專利名稱：用于組織填充的分化的未成熟脂肪細(xì)胞和生物可降解支架的移植的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及將衍生自人類脂肪組織的前脂肪細(xì)胞(preadipocyte) 分化成脂肪細(xì)胞并將這些分化的脂肪細(xì)胞連同生物可降解支架移植 進(jìn)入身體的技術(shù)。更具體地，本發(fā)明涉及細(xì)胞直徑在20到40微米的 未成熟脂肪細(xì)胞，該細(xì)胞是通過從自體或同種異體的人體脂肪組織中 分離前脂肪細(xì)胞并在含有生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述分離的前脂 肪細(xì)胞、隨后分化脂肪細(xì)胞而獲得的，本發(fā)明涉及一種用生物可降解 支架培養(yǎng)未成熟脂肪細(xì)胞的方法，以及一種將未成熟脂肪細(xì)胞連同生 物可降解支架一起移植進(jìn)入體內(nèi)的方法。
背景技術(shù)：
目前，脂肪的自體移植相當(dāng)普遍。自體脂肪移植的歷史可以追溯 到1890年代，這種技術(shù)隨著1980年吸脂技術(shù)的引入而被廣泛使用。 結(jié)果，大量具有驗(yàn)證根據(jù)的案例和記錄表明自體脂肪移植是安全的。 特別地，脂肪移植廣泛地用于各種各樣的應(yīng)用，例如減緩衰老皮膚的 皺褶，矯正和重建唇線、臉線和發(fā)際線，以及鼻整形術(shù)。另外，脂肪 移植還可以用于多種領(lǐng)域，如由于皮膚燙傷或外傷造成的皮膚凹陷， 由于癌切除術(shù)等造成的組織缺陷，產(chǎn)生如缺陷區(qū)域矯正手術(shù)的滿意結(jié) 果。
然而，用簡(jiǎn)單的吸脂術(shù)從脂肪組織獲得的脂肪的移植示出術(shù)后脂 肪移植物的較短的存活期以及持續(xù)性的不令人滿意的結(jié)果，包括移植 的脂肪體積的40-60%的高吸收率，因此需要進(jìn)行脂肪的再移植(S Eremia et al， 2000， Dermatol. Sur. 26， 1150-1158; and Fulton JE et al， 2001， Dermatol. Clin. 19(3)， 523-530)。
由于這些原因，人們進(jìn)行了大量的研究以從通過吸脂術(shù)獲取的脂
肪塊(bulk fat)中分離純脂肪細(xì)胞。為此，一些研究小組和機(jī)構(gòu)將纖 維物質(zhì)和血液從吸脂術(shù)獲得的脂肪塊中去除掉后進(jìn)行脂肪移植，但是 至今為止仍未取得滿意的結(jié)果(G Sattler et al， 2000， Dermatol. Sur. 26， 1140-1144)。
正如上面所討論的，當(dāng)將簡(jiǎn)單地從脂肪組織中分離出來的脂肪移 植進(jìn)入體內(nèi)時(shí)，會(huì)發(fā)生移植物體積減少。這是因?yàn)榇蠖鄶?shù)如此獲得的 脂肪細(xì)胞都已經(jīng)完全成熟，相當(dāng)一部分細(xì)胞在吸脂時(shí)被破壞，這是因 為成熟的脂肪細(xì)胞在壓力下很易碎，所以這就造成了移植后移入率降 低，血運(yùn)重建(revascularization)或新生血管化(neovascularization) 形成不很順利。
為此，大量的研究已經(jīng)或者正在積極地嘗試用脂肪組織中含有的 前脂肪細(xì)胞作為脂肪移植替代品的可能性。由于從脂肪組織衍生的前 脂肪細(xì)胞根據(jù)所給的分化條件可以分化成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌細(xì)胞、 神經(jīng)細(xì)胞等等，這種方法基于應(yīng)用涉及體內(nèi)移植前脂肪細(xì)胞及其在移 入靶位點(diǎn)后分化成脂肪細(xì)胞的機(jī)理(M Gimble et al， 2000, Bone 19: 421-428)。然而，前脂肪細(xì)胞所表現(xiàn)出的多能性，使得安全移植沒有 保障。另外，前脂肪細(xì)胞的分化潛能和分化成脂肪細(xì)胞的分化率嚴(yán)重 地受到耙移植位點(diǎn)周圍生理微環(huán)境的影響，因此很難準(zhǔn)確預(yù)測(cè)移植后 可能發(fā)生的結(jié)果。而且，結(jié)合生長(zhǎng)因子的治療作為幫助前脂肪細(xì)胞分 化成脂肪細(xì)胞的支持療法還可能會(huì)產(chǎn)生安全問題。
