專利名稱：：突變體擴環(huán)酶及其在β-內(nèi)酰胺化合物生產(chǎn)中的用途的制作方法突變體擴環(huán)酶及其在P-內(nèi)酰胺化合物生產(chǎn)中的用途本發(fā)明涉及突變體擴環(huán)酶、編碼這類酶的多核苷酸、用編碼所述突變體擴環(huán)酶的所述多核苷酸轉(zhuǎn)化的微生物，和這類突變體擴環(huán)酶或這類微生物在5-羧基戊?；?6-氨基青霉垸酸(己二?；?6-APA^d-6-APA)擴環(huán)中的應(yīng)用。g-內(nèi)酰胺類抗生素是具有很長臨床應(yīng)用歷史的抗生素化合物的最重要群體。在該群體中，突出的是青霉素類和頭孢菌素類。青霉素類通常由多種絲狀真菌如尸ew'a7/z'ww(例如尸.c/zo^oge做m)生產(chǎn)。頭包菌素類天然地由多禾中微生物如^cremom'wm(例如爿.c/zo^oge"wm)禾口5^e/tom_yces(例如iSVreptomyc&sc/avw/z'gen^)產(chǎn)生。作為經(jīng)典菌株改良技術(shù)的結(jié)果，在過去數(shù)十年內(nèi)尸.cAo^wge"MW和AcAo^oge肌m中抗生素的生產(chǎn)水平已顯著提高。隨著產(chǎn)生青霉素類和頭孢菌素類的生物合成途徑知識的增長和重組DNA技術(shù)的來臨，已經(jīng)能夠獲得用于改良生產(chǎn)菌株的新工具。已經(jīng)鑒定了涉及P-內(nèi)酰胺生物合成的大部分酶并克隆了它們相應(yīng)的基因，如可見于IngoliaandQueener，MedResRev(1989)9:245-264(生物合成途45和酶)禾卩Aharonowitz,Cohen,andMartin,AnnRevMicrobiol(1992)46:461-495(基因克隆)。尸.Wo^ogemwz中青霉素生物合成的前兩個步驟是將三個氨基酸L-5-氨基-5-羧基戊酸(L-a-氨基己二酸)(A)、L-半胱氨酸(C)和L-纈氨酸(V)縮合為三肽LLD-ACV，然后將該三肽環(huán)化形成異青霉素N。該化合物含有e-內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)。第三步涉及通過?；D(zhuǎn)移酶(AT)的作用用疏水側(cè)鏈取代L-5-氨基-5-羧基戊酸的親水側(cè)鏈。在EP-A-0448180中已描述由AT介導(dǎo)的酶交換反應(yīng)發(fā)生在細胞器微體中。觀察到表達脫乙酰氧基頭孢菌素C合酶(EC1.14.20,1-DAOCS，在本文還稱作擴環(huán)酶)的非前體尸.c/zo^ogeA7Mm轉(zhuǎn)化體可形成大量脫乙酰氧基頭孢菌素C(DAOC)，這意味著尸.c力o^oge聽m中存在大量的青霉素N—一擴環(huán)酶的天然底物(Alvietal.,JAntibiot(1995)48:338-340)。然而，DAOC的D-a-氨基-己二?；鶄?cè)鏈不容易被去除。頭孢菌素比青霉素昂貴得多。一個原因是一些頭孢菌素(例如頭孢氨芐)是通過大量化學(xué)轉(zhuǎn)化從青霉素制成的。另一個原因是迄今為止，只有具有D-o;-氨基-己二?；鶄?cè)鏈的頭孢菌素可以被發(fā)酵。在該方面迄今為止最重要的起始材料頭孢菌素C在任何pH下都非常易溶于水，從而意味著要使用麻煩和昂貴的柱技術(shù)的費時和昂貴的分離方法。以此種方式獲得的頭孢菌素C必需通過大量化學(xué)和酶轉(zhuǎn)化被轉(zhuǎn)化為治療中使用的頭孢菌素。目前工業(yè)上偏好的用于制備中間體7-氨基-脫乙酰氧基頭孢菌烷酸(7-ADCA)的方法涉及復(fù)雜的化學(xué)步驟來實現(xiàn)青霉素G的擴環(huán)和衍生。產(chǎn)生7-ADCA的必需化學(xué)步驟之一涉及將5元青霉素環(huán)結(jié)構(gòu)擴環(huán)為6元頭孢菌素環(huán)結(jié)構(gòu)(參閱例如US4，003，894)。該復(fù)雜的化學(xué)加工不但昂貴，而且對環(huán)境有害。因此，存在將這類化學(xué)方法用酶反應(yīng)(如酶催化，優(yōu)選地在發(fā)酵中)代替的強烈需要。用生物學(xué)方法替換這些化學(xué)擴環(huán)方法的關(guān)鍵在于頭孢菌素生物合成途徑中的中心酶——擴環(huán)酶。已發(fā)5見來自細菌S化eptomycesc/avw/Zgen^(S.c/avM/Zgen^)的擴環(huán)酶在一些情況下進行青霉素環(huán)的擴環(huán)。被引入尸，cAoAWge"wm后，其可將青霉素環(huán)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為頭孢菌素環(huán)結(jié)構(gòu)，如Cantwelletal.,ProcRSocLondB(1992)248:283-289中所述。擴環(huán)酶己被在生物化學(xué)和功能上充分表征(EP-A-0366354),其相應(yīng)基因也是如此。Ce伍基因(編碼ctovw/Zgem擴環(huán)酶的基因一EP-A-0341892)的物理圖譜、DNA序列和尸.c/owgem麗中用ceffi轉(zhuǎn)化的研究均已被描述。>S.^^"/^^1擴環(huán)酶的DNA和氨基酸序列顯示于SEQIDNO1。，廣環(huán)酷白勺另一來源是細菌7Vocani/fl/flcto附(iwra"s(TV./fl"awdwra"s,以前被稱作S./actomc/wraw)。該酶和編碼該酶的基因的DNA序列均已被描述一分別參閱Cortesetal.,JGenMicrobiol(1987)133:3165-3174和Coqueetal.,MolGenGenet(1993)236:453-458。最近，己在5^e/to^yces乂w附o"力."em7.51、^SYreptom^ycesa77^q/^de朋禾口^re^omycMc/iar^eiwes中發(fā)現(xiàn)新穎的擴環(huán)酶(ceffi)基因和酶一參閱Hsuetal.(2004),AppLandEnvironm.Microbiol.70,6257-6263。表1概括了來自若干擴環(huán)酶的氨基酸序列同一性，并顯示根據(jù)酶的來源，序列同一性范圍在67%至廿85%。表1:若干擴環(huán)酶的氨基酸序列鑒定(數(shù)據(jù)來自Hsuetal)。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>在原核細胞中的頭孢菌素生物合成中，脫乙酰氧基頭孢菌素c隨后被脫乙?；^孢菌素c合酶(也稱作脫乙酰氧基頭孢菌素c羥化酶或羥化酶(EC1.14.11.26-DACS))轉(zhuǎn)化為脫乙酰基頭孢菌素C。編碼這類羥化酶的基因稱作cefF基因(例如參閱Hsuetal.)。真核細胞(例如Jcmiwm'wm"0^oge""m)中發(fā)現(xiàn)的擴環(huán)酶由于具有擴環(huán)酶和水解酶二者的活性，可催化青霉素N到脫乙酰氧基頭孢菌素C的直接轉(zhuǎn)化，因此所編碼的基因稱作ce伍F(參閱Hsuetal.)。