專利名稱：膜轉(zhuǎn)位肽的制作方法
膜轉(zhuǎn)位肽發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及分離被稱為膜轉(zhuǎn)位肽(MTPs)的新型化合物的方法。該MTPs 的特征在于，具有將其自身及與MTP結(jié)合的非轉(zhuǎn)位部分轉(zhuǎn)運(yùn)穿過(guò)膜的能力。
背景技術(shù)：
將核酸、蛋白質(zhì)、肽、氨基酸、小分子、病毒等(下文將被共同稱為"非 轉(zhuǎn)位部分")遞送至細(xì)胞內(nèi)或遞送至特定類型的細(xì)胞內(nèi)的能力可用于腫瘤學(xué)、發(fā) 育生物學(xué)和基因治療的多種應(yīng)用，以及對(duì)模型系統(tǒng)中特定蛋白質(zhì)、核酸和小分 子的操作模式的一般性理解也有用。大多數(shù)重要的治療性蛋白質(zhì)和肽不易于轉(zhuǎn) 位穿過(guò)生物膜。然而，已發(fā)現(xiàn)一些反式激活因子和同源異型蛋白能夠促進(jìn)膜轉(zhuǎn) 位，其中包括Tat衍生肽(Fawell & 1994 Prac. M^/. 5W. t/SJ91:664-668)、觸角足同源結(jié)構(gòu)域蛋白的第三螺旋(Derossi"a/.， 1994， J!5/o/.C/^附. 269:10444-10450; U.S. Pat. Nos. 5,888,762 and 6,015,787)和VP22 (Schwarze "/.， 2000, 7>e"(is T^(^maco/. 5W. 21:45-48)。這些天然衍生的肽一般被隔離于細(xì)胞 質(zhì)中的膜囊中，這常常阻止結(jié)合的非轉(zhuǎn)位部分接近其預(yù)期的靶(Potocky w d 2003, J6oz7 278:50188-94)。目前，通過(guò)兩種不同的途徑來(lái)工程化新型肽。第一種途徑通過(guò)化學(xué)合成6-10 個(gè)氨基酸肽的隨機(jī)文庫(kù)來(lái)生成候選肽(J.Eichler W a/., 1995， i 饑化v.15:481-496; K丄am, 1996,爿油c朋cw Dn/gDm. 12:145-167; M. Lebl W 1997, e"巧/wo/. 289:336-392)。第二種途徑中，通過(guò)將隨機(jī)的寡核苷酸文庫(kù)克 隆至Ff絲狀噬菌體基因中而合成候選肽，這樣使得更大的肽在噬菌體的表面表 達(dá)(H. Lowman， 1997,^4"". i ev. fifop/2ys. 5wmo/. Sfn^cf, 26:401-424; G. Smith ef o/.， 1993, Me仇￡/iz. 217:228-257)。也已經(jīng)制備出長(zhǎng)度高達(dá)38個(gè)氨基酸的隨機(jī)肽文 庫(kù)，而且使用該系統(tǒng)，有可能制備出更長(zhǎng)的肽。使用上述兩種策略任意一種制 備的肽文庫(kù)隨后通常與預(yù)選的結(jié)合基質(zhì)的蛋白靶相混合。洗脫結(jié)合的肽，并確 定其序列。根據(jù)這一信息，合成新的肽，并確定其生物學(xué)特性。噬菌體展示以 往被用來(lái)鑒定轉(zhuǎn)位蛋白，但是通過(guò)這種方法分離出的肽相對(duì)很少，并且那些已經(jīng)分離到的肽通常為細(xì)胞類型特異性的肽，并需要通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞(Gao e^/. 2002，MW C/ ew.， 10:4057-65)。肽依賴內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞的現(xiàn)有技 術(shù)的缺點(diǎn)之一是，這種機(jī)制導(dǎo)致轉(zhuǎn)位肽及結(jié)合的非轉(zhuǎn)位部分進(jìn)入包含體，在包 含體中他們均將遭到破壞，從而不能引起所需的細(xì)胞作用。現(xiàn)有技術(shù)的又一缺點(diǎn)在于，通過(guò)噬菌體展示和化學(xué)合成而產(chǎn)生的文庫(kù)的容 量限制在106-109范圍內(nèi)。如果不繼而使用費(fèi)時(shí)的突變過(guò)程，這一限制導(dǎo)致較低 親和力肽的分離。上述文庫(kù)容量方面的限制導(dǎo)致了體外生成肽文庫(kù)技術(shù)的發(fā)展， 其中包括mRNA展示(Roberts, & Szostak, 1997, /Voc. A^/. 5W. C7&4， 94， 12297-12302)、核糖體展示(Mattheakis e "/., 1994,iVw/.C7&4， 91, 9022-9026)、和順式(CIS)展示(Odegrip ef a/.， 2004,尸rac. iVa" jcad [/&4, 101 2806-2810)等等。這些文庫(kù)優(yōu)于噬菌體展示文庫(kù)的方面在于通過(guò)該方法產(chǎn) 生的文庫(kù)容量比通過(guò)噬菌體展示而可能產(chǎn)生的文庫(kù)容量要大2至3個(gè)數(shù)量級(jí)。 其原因是，不同于諸如噬菌體展示等技術(shù)，其中不存在中間的體內(nèi)步驟。然而，目前還沒(méi)有記載使用體外展示系統(tǒng)而特異性和選擇性地鑒定膜轉(zhuǎn)位 肽(MTPs)的方法。而且，這種方法能鑒定可穿過(guò)細(xì)胞層(例如內(nèi)皮)的MTPs。因此，仍需能在MTP發(fā)現(xiàn)和肽藥物開(kāi)發(fā)領(lǐng)域提供具有需要的較大進(jìn)步的方法。發(fā)明概述本發(fā)明提供了選擇被稱為膜轉(zhuǎn)位蛋白或MTP的新化合物的方法，該新的化 合物可將其自身和非轉(zhuǎn)位部分轉(zhuǎn)位穿過(guò)如細(xì)胞膜的脂膜。根據(jù)其有效地將結(jié)合 的部分納入膜包裹的隔室內(nèi)的能力來(lái)選擇本發(fā)明的MTP，所述隔室包括體內(nèi)和 體外的很多細(xì)胞類型。所鑒定的本發(fā)明MTP也可包括用于診斷和治療目的的分子。因此，本發(fā)明的第一方面提供了從肽展示文庫(kù)中分離顯示膜轉(zhuǎn)位活性的化 合物的方法，其中所述文庫(kù)包括多種編碼展示肽的核酸序列，且該方法包括如 下歩驟a)表達(dá)多種核酸構(gòu)建體，其中，每個(gè)核酸構(gòu)建體包括可操作地連接至核酸序列的啟動(dòng)子序列，如此 以來(lái)，多種核酸構(gòu)建體的表達(dá)導(dǎo)致了多種核酸-肽偶聯(lián)體的形成，且每一偶聯(lián)體包括至少一種展示肽，其中所述的展示肽與編碼展示肽的相應(yīng)核酸構(gòu)建體相結(jié) 合.b) 將多個(gè)核酸-肽偶聯(lián)體暴露于膜包裹的隔室群，從而使轉(zhuǎn)位反應(yīng)發(fā)生；c) 移除與膜包裹的隔室未結(jié)合的核酸-肽偶聯(lián)體；以及d) 從膜包裹的隔室中回收被納入的核酸-肽偶聯(lián)體，并且當(dāng)包括膜轉(zhuǎn)位蛋白 (MTP)時(shí)，表征核酸序列編碼的肽。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，膜包裹的隔室為細(xì)胞。因此，本發(fā)明提供了 從肽展示文庫(kù)中分離顯示細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位活性的化合物的方法，其中所述文庫(kù)包括 多種編碼展示肽的核酸序列，且該方法包括如下步驟a) 表達(dá)多種核酸構(gòu)建體，其中，每個(gè)核酸構(gòu)建體包括可操作地連接至核酸序列的啟動(dòng)子序列，如此 以來(lái)，多種核酸構(gòu)建體的表達(dá)導(dǎo)致多種核酸-肽偶聯(lián)體的形成，且每一偶聯(lián)體包 括至少一種肽，其中所述的肽與編碼展示肽的相應(yīng)核酸構(gòu)建體相結(jié)合；b) 將多個(gè)核酸-肽偶聯(lián)體暴露于一種或一種以上的細(xì)胞類型，從而使轉(zhuǎn)位反 應(yīng)發(fā)生；C)移除與一種或多種細(xì)胞類型未結(jié)合的核酸-肽偶聯(lián)體；以及d)從細(xì)胞中回收被納入的核酸-肽偶聯(lián)體，并且當(dāng)包括膜轉(zhuǎn)位蛋白(MTP)時(shí)，表征核酸序列編碼的肽。