專利名稱：一種用超微磁顆粒分離純化生物靶物質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物樣品中特定物質(zhì)的分離純化，特別是指一種用超微磁顆粒分離純化生 物靶物質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有技術(shù)中，已經(jīng)有許多方法用磁顆粒分離純化純化生物大分子(核酸、蛋白等)，
這些方法都是用磁顆粒吸附生物大分子，這些磁顆粒包括硅磁顆粒、玻璃磁顆粒等，從
而達(dá)到分離和純化的目的。在美國專利6027945中描述了一種利用硅磁顆粒進(jìn)行生物耙物
質(zhì)分離純化的方法，該方法的主要特點(diǎn)是利用硅磁顆粒在特定條件下(高濃度胍鹽)吸附
核酸等物質(zhì)，然后外加磁場分離純化結(jié)合有核酸的磁顆粒，經(jīng)過含乙醇的洗液洗滌，最后
用水將核酸從磁珠上洗脫。另外，在美國專利6562568中利用一種玻璃磁顆粒進(jìn)行生物耙
分子分離純化的方法，其操作步驟與專利6027945中描述基本一致，只是使用的磁顆粒不
同，這個專利使用的是玻璃磁顆粒，同樣要用高濃度胍鹽促進(jìn)核酸結(jié)合到磁顆粒，然后再
用含乙醇的洗液洗滌，最后用水將核酸從磁珠上洗脫，兩個專利的主要區(qū)別是二者使用的
磁顆粒不同，而同樣是三個主要步驟，即"結(jié)合"、"洗滌"、"洗脫"。 詳觀上述方法，不難發(fā)現(xiàn)其存在下列問題
這些方法都是利用直徑在0. 5—15微米較大的磁顆粒吸附核酸等大分子，然后再磁分 離純化、洗滌、洗脫核酸。這些方法的特點(diǎn)是粒徑較大的磁顆粒吸附核酸， 一個磁顆粒吸 附若干個生物分子，而這種磁顆粒吸附核酸的能力較小，所以必須在高濃度強(qiáng)離液鹽(如 胍鹽)的條件下，同時必須使用氧化硅或玻璃等成分包裹在氧化鐵磁顆粒表面而增加吸附 能力，才能結(jié)合核酸。另外必須在洗滌磁顆粒和核酸的復(fù)合物時使用含有醇的試劑。而高 濃度強(qiáng)離液鹽毒性較大，對實(shí)驗人員和環(huán)境有較大影響，而用含有醇的溶液洗滌，對核酸 的后續(xù)操作有較大影響。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供一種用超微磁顆粒分離純化生物耙
物質(zhì)特別是核酸的方法。
本發(fā)明采用如下技術(shù)方案 一種用超微磁顆粒分離純化生物靶物質(zhì)的方法，包括如下 步驟
1) 將超微磁顆粒加入到含有生物靶物質(zhì)的樣品溶液中，超微磁顆粒結(jié)合到生物靶物 質(zhì)上，其結(jié)合方式為一個生物靶物質(zhì)分子結(jié)合若干個超微磁顆粒，形成生物靶物質(zhì)和超微 磁顆粒的復(fù)合物，在外加磁場的作用下，將生物靶物質(zhì)和超微磁顆粒的復(fù)合物從樣品中分 離出來；
2) 在洗脫液中將超微磁顆粒從生物靶物質(zhì)上洗脫下來，并在外加磁場的作用下，將 超微磁顆粒分離，從而獲得含生物靶物質(zhì)的溶液。