為應(yīng)付這些問題，美國(guó)專利No. 6，153，432 (于2000年11月28日 授權(quán))揭示了一種從通過吸脂手術(shù)獲得的脂肪組織中分離未分化的前 脂肪細(xì)胞并將分離的前脂肪細(xì)胞分化成移植所需的脂肪細(xì)胞的方法， 以及用于其的試劑。特別地，這種方法包括從通過吸脂術(shù)獲得的脂肪 組織中分離前脂肪細(xì)胞；將分離的前脂肪細(xì)胞懸浮于基質(zhì)培養(yǎng)基中， 接種這些懸浮的細(xì)胞到培養(yǎng)容器中，并在C02培養(yǎng)箱中在37°C溫育 24小時(shí)直到前脂肪細(xì)胞貼壁在培養(yǎng)容器底部；將基質(zhì)培養(yǎng)基換成分 化培養(yǎng)基，溫育所述細(xì)胞3天；將分化培養(yǎng)基替換為脂肪細(xì)胞培養(yǎng)基
并將前脂肪細(xì)胞分化成脂肪細(xì)胞。按照這種方法，可能最大化通過僅 僅移植健康的和未成熟的脂肪細(xì)胞獲得的所需效果，而不是使用那些 老化的脂肪細(xì)胞，這些細(xì)胞典型用于傳統(tǒng)的脂肪移植技術(shù)中，而且這 種方法也可能克服與使用前脂肪細(xì)胞可能產(chǎn)生的移植安全性和效率 相關(guān)的問題。
然而，在美國(guó)專利No. 6,153,432中所揭示的方法僅使用了表述 "分化的含有脂滴(LDs)的脂肪細(xì)胞"而沒有特別定義分化的脂肪細(xì) 胞，因此造成的困難是不能明確地指明和證實(shí)將最終從前脂肪細(xì)胞獲 得的分化脂肪細(xì)胞的最佳收獲時(shí)間以及這些脂肪細(xì)胞的質(zhì)量。
前脂肪細(xì)胞的成熟要通過以下幾個(gè)分化階段在分化的初始階 段，在細(xì)胞質(zhì)中形成小脂滴，小脂滴的數(shù)量逐漸增多，小脂滴聚集成 大脂滴。 一旦完成成熟， 一個(gè)脂滴將占據(jù)整個(gè)細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞的大小也 在成熟的過程中隨著脂類積聚而逐漸增大。前脂肪細(xì)胞，由于它們不 能確保在移植后能分化成脂肪細(xì)胞，而且在細(xì)胞收獲過程中完全成熟 的脂肪細(xì)胞有可能會(huì)被破壞，或者在其體內(nèi)移植后有可能表現(xiàn)出移入 率降低。因此，在相關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)需要研發(fā)一種方法，能夠通過特 別限定用于移植的細(xì)胞的特征及確保健康和未成熟的脂肪細(xì)胞而最 大化所需的移植結(jié)果。
在過去的幾年中，生物材料領(lǐng)域取得顯著的發(fā)展。大量材料己經(jīng) 進(jìn)入到臨床應(yīng)用，例如其中膠原是代表性的材料。另外，各種各樣的 生物材料被用于組織工程領(lǐng)域，包括例如，聚乳酸，聚乙醇酸，膠原 I型衍生物和藻酸鹽。通過移植這些生物材料聯(lián)合外源因子例如類固 醇和生長(zhǎng)激素治療，可能會(huì)促進(jìn)移植基質(zhì)中的細(xì)胞的生長(zhǎng)。根據(jù)最近 發(fā)表的文章，已經(jīng)證實(shí)將bFGF (堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)和Matrigel (基底膜膠原)一起注射進(jìn)小鼠中導(dǎo)致形成新的脂肪組織(K Toriyama et al, 2002, Tissue Engineering, vol. 8， 157-165)。即證實(shí)了內(nèi)皮細(xì)胞聚 集在Matrigel周圍，導(dǎo)致形成新的血管(新生血管化)，同時(shí)脂滴在這 些聚集的纖維樣細(xì)胞中形成。另夕卜，當(dāng)前脂肪細(xì)胞被引入到由聚乳酸 -乙醇酸共聚物(poly lactic-co-glycolic acid) (PLGA)形成的聚合物支
架中，該支架隨后被移植入大鼠體內(nèi)，前脂肪細(xì)胞分化成脂肪細(xì)胞，從而形成脂肪組織(CW Patrick et al， 2002， Tissue Engineering, vol. 8， 283-293)。
盡管在生物材料領(lǐng)域內(nèi)取得了顯著進(jìn)展，但是目前還沒有一種方 法可以通過移植生物材料進(jìn)入人體后有效地再生脂肪組織。最重要的 原因在于沒有找到能夠有效地?cái)U(kuò)增和分化人自體或同種異體脂肪細(xì) 胞的最佳條件，以及獲得能夠以高比率移入并在移植后能維持長(zhǎng)時(shí)期 的合適形式的分化的脂肪細(xì)胞的條件。因而，為了有效治療軟組織缺 乏或缺陷，需要將細(xì)胞生產(chǎn)技術(shù)和相關(guān)生物材料密切協(xié)調(diào)。