在另一個(gè)實(shí)施方式中，膜包裹的隔室優(yōu)選為脂質(zhì)囊。例如，人工構(gòu)建的脂質(zhì)包裹的隔室，如微團(tuán)或脂質(zhì)體。優(yōu)選地，脂質(zhì)囊是脂質(zhì)體。優(yōu)選地，膜包括脂雙層。在上述發(fā)明的另一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述方法在(c)后進(jìn)一步包括移除 核酸-肽偶聯(lián)體的步驟，其中所述的核酸-肽偶聯(lián)體連結(jié)至膜包裹隔室(例如，脂 質(zhì)體或一種或一種以上的細(xì)胞類型)表面，但沒(méi)有被納入隔室。因此，本發(fā)明 的方法優(yōu)選地進(jìn)一步包括步驟(C')移除與細(xì)胞表面結(jié)合的核酸-肽偶聯(lián)體。該 實(shí)施方式相對(duì)噬菌體展示而言顯示了本技術(shù)領(lǐng)域的顯著進(jìn)步，因?yàn)槠鋮^(qū)分了表 面結(jié)合的MTPs和被納入的MTPs。令人驚喜的是，這顯著提高了經(jīng)過(guò)一輪、兩 輪或多輪的選擇之后被鑒定出的MTPs的數(shù)目。確實(shí)，在對(duì)順式(CIS)展示文 庫(kù)進(jìn)行5輪選擇后，9/23的肽被鑒定為MTPs (實(shí)施例1)。相反，通常在用于6鑒定MTPs的噬菌體展示選擇中，只發(fā)現(xiàn)了很少數(shù)量的MTPs (Gao 2002, 所owg.C/ze附.10:4057-4065)。在另一實(shí)施方式中，所選擇的MTP的膜轉(zhuǎn)位活性不涉及或不需要內(nèi)吞作用。 優(yōu)選地，MTP能在無(wú)內(nèi)吞機(jī)制的情況下穿過(guò)靶膜。因而，在優(yōu)選的方法中，所 述的一種或一種以上的細(xì)胞類型是沒(méi)有內(nèi)吞能力的，例如紅血細(xì)胞。本發(fā)明的另一方面提供了通過(guò)本發(fā)明的方法所鑒定的MTP。優(yōu)選地，MTP 為被分離的肽。本發(fā)明進(jìn)一步包括本發(fā)明的MTP的衍生物。在另一優(yōu)選的實(shí)施 方式中，本發(fā)明的MTP或衍生物連接、結(jié)合或者附著/偶聯(lián)至非轉(zhuǎn)位部分。如以 下詳述，非轉(zhuǎn)位部分可為肽、核酸或另一化合物。優(yōu)點(diǎn)在于，上述連接、結(jié)合、 附著或偶聯(lián)的方式易于通過(guò)酶促反應(yīng)或其它的化學(xué)方法/降解而被斷裂。如果轉(zhuǎn)位是單向的，至少對(duì)于轉(zhuǎn)位穿過(guò)膜的化合物的部分是單向的，則是 優(yōu)選的。這樣是有好處的，因?yàn)镸TP可能能夠轉(zhuǎn)位進(jìn)入膜包裹的隔室或從膜包 裹的隔室轉(zhuǎn)位出來(lái)。因而， 一旦MTP轉(zhuǎn)位至膜包裹的隔室內(nèi)，至少肽的一部分 保留在隔室中。保留在隔室中的肽的一部分可為MTP本身、結(jié)合的非轉(zhuǎn)位部分、 或者M(jìn)TP和非轉(zhuǎn)位部分兩者。優(yōu)選地，至少非轉(zhuǎn)位部分保留在膜包裹的隔室例 如靶細(xì)胞中。因此，更優(yōu)選地，MTP連接、結(jié)合或者附著/偶聯(lián)至(例如通過(guò)可 斷裂的鍵的方式)非轉(zhuǎn)位部分，且在轉(zhuǎn)位至膜包裹的隔室中之后，非轉(zhuǎn)位部分 從MTP釋放至隔室或細(xì)胞。方便的是，非轉(zhuǎn)位部分的釋放是通過(guò)酶切或化學(xué)方 法，例如化學(xué)降解，這些將在下文中有進(jìn)一步的描述。本發(fā)明進(jìn)一步提供包括MTP的治療性分子，其中所述的MTP偶聯(lián)至或功 能性地連接至治療性分子，例如治療性肽或核酸。方便的是，治療性分子為如 上所述的非轉(zhuǎn)位部分，其包括用作診斷劑或治療劑的任何化合物。非轉(zhuǎn)位部分和潛在性治療性分子的非限制性實(shí)例包括核酸(例如siRNA分 子)、酶、激素、細(xì)胞因子、抗體或抗體片段、肽片段(例如抗體識(shí)別的肽)、 止痛劑、退熱劑、抗炎劑、抗生素、抗病毒劑、抗真菌藥物、心血管藥物、影 響腎功能和電解質(zhì)新陳代謝的藥物、作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥物和化療藥物等 等。本發(fā)明的又一方面提供了包括編碼本發(fā)明MTP的核酸序列的核酸分子，該 核酸序列任選地進(jìn)一步編碼非轉(zhuǎn)位肽或非轉(zhuǎn)位部分，并任選地進(jìn)一步包括調(diào)節(jié) 性核酸序列。同時(shí)也提供了包含本發(fā)明核酸分子的表達(dá)載體。本發(fā)明的又一方面提供了一種組合物(例如治療性組合物)，其包括膜包裹的隔室(例如脂質(zhì)體)和本發(fā)明的MTP。優(yōu)選地，該組合物進(jìn)一步包括偶聯(lián)至 MTP的非轉(zhuǎn)位部分。最優(yōu)選地，非轉(zhuǎn)位部分是治療性分子。進(jìn)一步優(yōu)選地，治 療性組合物是通過(guò)將一種或一種以上的治療性分子或/和本發(fā)明的MTP，或者兩 者一起添加至一種或一種以上脂質(zhì)體的制劑中并使轉(zhuǎn)位發(fā)生而制備的。本發(fā)明的MTP文庫(kù)由例如肽或肽的衍生物(如由天然的或非天然的氨基酸 組成的肽模擬物和肽類似物)組成。根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)本發(fā)明分離的膜轉(zhuǎn)位肽 (MTP)優(yōu)選為非天然的氨基酸序列，其能越過(guò)或橫跨脂質(zhì)膜，優(yōu)選地，越過(guò) 或橫跨脂雙層。通常，本發(fā)明的MTP能越過(guò)靶膜，從而肽被釋放至膜內(nèi)空間，即細(xì)胞的胞 質(zhì)溶膠或脂質(zhì)體的內(nèi)空間。然而，在某些情況下，MTP可僅僅嵌入至靶膜中， 進(jìn)而其能橫跨膜。在這種情況下，至少M(fèi)TP的一部分處于膜中，優(yōu)選地，至少 MTP的一部分和/或結(jié)合的非轉(zhuǎn)位部分中的一種處于內(nèi)膜空間中。優(yōu)選地，本發(fā) 明的MTP能越過(guò)靶膜并進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，例如紅血細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。優(yōu)選地，MTP 為大約2-25個(gè)或大約8-20個(gè)氨基酸殘基的非天然氨基酸序列。優(yōu)選地，通過(guò)本發(fā)明的方法來(lái)選擇這些化合物，以進(jìn)入膜包裹的隔室(例 如目標(biāo)細(xì)胞)，同時(shí)保持與編碼性核酸連接，從而也將核酸轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)。這些化合物的特異性實(shí)例包括線性肽或環(huán)肽(優(yōu)選的長(zhǎng)度為2-25個(gè)氨基酸 或大約8-20個(gè)氨基酸殘基)、上述線性肽和環(huán)肽的組合(任選地，肽在N端或C 端、或兩端有修飾)、及其鹽和衍生物、其功能性類似物、和在序列的末端帶有 氨基酸或多肽的延長(zhǎng)的肽鏈。根據(jù)本發(fā)明，體外肽展示文庫(kù)通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的合適方法而制得。 