如本文所定義的，術(shù)語擴環(huán)酶涉及擴環(huán)酶(EC1.14.20.1，由ce伍基因編碼)以及還額外具有羥化酶活性的擴環(huán)酶(由ceffiF基因編碼的EC1.14.20.1+EC1.14.11.26)。因為擴環(huán)酶將青霉素N的5元噻唑烷環(huán)催化為DAOC6元雙氫噻嗪環(huán)，所以該酶當然是代替化學(xué)方法中環(huán)擴環(huán)步驟的合理候選者。不幸的是，該酶對頭孢菌素生物合成途徑的青霉素N中間體作用，但是對容易獲得的由尸.Wo^oge"Mm生產(chǎn)的廉價青霉素(如青霉素V或青霉素G)不起作用或作用效率非常低。青霉素N不能商業(yè)獲得，而且即便被擴環(huán)，其D-a-氨基-己二酰基側(cè)鏈不容易被青霉素?；溉コＲ呀?jīng)報導(dǎo)擴環(huán)酶能夠?qū)⒕哂刑囟▊?cè)鏈的青霉素擴環(huán)為相應(yīng)的7-ADCA衍生物。擴環(huán)酶的該特征已被如EP-A-0532341、WO95/04148和WO95/04149中公開的技術(shù)利用。在這些公開中，青霉素G到7-ADCA的常規(guī)化學(xué)體外轉(zhuǎn)化已被某些6-氨基青霉烷酸(6-APA)衍生物在用擴環(huán)酶基因轉(zhuǎn)化的重組尸em'c/〃/wwcAo^oge做m菌株中的體內(nèi)轉(zhuǎn)化所代替。更具體地，EP-A-0532341教導(dǎo)了擴環(huán)酶在P.cAo^ge"wm中的體內(nèi)用途，結(jié)合己二?；鶄?cè)鏈(也稱作己二?；?作為原料，其為尸.cA，oge"讓中?；D(zhuǎn)移酶的底物。這導(dǎo)致形成己二?；?6-APA，其被引入P.c/io^ge"簡菌株中的擴環(huán)酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)生己二?；?7-ADCA。最后，描述了己二?；鶄?cè)鏈的去除，產(chǎn)生7-ADCA作為最終產(chǎn)物。另外，EP-A-540210教導(dǎo)了己二酰基-7-ADCA和己二?；?7-ACA的相似生產(chǎn)。作為備選的途徑，EP0828850中提出了使用用ceffi轉(zhuǎn)化的尸.c力0^^e做m將青霉素G擴環(huán)。另外，為了促進青霉素G的擴環(huán)，描述了S.c/麵"g醒的突變體ceffi基因的用途。US5,919,680、WO98/02551、WO99/33994、WO01/85951和EP1348759均公開了據(jù)說編碼下述酶的突變體ceffi基因，所述酶對青霉素G具有更高的擴環(huán)酶活性。然而，這些突變體擴環(huán)酶仍然不提供生產(chǎn)頭孢菌素的商業(yè)上有吸引力的方法。因此，存在進一步改良從己二?；?6-APA的擴環(huán)制備頭孢菌素的方法的需要。該方法特征在于從頭孢菌素核心材料中有效地去除側(cè)鏈材料。進一步改良該方法的一個步驟是改進對己二?；?6-APA的擴環(huán)酶活性。第一方面，本發(fā)明提供突變體擴環(huán)酶，其為具有擴環(huán)酶活性的模型多肽的變體。優(yōu)選地，本發(fā)明提供突變體擴環(huán)酶，其中與具有擴環(huán)酶活性的模型多肽相比，所述突變體擴環(huán)酶對己二?；?6-APA的體外擴環(huán)酶活性提高至少2.5倍。對己二酰基-6-APA的體外擴環(huán)酶活性的測定在材料與方法中詳細描述。更優(yōu)選地，突變體擴環(huán)酶對己二酰基-6-APA的體外擴環(huán)酶活性被提高至少3倍、更優(yōu)選地至少4倍、更優(yōu)選地至少5倍、更優(yōu)選地至少6倍、更優(yōu)選地至少7倍、更優(yōu)選地至少8倍、更優(yōu)選地至少9倍、更優(yōu)選地至少10倍、更優(yōu)選地至少ll倍、更優(yōu)選地至少12倍、更優(yōu)選地至少13倍、更優(yōu)選地至少14倍、更優(yōu)選地至少15倍、更優(yōu)選地至少16倍、更優(yōu)選地至少17倍、更優(yōu)選地至少18倍、更優(yōu)選地至少19倍、更優(yōu)選地至少20倍。本發(fā)明還提供突變體擴環(huán)酶，其優(yōu)選地在選自以下的至少一個氨基酸位置上被修飾由位置2、59、73、89、90、99、101、105、113、155、170、177、209、213、217、244、249、251、277、278、280、281、293、300、306、307和311組成的組，其中使用由5^eptomyc^c/aw//gemsceffi基因編碼的擴環(huán)酶的氨基酸序列的氨基酸位置編號。S&印tom;;cesc/avw//gwwceffi基因以及由所述ceffi基因編碼的氨基酸序列描述于SEQIDNO:1。更優(yōu)選地，突變體擴環(huán)酶在選自以下的至少一個氨基酸位置上被修飾由位置2、59、89、90、99、105、113、170、177、209、213、217、249、251、278、280禾B293組成的組。最優(yōu)選地，突變體擴環(huán)酶在選自以下的至少一個氨基酸位置上被修飾由位置2、89、90、99、105、177、251、278、280和293組成的組。本發(fā)明上下文中"改變的擴環(huán)酶"或"突變體擴環(huán)酶"是指具有擴環(huán)酶活性的任何酶，其并非得自天然來源，且其氨基酸序列與天然擴環(huán)酶的完整氨基酸序列不同。最優(yōu)選地，本發(fā)明提供突變體擴環(huán)酶，其中所述突變體擴環(huán)酶與具有擴環(huán)酶活性的模型多肽相比對己二?；?6-APA的體外擴環(huán)酶活性至少提高2.5倍、更優(yōu)選地至少3倍、更優(yōu)選地至少4倍、更優(yōu)選地至少5倍、更優(yōu)選地至少6倍、更優(yōu)選地至少7倍、更優(yōu)選地至少8倍、更優(yōu)選地至少9倍、更優(yōu)選地至少10倍、更優(yōu)選地至少ll倍、更優(yōu)選地至少12倍、更優(yōu)選地至少13倍、更優(yōu)選地至少14倍、更優(yōu)選地至少15倍、更優(yōu)選地至少16倍、更優(yōu)選地至少17倍、更優(yōu)選地至少18倍、更優(yōu)選地至少19倍、更優(yōu)選地至少20倍，且其中所述突變體擴環(huán)酶優(yōu)選地在選自以下的至少一個氨基酸位置上被修飾由位置2、59、73、89、卯、99、101、105、113、155、170、177、209、213、217、244、249、251、277、278、280、281、293、300、306、307和311組成的組，其中使用由S^;tom，^c/avw/z;gm^ceffi基因編碼的擴環(huán)酶的氨基酸序列的氨基酸位置編號。更優(yōu)選地，突變體擴環(huán)酶在選自以下的至少一個氨基酸位置上被修飾由位置2、59、89、90、99、105、113、170、177、209、213、217、249、251、278、280和293組成的組。最優(yōu)選地，突變體擴環(huán)酶在選自以下的至少一個氨基酸位置上被修飾由位置2、89、90、99、105、177、251、278、280和293組成的組?？