本發(fā)明描述 技術(shù)問題
因此，本發(fā)明正是鑒于以上問題而產(chǎn)生的。本發(fā)明的目的在于提 供一種能夠通過形成脂肪組織如體內(nèi)移植天然脂肪細(xì)胞和生物可降 解支架來有效地替換(replacing)靶位點(diǎn)的身體體積(body volume) 的方法，這種方法通過建立用于從人體脂肪組織中分離的未分化的前 脂肪細(xì)胞生產(chǎn)可移植的分化的未成熟脂肪細(xì)胞的技術(shù)并通過在體外 將分離的前脂肪細(xì)胞和生物可降解支架共培養(yǎng)證實(shí)生物可降解支架 中的脂肪細(xì)胞的成熟來進(jìn)行。
技術(shù)方案
按照本發(fā)明的一個(gè)方面，上述和其它目的通過提供用于替換身體 體積的可移植的脂肪細(xì)胞組合物來實(shí)現(xiàn)，該組合物包含細(xì)胞直徑20 到40微米的未成熟脂肪細(xì)胞，該細(xì)胞是通過將脂肪組織衍生的前脂 肪細(xì)胞分化成脂肪細(xì)胞而獲得的。
按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種生產(chǎn)可移植脂肪細(xì)胞組合 物的方法，包括
(a) 將未分化的從自體或同種異體脂肪組織中分離的前脂肪細(xì)胞 分化成脂肪細(xì)胞；
(b) 收集細(xì)胞直徑為20到40微米的分化的未成熟脂肪細(xì)胞；及
(C)在體外培養(yǎng)收集的未成熟脂肪細(xì)胞和生物可降解支架。 按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種移植脂肪細(xì)胞的方法，包
括
(a) 將未分化的從自體或同種異體脂肪組織中分離的前脂肪細(xì)胞 分化成脂肪細(xì)胞；
(b) 收集細(xì)胞直徑為20到40微米的分化的未成熟脂肪細(xì)胞；
(c) 在體外培養(yǎng)收集的未成熟脂肪細(xì)胞和生物可降解支架；及
(d) 移植未成熟的脂肪細(xì)胞連同生物可降解支架進(jìn)入體中。 將從自體或同種異體脂肪組織中分離出的未分化的前脂肪細(xì)胞
分化成脂肪細(xì)胞時(shí)，本發(fā)明的特點(diǎn)在于具有最大化分化率的脂肪細(xì)胞 是通過使用合適的基質(zhì)培養(yǎng)基、擴(kuò)增培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基和維持培養(yǎng) 基培養(yǎng)前脂肪細(xì)胞并收集那些成熟為預(yù)定大小的未成熟脂肪細(xì)胞而 獲得的。
本發(fā)明中用于移植的脂肪細(xì)胞是細(xì)胞直徑為20到40微米的分化 的未成熟脂肪細(xì)胞，并在靶移植位點(diǎn)隨著數(shù)量的逐漸增加而成熟。在 這個(gè)階段的未成熟脂肪細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)如不需要像前脂肪細(xì)胞那樣需要 分化誘導(dǎo)因子，比成熟的脂肪細(xì)胞或其它方法獲得的脂肪細(xì)胞具有更 優(yōu)越的存活率和移入率，并使得移植位點(diǎn)的體積逐漸增加。
當(dāng)本發(fā)明獲得的未成熟脂肪細(xì)胞連同支架一起移植的時(shí)候，在移 植初期階段的體積替換受支架的影響，這種支架是生物可降解的并在 脂肪細(xì)胞移入和生長(zhǎng)的過程中被吸收，隨后移植的缺陷區(qū)域?qū)⒈恍螒B(tài) 和特征都和天然脂肪組織相同的脂肪組織所替代。因此，本發(fā)明的可 移植脂肪細(xì)胞組合物導(dǎo)致在靶移植位點(diǎn)隨著脂肪細(xì)胞的成熟而逐漸 增加體積，因而可以用于有效地替換身體體積，可以治療各種由于軟 組織缺陷或外觀審美缺陷造成的病癥。


本發(fā)明的上述和其它目的、特征和其它優(yōu)點(diǎn)通過以下的詳細(xì)描述 連同附圖將被更清楚地理解，其中
圖1為顯微圖(X 400)，顯示經(jīng)油紅O染色確定的分化的未成熟 脂肪細(xì)胞和成熟脂肪細(xì)胞的大??；
圖2為將分化的未成熟脂肪細(xì)胞引入纖維蛋白中并將其共培養(yǎng)1 個(gè)月后，用油紅O染色的成熟脂肪細(xì)胞的顯微圖(A, C-F: X 400);
圖3為顯示將分化的未成熟脂肪細(xì)胞引入纖維蛋白中并將其共 培養(yǎng)后分泌到培養(yǎng)上清液中的瘦蛋白的變化的圖4為將分化的未成熟脂肪細(xì)胞引入藻酸鹽珠中并將其共培養(yǎng) 后用油紅O染色的脂肪細(xì)胞顯微圖(A: X 40和B-D: X 400)。
最佳方式
在下文中，將更細(xì)致地描述本發(fā)明。