例如，體外產(chǎn)生的核酸-肽偶聯(lián)體的文庫(kù)可通過(guò)下述合適的方法而適宜地產(chǎn)生， 例如Robert, & Szostak (1997,Ato/. ^cad 94, 12297-12302)、Mattheakis ef a/"(1994, iVa".爿cad Sci, 91,9022國(guó)9026)和Odegrip ""/.，(2004,戶rac. 7V"f/. ^cad t/&4, 101 2806-2810)以及WO2004/022746所描述 的方法。諸如在文庫(kù)的最大庫(kù)容在噬菌體展示技術(shù)或化學(xué)合成的限度內(nèi)的某些 情況下，這些方法可擇一使用。然后根據(jù)轉(zhuǎn)位越過(guò)(或至少為橫跨)靶膜例如 目標(biāo)類型細(xì)胞的膜的能力，對(duì)體外產(chǎn)生的核酸-肽偶聯(lián)體的文庫(kù)進(jìn)行選擇。在本發(fā)明所述方法的另一步驟中，編碼MTP的文庫(kù)成員通過(guò)使用合適的核 酸酶或蛋白酶或其兩者的結(jié)合，從靶膜或細(xì)胞的表面移除編碼非膜轉(zhuǎn)位肽的核 酸-肽偶聯(lián)體而被進(jìn)一步選擇。然后回收和表征能越過(guò)膜，進(jìn)而進(jìn)入細(xì)胞或囊(例 如脂質(zhì)體)，并將結(jié)合的核酸部分轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞的MTP。本發(fā)明還提供了編碼MTP的核酸-肽偶聯(lián)體的選擇，其中的MTP連接至兩 種或更多種MTP或本領(lǐng)域技術(shù)人員可想到的其它任何組合上。例如，核酸序列 文庫(kù)的一個(gè)或一個(gè)以上(優(yōu)選"每個(gè)")成員可編碼2、 3、 4或更多MTP或潛 在的MTP序列。本發(fā)明進(jìn)一步提供了編碼連接至兩種或更多種非轉(zhuǎn)位部分的 MTP的核酸-肽偶聯(lián)體的選擇。本文引用的所有文獻(xiàn)以整體引用的方式納入本文。如果沒(méi)有特別限定，本 文所有的技術(shù)術(shù)語(yǔ)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明所述領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的 含義。本發(fā)明通過(guò)附圖進(jìn)一步說(shuō)明，其中

圖1顯示非固定的Jurkat細(xì)胞的FACS分析和熒光顯微觀察。肽7、 13和 19為通過(guò)本發(fā)明的方法分離的膜轉(zhuǎn)位肽。肽24為陰性對(duì)照FLAG表位肽。圖2顯示了通過(guò)本發(fā)明的方法所選擇出的膜轉(zhuǎn)位肽與已知的HIV-TAT的膜 轉(zhuǎn)位肽之間的肽序列比較。詳細(xì)描述為了有助于理解本發(fā)明，本文對(duì)幾個(gè)術(shù)語(yǔ)進(jìn)行了定義。本文所用的"肽"、"膜轉(zhuǎn)位肽"或"MTP"是指以線性鏈的形式連接在一 起的多個(gè)氨基酸，包括二肽、三肽、寡肽和多肽。二肽包括兩個(gè)氨基酸；三肽 包括3個(gè)氨基酸；寡肽通常是指具有2至大約50個(gè)或更多個(gè)氨基酸的肽。大于 50個(gè)氨基酸的肽通常被稱為多肽或蛋白質(zhì)。本發(fā)明的"肽"和"膜轉(zhuǎn)位肽"或 "MTP"不被限制于任何特定的氨基酸數(shù)目。優(yōu)選地，它們包含約2-約50或約 2-約40個(gè)氨基酸，更優(yōu)選地，它們包括約2-約30個(gè)氨基酸或約2-約25個(gè)氨基 酸。最優(yōu)選地，肽或MTP包括約2-約20個(gè)氨基酸或約8-約20個(gè)氨基酸。例如， 本發(fā)明所鑒定的MTP的長(zhǎng)度可為18、 19、 20、 21、 22、 23、 24或25個(gè)氨基酸， 通常，蛋白質(zhì)的膜橫跨結(jié)構(gòu)域的長(zhǎng)度是22-25個(gè)氨基酸，因此，特別在MTP橫 跨而非越過(guò)靶膜的情況下，MTP的長(zhǎng)度可為22、 23、 24或25個(gè)氨基酸。本文所用的"膜轉(zhuǎn)位肽"(MTP)是指氨基酸序列(如上所述)，其可包含 天然氨基酸和非天然的氨基酸。所以，所謂的"肽模擬物"和"肽類似物"在 本發(fā)明的上下文中也可為"膜轉(zhuǎn)位肽"，其中所述的"肽模擬物"和"肽類似物" 可包括模擬特定氨基酸或肽的非氨基酸性的化學(xué)結(jié)構(gòu)。該模擬物或類似物的特 性通常表現(xiàn)為相似的物理性質(zhì)，諸如大小、帶電性或疏水性，以及在他們的天 然肽對(duì)等物中所發(fā)現(xiàn)的合適的空間定位。肽模擬化合物的特定實(shí)例是其中的一 個(gè)或多個(gè)氨基酸之間的酰胺鍵被例如為碳-碳鍵或其它非酰胺鍵的鍵所替代的化 合物，這是本領(lǐng)域所熟知的(例如，見(jiàn)尸e/ "fifeBasWDn/gr^/g/z, pp. 378-422， ACS, Washington D.C. 1995中的Sawyer)。本發(fā)明針對(duì)從肽群(或肽庫(kù))中鑒定和表征MTP， g卩，在核酸序列文庫(kù)中 表達(dá)的潛在的或假定的MTP。盡管本文用到術(shù)語(yǔ)"肽"，應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明 并不排除那些可能按照傳統(tǒng)的命名法而被恰當(dāng)?shù)胤Q為多肽或蛋白質(zhì)的MTP或更 大的肽結(jié)構(gòu)域和基序的鑒定。進(jìn)一步地，術(shù)語(yǔ)"膜轉(zhuǎn)位肽"(MTP)可包括越過(guò)膜的肽，從而MTP以及 任何結(jié)合的非轉(zhuǎn)位部分從膜的一邊穿過(guò)到膜的另一邊，并且，該術(shù)語(yǔ)也可包括 僅僅"橫跨"靶膜的肽。"橫跨"是指，MTP可插入(或貫穿)靶膜，從而至少 MTP的一部分留在膜中。因此，例如，通過(guò)本發(fā)明的方法選擇的MTP可橫跨靶 膜，從而導(dǎo)致了 MTP的一部分留在膜(或脂雙層)中以及MTP的一部分或結(jié) 合的非轉(zhuǎn)位部分被納入(即被發(fā)現(xiàn)位于各自囊或細(xì)胞的內(nèi)部)。然而優(yōu)選地，本 發(fā)明的MTP越過(guò)靶膜，從膜的一側(cè)穿過(guò)到另一側(cè)。有一種形式是，本發(fā)明的 MTP能越過(guò)多個(gè)膜，例如多層Caco-2細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞，這樣，MTP能從組織 的一側(cè)移動(dòng)到組織的另一側(cè)或到組織的層中。MTP的"衍生物"是指能將自身和任選的結(jié)合的順聯(lián)的非轉(zhuǎn)位部分穿過(guò)靶 膜的肽序列，其包含對(duì)通過(guò)本發(fā)明的方法鑒定的MTP的初級(jí)肽序列的一個(gè)或一 個(gè)以上的突變或修飾。因此，MTP的衍生物可具有引入至本發(fā)明的MTP的一個(gè) 或一個(gè)以上，例如1、 2、 3、 4、 5和更多個(gè)化學(xué)修飾的側(cè)鏈。另外，或可選擇 地，MTP的衍生物可含有對(duì)本發(fā)明的MTP的初級(jí)肽序列的一個(gè)或一個(gè)以上，例 如1、 2、 3、 4、 5和更多氨基酸突變、替換或缺失。因此，本發(fā)明包括為改善 MTP的一個(gè)或一個(gè)以上的性質(zhì)而對(duì)MTP進(jìn)行的突變?cè)囼?yàn)的結(jié)果。