稍诓煌瑮l件下測量擴環(huán)酶的活性?；钚詼y定中底物(例如己二?；?的濃度決定了擴環(huán)酶活性是否在下述兩種條件下進行其中Vmax決定活性的條件(與擴環(huán)酶對其底物的Km相比，底物濃度高得多的情況下，例如5-20倍)，或其中Km也額外決定擴環(huán)酶活性的條件(與擴環(huán)酶對其底物的Km相比，底物濃度大致等于或低于(得多)■~~例如<0.05-0.2倍)?？稍谶@些不同條件下測量突變體擴環(huán)酶的提高因數(shù)。在氨基酸位置上的修飾可包括被另一氨基酸取代，所述另一氨基酸選自天然存在的20個L氨基酸——見表2。或者，氨基酸位置上的修飾可包括刪除所述位置上的氨基酸。另外，氨基酸位置上的修飾可包括取代所述氨基酸C端或N端側(cè)的一個或多個氨基酸。表2氨基酸3字母代碼1字母代碼丙氨酸AlaA精氨酸ArgR天冬酰胺AsnN天冬氨酸AspD半胱氨酸CysC谷氨酸GluE谷氨酰胺GinQ<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>本發(fā)明中使用的具有擴環(huán)酶活性的模型多肽選自由以下多肽組成的組具有擴環(huán)酶活性的多肽，其優(yōu)選地具有SEQIDNO:1的氨基酸序列；和具有擴環(huán)酶活性的多肽，其具有與SEQIDNO:1至少70%、優(yōu)選地至少75%、更優(yōu)選地至少80%、更優(yōu)選地至少85。％、更優(yōu)選地至少90%、最優(yōu)選地至少95%同一性的氨基酸序列，例如表1中總結(jié)的擴環(huán)酶。本發(fā)明優(yōu)選地提供突變的擴環(huán)酶，其至少在以下位點具有修飾選自2、59、73、89、90、99、101、105、113、155、170、177、209、213、217、244、249、251、277、278、280、281、293、300、307和311的一個或多個氨基酸位置。選自2、59、89、90、99、105、113、170、177、209、213、217、249、251、278、280和293的一個或多個氨基酸位置。選自2、89、90、99、105、177、251、278、280和293的一個或多個氨基酸位置。選自2、89、277、281和300的2個或多個氨基酸位置，更優(yōu)選地在位置2+281或89+281或277+300。選自2、89、281、293和311的3個或更多個氨基酸位置，更優(yōu)選地在位置2+89+281或89+281+3U或89+281+293。選自2、73、89、90、217、244、277、280、281、306、307和311的4個或更多氨基酸位置，更優(yōu)選地在位置2+277+280+281或2+281+307+311或73+89+281+311或89+217+281+311或89+244+281+311或89+281+307+311或277+281+306+311或89+281+306+311或90+281+306+311。選自2、73、89、90、155、213、249、278、281、293、300、306、307和311的5個或更多氨基酸位置，更優(yōu)選地在位置2+89+281+306+311或2+155+281+306+311或73+89+213+281+311或89+78+218+307+311、89+281+293+300+311或89+249+281+307+311。*選自90+105+113+281+306+311的6個氨基酸位置。選自2、73、89、105、113、155、170、177、251、277、280、281、293、300、306、307和311的7個或更多氨基酸位置，更優(yōu)選地73+89+281+293+300+307+311或105+113+155+177+281+306+311或155+177+277+280+281+306+311。選自2、89、90、99、105、113、155、177、277、281、307和311的8個或更多個氨基酸位置，更優(yōu)選地在2+90+99+105+113+281+306+311或2+90+105+113+155+177+277+281。選自2+90+105+113+155+177+281+306+311的9個氨基酸位置。選自2、59、90、101、105、113、155、177、209、277、281、307和311的10個氨基酸位置，更優(yōu)選地在2+90+105+113+155+177+277+281+306+311。選自2、卯、105、113、155、177、277、281、293、307、311的ll個氨基酸位置。本發(fā)明還提供前文定義的突變體擴環(huán)酶，其為&^tom.VC"C/aVM"gerM擴環(huán)酶的變體，所述突變體擴環(huán)酶在選自以下的氨基酸位置上被修飾由位置D2、S59、M73、T89、N90、M99、Y101、T105、G113、C155、H170、P177、G209、T213、Y217、H244、R249、L277、E280、C281、T293、G300、R306、R307和A311組成的組,其中數(shù)字前的字母表示各自的氨基酸(單字母)，后面的數(shù)字是SEQIDNO:1中所述^reptom;;cMc/avw/Zgen^擴環(huán)酶的氨基酸序列中的氨基酸位置。優(yōu)選的突變擴環(huán)酶是至少在下述位點具有修飾的^w;7towj;a^c/ww/Zgems1擴環(huán)酉每變體選自D2、S59、M73、T89、N90、M99、T105、G113、C155、H170、P177、G209、T213、Y217、H244、R249、D251、L277、A278、E280、C281、T293、G300、R306、R307禾BA311的1個或多個氨基酸位置。選自D2、S59、T89、N90、M99、T105、G113、H170、P177、G209、T213、Y217、R249、D251、A278、E280禾口T293的1個或多個氨基酸位置。選自D2、T89、N90、M99、T105、P177、D251、A278、E280和T293的1個或多個氨基酸位置。選自D2、T89、L277、C281和G300的2個或更多氨基酸位置。選自D2、T89、C281、T293和A311的3個或更多氨基酸位置。選自D2、M73、T89、N90、Y217、H244、L277、E280、C281、R306、R307和A311的4個或更多氨基酸位置選自D2、M73、T89、N90、C155、T213、R249、A278、C281、T293、R306、R307和A3U的5個或更多氨基酸位置選自N90+T105+G113+C281+R306+A311的6個氨基酸位置。選自D2、M73、T89、T105、G113、C155、H170、P177、D251、L277、E280、C281、T293、G300、R306、R307和A311的7個或更多氨基酸位置選自D2、T89、N90、M99、T105、G113、C155、P177、L277、C281、R306、R307和A311的8個氨基酸位置。