本文所用術(shù)語"前脂肪細(xì)胞"是指從脂肪組織中分離的細(xì)胞，特別 是具有分化成脂肪細(xì)胞的潛能的細(xì)胞。
本文所用術(shù)語"脂肪細(xì)胞"在本發(fā)明中是指通過用分化誘導(dǎo)因子 處理前脂肪細(xì)胞而形成脂滴并分泌瘦蛋白的細(xì)胞，及指由未分化的前 脂肪細(xì)胞分化而成的脂肪細(xì)胞。
本文所用術(shù)語"分化的未成熟脂肪細(xì)胞"在本發(fā)明中是指通過用 分化誘導(dǎo)因子處理前脂肪細(xì)胞而形成脂滴并分泌瘦蛋白的細(xì)胞，及指 由未分化前脂肪細(xì)胞分化而成的細(xì)胞直徑在20到40微米的細(xì)胞。
本文所用術(shù)語"前脂肪細(xì)胞分化因子"是指將前脂肪細(xì)胞分化成 脂肪細(xì)胞所必需的物質(zhì)，包括例如生物素、胰島素、泛酸酯 (pantothenate)、地塞米松(dexamethasone)、異丁基甲基黃嘌呤 (isobutylmethylxantine ) (IBMX)禾口卩弓|卩朵美辛(indomethacin)。
本文所用短語"臨床應(yīng)用移植"是指移植由前脂肪細(xì)胞分化的未 成熟脂肪細(xì)胞以糾正身體輪廓例如緩和或減少由于衰老而導(dǎo)致的皮 膚褶皺，或糾正臉部輪廓，或再生身體上凹陷的區(qū)域，例如由于癌切 除術(shù)而引起的組織缺陷，傷口造成的凹陷區(qū)域，以及身體畸形而導(dǎo)致 的凹陷區(qū)域等等。
本文所用術(shù)語"同種異體移植"是指移植從衍生自同一物種的其他人或其它動(dòng)物的特定組織或器官或細(xì)胞，及指不可能使用自體組織 或器官或細(xì)胞時(shí)，移植衍生自其他人或其它動(dòng)物的組織或器官或細(xì) 胞。
本發(fā)明包括將從自體或同種異體脂肪組織中分離的未分化的前 脂肪細(xì)胞分化成脂肪細(xì)胞，有很多不同的分化前脂肪細(xì)胞的方法已經(jīng)
在大量的文獻(xiàn)中發(fā)表。通過對(duì)上述引用到的美國(guó)專利No. 6，153，432(于2000年11月28日授權(quán))中揭示的方法的改良，本發(fā)明提 出了生產(chǎn)可以在移植后逐漸增加體積的細(xì)胞的方法。
可以用在本發(fā)明中的前脂肪細(xì)胞主要是從(但不僅限于)吸脂術(shù) 獲得的人類皮下脂肪組織中得到的。
按照本發(fā)明，用于移植的分化的自體或同種異體脂肪細(xì)胞可以通 過以下方法獲得
(1) 從吸脂術(shù)得到的脂肪組織中分離前脂肪細(xì)胞
脂肪組織用KRB溶液(Krebs-Ringer重碳酸鹽溶液)洗滌，用 膠原酶處理，然后離心去除頂端脂層，在底層中加入基質(zhì)培養(yǎng)基，隨 后通過離心從底層中回收前脂肪細(xì)胞。
(2) 在基質(zhì)培養(yǎng)基中培養(yǎng)前脂肪細(xì)胞
將前脂肪細(xì)胞懸浮于基質(zhì)培養(yǎng)基中，并接種到培養(yǎng)容器中培養(yǎng)直 到細(xì)胞在培養(yǎng)容器底部貼壁。細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)，使用含有10%胎牛 血清(FBS)的DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 Nutrient Broth)作為基質(zhì)培養(yǎng)基。
(3)在擴(kuò)增培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞
去除基質(zhì)培養(yǎng)基后，細(xì)胞培養(yǎng)于擴(kuò)增培養(yǎng)基中，使得足夠數(shù)量的 前脂肪細(xì)胞得到擴(kuò)增。本文使用的擴(kuò)增培養(yǎng)基為DMEM/F12加 10%FBS、 EGF (表皮生長(zhǎng)因子)、bFGF (堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子) 和TGF-betal (轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子betal )，其通過誘導(dǎo)前脂肪細(xì)胞的快速 增殖使得細(xì)胞數(shù)量得到大量增加。
(4)細(xì)胞在基質(zhì)培養(yǎng)基中培養(yǎng)
當(dāng)培養(yǎng)容器的底部充滿單層細(xì)胞時(shí)，用基質(zhì)培養(yǎng)基替換擴(kuò)增培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞1到3天。