例如，使用本 領(lǐng)域已知的方法(例如通過(guò)修飾編碼性DNA或RNA序列)而隨機(jī)突變或特異性突變MTP的1、 2、 3、 4、 5和更多個(gè)氨基酸殘基，并通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何 方法，根據(jù)預(yù)定的要求(例如對(duì)轉(zhuǎn)位至特定細(xì)胞類型的改善，或?qū)μ囟?xì)胞類 型選擇性的改善)而選擇所獲得的衍生肽的文庫(kù)或群。所選擇出的顯示出膜轉(zhuǎn) 位能力的肽為MTP的衍生物，并落入到本發(fā)明的范圍之內(nèi)。"膜轉(zhuǎn)位蛋白"短語(yǔ)中的術(shù)語(yǔ)"膜"包括任何人工的或天然的膜，其包括 單層或雙層的脂肪族分子，例如脂肪酸或脂質(zhì)分子。因此，該術(shù)語(yǔ)包括微團(tuán)的 膜、脂質(zhì)體膜或本領(lǐng)域技術(shù)人員己知的其它囊的膜、和任何類型天然細(xì)胞的膜， 其中包括細(xì)菌、真菌、植物、動(dòng)物或人，例如血細(xì)胞(如紅細(xì)胞)或上皮細(xì)胞(包括皮膚細(xì)胞和腸壁細(xì)胞)。優(yōu)選地，膜是脂雙層并包裹人工脂質(zhì)體，或是胞 內(nèi)機(jī)能不全的細(xì)胞。本文所述的"非轉(zhuǎn)位部分"是指不能使其自身穿過(guò)膜(例如為脂單層、脂 雙層或細(xì)胞膜)的實(shí)體；或指不能使其自身充分有效地越過(guò)膜從而產(chǎn)生預(yù)期胞 內(nèi)效果的部分。這種非轉(zhuǎn)位部分包括核酸和其它聚合物、肽、蛋白質(zhì)、肽核酸(PNAs)、抗體、抗體片段和膜不透性小分子等。優(yōu)選地，非轉(zhuǎn)位部分是治療性 分子，這些在本文的其它部分有進(jìn)一步的描述。本發(fā)明范圍內(nèi)的術(shù)語(yǔ)"氨基酸"以其最廣泛的含義使用，其旨在包括天然 的L型a氨基酸或氨基酸殘基。本文使用通常所使用的天然氨基酸的單字母或 三字母簡(jiǎn)稱(Lehninger， A丄.，(1975)歷0c/^附W7, 2d ed.， pp. 71-92， Worth Publishers, New York)。標(biāo)準(zhǔn)的單字母代碼和標(biāo)準(zhǔn)的三字母代碼的對(duì)應(yīng)關(guān)系是本 領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，復(fù)述如下A=Ala; C=Cys; D=Asp; E=Glu; F=Phe; G=Gly; H=His; I=Ile; K=Lys; L=Leu; M=Met; N=Asn; P=Pro; Q=Gln; R=Arg; S=Ser;T=Thr;V=Val; W=Trp;Y=Tyr。 一般性術(shù)語(yǔ)"氨基酸"進(jìn)一步包括D氨基 酸以及化學(xué)修飾的氨基酸(例如氨基酸類似物)、通常不包含在蛋白質(zhì)中的天然 氨基酸(如正亮氨酸)和具有本領(lǐng)域已知的氨基酸特性的化學(xué)合成化合物。例 如苯丙氨酸或脯氨酸的類似物或模擬物同天然的Phe或Pro—樣對(duì)肽化合物起到 相同的構(gòu)象限制作用，所以他們屬于氨基酸定義的范疇。這種類似物或模擬物 在本文被稱為各自氨基酸的"功能性類似物"。氨基酸的其它實(shí)例見(jiàn)通過(guò)引用被 納入本文的下述文獻(xiàn)Robert and Vellaccio， 7T e尸e/ ^/asv ^wa/ys/s, Gross and Meiehofer， eds., Vol. 5p. 341, Academic Press, Inc., N.Y. 1983.本發(fā)明針對(duì)從肽群(或庫(kù))中鑒定和表征MTP，即潛在的或假定MTPs。 具體地說(shuō)，本發(fā)明的MTPs的選擇是通過(guò)使用體外產(chǎn)生的肽庫(kù)的體外展示而進(jìn) 行的。本文所用的術(shù)語(yǔ)"體外展示"、"體外肽展示"和"體外產(chǎn)生的文庫(kù)"是指 這樣的系統(tǒng)，其中肽庫(kù)以被表達(dá)的肽與編碼它們的核酸相結(jié)合的方式被表達(dá)， 而且這種結(jié)合不隨細(xì)胞或細(xì)菌與所述核酸而轉(zhuǎn)化。該系統(tǒng)與噬菌體展示和其它 "體內(nèi)展示"系統(tǒng)形成鮮明的對(duì)比，在后者的系統(tǒng)中，肽與編碼它們的核酸的 結(jié)合隨細(xì)胞或細(xì)菌與所述核酸而轉(zhuǎn)化。本文的上下文中所用的膜轉(zhuǎn)位肽可"偶聯(lián)"至非轉(zhuǎn)位部分。本文所用的術(shù) 語(yǔ)"偶聯(lián)"以其最廣泛的含義使用，從而包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的所有聯(lián)結(jié)或 連接的方法。例如，非轉(zhuǎn)位部分可以是MTP的C端或N端的氨基酸延伸。另 外，在MTP和非轉(zhuǎn)位部分之間可存在短的氨基酸連接子序列。本發(fā)明進(jìn)一步提 供了MTP連接的分子，例如任選地通過(guò)連接子序列化學(xué)偶聯(lián)至非轉(zhuǎn)位部分。一 般情況下，MTP將通過(guò)非轉(zhuǎn)位部分中不影響非轉(zhuǎn)位部分活性的位點(diǎn)而被連接至 非轉(zhuǎn)位部分。再一次地，認(rèn)為MTP被偶聯(lián)至非轉(zhuǎn)位部分。任選地，在被納入后 這種連接可被細(xì)胞質(zhì)中的還原性環(huán)境所破壞。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)"偶聯(lián)"可與術(shù)語(yǔ)"連接"、"結(jié)合"或"附著"互換 使用。廣泛的共價(jià)和非共價(jià)形式的偶聯(lián)是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的，并落入至 本發(fā)明的范圍之中。例如雙硫鍵、化學(xué)性連接和肽鏈都是共價(jià)連接的形式。在 優(yōu)選非共價(jià)方式的偶聯(lián)時(shí)，聯(lián)結(jié)的方式可為，例如生物素-抗生蛋白(鏈菌素) 連接或與其類似的連接?？贵w(或抗體片段)-抗原間的相互反應(yīng)也適用于將本 發(fā)明的MTP偶聯(lián)至非轉(zhuǎn)位部分。合適的抗體-抗原的配對(duì)是熒光素-抗熒光素間 的相互反應(yīng)。用這種方式制備單向和靶向的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，借此，MTP及其結(jié)合的非轉(zhuǎn)位部 分之間的偶聯(lián)方式優(yōu)選地在一旦MTP及其結(jié)合的非轉(zhuǎn)位部分(至少是非轉(zhuǎn)位部 分本身)越過(guò)靶膜時(shí)被斷裂/剪切。可使用偶聯(lián)方式與剪切系統(tǒng)的任一合適的組 合，例如酶切、配體競(jìng)爭(zhēng)、輻射等等。優(yōu)選地，當(dāng)靶膜為細(xì)胞膜時(shí)(這時(shí)非轉(zhuǎn) 位部分將被遞送至細(xì)胞)，偶聯(lián)方式為在細(xì)胞內(nèi)(例如在細(xì)胞質(zhì)內(nèi))能被酶(優(yōu) 選為內(nèi)切酶)剪切的肽鍵。或者，偶聯(lián)優(yōu)選為易于在細(xì)胞的胞內(nèi)還原性環(huán)境剪 切的二硫橋。當(dāng)膜包裹的隔室不是細(xì)胞，例如為脂質(zhì)囊、脂質(zhì)體或其類似物時(shí)，優(yōu)選使用偶聯(lián)方式與剪切方式的替代組合。同樣，只要非轉(zhuǎn)位部分可被單向性 地遞送至隔室內(nèi)部(如需要)，可使用任何合適的方式。偶聯(lián)形式的非轉(zhuǎn)位部分可以是活性的，也可以不是活性的，但在任何情況下優(yōu)選地是，其從MTP上解離后(也就是一旦偶聯(lián)被斷裂)是活性的。本發(fā)明通過(guò)在體外產(chǎn)生的文庫(kù)中篩選膜轉(zhuǎn)位性質(zhì)，從而表現(xiàn)出在肽藥物開(kāi) 發(fā)領(lǐng)域的顯著進(jìn)步。