選自D2+N90+T105+G113+C155+P177+C281+R306+A311的9個氨基酸位置。選自D2、S59、N90、T105、G113、T105、G113、C155、P177、G209、L277、C281、R306、R307、A311的10個氨基酸位置。選自D2、N90、T105、G113、C155、P177、L277、C281、R306、R307、A311的11個氨基酸位置。^reptomycMc/avw//gen擴環(huán)酶中各位點的優(yōu)選修飾如下(使用氨基酸單字母代碼)-SEQIDNO1位置2的D被親水氮基酸Y、N、H、D、Q、E、K、R、S或T取代，優(yōu)選地被Y、N、Q或H取代。最優(yōu)選地是D2Y、D2N和D2H取代。SEQIDNO1位置73的M被A、V、I、L、N、Q、H、K或R取代，優(yōu)選地被N、Q、H、L或I取代。最優(yōu)選M73H和M73I取代。SEQIDNO1位置89的T被K、R、A、C、P、V、I、L或M取代，優(yōu)選地被A、V、I、L、R或K取代，更優(yōu)選地被A、V或K取代。最優(yōu)選T89K取代。SEQIDNO1位置90的N被H、R、K、N、Q、W、S、C、T或Y取代，優(yōu)選地被K、R、N、S、W取代。最優(yōu)選的是N90W和N90S取代。SEQIDNO1位置99的M被A、R、K、Q、E、N、D、S或T取代，更優(yōu)選被K、Q、E或T取代。最優(yōu)選M99T取代。SEQIDNO1位置105的T被A、V、I、L、R、K、H、Q或N取代，優(yōu)選地被V、I、L、R或K取代。最優(yōu)選T105I和T105K取代。SEQIDNOl位置113的G被A、P、Q、K、R、E、D或N取代，更優(yōu)選地被A、D、E、Q、K或R取代。最優(yōu)選G113D取代。SEQIDNOl位置155的C被A、N、S、T、V、W取代，更優(yōu)選地被A、S、T、V或W取代。最優(yōu)選C155W取代。SEQIDNOl位置177的P被K、E、L、A、V、T、I取代，更優(yōu)選地被L、A、V、T、I取代。最優(yōu)選P177L和P177I取代。SEQIDNO1位置213的T被Q、G、A、V、I、R、S取代，更優(yōu)選地被G、A、V、I、S取代。最優(yōu)選T213A取代。SEQIDNO1位置217的Y被A、V、H、P、T、N或Q取代，更優(yōu)選地被A、P、N、Q或H取代。最優(yōu)選Y217H取代。SEQIDNO1位置244的H被N、Q、K或R取代，更優(yōu)選地被K或R取代。最優(yōu)選H244R取代。SEQIDNO1位置249的R被G、S、T、N、D、Q、E、K、R、H或C取代，更優(yōu)選地被G、S、D、N或C取代。最優(yōu)選R249C取代。SEQIDNO1位置251的D被G取代。SEQIDNO1位置277的L被E、A、Q、K、R、H或T取代，更優(yōu)選地被Q、E、K、R、H、T取代。最優(yōu)選L277Q、L277T和L277K取代。SEQIDNO1位置280的E被G、A、Q、K、R或H取代，更優(yōu)選地被G、Q或R取代。最優(yōu)選E280G取代。SEQIDNOl位置281的C被Y、S、L、W、A、S、T或H取代，更優(yōu)選地被A、S、T、W、H或Y取代。最優(yōu)選C281Y取代。SEQIDNO1位置293的T被S、D、N、K或R取代，更優(yōu)選地被S、K或R取代。最優(yōu)選T293K取代。SEQIDNOl位置300的G被A、S、T、N、D、Q、E、K、R、H或L取代，更優(yōu)選地被A、S、T、K、R、H或L取代。最優(yōu)選G300S、G300K和G300L取代。SEQIDNOl位置306的R被刪除或被H取代。SEQIDNO1位置307的R被T、K、A、S、V、G、D、N、Q、E、R、H、I取代或被刪除，更優(yōu)選地被S、T、K、R、H、I取代或被刪除。最優(yōu)選R307T、R307I和(R307刪除)取代。SEQIDN01位置311的A被D取代。高度優(yōu)選的突變體擴環(huán)酶是表3和表4中概括的突變體擴環(huán)酶。優(yōu)選地，本發(fā)明提供的突變體擴環(huán)酶對己二酰基-6-APA具有前文所述提高了至少2.5倍的擴環(huán)酶活性。或者本發(fā)明提供的突變體擴環(huán)酶與具有擴環(huán)酶活性的模型多肽相比，對Pen-G的擴環(huán)酶活性提高了至少1.5倍、更優(yōu)選地至少3倍、更優(yōu)選地至少4倍、更優(yōu)選地至少5倍、更優(yōu)選地至少6倍、更優(yōu)選地至少7倍、更優(yōu)選地至少8倍。對Pen-G具有提高活性的突變體擴環(huán)酶可有利地用于苯乙酰-7-ADCA的生產(chǎn)方法中，其在下文被進一步描述。優(yōu)選地，本發(fā)明提供的突變體擴環(huán)酶如前文所述對己二?；?6-APA和Pen-G均具有提高的擴環(huán)酶活性。本發(fā)明還提供了對異青霉素N(iPN)具有降低的擴環(huán)酶活性或甚至不具有擴環(huán)酶活性的突變體擴環(huán)酶。優(yōu)選地，對己二?；?6-APA或Pen-G的擴環(huán)酶活性不受影響，但是更優(yōu)選對己二酰基-6-APA或Pen-G的活性之一或兩者均如前文所述被提高。這些更優(yōu)選的突變體擴環(huán)酶的優(yōu)點在于對異青霉素(iPN)降低甚至不存在的擴環(huán)酶活性導(dǎo)致生產(chǎn)己二?；?7-ADCA或苯乙酰-7-ADCA的發(fā)酵方法中產(chǎn)生更少的副產(chǎn)物。優(yōu)選的突變體擴環(huán)酶對異青霉素N(iPN)底物具有降低的或甚至不存在的擴環(huán)酶活性結(jié)合可選地對ad-6-APA底物的提高的擴環(huán)酶活性，并在根據(jù)SEQIDNo1氨基酸排序的位置89上被修飾。其中天然存在的氨基酸己被修飾，優(yōu)選地被帶電氨基酸如賴氨酸、精氨酸或組氨酸修飾，優(yōu)選地被賴氨酸修飾。高度優(yōu)選的突變體擴環(huán)酶選自由H401、H402、H403、H501、H502、H503、H504、H505、H506、H507、H508、H601、H602、H603、H604、H605、H606、H607、腳8、H609、H650、H651、H652、H653、H654、H655、H656、H657、H658、H659、H660、H661、脳2、G601、G602、G603、G604、G605、G606、G607、G608、G609、G610、G611、G613、G614、H701、H702、H703、H704、H705、H706組成的組(參閱表3和表4)。第二方面，本發(fā)明提供編碼本發(fā)明突變體擴環(huán)酶的多核苷酸。編碼本發(fā)明突變體擴環(huán)酶的多核苷酸可以是編碼本發(fā)明合適氨基酸序列的任何多核苷酸?；蛘?，本發(fā)明的多核苷酸可包含編碼序列，其中多種氨基酸的密碼子選擇不同于來自&c/avM//gems中的密碼子選擇。例如所述密碼子可以被修改來適應(yīng)特定宿主細胞的密碼子選擇，其將要或已經(jīng)用編碼改變的擴環(huán)酶的DNA片段轉(zhuǎn)化。