(5) 細(xì)胞在分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)
去除基質(zhì)培養(yǎng)基，細(xì)胞在分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)。本文使用的分化培 養(yǎng)基為DMEM/F12加3%FBS、生物素、泛酸酯、胰島素、地塞米松、 異丁基甲基黃嘌呤(IBMX)和吲哚美辛，其誘導(dǎo)前脂肪細(xì)胞分化成脂 肪細(xì)胞，從而開始在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)形成小脂滴。
(6) 細(xì)胞在維持培養(yǎng)基中培養(yǎng)
去除分化培養(yǎng)基，將細(xì)胞在維持培養(yǎng)基中培養(yǎng)。本文使用的維持 培養(yǎng)基為分化培養(yǎng)基的一種改良形式，其中的細(xì)胞分化誘導(dǎo)因子異丁 基甲基黃嘌呤(IBMX)和吲哚美辛被去除，每2到3天更換一次新鮮 培養(yǎng)基。當(dāng)在維持培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞成熟為脂肪細(xì)胞，脂滴的數(shù) 量增加并逐漸增加細(xì)胞的大小。
特別地，當(dāng)前脂肪細(xì)胞從開始的脂肪組織中分離出來并等份分到 培養(yǎng)容器中時(shí)，對(duì)于通過吸脂獲得的脂肪，調(diào)節(jié)細(xì)胞的脂肪濃度為大 約0.04 M《/cm2，并培養(yǎng)6到8天以保證充分?jǐn)U增。不進(jìn)行亞培養(yǎng)，細(xì) 胞擴(kuò)增終止于0代(P0)，隨后分化獲得具有最大分化率的脂肪細(xì)胞。
收集如此分化的脂肪細(xì)胞的時(shí)期可以如下確定。即前脂肪細(xì)胞在 分化培養(yǎng)基中開始形成脂滴。隨著在維持培養(yǎng)基中溫育時(shí)間的增加， 脂滴的數(shù)量和大小都隨之增加，從而產(chǎn)生成熟的細(xì)胞。 一旦細(xì)胞充分 成熟，通過積累更多的脂質(zhì)，脂滴合并成一個(gè)占據(jù)整個(gè)細(xì)胞質(zhì)的脂滴。 在培養(yǎng)過程中，細(xì)胞從培養(yǎng)容器底部脫離，懸浮在培養(yǎng)液中。另外， 前脂肪細(xì)胞在分化階段中逐漸增加大小，在分化早期階段的脂肪細(xì)胞 直徑為大約10到20微米，而完全成熟的脂肪細(xì)胞的大小為大約70 到120微米。按照本發(fā)明，優(yōu)選在分化的脂肪細(xì)胞達(dá)到細(xì)胞直徑為 20到40微米時(shí)收獲細(xì)胞。
按照本發(fā)明，分化的未成熟脂肪細(xì)胞和生物可降解支架在體外共 培養(yǎng)，脂肪細(xì)胞在生物可降解支架中的結(jié)合和成熟如下確定-
(1)收獲分化的未成熟脂肪細(xì)胞
在維持培養(yǎng)基中培養(yǎng)的脂肪細(xì)胞通過每隔2到3天更換一次新鮮
培養(yǎng)基在培養(yǎng)基維持。用胰蛋白酶/EDTA收獲培養(yǎng)6到9天的脂肪細(xì) 胞，測(cè)量細(xì)胞大小。特別地，如此收獲的細(xì)胞應(yīng)用在人體上時(shí)，優(yōu)選 在細(xì)胞收集前2到4天使用不含牛血清的培養(yǎng)基。
(2) 生物可降解支架
生物可降解支架的材料可以包括但不僅限于纖維蛋白、藻酸鹽、 PLGA (聚乳酸-乙醇酸共聚物)和PTFT(聚四氟乙烯)。生物可降解支架
的形式也包括通過注射的可注射形式和通過外科手術(shù)的可移植形式。
(3) 將分化的未成熟脂肪細(xì)胞移植到生物可降解支架中
細(xì)胞直徑在20到40微米的未成熟脂肪細(xì)胞被移植到生物可降解
支架中，并在培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
(4) 測(cè)定在生物可降解支架中脂肪細(xì)胞的結(jié)合和成熟 在生物可降解支架中脂肪細(xì)胞的移入和成熟由以下方法測(cè)定
① 是通過油紅O染色鑒定脂肪細(xì)胞以及測(cè)定其成熟度和大小的 方法；或
② 通過定量細(xì)胞培養(yǎng)上清中的瘦蛋白來證實(shí)脂肪細(xì)胞的功能。
當(dāng)上述獲得的未成熟脂肪細(xì)胞移植到生物可降解支架中時(shí)，己證
實(shí)移植的細(xì)胞很好地移入到靶位點(diǎn)并隨著脂滴大小增加以及隨后細(xì) 胞大小的增加而完全成熟。另外，瘦蛋白的分泌(其是脂肪細(xì)胞的特 征功能)也持續(xù)增加。