前述一種用超微磁顆粒分離純化生物靶物質(zhì)的方法，所述的生物耙物質(zhì)和磁顆粒的結(jié) 合方式與現(xiàn)有技術(shù)不同，現(xiàn)有技術(shù)采用粒徑較大的磁顆粒，其和生物靶物質(zhì)結(jié)合方式是"一 個磁顆粒吸附多個生物耙物質(zhì)分子"，而本發(fā)明采用粒徑較小的磁顆粒，其和生物靶物質(zhì) 結(jié)合方式是"一個生物靶物質(zhì)分子吸附多個磁顆粒"。這種結(jié)合方式的改變，使得本發(fā)明 中生物靶物質(zhì)和磁顆粒的結(jié)合更"容易"，從而在后續(xù)的結(jié)合液的選擇、洗滌液的選擇、 洗脫液的選擇中有更寬松的選擇。因此整個生物靶物質(zhì)分離純化實(shí)驗更簡單、安全，具有 明顯的優(yōu)越性。
前述一種用超微磁顆粒分離純化生物靶物質(zhì)的方法，所述超微磁顆粒的平均粒徑為 10-200nm，優(yōu)選的平均粒徑為50-150nm，比現(xiàn)有技術(shù)的磁顆粒直徑平均小100倍，體積 小100萬倍左右。
前述一種用超微磁顆粒分離純化生物耙物質(zhì)的方法，所述超微磁顆粒為具有超順磁性 的超微磁顆粒，可以是含有鐵的氧化物的磁顆粒、氧化硅包裹的復(fù)合磁顆粒、氧化硅和氧 化硼包裹的復(fù)合磁顆粒。
前述一種用超微磁顆粒分離純化生物靶物質(zhì)的方法，所述超微磁顆粒為氧化鐵磁顆粒。
前述一種用超微磁顆粒分離純化生物靶物質(zhì)的方法，所述生物靶物質(zhì)為核酸、蛋白質(zhì) 等生物大分子。
前述一種用超微磁顆粒分離純化生物靶物質(zhì)的方法，所述生物靶物質(zhì)和磁顆粒結(jié)合 時，可以使用結(jié)合液促進(jìn)生物靶物質(zhì)和磁顆粒的結(jié)合，結(jié)合液由普通的鹽溶液、醇溶液或 二者的組合組成，而不采用有毒的高濃度強(qiáng)離液鹽(如胍鹽)。
前述一種用超微磁顆粒分離純化生物靶物質(zhì)的方法，在生物靶物質(zhì)和磁顆粒結(jié)合形成 復(fù)合物后，可以用洗滌液洗滌分離出來的這個復(fù)合物，并在外加磁場的作用下將洗滌后的 生物靶物質(zhì)和超微磁顆粒的復(fù)合物從洗滌液中分離出來。
前述一種用超微磁顆粒分離純化生物靶物質(zhì)的方法，所述結(jié)合液為無毒的鹽溶液、醇 溶液、或二者的組合，如可以是氯化鈉溶液、異丙醇溶液或二者的組合。
前述一種用超微磁顆粒分離純化生物靶物質(zhì)的方法，所述洗滌液為鹽溶液、醇溶液、 或二者的組合。
前述一種用超微磁顆粒分離純化生物靶物質(zhì)的方法，所述洗滌液為鹽溶液，如可以是 低濃度的氯化鈉溶液，而不使用醇。
前述一種用超微磁顆粒分離純化生物靶物質(zhì)的方法，所述洗脫液為水或PH值約等于 8的低離子濃度的緩沖液。
前述一種用超微磁顆粒分離純化生物靶物質(zhì)的方法，所述洗脫液為Tris-HC1溶液。
本發(fā)明中，結(jié)合液的選擇至關(guān)重要，不同的鹽濃度和鹽種類對核酸與超微磁顆粒的結(jié) 合的影響有很大不同。核酸和超微磁顆粒均與水結(jié)合，而加入鹽，鹽在溶液中要結(jié)合大量 的游離水，從而使得核酸、超微磁顆粒與7jC分離，并且核酸與超微磁顆粒結(jié)合成復(fù)合物。 反應(yīng)體系中鹽離子濃度越高，其去水化能力就越強(qiáng)，越能促進(jìn)核酸與超微磁顆粒的結(jié)合。 但是，如果樣品中含有蛋白質(zhì)，而分離樣品的目的只是想得到核酸，則有些種類的鹽可能 會使蛋白質(zhì)變性而污染核酸。高濃度的異硫氰酸胍、高氯酸鈉、碘化鈉等鹽溶液是促進(jìn)核 酸與磁顆粒結(jié)合的首選，但是這幾種鹽均有很大的毒性，對實(shí)驗人員和環(huán)境均有較大的不 良影響。本發(fā)明中，由于采用了體積小100萬倍的超微磁顆粒，其結(jié)合方式是一個核酸分 子結(jié)合多個磁顆粒，其與核酸結(jié)合的能力更強(qiáng)，因此可以選用無毒的鹽溶液作為結(jié)合液， 比如可以選用高濃度的氯化鈉溶液來促進(jìn)核酸與超微磁顆粒的結(jié)合。
