙氨酸脫氫酶L-丙氨酸+ 水+輔酶丙氨酸+水+氧甘氨酸氧化酶氨離子+丙酮酸+ 過氧化氫將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的速度，測(cè)算出二氧化碳的濃度大小測(cè)定結(jié)果。
2. —種二氧化碳診斷/測(cè)定試劑盒，主要成分包括緩沖液穩(wěn)定劑還原型輔酶過氧化氫乙酰輔酶A20--500 mmol/Ll一 4000mmol/L0.1--0.35 mmol/L-50 mmol/L畫50 mmol/L畫50 mmol/L丙酮酸氧化酶 丙氨酸脫氫酶iooo--80000 U/L1000——80000 U/L甘氨酸氧化〖IOOO--80000 U/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用; 也可以配制成液體試劑，直接使用。氨離子可以是任何氨鹽，如氯 化氨、硫酸氨等。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述二氧化碳診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、過氧化氫、乙酰輔酶A、氨離子、 丙酮酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述二氧化碳診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、過氧化氫、乙酰輔酶A、氨離子、 丙酮酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶組成雙劑試劑；試劑 1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、過氧化氫、乙酰輔酶A、氨 離子組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸氧化酶、丙氨酸脫 氫酶、甘氨酸氧化酶組成。還原型輔酶、過氧化氫、乙酰輔酶A、 氨離子、丙酮酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶在試劑1或 試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述二氧化碳診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、過氧化氫、乙酰輔酶A、氨離子、 丙酮酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶組成多劑試劑；試劑 1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、過氧化氫、乙酰輔酶A、氨 離子組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧 化酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸氧化酶組成。還原 型輔酶、過氧化氫、乙酰輔酶A、氨離子、丙酮酸氧化酶、丙氨酸 脫氫酶、甘氨酸氧化酶在試劑l、試劑2或試劑3中的位置可以不
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述二氧化碳診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn)定劑14000mmol/L或0.1Q/。-100。/。體積比。所述穩(wěn)定劑為 硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶循環(huán)擴(kuò)增法、酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的二氧化碳診斷/測(cè)定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定二氧化碳濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、過氧化氫、乙酰輔酶A、氨離子、丙酮酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm處吸光度下降的速度，從而測(cè)算出二氧化碳的濃度大小。采用本發(fā)明完全可以通過紫外/可見光分析儀器得出所需的測(cè)定結(jié)果。
文檔編號(hào)C12Q1/26GK101324606SQ20071002322
公開日2008年12月17日 申請(qǐng)日期2007年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月13日
發(fā)明者王爾中 申請(qǐng)人:蘇州艾杰生物科技有限公司