第三方面，本發(fā)明提供包含前文所述本發(fā)明多核苷酸的表達載體或表達盒。第四方面，本發(fā)明提供經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細胞，其用本發(fā)明的多核苷酸或本發(fā)明的表達載體或表達盒轉(zhuǎn)化。經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細胞可用于生產(chǎn)本發(fā)明的突變體擴環(huán)酶，或所述宿主細胞可用于生產(chǎn)感興趣的P-內(nèi)酰胺化合物。用于生產(chǎn)本發(fā)明突變體擴環(huán)酶的宿主細胞優(yōu)選地是下述宿主細胞，所述宿主細胞因其在細胞外或細胞內(nèi)有效生產(chǎn)蛋白質(zhì)或酶而被本領(lǐng)域所已知，例如微生物，如真菌、酵母和細菌。優(yōu)選的宿主細胞的實例包括，但不僅P艮于以下屬yl/erg7'〃ws(例如爿.m'ger，J.o^^ea)、Pem'c/〃/ww(例如尸.eweraom)'、尸.cAowgewww)、/S^cc/araw_ycey(例如Xcerev/a'"e)、A7炒veraw;^M(例如K/acto)、SacZ〃ws(例如及si/6"fo、5.(例如6*.c/avw/Zgen^)。用于生產(chǎn)P-內(nèi)酰胺化合物的宿主細胞優(yōu)選地是下述宿主細胞，所述宿主細胞因其有效生產(chǎn)^-內(nèi)酰胺化合物而被本領(lǐng)域已知。優(yōu)選的宿主細胞的實例包括，但不限于下述屬尸e"Zd〃/wm(例如尸.cA/^wgewwm)、爿crewom'wm(例如AcA/jsogewwm)、5Vreptom_ycas(例如51.c/avw//gen)、7Vocfl/^/a(例如A/"./actomfi^ra朋)、丄"o^^cter(例如丄./actomge/ws)禾卩F/avo6acten'wm禾中。第五方面，本發(fā)明提供用于生產(chǎn)本發(fā)明突變體擴環(huán)酶的方法，包括在有助于生產(chǎn)突變體擴環(huán)酶的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的經(jīng)轉(zhuǎn)化宿主細胞，和可選地回收突變體擴環(huán)酶。經(jīng)回收的突變體擴環(huán)酶可有利地用于體外方法，從相應(yīng)的青霉素生產(chǎn)所需的頭孢菌素，例如經(jīng)回收的突變體擴環(huán)酶可用于從Pen-G生產(chǎn)苯乙酰-7-ADCA或從己二?；?6-APA生產(chǎn)己二?；?7-ADCA。第六方面，本發(fā)明提供用于生產(chǎn)感興趣的e-內(nèi)酰胺化合物的方法，包括在有助于生產(chǎn)感興趣的P-內(nèi)酰胺化合物的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的經(jīng)轉(zhuǎn)化宿主細胞，和可選地回收e-內(nèi)酰胺化合物。優(yōu)選的e-內(nèi)酰胺化合物屬于頭孢菌素類，例如苯乙酰-7-ADCA、己二?；?7-ADAC、己二?；?7-ADCA和己二?；?7-ACA。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供通過培養(yǎng)c/o^gemmz選定菌株來生產(chǎn)苯乙酰-7-ADCA或己二?；?7-ADCA的方法，所述菌株己用編碼本發(fā)明突變體擴環(huán)酶的選定的本發(fā)明多核苷酸轉(zhuǎn)化。高度優(yōu)選的突變體擴環(huán)酶選自由H401、H402、H403、H501、H502、H503、H504、H505、H506、H507、H508、H601、H602、H603、H604、H605、H606、H607、H608、H609、H650、H651、H652、H653、H654、H655、H656、H657、H658、H659、H660、H661、H662、G601、G602、G603、G604、G605、G606、G607、G608、G609、G610、G611、G613、G614、H701、H702、H703、H704、H705、H706組成的組(見表3和表4)。就苯乙酰-7-ADCA生產(chǎn)而言，選擇對Pen-G底物具有高的提高因數(shù)的突變體擴環(huán)酶。就己二酰基-7-ADCA生產(chǎn)而言，選擇對ad-6-APA底物具有高的提高因數(shù)的突變體擴環(huán)酶。在另一優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供用于生產(chǎn)7-ADCA的方法，包括本文之前所述用于生產(chǎn)苯乙酰-7-ADCA或己二?；?7-ADCA的方法，在所述7-ADCA衍生物的可選的純化后進行下述方法步驟，其中苯乙酰-7-ADCA和己二?；?7-ADCA各自的苯乙酰基或己二?；鶄?cè)鏈被切除，從而產(chǎn)生7-ADCA和被釋放的側(cè)鏈酸。所述切割可通過化學(xué)手段，或更優(yōu)選使用?；附?jīng)酶反應(yīng)獲得。用于切割己二?；鶄?cè)鏈的合適?；缚傻米远喾N尸"W(io/ncw(XS物禾中，如尸sewc/o"w"(xySY-77或尸化w^wo"os1SE-83。用于切割苯乙?；鶄?cè)鏈的合適酰基酶是來自五scAer/c/n'aco/Z或J/ca"ge"^/e"cflfo的青霉素?；?。第七方面，本發(fā)明提供用于從相應(yīng)青霉素生產(chǎn)頭孢菌素的方法，其中青霉素5元噻唑烷環(huán)到環(huán)孢菌素6元雙氫噻嗪環(huán)的擴環(huán)發(fā)生在體外過程中，所述過程由本發(fā)明的突變體擴環(huán)酶催化。在優(yōu)選的過程中，通過本發(fā)明的突變體擴環(huán)酶將己二?；?6-APA擴環(huán)為相應(yīng)的己二酰基-7-ADCA，優(yōu)選的使用當己二酰基-6-APA作為底物時具有高提高因數(shù)的突變體擴環(huán)酶。在另一優(yōu)選的過程中，通過本發(fā)明的突變體擴環(huán)酶將Pen-G擴環(huán)為相應(yīng)的苯乙酰-7-ADCA，優(yōu)選的使用當Pen-G作為底物時具有高提高因數(shù)的突變體擴環(huán)酶?？蛇x地純化所述7-ADCA衍生物后，該方法可隨后進行下述方法步驟，其中己二酰基-7-ADCA和苯乙酰-7-ADCA的側(cè)鏈被切除，從而產(chǎn)生7-ADCA和被釋放的側(cè)鏈，參見上文。所需的終產(chǎn)物7-ADCA可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法回收，所述方法涉及己二?；?7-ADCA或苯乙酰-7-ADCA側(cè)鏈的化學(xué)切割或酶切割，可選地可將得到的7-ADCA進一步純化和/或結(jié)晶。第八方面，本發(fā)明提供獲得本發(fā)明突變體擴環(huán)酶的方法，其中所述方法包括以下步驟1.