另外，由于醇類可以降低水的介電常數(shù)，本發(fā)明中，結(jié)合液可以通過加入一定的醇類
而促進(jìn)核酸與超微磁顆粒的結(jié)合，如可以加入乙醇、異丙醇等。但是，由于醇類可能抑制 核酸后續(xù)的酶反應(yīng)，所以本發(fā)明在洗滌時不傾向于使用醇類。
由上述對本發(fā)明的描述可知，和現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)
1) 本發(fā)明生物耙物質(zhì)和磁顆粒的結(jié)合方式與現(xiàn)有技術(shù)不同，現(xiàn)有技術(shù)采用粒徑較大 的磁顆粒，其和生物靶物質(zhì)結(jié)合方式是"一個磁顆粒吸附多個生物靶物質(zhì)分子"，而本發(fā) 明采用粒徑較小磁顆粒，其和生物靶物質(zhì)結(jié)合方式是"一個生物靶物質(zhì)分子吸附多個磁顆 粒"。這種結(jié)合方式的改變，使得本技術(shù)中生物靶物質(zhì)和磁顆粒的結(jié)合更"容易"，從而在 后續(xù)的結(jié)合液的選擇、洗滌液的選擇、洗脫液的選擇中有更寬松的選擇。因此整個核酸純 化實(shí)驗更簡單、安全，具有明顯的優(yōu)越性。
2) 正是由于本發(fā)明的超微磁顆粒與生物靶物質(zhì)具有較強(qiáng)的結(jié)合能力，本發(fā)明的結(jié)合
液可以不選用有毒的高濃度鹽溶液，而選用無毒的鹽溶液促進(jìn)生物靶物質(zhì)與超微磁顆粒的
組合 o
3) 也正是由于本發(fā)明的超微磁顆粒與生物耙物質(zhì)具有較強(qiáng)的結(jié)合能力，本發(fā)明克服 了現(xiàn)有技術(shù)中必須使用含醇的洗滌液進(jìn)行洗滌，而可以采用不含醇的洗滌液進(jìn)行洗滌，從 而不會對生物耙物質(zhì)的后續(xù)操作有不利的影響。
4) 由于本發(fā)明的超微磁顆粒粒徑較小，其在與生物靶物質(zhì)大分子結(jié)合時可以穿插黏 附于生物大分子上，故本發(fā)明的超微磁顆粒外層可以是不包裹硅的磁顆粒，也可以達(dá)到同 樣的對生物靶物質(zhì)分離純化的效果。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l:用超微磁顆粒結(jié)合樣品中核酸 材料
分別使用3種超微磁顆粒，即氧化鐵超微磁顆粒、硅包裹超微磁顆粒、硅硼包裹超微 磁顆粒，粒徑平均范圍50—100nm,濃度40mg/mL。 結(jié)合液l: 20%氯化鈉、30%異丙醇； 結(jié)合液2: 20%氯化鈉； 結(jié)合液3: 30%異丙醇；
結(jié)合液4: 60%異硫氰酸胍； 1Pg/叱魚精DNA; 操作步驟