合成編碼多種肽的體外產(chǎn)生的文庫(kù)并首先對(duì)結(jié)合、貫穿(例 如橫跨膜)或納入至靶細(xì)胞或脂質(zhì)體群進(jìn)行選擇。不能以上述一種或兩種方式 與靶細(xì)胞或脂質(zhì)體相結(jié)合文庫(kù)成員通過(guò)洗滌或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它的合 適方法被移除。例如，密度足夠大的細(xì)胞和脂質(zhì)體(或其它靶膜包裹的隔室) 可以通過(guò)旋轉(zhuǎn)穿過(guò)非水相的油層，從未結(jié)合的文庫(kù)成員中分離結(jié)合膜的文庫(kù)成 員。優(yōu)選地，所述油為礦物油。其它合適的油包括比重比水小的油。在這一方 面，礦物油在25'C下具有的比重為0.84g/ml。優(yōu)選地，諸如血紅細(xì)胞的細(xì)胞通 過(guò)離心穿過(guò)礦物油而從未結(jié)合文庫(kù)成員中分離出來(lái)。如上面所提到的，MTP可 貫穿或越過(guò)靶膜，編碼MTP或表面結(jié)合肽的文庫(kù)成員在這一過(guò)程中保持與靶的 結(jié)合或被納入至細(xì)胞。隨后通過(guò)非特異性蛋白酶(例如胰蛋白酶)或核酸酶(例如DNaseI)、或上 述兩者的組合，或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其它的方法將表面結(jié)合文庫(kù)成員 從細(xì)胞表面移除。只有編碼MTP的文庫(kù)成員保留在細(xì)胞群中。然后回收被納入的MTPs，并通過(guò)對(duì)結(jié)合的核酸進(jìn)行測(cè)序以及通過(guò)例如表達(dá) 或合成編碼的MTP以確認(rèn)所需的膜轉(zhuǎn)位特性，從而對(duì)其逐一進(jìn)行表征。也可確 定MTP的最終亞細(xì)胞定位。如前所述，該步驟(即，從MTPs中移除與膜結(jié)合 的文庫(kù)成員)不能用于噬菌體展示文庫(kù)，這是因?yàn)檫@些噬菌體展示文庫(kù)對(duì)蛋白 酶(例如胰蛋白酶)有天然抗性(見(jiàn)例如WO-A-9卯58655)，并且由于病毒衣 對(duì)噬菌體核酸的保護(hù)而導(dǎo)致不能使用核酸酶。噬菌體展示文庫(kù)的又一限制在于， 噬菌體顆粒對(duì)細(xì)胞膜的固有的非特異性結(jié)合，該非特異性結(jié)合對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù) 人員而言是熟知的。優(yōu)點(diǎn)是，本發(fā)明的MTPs被分離并被分別表征。然而，可通過(guò)本發(fā)明的方 法來(lái)獲得MTPs的混合群，例如在本發(fā)明的方法中當(dāng)一種以上核酸-肽偶聯(lián)體越 過(guò)膜并被納入至例如脂質(zhì)體或細(xì)胞中時(shí)。這時(shí)，本發(fā)明也包括所述的MTPs的 混合群。優(yōu)選地，本發(fā)明提供了不是通過(guò)內(nèi)吞作用而令人驚訝地越過(guò)細(xì)胞膜的MTPs。這些MTPs可通過(guò)在選擇中使用沒(méi)有已知的內(nèi)吞轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的細(xì)胞(例如 血紅細(xì)胞)，或通過(guò)使用膜包裹的隔室(例如脂質(zhì)體)進(jìn)行進(jìn)一步的選擇。任選地，本發(fā)明可用于細(xì)胞類型特異性MTPs的分離。合成體外產(chǎn)生的編 碼多種肽的核酸文庫(kù)，并在與不同的非靶細(xì)胞群一起進(jìn)行較早時(shí)的溫育以移除 可交叉反應(yīng)的MTP (即那些與非耙細(xì)胞類型相結(jié)合的MTP)后，根據(jù)結(jié)合或納 入至所感興趣的靶細(xì)胞群(例如癌細(xì)胞群)而進(jìn)行選擇。實(shí)施該方法的手段將 為本領(lǐng)域技術(shù)人員所周知。通常，通過(guò)洗滌或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法 移除不能結(jié)合至所感興趣靶細(xì)胞群的文庫(kù)成員。然后通過(guò)非特異性蛋白酶(例 如胰蛋白酶)、或核酸酶(例如DNaseI)、或上述兩者的結(jié)合、或本領(lǐng)域技術(shù)人 員已知的其它方法將表面結(jié)合的文庫(kù)成員從細(xì)胞表面移除。在本發(fā)明上述方法 中，只有編碼MTP的文庫(kù)成員保留在細(xì)胞群中。然后回收被納入的MTPs，并 通過(guò)對(duì)結(jié)合的核酸進(jìn)行測(cè)序、表達(dá)或合成編碼的MTP進(jìn)行測(cè)序以確認(rèn)所需的膜 轉(zhuǎn)位特性，而對(duì)其進(jìn)行逐一表征，而且，如果有可能，也可通過(guò)確定MTP的亞 細(xì)胞定位進(jìn)行表征。本發(fā)明也可用于對(duì)能越過(guò)諸如Caco-2細(xì)胞或人上皮細(xì)胞的細(xì)胞層的MTPs 的分離。合成編碼多種靶肽的體外產(chǎn)生的核酸文庫(kù)，然后根據(jù)結(jié)合、貫穿或納 入至感興趣的細(xì)胞群進(jìn)行選擇，其中所述的靶細(xì)胞群，例如為生長(zhǎng)于層中的 Caco-2細(xì)胞。通過(guò)洗滌或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他方法移除不能結(jié)合至靶細(xì) 胞群的文庫(kù)成員。優(yōu)選地，然后通過(guò)非特異性蛋白酶(例如胰蛋白酶)、或核酸 酶(例如DNaseI)、或上述兩者的結(jié)合、或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法將表 面結(jié)合的文庫(kù)成員從細(xì)胞表面移除。再一次地，只有編碼MTP的文庫(kù)成員保留 在細(xì)胞群中，并免遭蛋白酶和核酸酶的裂解。然后回收被納入的MTPs，并通過(guò) 對(duì)結(jié)合的核酸進(jìn)行測(cè)序、以及任選的表達(dá)或合成編碼的MTP以確認(rèn)所需的上皮 細(xì)胞層的轉(zhuǎn)位特性，而對(duì)其進(jìn)行逐一表征?；蛘?，細(xì)胞可在聚碳酸酯濾器上排 列成單層，并如Stevenson等(1999， 7/ t. /尸力ar瓜177, pp 103-115)所述進(jìn)行選擇。如果其轉(zhuǎn)位通過(guò)細(xì)胞的話，可將放置在細(xì)胞頂面的體外肽文庫(kù)回 收在基底外測(cè)面。使用這種方法，有可能選擇能越過(guò)生物膜(例如腸細(xì)胞壁或 皮膚)的MTPs。用這種方式分離的MTPs具有作為非轉(zhuǎn)位部分的口服遞送劑的用途。舉例 來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的MTP可偶聯(lián)至諸如胰島素的蛋白質(zhì)藥物并配制成合適的藥物組 合物，從而在進(jìn)入腸時(shí)MTP將胰島素轉(zhuǎn)位至血液循環(huán)系統(tǒng)。再舉一例，本發(fā)明 的MTP可偶聯(lián)至小分子并配制成合適的藥物組合物，從而在進(jìn)入腸時(shí)MTP將 小分子轉(zhuǎn)位至血液循環(huán)系統(tǒng)。在又一實(shí)例中，可將MTP以適當(dāng)?shù)乃幬锝M合物包 被在包含蛋白質(zhì)、肽或小分子藥物的納米顆粒表面，從而在進(jìn)入腸時(shí)MTP將納 米顆粒轉(zhuǎn)位至血液循環(huán)系統(tǒng)。在本發(fā)明的另一組合物中，MTP及其結(jié)合的非轉(zhuǎn)位部分(即治療性分子) 與脂質(zhì)偉群(即脂質(zhì)囊或其它人工膜包裹的隔室)相混合，以產(chǎn)生包含MTP和 治療性分子的脂質(zhì)體治療性群。