進(jìn)一步，本發(fā)明包括了將分化的未成熟脂肪細(xì)胞和生物可降解支 架共移植到體內(nèi)的步驟。即按照本發(fā)明的方法獲得的自體或同種異體 脂肪細(xì)胞可以連同生物可降解支架一起用于臨床應(yīng)用移植。
本發(fā)明模式
現(xiàn)在，參考以下實(shí)施例來更詳細(xì)的描述本發(fā)明。這些實(shí)施例只是 用來舉例說明本發(fā)明，并不能理解為限制本發(fā)明的范圍和精神。
實(shí)施例l:生產(chǎn)未成熟脂肪細(xì)胞
先，如下從通過吸脂術(shù)獲得的脂肪組織中分離前脂肪細(xì)胞為了去除血液，脂肪組織用相同體積的KRB溶液洗滌3到4次。隨后 加入和脂肪組織同體積的膠原酶溶液，然后所述物質(zhì)在37°C水浴中 反應(yīng)。所得反應(yīng)溶液轉(zhuǎn)移到離心管中，在1200rpm和20°C離心10分 鐘。去除掉作為上清的脂質(zhì)和脂肪層，小心地分離出下層，即膠原酶 溶液，不要引起震蕩。向其中加入基質(zhì)培養(yǎng)基，在1200rpm和20°C 離心5分鐘。此時(shí)，前脂肪細(xì)胞沉淀下來，去除上清。
將這樣得到的前脂肪細(xì)胞懸浮于基質(zhì)培養(yǎng)基中，接種到培養(yǎng)容器 里，在5。/。C02培養(yǎng)箱中37。C培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼，底部。本文 用到的基質(zhì)培養(yǎng)基為DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 Nutrient Broth)力卩10%胎牛血清。
然后，周期性地用擴(kuò)增培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)直到培 養(yǎng)容器的底部充滿單層細(xì)胞。擴(kuò)增培養(yǎng)基的成分是DMEM/F12， 10% FBS， 5ng/mlEGF， 0.25 ng/ml bFGF，和0.25 ng/ml TGF國(guó)bl 。
當(dāng)培養(yǎng)容器的底部充滿單層細(xì)胞時(shí)，用基質(zhì)培養(yǎng)基替換擴(kuò)增培養(yǎng)
基，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞3天。
然后，用分化培養(yǎng)基替換基質(zhì)培養(yǎng)基，培養(yǎng)細(xì)胞3天。分化培養(yǎng) 基的成分為DMEM/F12，3%FBS， 33pM生物素，17一泛酸酯，1 ^iM胰島素，1 nM地塞米松，250 nM異丁基甲基黃嘌呤(IBMX)和 100,噴哚美辛。
下一步，分化培養(yǎng)基替換為脂肪細(xì)胞培養(yǎng)基(維持培養(yǎng)基)，培 養(yǎng)細(xì)胞直到收集到的細(xì)胞隨著脂滴的生長(zhǎng)，直徑達(dá)到20到40微米。 脂肪細(xì)胞培養(yǎng)基的成分為DMEM/F12， 3%FBS, 33pM生物素，17一 泛酸酯，100 jiM胰島素和1 地塞米松。
實(shí)施例2:將未成熟脂肪細(xì)胞移入支架中并將其共培養(yǎng) (1)收獲分化的未成熟脂肪細(xì)胞
向含有在實(shí)施例1中生產(chǎn)的未成熟脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中加入t胰 蛋白酶/EDTA溶液。所得混合物在培養(yǎng)箱中反應(yīng)1到15分鐘，隨后 加入DMEM/F12，使胰蛋白酶/EDTA溶液失活。
收集以上溶液，在1200 rpm和20 °C離心5分鐘。去除上清，加 入運(yùn)送培養(yǎng)基(無酚紅DMEM)以懸浮細(xì)胞，混合物再按上述條件 離心一次。去除上清，加入適量的運(yùn)送培養(yǎng)基，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。計(jì)算 最終加入的運(yùn)送培養(yǎng)基的量，并再次離心。
圖l.為顯微圖(X 400)，顯示經(jīng)油紅O染色測(cè)定的分化的未成熟 脂肪細(xì)胞和成熟脂肪細(xì)胞的大小。圖1A顯示收集分化的未成熟脂肪 細(xì)胞后測(cè)量的細(xì)胞大小，其中細(xì)胞含有一些脂滴，細(xì)胞直徑在20到 40微米。圖1B為經(jīng)油紅O染色的成熟脂肪細(xì)胞的顯微圖片，在經(jīng)過 對(duì)收集的未成熟脂肪細(xì)胞體外三維培養(yǎng)后，其中一些脂滴融合成一個(gè) 大脂滴，細(xì)胞的細(xì)胞直徑達(dá)到60到100微米。