將20叱的lPg^L魚精DNA分別加入到100PL結(jié)合液中，混勻，分別加入三種各100叱 的超微磁顆粒(濃度40mg/mL),混勻，保持磁顆粒懸浮，放置10分鐘，用磁力架分離磁 顆粒，剩余的液體用瓊脂糖電泳，SYBR Green I染色。
通過結(jié)果觀測可見，結(jié)合液l、結(jié)合液3、結(jié)合液4溶液中基本沒有剩余核酸，結(jié)合 液2中有剩余核酸，與原液對比，結(jié)合效率大致有80%左右。 實(shí)施例2:各種洗滌液對比
材料-
洗滌液l: 50畫ol/L Tris-HC1， 10O咖ol/L NaCl， 50%乙醇; 洗滌液2: 50ramol/L Tris-HC1, 20%NaCl; 洗滌液3: 50咖ol/L Tris-HC1， 50%乙醇； 操作步驟
將20叱的Wg/叱魚精DNA分別加入到IOOML結(jié)合液中，混勻，分別加入IOO化的超 微磁顆粒(濃度40mg/mL)，混勻，保持磁顆粒懸浮，放置10分鐘，用磁力架分離磁顆粒， 去除液體，加入各種洗滌液4001,混勻，磁力架分離磁顆粒，去除液體，重復(fù)用洗滌液 洗3遍，最后1遍時盡量去除液體，晾干10分鐘，加入洗脫液100叱，旋渦振蕩10分 鐘，磁力架分離磁顆粒，將液體取出，即為純化的DNA。用瓊脂糖電泳，SYBR Green I 染色觀測。
通過結(jié)果觀測可見，洗滌液l、洗滌液2、洗滌液3都具有很好的洗滌效果，各洗滌 液都有較好的提取效果，證實(shí)核酸和磁顆粒結(jié)合后，在洗滌液中二者不會分離。 實(shí)施例3:提取人血液中基因組DNA
材料-
分別使用3種超微磁顆粒，即氧化鐵超微磁顆粒、硅包裹超微磁顆粒、硅硼包裹超微 磁顆粒，粒徑平均范圍50"100nm，濃度40mg/mL。
結(jié)合液l: 20%氯化鈉、30%異丙醇；
洗滌液50ramol/L Tris-HC1， 2(^氯化鈉NaCl;
洗脫液10mmol/L Tris-HC1;
蛋白酶K: 10mg/ml;
操作步驟
10(HiL血液用蛋白酶K消化后，加入30(mL結(jié)合液l，混勻，分別加入三種各100叱 的超微磁顆粒(濃度40mg/mL)，混勻，保持磁顆粒懸浮，放置10分鐘，用磁力架分離磁 顆粒，去處液體，再加入300化結(jié)合液1，用磁力架分離磁顆粒，去處液體。加入洗滌液 40(^L，混勻，磁力架分離磁顆粒，去處液體，重復(fù)用洗滌液洗3遍，最后l遍時盡量去 除液體，晾干10分鐘，加入洗脫液100 A,旋渦振蕩10分鐘，磁力架分離磁顆粒，將 液體取出，即為純化的DNA。用瓊脂糖電泳，SYBR Green I染色觀測。
結(jié)果可見各磁顆粒都可以提取核酸，三者差別不大。
上述僅為本發(fā)明的幾個具體實(shí)施方式
，但本發(fā)明的設(shè)計構(gòu)思并不局限于此，凡利用此 構(gòu)思對本發(fā)明進(jìn)行非實(shí)質(zhì)性的改動，均應(yīng)屬于侵犯本發(fā)明保護(hù)范圍的行為。
權(quán)利要求
1、一種用超微磁顆粒分離純化生物靶物質(zhì)的方法，其特征在于包括如下步驟 1)將超微磁顆粒加入到含有生物靶物質(zhì)的樣品溶液中，超微磁顆粒結(jié)合到生物靶物質(zhì)上，其結(jié)合方式為一個生物靶物質(zhì)分子結(jié)合多個超微磁顆粒，形成生物靶物質(zhì)和超微磁顆粒的復(fù)合物，在外加磁場的作用下，將生物靶物質(zhì)和超微磁顆粒的復(fù)合物從樣品中分離出來；2)在洗脫液中將超微磁顆粒從生物靶物質(zhì)上洗脫下來，并在外加磁場的作用下，將超 微磁顆粒分離，從而獲得含生物靶物質(zhì)的溶液。