可通過(guò)例如靜脈注射的方式將脂質(zhì)體治療性群 施用至患者。當(dāng)治療性脂質(zhì)體有必要特異性地靶向特定細(xì)胞類型時(shí)，脂質(zhì)體組 合物可與識(shí)別耙細(xì)胞類型的抗體結(jié)構(gòu)域或其類似物進(jìn)行進(jìn)一步地配制。該方法 對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是公知的。本發(fā)明的MTPs以及結(jié)合至非轉(zhuǎn)位肽的MTPs可通過(guò)重組DNA技術(shù)和標(biāo)準(zhǔn) 的蛋白表達(dá)和純化步驟進(jìn)行制備。因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供了編碼本發(fā)明的 MTPs、及其衍生物或治療性分子的核酸分子。例如，根據(jù)常規(guī)技術(shù)(Sambrook J. et al, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY)將編碼相關(guān)肽的DNA插入至合適的表達(dá)載體(例如 pGEM ， PromegaCorp.，USA)中，并轉(zhuǎn)化至合適的宿主細(xì)胞中進(jìn)行蛋白表達(dá)。 合適的宿主細(xì)胞是那些能在培養(yǎng)物中生長(zhǎng)并順從外源DNA轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，包括細(xì) 菌、真菌細(xì)胞以及較高等的真核來(lái)源細(xì)胞(優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞)?；蛘?，可使用 合適的體外(轉(zhuǎn)錄和)翻譯系統(tǒng)(例如大腸桿菌S30提取系統(tǒng)，Promega corp.,USA)來(lái)體外合成MTPs。應(yīng)用于DNA序列(例如在表達(dá)載體中或構(gòu)建體中)的術(shù)語(yǔ)"可操作地連接" 是指排列序列，以使序列能協(xié)調(diào)作用，從而達(dá)到所期望的目的，即，啟動(dòng)子序 列起始轉(zhuǎn)錄，并使之繼續(xù)進(jìn)行通過(guò)所連接的編碼性序列，直至終止序列。選擇和分離MTP后，通過(guò)合適的手段將諸如治療性分子的功能性群體聯(lián)結(jié) 至MTP。如之前所述，MTP可偶聯(lián)至治療性分子的任一合適形式，例如抗體、 酶和小分子化學(xué)性化合物。治療性分子的優(yōu)選形式是能在靶細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)RNAi 的siRNA分子。通常，使用化學(xué)連接子將siRNA連接至諸如MTP的肽。例如，通過(guò)馬來(lái)酰亞胺-巰基鍵(馬來(lái)酰亞胺基在肽上，而巰基在核酸上)或二硫鍵(游離的半胱氨酸基在肽上，而巰基在核酸上)將核酸或PNA連接至肽。按照常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)配制本發(fā)明的藥物制劑和組合物，并以口服、靜脈、局部或 其它標(biāo)準(zhǔn)途徑的形式施用。藥物組合物的形式可為片劑、丸劑、洗劑、凝膠劑、 液體、粉劑、栓劑、混懸劑、脂質(zhì)體、微顆粒或本領(lǐng)域已知的其它合適劑型。因此，本發(fā)明也包括根據(jù)本發(fā)明方法分離的MTP在治療性或診斷性處理中 的用途。具體地說(shuō)，本發(fā)明提供了MTP將非轉(zhuǎn)位部分(如前文所述)遞送至一 種或一種以上膜包裹的隔室群中的用途。優(yōu)選地，所述的膜包裹的隔室是脂質(zhì) 體或一種或一種以上的細(xì)胞類型的群。尤其優(yōu)選的本發(fā)明的MTP的用途是將 非轉(zhuǎn)位部分(尤其是諸如siRNA分子的治療性分子)遞送至靶細(xì)胞類型或群體。 靶細(xì)胞或細(xì)胞群可為體內(nèi)的，即在動(dòng)物或人受試者中；或?yàn)殚g接體內(nèi)的，即從 動(dòng)物或人受試者中移除后并將其重新導(dǎo)入；或者另外，細(xì)胞、細(xì)胞群或脂質(zhì)體 是體外的?？墒褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的任一施用途徑。具體而言，優(yōu)選使用 對(duì)靶細(xì)胞類型或靶細(xì)胞群優(yōu)選的施用途徑。例如，施用至受試者或患者的優(yōu)選 途徑包括皮下注射、攝食或栓劑。示例性地，為了治療受試者的病毒感染，本發(fā)明的MTP可偶聯(lián)至合適的抗 病毒劑，然后將MTP和抗病毒分子以裸露的形式或以包含在如人工脂質(zhì)體中的 形式施用至受試者。相似地，如果受試者患有諸如癌癥的細(xì)胞性疾病，本發(fā)明 的MTP可偶聯(lián)至合適的抗癌分子/藥物(例如siRNA分子或其它治療性實(shí)體)， 并通過(guò)合適的施用途徑將其施用至受試者。MTPs可用于將其自身或非轉(zhuǎn)位部分 遞送至細(xì)菌細(xì)胞。因此，通過(guò)將本發(fā)明的MTP偶聯(lián)至抗細(xì)菌劑能治療受試者的 細(xì)菌感染。進(jìn)一步，在這方面有時(shí)需要治療性組合物，諸如偶聯(lián)至治療性分子的MTP， 被遞送至受試者中特異性的細(xì)胞類型或細(xì)胞群。這可通過(guò)下述方式以間接體外 的方式完成，例如，將治療性組合物添加至已從受試者或患者中移除的細(xì)胞群 中。另外，可根據(jù)需要如前所述地選擇MTP以轉(zhuǎn)位至特異性的細(xì)胞類型。另外， MTP可直接偶聯(lián)至抗體分子、抗體片段(例如Fab、 F(ab)2、 scFv等)或其它 合適的靶向性試劑，從而MTP和任何其它的被偶聯(lián)部分靶向需要治療和診斷的 特異性細(xì)胞群。在另一個(gè)實(shí)施方式中，MTP和其結(jié)合的非轉(zhuǎn)位部分可包含在脂16質(zhì)體群中，其中脂質(zhì)體(例如脂質(zhì)體膜)又包括合適的靶向性部分，例如抗體 和抗體片段。然后可將所得的脂質(zhì)體施用至受試者和患者。在上述用途中，優(yōu)選地，MTP通過(guò)在靶細(xì)胞類型中可剪切的相互作用偶聯(lián) 至非轉(zhuǎn)位部分或治療性分子，例如通過(guò)酶切，或源于細(xì)胞內(nèi)還原性環(huán)境的方式。 本發(fā)明將通過(guò)下述非限制性的實(shí)施例得到進(jìn)一步的闡釋。實(shí)施例除非另外指出，實(shí)施例中使用市售的反應(yīng)試劑和分子生物學(xué)和生物化學(xué)中 的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。材料和方法本申請(qǐng)所使用的下述方法在上述的Sambrook， J. et al.， 1989:analysis of restriction enzyme digestion products on agarose gels and preparation of phosphate buffered saline中有描述。通常用途的反應(yīng)試劑從SIGMA-AldrichLtd (Poole， Dorset, U.K.)處購(gòu)買(mǎi)。 寡核苷酸得自Eurogenetec Ltd (Southampton, U.K.)。氨基酸和S30提取物得自Promega Ltd( Southampton, Hampshire, U.K. )。 Vent 和Taq DNA聚合酶得自New England Biolabs(Cambridgeshire, U.K.)。 FITC標(biāo)記 的肽得自Pepscan Systems (Lelystad, Netherlands )。