(2)將分化的未成熟脂肪細(xì)胞和纖維蛋白共培養(yǎng)
纖維蛋白原溶液和凝血酶溶液在使用前10分鐘如下準(zhǔn)備在裝 有凍干纖維蛋白原的小瓶中加入抑酶肽(aprotinin)溶液，放置1到 2分鐘，輕微的震蕩以完全溶解。在含有凝血酶的小瓶中加入氯化鈣 溶液并震蕩小瓶直到內(nèi)容物完全溶解來制備凝血酶溶液。
在步驟(1)中最后離心之后，將凝血酶溶液加入到通過去除上 清液獲得的未成熟脂肪細(xì)胞中，使得細(xì)胞懸浮的濃度為1到5 x 107 細(xì)胞/ml。將100微升的凝血酶-細(xì)胞懸液和IOO微升纖維蛋白原溶液 混合均勻。過1到2分鐘后形成纖維蛋白凝膠(其中導(dǎo)入了未成熟脂 肪細(xì)胞)時(shí)，加入脂肪細(xì)胞培養(yǎng)基并共培養(yǎng)，并每隔3天定期更換培 養(yǎng)基。
圖2.為將分化的未成熟脂肪細(xì)胞引入纖維蛋白中并將其共培養(yǎng)1 個(gè)月后，用油紅0染色的成熟脂肪細(xì)胞的顯微圖(A,C-F:X400)。圖 2A為收集的分化的未成熟脂肪細(xì)胞的顯微圖片，其中細(xì)胞含有一些 脂滴。圖2B為將收集的未成熟脂肪細(xì)胞引入纖維蛋白后共培養(yǎng)1個(gè) 月的纖維蛋白-細(xì)胞的顯微圖。圖2C和圖2D分別為纖維蛋白凝膠中 成熟的脂肪細(xì)胞和用油紅O染色的成熟脂肪細(xì)胞的顯微圖片，顯示 它們具有和用油紅O染色的人類脂肪組織(圖2E和圖2F)相似的大 小和形態(tài)。
圖3.為顯示將分化的未成熟脂肪細(xì)胞引入纖維蛋白中并將其共
培養(yǎng)后分泌到培養(yǎng)上清液中的瘦蛋白的量的變化圖。從中可見，纖維 蛋白-細(xì)胞的共培養(yǎng)使得瘦蛋白的分泌從共培養(yǎng)的第1天到第14天持 續(xù)增加，并在14天后維持一個(gè)穩(wěn)定水平。
從圖2和圖3中可見，分化的未成熟脂肪細(xì)胞通過在纖維蛋白凝 膠中三維培養(yǎng)后得到完全成熟，從而顯示出和機(jī)體中天然形成的脂肪 組織的細(xì)胞生物學(xué)相似性。纖維蛋白對(duì)未成熟脂肪細(xì)胞無毒性，并在 未成熟脂肪細(xì)胞成熟的過程中降解，因而為脂肪細(xì)胞大小的增加提供 空間。結(jié)果，可能最大化未成熟脂肪細(xì)胞的移植效果。
(3)將分化的未成熟脂肪細(xì)胞和藻酸鹽珠共培養(yǎng)
將藻酸鹽溶于PBS中制成2%溶液，除菌過濾后保存在室溫分別。 制備102mM氯化鈣和150mM氯化鈉溶液，除菌并保存在室溫。
向?qū)⒉襟E(l)最后離心后通過去除上清獲得的未成熟脂肪細(xì)胞中 加入藻酸鹽溶液，使得懸浮的細(xì)胞濃度為l到5xl(^細(xì)胞/ml。將藻 酸鹽-細(xì)胞懸浮液裝入注射器中，滴入氯化鈣溶液中，輕微振蕩，放 置IO分鐘。當(dāng)含有未成熟脂肪細(xì)胞的藻酸鹽珠(直徑大約lmm)形 成時(shí)，去除氯化鈣溶液，用氯化鈉溶液洗滌如此形成的珠4次。去除 掉氯化鈉溶液后，向珠中加入脂肪細(xì)胞培養(yǎng)基并共培養(yǎng)混合物，每3 天更換培養(yǎng)基。
圖4為將分化的未成熟脂肪細(xì)胞引入藻酸鹽珠中并將其共培養(yǎng) 后用油紅O染色的脂肪細(xì)胞的顯微圖(A: X 40和B-D: X 400)。 4A: 含有脂肪細(xì)胞的藻酸鹽珠的顯微圖；4B:放大400倍下的藻酸鹽珠 的顯微圖；4C:共培養(yǎng)2周后脂肪細(xì)胞的顯微圖；4D:共培養(yǎng)1個(gè) 月后用油紅O染色的成熟脂肪細(xì)胞的顯微圖。
實(shí)施例3:未成熟脂肪細(xì)胞和支架的共移植
纖維蛋白原溶液和凝血酶溶液在使用前10分鐘如下準(zhǔn)備在含
有凍干纖維蛋白原的小瓶中加入抑酶肽溶液，放置1到2分鐘，輕微
振蕩直到完全溶解，隨后裝入注射器中。在含有凝血酶的小瓶中加入氯化鈣溶液并振蕩小瓶直到內(nèi)容物完全溶解來制備凝血酶溶液。
向在實(shí)施例1步驟(l)最后離心后通過去除上清獲得的未成熟脂肪細(xì)胞中加入凝血酶溶液，使得懸浮細(xì)胞的濃度為1到5xl(^細(xì)胞/ml， 將所得懸液裝入另一個(gè)注射器中。將裝有纖維蛋白原溶液的注射器和 裝有凝血酶-細(xì)胞懸液的注射器分別連接到雙注射器套具(dual syringekit)的相應(yīng)部分，在注射器末端的噴頭裝上18-規(guī)格針頭。用 雙注射器套具將各100微升的纖維蛋白原溶液和凝血酶-細(xì)胞懸液被 混合移植入裸鼠(Crl:Nu/Nu-nuBR)的胸骨區(qū)域上方的真皮中。移植后， 將動(dòng)物飼養(yǎng)1天到12個(gè)月，移植位點(diǎn)的組織經(jīng)活組織切片分離。測(cè) 量移植物的分布位點(diǎn)、大小、移入率和存活率。另外，為了證實(shí)移植 物和宿主間的免疫排斥現(xiàn)象，進(jìn)行了免疫染色、生物化學(xué)檢查和分子 生物學(xué)檢查。用人類特異性抗體進(jìn)行的免疫染色反應(yīng)和用人類特異性 DNA標(biāo)記的AIu序列進(jìn)行的PCR技術(shù)都證實(shí)了檢測(cè)到分化的人類脂 肪細(xì)胞。