2、 如權(quán)利要求1所述的一種用超微磁顆粒分離純化生物靶物質(zhì)的方法，其特征在于所 述超微磁顆粒的平均粒徑為10-200nm,優(yōu)選的平均粒徑為50-150nm。
3、 如權(quán)利要求1所述的一種用超微磁顆粒分離純化生物靶物質(zhì)的方法，其特征在于所 述的超微磁顆粒為具有超順磁性的超微磁顆粒，可以是含有鐵的氧化物的磁顆粒、氧 化硅包裹的復(fù)合磁顆粒、氧化硅和氧化硼包裹的復(fù)合磁顆粒。
4、 如權(quán)利要求1所述的一種用超微磁顆粒分離純化生物靶物質(zhì)的方法，其特征在于所 述的超微磁顆粒為氧化鐵磁顆粒。
5、 如權(quán)利要求1所述的一種用超微磁顆粒分離純化生物靶物質(zhì)的方法，其特征在于所述生物靶物質(zhì)為核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子。
6、 如權(quán)利要求1所述的一種用超微磁顆粒分離純化生物靶物質(zhì)的方法，其特征在于所述的生物耙物質(zhì)和磁顆粒結(jié)合時，可以使用結(jié)合液促進(jìn)生物耙物質(zhì)和磁顆粒的結(jié)合， 結(jié)合液是鹽溶液、醇溶液或二者的組合。
7、 如權(quán)利要求6所述的一種用超微磁顆粒分離純化生物靶物質(zhì)的方法，其特征在于所述的結(jié)合液為氯化鈉溶液、異丙醇溶液、或二者的組合。
8、 如權(quán)利要求1所述的一種用超微磁顆粒分離純化生物靶物質(zhì)的方法，其特征在于在 生物靶物質(zhì)和磁顆粒結(jié)合形成復(fù)合物后，可以用洗滌液洗滌分離出來的這個復(fù)合物， 并在外加磁場的作用下將洗滌后的生物靶物質(zhì)和超微磁顆粒的復(fù)合物從洗滌液中分離 出來。
9、 如權(quán)利要求8所述的一種用超微磁顆粒分離純化生物靶物質(zhì)的方法，其特征在于所 述洗滌液為鹽溶液、醇溶液、或二者的組合。
10、 如權(quán)利要求1所述的一種用超微磁顆粒分離純化生物靶物質(zhì)的方法，其特征在于 所述洗脫液為水或pH值約等于8的緩沖液。
全文摘要
一種用超微磁顆粒分離純化生物靶物質(zhì)的方法，超微磁顆粒結(jié)合到生物靶物質(zhì)大分子上，在外加磁場的作用下，依次經(jīng)過洗滌、洗脫，分離純化得到生物靶物質(zhì)。本發(fā)明采用具有較小粒徑的超微磁顆粒與生物靶物質(zhì)結(jié)合，一個生物靶物質(zhì)大分子結(jié)合多個超微磁顆粒，相對于現(xiàn)有技術(shù)的一個磁顆粒結(jié)合多個生物靶物質(zhì)分子，其結(jié)合能力更強(qiáng)，從而在后續(xù)的結(jié)合液的選擇、洗滌液的選擇、洗脫液的選擇中有更寬松的選擇。
文檔編號C12Q1/68GK101363045SQ20071000952
公開日2009年2月11日 申請日期2007年9月10日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月10日
發(fā)明者偉 占, 廖逸群, 李慶閣, 欒國彥, 鄭淑敏 申請人:廈門百維信生物科技有限公司