誘變編碼具有擴環(huán)酶活性的模型多肽的克隆基因從而獲得編碼突變體擴環(huán)酶的被誘變基因的集合；2.在合適的宿主中表達編碼突變體擴環(huán)酶的所述被誘變基因的集合，并篩選出對合適底物具有提高活性的突變體擴環(huán)酶集合；3.使用編碼具有擴環(huán)酶活性的模型多肽的基因或一種或多種編碼對合適底物具有提高活性的突變體擴環(huán)酶的經(jīng)誘變基因可選地將步驟1和2重復(fù)一次或若干次?？筛鶕?jù)本領(lǐng)域已知的方法對編碼具有擴環(huán)酶活性的多肽的基因進行克隆。具有擴環(huán)酶活性的優(yōu)選的模型多肽選自由下述多肽組成的組可得自S^;to^yc^c/avw/z'gm^的具有擴環(huán)酶活性的多肽，其優(yōu)選的具有SEQIDNO:1的氨基酸序列；和具有擴環(huán)酶活性的多肽，其優(yōu)選的具有下述氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:1具有至少70%、優(yōu)選地至少75%、更優(yōu)選地至少80%、更優(yōu)選地至少85%、更優(yōu)選地至少90%、最優(yōu)選地至少95%的同一性，例如表1中概括的擴環(huán)酶?？墒褂迷谡麄€基因中導(dǎo)致突變的任何誘變技術(shù)。合適的技術(shù)為易錯(EP)PCR(聚合酶鏈式反應(yīng))和/或通過使用完全根據(jù)WO03/010183的MutationPrimerPCR(sMPP)。材料和方法l.通用的寡核苷酸由Invitrogen(CarlsbadCA,美國)合成。DNA測序由SEQLAB(G6ttingen,德國)或Baseclear(Leiden，荷蘭)進行。限制性酶購自Invitrogen。蛋白質(zhì)測定根據(jù)Bradford,M.M.(1976)AnalBiochem.72:248-54所述方法進行￡^c/^n'c/'aco//DH10Belectromax感受態(tài)細胞得自Invitrogen。方案由制造商提供。SDS-PAGE電泳在Invitrogen提供的系統(tǒng)中進行。NuPAGENovexBis-TrisGels(Invitrogen)。SimplyBlueSafeStainMicrowave方案。為了產(chǎn)生Ce伍表達載體，用zeozin選擇標記代替pBAD/Myc-His(可得自InvitrogenTM)中的氨芐西林選擇標記。另外，將麥芽糖結(jié)合蛋白與野生型c/wM%m擴環(huán)酶基因融合并連接在pBAD啟動子后，得到載體pBAD-MH-Zeo-MBP-ScEwt。用易錯突變體文庫交換野生型Ceffi。2.在微孔滴定板(MTP)上初級篩選生長和誘導(dǎo)將擴環(huán)酶co//文庫涂布在低鹽瓊脂+25pg/mlZeocine的Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)平板上，在37。C孵育過夜。將含有150/xlLB低鹽培養(yǎng)基和25Mg/mlZeocine的微孔滴定板(MTP)從上述平板中接種并在25。C和550rpm下孵育36小曰寸。從MTP中取5/xl接種于含1ml2*TY(胰蛋白胨和酵母提取物)培養(yǎng)基+50pg/mlZeocine+阿拉伯聚糖的深孔平板中。向MTP中剩余的培養(yǎng)物中加入100/xl50%甘油并冷凍于-80°(:作為甘油儲存株。將深孔平板在25。C和550rpm下孵育30小時。將深孔平板在2750rpm(Heraeusmultifuge4kr.)下離心10分鐘。棄去上清液并將沉淀物凍存于-20。C。無細胞抽提物(CFE)將前一節(jié)中獲得的凍存沉淀物在200^1抽提緩沖液(50mMTris/HCIpH=7.5;5mMDTT;0.1mg/mlDNAse;5mMMgS04H20禾口0.5mg/mllysozyme)中融化。為了重懸沉淀物，振動平板。將平板在室溫下孵育30分鐘并在2750rpm離心IO分鐘。3在燒瓶中再次篩選生長和誘導(dǎo)將選定的克隆從平板上接種在10ml低鹽LB+Zeocin25/xg/ml中并在37°C、280rpm下孵育過夜。將生長培養(yǎng)基以0.010到0.050之間的最佳光密度(600nm)(BiochromUltraspec2000)接種于帶有25/xg/mlZeocine的100ml低鹽LB中。在37。C、280rpm生長后，在0.4-0.6之間600nm處的最佳光密度下收集細胞。然后添加阿拉伯糖(終濃度0.2%)并在27°C220rpm下誘導(dǎo)過夜。將培養(yǎng)物離心，棄去上清液并將沉淀凍于-2(TC?？寺.coli表達載體通過EcoRI/Sa11消化將融合產(chǎn)物連接在pBAD/MHMBP-ScEwtDestzeo-zeo載體中。這用文庫基因代替了野生型擴環(huán)酶基因。為了防止大量野生型構(gòu)建體，用Smal消化連接構(gòu)建體。構(gòu)建文庫用大約12，000-13，000個克隆的連接混合產(chǎn)生的文庫轉(zhuǎn)化五.co/!'。為了測試文庫的品質(zhì)，選擇隨機的菌落集合，并用限制性酶消化構(gòu)建體。這顯示了約26。X的文庫顯示異常模式。接著對10個常規(guī)克隆進行序列分析以測定突變頻率。序列顯示飽和和易錯突變均以令人滿意的水平存在。4擴環(huán)酶測定將總共300^的反應(yīng)混合物添加至75^CFE中并在29。C孵育所需時間，所述反應(yīng)混合物由50mMTris/HClpH7.5、1mMDTT、2.7mM抗壞血酸、0.05mMATP、24mMa-酮戊二酸、0.06mMFeS04'7H20、4mM己二酰基-6-氨基-青霉烷酸(ad-6-APA)組成。加入60/xl馬來酸和10g/lEDTA終止反應(yīng)。使用iH-NMR檢測己二?；?7-氨基-脫乙酰氧基-頭孢霉烷酸(ad-7-ADCA)的形成。在這些條件下，在接近Vmax條件下測量擴環(huán)酶活性，因為51.c/avw/z'ge^野生型酶對ad-6-APA的Kw約為0.4mM。或者該測定可以使用0.4mMad-6-APA進行(&c/a術(shù)〃gen'5野生型酶對ad-6-APA的KM)。己二?；?6-APA得自由戊二酰?；?EC3.5丄11)催化的6-APA和己二酸?；蛘?，己二?；?6-APA可通過在存在己二酸作為前體時培養(yǎng)例如合適的Pe"/c〃/z',cA，oge"廳菌株來獲得。實施例實施例l第一代改良的擴環(huán)酶(H400系列)通過對野生型^re/towj;cMc/mWZgm^Ceffi基因(SEQIDNo.l)進行易錯(EP)PCR(聚合酶鏈式反應(yīng))構(gòu)建第一代擴環(huán)酶文庫。在該文庫中篩選ad-6-APA到ad-7-ADCA的改良轉(zhuǎn)化后，選擇了3個不同的突變體基因。所述突變體顯示高達2.5倍的提高的ad-6-APA擴環(huán)活性(H401、H402、H403:見表3)。實施例2第二代改良的擴環(huán)酶(H500系列)通過使用飽和的突變引物PCR(sMPP)完全根據(jù)WO03/010183構(gòu)建第二代擴環(huán)酶文庫。