從移植位點(diǎn)的組織檢査結(jié)果證實(shí)了移植的未成熟脂肪細(xì)胞很好 地移入到小鼠的皮下組織中并在此成長(zhǎng)為成熟的脂肪細(xì)胞。
工業(yè)應(yīng)用性
如本文所示，當(dāng)從人類脂肪組織獲得的前脂肪細(xì)胞分化成的、細(xì) 胞直徑為20到40微米的未成熟脂肪細(xì)胞和支架聯(lián)合用于自體或同種 異體移植時(shí)，在靶移植位點(diǎn)隨著體積的逐漸增加，實(shí)現(xiàn)了脂肪細(xì)胞的 成熟。因此，本發(fā)明的脂肪細(xì)胞-生物可降解支架組合物可以用于有 效的機(jī)體體積替換及可治療多種由于軟組織缺陷或外觀審美缺陷引 起的病癥。
雖然為了說明目的，已經(jīng)揭示了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，本領(lǐng)域 技術(shù)人員將知道在不偏離如附隨的權(quán)利要求書中揭示的本發(fā)明的范 圍和精神的前提下，可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行多種修改、添加和替代。
權(quán)利要求
1.一種用于替換身體體積的可移植的脂肪細(xì)胞組合物，包含通過分化脂肪組織衍生的前脂肪細(xì)胞為脂肪細(xì)胞而獲得的、細(xì)胞直徑為20到40微米的未成熟脂肪細(xì)胞。
2. 權(quán)利要求1中的組合物，其用于哺乳動(dòng)物的自體或同種異體 移植。
3. 權(quán)利要求2中的組合物，其中哺乳動(dòng)物為人類。
4. 生產(chǎn)可移植的脂肪細(xì)胞組合物的方法，包括(a) 將未分化的從自體或同種異體脂肪組織中分離的前脂肪細(xì)胞 分化成脂肪細(xì)胞；(b) 收集細(xì)胞直徑為20到40微米的分化的未成熟脂肪細(xì)胞；及(c) 在體外培養(yǎng)收集的未成熟脂肪細(xì)胞和生物可降解支架。
5. 權(quán)利要求4中的方法，進(jìn)一步包括(d)測(cè)定生物可降解支架中 脂肪細(xì)胞的結(jié)合和成熟。
6. —種移植脂肪細(xì)胞的方法，包括(a) 將未分化的從自體或同種異體脂肪組織中分離的前脂肪細(xì)胞 分化成脂肪細(xì)胞；(b) 收集細(xì)胞直徑為20到40微米的分化的未成熟脂肪細(xì)胞；(c) 在體外培養(yǎng)收集的未成熟脂肪細(xì)胞和生物降解支架；及(d) 將未成熟的脂肪細(xì)胞同生物可降解支架移植進(jìn)入身體。
7. 權(quán)利要求6中的方法，其中脂肪細(xì)胞和生物可降解支架是通 過注射移植的。
8. 權(quán)利要求6中的方法，其中脂肪細(xì)胞和生物可降解支架是通 過外科手術(shù)移植的。
9. 權(quán)利要求6中的方法，其中移植脂肪細(xì)胞和生物可降解支架用于組織重建或美容整形手術(shù)。
全文摘要
本發(fā)明所提供了將從人類脂肪組織來源的前脂肪細(xì)胞分化成脂肪細(xì)胞并將這些分化的脂肪細(xì)胞聯(lián)同一種生物可降解支架一起移植進(jìn)入身體。根據(jù)本發(fā)明，當(dāng)將通過脂肪組織衍生的前脂肪細(xì)胞分化為脂肪組織而獲得的、細(xì)胞直徑在20到40微米的未成熟脂肪細(xì)胞與一種支架聯(lián)合用于自體或同種異體移植時(shí)，脂肪細(xì)胞在目標(biāo)移植位點(diǎn)的成熟使得脂肪細(xì)胞體積逐步增長(zhǎng)。因此，本發(fā)明中的這種脂肪細(xì)胞-支架組合物可以用作有效的身體體積替換，可以治療多種由于軟組織缺陷或外觀審美缺陷造成的疾病。
文檔編號(hào)C12N5/077GK101203601SQ200680022417
公開日2008年6月18日 申請(qǐng)日期2006年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月21日
發(fā)明者李圣求, 金仁玉, 金美亨 申請(qǐng)人:安特羅根有限公司