實(shí)施例l(i) 用于選擇MTPs的順式展示文庫(kù)的構(gòu)建 文庫(kù)構(gòu)建及體外轉(zhuǎn)錄和翻譯的實(shí)施在文獻(xiàn)Odrgrip et al., 2004, Proc. Natl.Acad. SciUSA， 101 2806-2810中有描述。通過(guò)PCR將18-mer NNB文庫(kù)(其中N為任一核苷酸，B為C、 T或G) 附著至tac啟動(dòng)子，然后通過(guò)PCR擴(kuò)增將其連接至-RepA-CIS-ori區(qū)域，從而制 得tac-NNB-RepA-CIS-ori構(gòu)建體。(ii) 具有細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位能力的肽的選擇3(TC下在大腸桿菌S-30溶菌產(chǎn)物系統(tǒng)中用2pg文庫(kù)DNA進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄和 翻譯30分鐘，然后用封閉緩沖液進(jìn)行稀釋(含1%BSA的PBS)。通常，每50^1S-30溶菌產(chǎn)物中添加2嗎線性DNA。向表達(dá)的文庫(kù)中添加5^1 PBS洗滌的紅血 細(xì)胞(RBC)中，并在冰上孵育30分鐘。在2000 rpm下離心RBC達(dá)5分鐘，然后移除上清液。RBC沉淀物在200^1添加有2mM CaC12、2mM MgCl和l嗎DNasel的PBS中重新懸浮，并在室溫下溫育15分鐘。用PBS洗滌細(xì)胞一次，通過(guò)離心形成松 散的沉淀物，然后將該沉淀物再次重新懸浮于20(^1 PBS中。將RBC混懸液置 于200ial鄰苯二甲酸二丁酯上，并在11000rpm下離心4分鐘。移除水相，并將 RBC沉淀物從油中慢慢吸出，再重新懸浮在100plPBS中。在500(il PB緩沖液(Qiagen)中溶解細(xì)胞，使用Qiagen柱純化DNA，然 后將純化的DNA重新懸浮于50^1無(wú)菌水中。在平行選擇中，用lkig/ml胰蛋白酶代替DNaseI在37"C下處理RBC達(dá)30 分鐘，此時(shí)，旋轉(zhuǎn)細(xì)胞，移除上清液，然后將沉淀物重新懸浮于200^1 PBS中。 旋轉(zhuǎn)細(xì)胞通過(guò)鄰苯二甲酸二丁酯，并且將如上所述回收的DNA用于DNase處理 的細(xì)胞。如Odegrip等的文獻(xiàn)(2004， Proc.Natl. Acad. Sci USA, 101 2806-2810)所 述，分別從兩種選擇中擴(kuò)增N末端文庫(kù)區(qū)域，并用Rep-CIS-ori進(jìn)行重新組裝, 從而產(chǎn)生用于下輪選擇的輸入用DNA。5輪選擇后，使用PCR擴(kuò)增回收的DNA， 純化后用和iVcoI消化。然后將上述DNA連接至被相似消化的M13 gpVIII 噬菌粒載體，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌XL-1藍(lán)細(xì)胞中，然后平鋪在2%葡萄糖、2xTY、 100 pg/ml氨卡青霉素平板上。使單克隆生長(zhǎng)過(guò)夜，分離噬菌體DNA并對(duì)其測(cè) 序以確定其肽序列。(m)膜轉(zhuǎn)位能力分析合成所選擇的肽，同時(shí)在N端用FITC標(biāo)記，并使用Jurkat細(xì)胞通過(guò)FACS 分析細(xì)胞結(jié)合。在PBS中洗滌Jurkat細(xì)胞(100 000)，室溫下在100 pl添加有1% 胎牛血清的PBS中與1嗎標(biāo)記肽溫育15分鐘，在PBS中洗滌兩次，然后在Becton Dickinson FACS分析儀中分析。在沒(méi)有固定的情況下用熒光顯微鏡下觀察結(jié)合 細(xì)胞的肽以監(jiān)測(cè)細(xì)胞的納入。23種肽中，有9種與細(xì)胞相結(jié)合。實(shí)例如圖l所示。圖1顯示了非固定的Jurkat細(xì)胞的熒光顯微鏡檢測(cè)以及FACS分析。肽7、 13和19為通過(guò)所述方法分離的示例性膜轉(zhuǎn)位肽。通過(guò)顯微鏡所觀察到的細(xì)胞內(nèi)的熒光(左邊和中間的圖片)和FACS得到細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度(右邊的曲線圖) 可觀察標(biāo)記。FACS分析的曲線圖表明了FITC-熒光(X軸)對(duì)細(xì)胞數(shù)目(Y軸) 的計(jì)數(shù)。肽24是作為陰性對(duì)照的FLAG表位肽，其通過(guò)顯微鏡下或FACS分析 時(shí)不使細(xì)胞產(chǎn)生熒光。如上所述，用DNaseI或胰蛋白酶進(jìn)行平行選擇，以移除膜結(jié)合的或非轉(zhuǎn)位 的肽-repA-DNAl體，從而避免對(duì)細(xì)胞溶解后對(duì)MTP回收的污染。被納入的肽 -repA-DNAl體對(duì)這些酶中的任何一個(gè)的處理具有抗性。在另一個(gè)方法中，或者 使用DNaseI消化repA DNA，從而其不能被擴(kuò)增，或者使用胰蛋白酶消化肽-repA 蛋白以及任何潛在的蛋白-蛋白間的相互反應(yīng)。己發(fā)現(xiàn)，這兩種方法在選擇所需 MTPs方面是成功的。(iv) MTP的序列分析選擇膜轉(zhuǎn)位活性肽(MTP)進(jìn)行序列分析，以確定膜轉(zhuǎn)位活性肽序列是否 與己知的膜轉(zhuǎn)位基序具有序列相似性。結(jié)果如圖2所示。如所顯示的那樣，所選擇的肽(表示為D4，最上面的一行，SEQIDNO: 1) 顯示出與已知的mV-TAT蛋白的膜轉(zhuǎn)位基序(最下面的一行)具有某種程度的 序列同源性(如中間的一行所示)。結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明了所述選擇方法的功效，其中所述的選擇方法用于分離顯 示出細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位活性的化合物。然而需要指出的是，根據(jù)所述及的方法分離到的其它MTPs并沒(méi)有顯示出 與已知轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域的序列同源性。這提供了對(duì)新型MTPs的鑒定。實(shí)施例2(i) 用于選擇MTPs的順式展示文庫(kù)的構(gòu)建 下述實(shí)施例描述了能夠越過(guò)或貫穿合成脂質(zhì)膜的MTPs的選擇。文庫(kù)構(gòu)建以及體外轉(zhuǎn)錄和翻譯根據(jù)上述實(shí)施例1所述進(jìn)行。(ii) 合成的具有膜轉(zhuǎn)位能力的肽的選擇 體外轉(zhuǎn)錄和翻譯根據(jù)上述實(shí)施例1所述進(jìn)行。人造油性隔室的乳劑通過(guò)如下步驟制備將50plPBS (以10pl等分)緩緩 加至0.5 ml冰冷的含0.5% Triton X-100和4.5% Span80 (山梨糖醇酐三油酸酯 (sorbitane trioleate))的輕礦物油，并于冰上以1600rpm攪拌5分鐘。乳劑混合物在3000g下旋轉(zhuǎn)5分鐘，移除油相，使乳劑保留在管底部。然后將體外轉(zhuǎn)錄 和翻譯混合物加至lml PBS中的乳劑混合物中，并緩緩翻轉(zhuǎn)5次進(jìn)行混合，然 后在冰上孵育30分鐘。然后加入2.5pg DNaseI以及2mM CaCl2和2mM MgCl (最終濃度)，并在室 溫下溫育15分鐘。作為DNaseI的替代，可加入lpg/ml胰蛋白酶，并在37"C下 溫育30分鐘。通過(guò)每次加入lml PBS并在3000g下離心5分鐘，再去除洗液來(lái)洗滌乳劑5 次。通過(guò)加入lml己垸、漩渦、簡(jiǎn)短離心和移除己烷層來(lái)破壞和洗滌乳劑。洗 滌步驟可重復(fù)1次或兩次以上，殘留的己垸通過(guò)在Speedvac (Farmingdale， NY) 中室溫下干燥5分鐘來(lái)移除。通過(guò)加入100plPB緩沖液(Qiagen)來(lái)回收DNA，且如實(shí)施例1所示制備 用于下一輪的選擇的DNA。在如實(shí)施例1所示將DNA克隆至噬菌體之前，選擇步驟可重復(fù)多次，例如 5次。通過(guò)測(cè)序可鑒定肽序列，并且如實(shí)施例1所示檢測(cè)肽。