來自第一代的選定突變體基因(H401、FW02和H403)用作構(gòu)建第二代文庫的模板。通過使用Taq聚合酶進行sMPP，從而引入額外的突變(隨機)并提高文庫的變異。設(shè)計的引物在突變位置退火并在第一代擴環(huán)酶擊中(hit)中發(fā)現(xiàn)的突變處被飽和。另外，設(shè)計通用的正向和反向引物，其中分別引入Ndel和Nsil位點。這促進進入Penicillium表達載體的克隆，所述載體用于體內(nèi)測試突變體擴環(huán)酶。如材料與方法章節(jié)中所述培養(yǎng)文庫并誘導(dǎo)擴環(huán)酶表達。如材料與方法章節(jié)中所述使用HMR測定ad-7-ADCA的形成。選擇約150個改良的突變體擴環(huán)酶并再檢驗它們的ad-6-APA擴環(huán)酶活性。根據(jù)該再檢驗的結(jié)果，選擇17個突變體用于在搖瓶中最終檢驗。用ad-6-APA作為底物時，17個選定擊中中總計15個顯示顯著提高的擴環(huán)酶活性。為了排除擴環(huán)酶的假陽性選擇，在SDS-PAGE上定量蛋白質(zhì)水平。這證實了提高的活性不是因為大腸桿菌中擴環(huán)酶的更強表達，而是提高可歸功于擴環(huán)酶突變體提高的特異活性。總共鑒定出了8個突變體擴環(huán)酶，它們顯示高達4、5倍的ad-6-APA擴環(huán)酶提高因數(shù)(與S.c/"vM/z'gm^野生型擴環(huán)酶相比-SEQIDNo1)。這些突變體被稱作H501-H508(見表3)。實施例3第三代改良的擴環(huán)酶(H600系列)得自實施例2中第二代的8個突變體(H501-H508)被用作構(gòu)建第三代擴環(huán)酶文庫的模板。該文庫以與第二代擴環(huán)酶文庫相同的方式構(gòu)建。另外，擴環(huán)酶C端的SKA信號序列被改變?yōu)镾KD，導(dǎo)致在尸em'c/肌wm中表達時擴環(huán)酶僅在胞質(zhì)溶膠中表達。該文庫的篩選得到22個不同的擴環(huán)酶突變體基因，它們與Xc/avM//gm擴環(huán)酶相比顯著地提高了5倍到11倍之間(表3，H600系列)。使用7mM的Pen-G作為底物將同一文庫篩選第二遍，得到13個額外的突變體擴環(huán)酶(G601-G611和G613-G614;見表3)。實施例4第四代改良的擴環(huán)酶(H700系列)得自實施例3中第三代的突變體(G606、G612、H602、H606、H650、H651、H653、H655、H658、H661)被用作第四代擴環(huán)酶文庫構(gòu)建的模板。以與第三代擴環(huán)酶文庫相同的方式構(gòu)建該文庫。該文庫的篩選得到6個不同的擴環(huán)酶突變體基因，據(jù)測試它們對0.4mM濃度的ad-6-APA的擴環(huán)酶活性被顯著提高(高達20倍)(表4，H701-H706)。實施例5用異青霉素N(iPN)和青霉素-G(pen-G)作為底物的改良的突變體擴環(huán)酶的活性使用iPN和Pen-G作為底物測量了若干種突變體擴環(huán)酶的活性。使用iPN作為底物的測定法如材料與方法章節(jié)中所述進行，但是用相同濃度的iPN(4mM)代替ad-6-APA。用Pen-G作為底物的測定法如材料和方法章節(jié)中所述進行，但是用7mM的Pen-G代替ad-6-APA。表3概括了多種擴環(huán)酶突變體對iPN和Pen-G的活性。盡管大部分測試的擴環(huán)酶突變體顯示它們對iPN的擴環(huán)酶活性提高5倍，但是帶有T89K突變的突變體事實上喪失了對iPN的所有活性。測試的多種擴環(huán)酶突變體對Pen-G的活性與野生型擴環(huán)酶(提高因數(shù)為l)相同，或被提髙至8倍。數(shù)據(jù)還顯示無論用ad-6-APA和Pen-G作為底物，得自單個突變的提高因數(shù)間不存在相關(guān)。對于ad-6-APA和Pen-G的各提高因數(shù)之間的比例在0.1(例如H654)至l」1.2(例如H503)范圍內(nèi)變化。表3.突變體擴環(huán)酶及其對ad-6-APA、Pen-G禾tliPN的擴環(huán)酶活性。每個突變體由其代碼標識；突變被引入來自&c/aviJ/gen^的模型擴環(huán)酶(SEQIDNOl)中。根據(jù)"材料和方法"和實施例4中的體外擴環(huán)酶測定法，擴環(huán)酶活性被表達為與來自&c/avw/Zgen^的模型擴環(huán)酶(定義為擴環(huán)酶活性-l)相比的提高因數(shù)。<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>表3顯示已獲得46個突變體擴環(huán)酶，其具有1.5至lj10.6倍范圍內(nèi)的提<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>權(quán)利要求1.一種突變體擴環(huán)酶，其為具有擴環(huán)酶活性的模型多肽的變體，其中所述突變體擴環(huán)酶與具有擴環(huán)酶活性的模型多肽相比，對己二?；?6-APA的體外擴環(huán)酶活性至少提高2.5倍。2.—種突變體擴環(huán)酶，其為具有擴環(huán)酶活性的模型多肽的變體，其中所述突變體擴環(huán)酶在選自以下的氨基酸位置組的至少一個氨基酸位置上被修飾由位置2、59、73、89、90、99、101、105、113、155、170、177、209、213、217、244、249、251、277、278、280、281、293、300、306、307禾卩311組成的組，其中使用6Ve;7tow7cMc/ara//gem的ceffi基因編碼的擴環(huán)酶氨基酸序列(SEQIDNO:l)的氨基酸位置編號。3.根據(jù)權(quán)利要求2的突變體擴環(huán)酶，其中所述突變體擴環(huán)酶在選自以下的氨基酸位置組的至少一個氨基酸位置上被修飾由位置2、59、89、90、99、105、113、170、177、209、213、217、249、251、278、280和293組成的組，更優(yōu)選地選自由位置2、89、90、99、105、177、251、278、280和293組成的組。4.根據(jù)權(quán)利要求1的突變體擴環(huán)酶，其至少在選自權(quán)利要求2所述組中的至少一個氨基酸位置上被修飾，或在選自權(quán)利要求3所述任一組中的至少一個氨基酸位置上被修飾。5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項的突變體擴環(huán)酶，其包含至少2個或更多個選自以下的氨基酸位置由位置2、89、277、281和300組成的組，優(yōu)選地在位置2+281或89+281或277+300上。6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項的突變體擴環(huán)酶，其包含至少3個或更多選自以下的氨基酸位置由位置2、89、281、293和311組成的組，優(yōu)選在位置2+89+281或89+281+311或89+281+293上。7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項的突變體擴環(huán)酶，其包含至少4個或更多選自以下的氨基酸位置由位置2、73、89、90、217、244、277、281、306、307和311組成的組，更優(yōu)選地在位置2+277+280+281或2+281+306+311或73+89+281+311或89+217+281+311或89+244+281+311或89+281+307+311或277+281+306+311或89+281+306+311或90+281+306+311上。8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項的突變體擴環(huán)酶，其包含至少5個或更多個選自以下的氨基酸位置由位置2、73、89、155、213、249、281、293、300、306禾n311組成的組，更優(yōu)選地在位置2+89+281+306+311或2+155+281+306+311或73+89+213+281+311或89+281+293+300+311或89+249+281+306+311上。9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項的突變體擴環(huán)酶，其包含至少6個選自由位置90+105+113+281+306+311組成的組的氨基酸位置。10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項的突變體擴環(huán)酶，其包含至少7個或更多個選自以下的氨基酸位置由位置73、89、105、113、155、177、277、280、281、293、300、306、307和311組成的組，更優(yōu)選地為73+89+281+293+300+307+311或105+113+155+177+281+306+311或155+177+277+280+281+306+311。11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項的突變體擴環(huán)酶，其包含至少8個或更多選自以下的氨基酸位置由位置2、90、99、105、113、155、177、277、281、306和311組成的組，更優(yōu)選地在2+90+99+105+113+281+306+311或2+90+105+113+155+177+277+281上。12.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項的突變體擴環(huán)酶，其包含至少9個選自由位置2+90+105+113+155+177+281+306+311組成的組的氨基酸位置。13.根據(jù)權(quán)利要求1的突變體擴環(huán)酶，其包含至少IO個選自由位置2+90+105+113+155+177+281+306+311組成的組的氨基酸位置。14.根據(jù)權(quán)利要求2、3和4-13中任一項的突變體擴環(huán)酶，其與具有擴環(huán)酶活性的模型多肽相比對己二?；?6-APA的體外擴環(huán)酶活性至少提高2.5倍。15.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項的突變體擴環(huán)酶，其中所述突變體擴環(huán)酶是由SEQIDNo.1所述基因ceffi編碼的51.c/avw紐m^擴環(huán)酶的變體。16.根據(jù)權(quán)利要求15的突變體擴環(huán)酶，其中所述突變體擴環(huán)酶至少在選自以下的氨基酸位置被修飾由位置D2、S59、M73、T89、N90、M99、Y101、T105、G113、C155、H170、P177、G209、T213、Y217、H244、R249、D251、L277、A278、E280、C281、T293、G300、R306、R307和A311組成的組，更優(yōu)選地至少在選自以下的氨基酸位置上被修飾由位置2、59、89、90、99、105、113、170、177、209、213、217、249、251、278、280和293組成的組，更優(yōu)選地選自由位置2、89、90、99、105、177、251、278、280和293組成的組。17.—種多核苷酸，其編碼前述權(quán)利要求任一項的突變體擴環(huán)酶。18.—種表達載體或表達盒，其包含權(quán)利要求17的多核苷酸。19.一種宿主細胞，其被權(quán)利要求17的多核苷酸或權(quán)利要求18的載體或表達盒轉(zhuǎn)化。20.權(quán)利要求1-16中任一項的突變體擴環(huán)酶的生產(chǎn)方法，其包括在有助于生產(chǎn)所述突變體擴環(huán)酶的條件下培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求19的宿主細胞，和可選地回收所述多肽。21.—種生產(chǎn)感興趣的P-內(nèi)酰胺化合物的方法，其包括在有助于生產(chǎn)所述e-內(nèi)酰胺化合物的條件下培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求20的宿主細胞，和可選地回收所述P-內(nèi)酰胺化合物。22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其還包含將P-內(nèi)酰胺化合物N-脫酰基以生產(chǎn)N-脫?；?-內(nèi)酰胺化合物。23.獲得根據(jù)權(quán)利要求1-16中任一項的突變體擴環(huán)酶的方法，其中所述方法包括以下步驟誘變編碼具有擴環(huán)酶活性的模型多肽的克隆基因從而獲得編碼突變體擴環(huán)酶的被誘變基因的集合，所述克隆基因優(yōu)選地是編碼來自&c/flvw//gm的擴環(huán)酶的ceffi;在合適的宿主中表達編碼突變體擴環(huán)酶的所述被誘變基因的集合，并篩選出對合適底物具有提高活性的突變體擴環(huán)酶集合，所述底物優(yōu)選地是ad-6-APA;使用編碼具有擴環(huán)酶活性的模型多肽的基因，和/或一種或多種編碼對合適底物具有提高活性的突變體擴環(huán)酶的經(jīng)誘變的基因，可選地將步驟1和2重復(fù)一次或若干次，從而誘變所使用的基因。全文摘要本發(fā)明涉及突變體擴環(huán)酶，其為具有擴環(huán)酶活性的模型多肽的變體，其中所述突變體擴環(huán)酶與具有擴環(huán)酶活性的模型多肽相比，對己二?；?6-APA的體外擴環(huán)酶活性至少提高2.5倍。文檔編號C12N9/02GK101300360SQ200680025577公開日2008年11月5日申請日期2006年4月10日優(yōu)先權(quán)日2005年7月12日發(fā)明者理查德·克爾曼,羅拉納·麥德勒尼·拉姆斯多克,迪克·希珀,魯洛夫·阿利·蘭斯·伯韋比格申請人:帝斯曼知識產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司