權(quán)利要求
1. 從肽展示文庫(kù)中分離顯示膜轉(zhuǎn)位活性的化合物的方法，其中所述文庫(kù)包括多種編碼展示肽的核酸序列，該方法包括如下步驟a)表達(dá)多種核酸構(gòu)建體其中，每個(gè)核酸構(gòu)建體包括可操作地連接至核酸序列的啟動(dòng)子序列，以使多種核酸構(gòu)建體的表達(dá)導(dǎo)致多種核酸-肽偶聯(lián)體的形成，且每一偶聯(lián)體包括至少一種展示肽，所述展示肽與編碼展示肽的相應(yīng)核酸構(gòu)建體相結(jié)合；b)將多個(gè)核酸-肽偶聯(lián)體暴露于膜包裹的隔室群，從而使轉(zhuǎn)位反應(yīng)發(fā)生；c)移除與膜包裹的隔室未結(jié)合的核酸-肽偶聯(lián)體；以及d)從膜包裹的隔室中回收被納入的核酸-肽偶聯(lián)體，并且當(dāng)包含膜轉(zhuǎn)位肽(MTP)時(shí)，表征核酸序列編碼的肽。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的膜包裹的隔室群是一種或一種以上類型的細(xì)胞群。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中一種或一種以上類型的細(xì)胞群包括細(xì) 胞層。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中步驟(d)被修改為回收轉(zhuǎn)位通過(guò)細(xì)胞 層的核酸-肽偶聯(lián)體。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其中所述的細(xì)胞為Caco-2細(xì)胞。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的膜包裹的隔室群為脂質(zhì)體群。
7. 根據(jù)以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其在(c)部分后進(jìn)一步包括移除 核酸-肽偶聯(lián)體的步驟，其中所述的核酸-肽偶聯(lián)體結(jié)合至膜包裹的隔室表面，但 并沒(méi)有被納入隔室內(nèi)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述的移除包括將膜包裹的隔室暴露 于蛋白酶、核酸酶或蛋白酶和核酸酶的組合。
9. 根據(jù)以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中通過(guò)離心隔室通過(guò)非水層將 未結(jié)合膜的肽-核酸偶聯(lián)體與膜包裹的隔室分離。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述非水層為礦物油。
11. 根據(jù)以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述的肽展示文庫(kù)為體外肽 展示文庫(kù)。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中體外肽展示文庫(kù)為順式體外肽展示 文庫(kù)。
13. 根據(jù)以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其進(jìn)一步包括將步驟(d)中的 一種或一種以上表達(dá)的膜轉(zhuǎn)位肽與相應(yīng)的核酸構(gòu)建體相關(guān)聯(lián)的步驟，從而鑒定 膜轉(zhuǎn)位肽化合物的核酸序列。
14. 根據(jù)以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述MTP包括長(zhǎng)度為2-50 個(gè)殘基的氨基酸序列。
15. 根據(jù)以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述MTP包括長(zhǎng)度為2-25 個(gè)殘基的氨基酸序列。
16. 根據(jù)以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述MTP包括長(zhǎng)度為2-20 個(gè)殘基的氨基酸序列。
17. 通過(guò)以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法獲得的膜轉(zhuǎn)位肽(MTP)或其衍生物。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的MTP或其衍生物，其偶聯(lián)至非轉(zhuǎn)位部分。
19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的MTP,其中偶聯(lián)的非轉(zhuǎn)位部分是治療性分子。
20. 根據(jù)權(quán)利要求18或19所述的MTP，其中所述的偶聯(lián)可在細(xì)胞內(nèi)被剪 切，從而非轉(zhuǎn)位部分或治療性分子被胞內(nèi)遞送。
21. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的MTP，其中所述的偶聯(lián)借助二硫鍵或可酶切肽鍵。
22. 根據(jù)權(quán)利要求19-21任一項(xiàng)所述的MTP，其中所述的治療性分子是 siRNA分子、肽核酸、或者抗體或抗體片段。
23. 通過(guò)權(quán)利要求1-16任一項(xiàng)所述的方法獲得的編碼MTP的核酸。
24. 包含權(quán)利要求23所述核酸的表達(dá)載體或構(gòu)建體。
25. —種脂質(zhì)體組合物，其包括一種或一種以上的脂質(zhì)體以及一種或一種以 上的權(quán)利要求14-19任一項(xiàng)所述的肽。
26. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的脂質(zhì)體組合物，其進(jìn)一步包括諸如抗體或抗體 片段的靶向部分。
27. 權(quán)利要求17所述的MTP在將非轉(zhuǎn)位部分遞送至耙細(xì)胞中的應(yīng)用。
全文摘要
本申請(qǐng)?zhí)峁┝藦碾恼故疚膸?kù)中選擇膜轉(zhuǎn)位肽(MTPs)的方法，其中所述的轉(zhuǎn)位肽越過(guò)或貫穿脂質(zhì)膜。表達(dá)編碼展示肽的多種核酸構(gòu)建體，從而形成多種核酸-肽偶聯(lián)體，且每一偶聯(lián)體包含至少一種展示肽，其中所述展示肽結(jié)合有編碼該展示肽的相應(yīng)核酸構(gòu)建體；將偶聯(lián)體暴露于膜包裹的隔室群中，從而使轉(zhuǎn)位反應(yīng)發(fā)生；移除與膜未結(jié)合的偶聯(lián)體；任選地，移除與膜結(jié)合的偶聯(lián)體；并回收被納入的核酸-肽偶聯(lián)體。所述的膜包裹的隔室可為人造小囊，例如脂質(zhì)體，或?yàn)橐环N或一種以上細(xì)胞類型的群。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101258242SQ200680026758
公開(kāi)日2008年9月3日 申請(qǐng)日期2006年7月24日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月22日
發(fā)明者克里斯·厄爾曼, 凱文·菲茨杰拉德, 戴維·孔伯, 托馬斯·利安德森, 鄧肯·麥格雷戈 申請(qǐng)人:伊索杰尼卡有限公司