專利名稱：：來自巴勒斯坦側(cè)金盞花的酮類胡蘿卜素的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種新的改良植物巴勒斯坦側(cè)金盞花和及其植物種群的種植和特點，以及通過對植物種群進行改良，如增大花朵，以便達到增加花朵中的蝦青素，增加或降低花朵中的類胡蘿卜素的含量的目的。本發(fā)明進一步闡述了從巴勒斯坦側(cè)金盞花植物的花朵當中萃取蝦青素和其它類胡蘿卜素，同時在生成的萃取物中降低非胡蘿卜素酮和類胡蘿卜素的方法。
背景技術(shù)：
：類胡蘿卜素色素兩個二萜(C)"頭對頭"縮合而成番茄紅素(蕃茄之類胡蘿卜素)、含氧葉黃素。葉黃素是(3-胡蘿卜素的衍生物，一般在葉黃素分子中的一個或兩個(3-ionene環(huán)中含有羥基或酮基結(jié)構(gòu)群，因此可以組成結(jié)構(gòu)相似的幾種化合物。含有羥基的葉黃素往往呈現(xiàn)出黃色，而含一個或幾個酮基的葉黃素則往往呈現(xiàn)出紅色。蝦青素(3，3'-二羥基-4，4'-二酮基-P，P'-胡蘿卜素，結(jié)構(gòu)式請見下圖)是脂溶性類胡蘿卜素的一種，蝦青素易溶于氯仿、丙酮、苯Astaxanthin和二硫化碳等有機溶劑。蝦青素易于氧化，氧化后變?yōu)槲r紅素。蝦青素多分布于海洋動物里，如加吉魚、大馬哈魚等紅魚，蟹、龍蝦等甲殼類動物當中。因為海洋動物通常不能直接生成類胡蘿卜素，它們通過所吸收的微生物或植物獲得類胡蘿卜素。因此，在水產(chǎn)業(yè)中，為了提高產(chǎn)出的養(yǎng)殖魚和甲殼類動物(如加吉魚、大馬哈魚、蝦等等)的外形效果，讓養(yǎng)殖海鮮的外表看起來更加鮮、紅、嫩，從而廣泛的喂養(yǎng)蝦青素，這樣一來，奸青素廣泛用作詞料添加劑。蝦青素也能為家禽類的翅翼以及觀賞魚(如錦鯉)提供色素(雞肉皮層和蛋黃)。蝦青素也有許多生物功效。由于蝦青素不是維生素A原，所以以前認為它不具備生理活性。然而，然而近年的研究表明，蝦青素具有很強的抗氧化功能，能清除體內(nèi)由紫外線照射產(chǎn)生的自由基，其清道夫功能能夠有效的清除體內(nèi)垃圾，還有提高免疫力的功能。(請參考Misawaetal，J，Bacteriol，177,6575-6584(1995))，米沙瓦通過對蝦青素屬性的研究證明，蝦青素因在食品添加劑、水產(chǎn)養(yǎng)殖、化妝品、保健品和醫(yī)藥工業(yè)方面有廣闊的應(yīng)用前景。雖然蝦青素的全部生物醫(yī)學功效仍然需要做一步的研究，但蝦青素最早的效果顯示在癌癥和腫瘤的預防上，它對提升免疫力具有較為顯著的效果，同時它也能起至U抗月中消炎作用。(請參考Tanakaetal，Carcinogenesis19(3):269-280(1993))美國專利文獻(美國專利號6，433，025)里，該專利的發(fā)明人洛倫茲闡述了每天服用1100毫克的蝦青素可以有效控制或預防皮膚曬傷，而每天服用220毫克則是最佳選擇。服用蝦青素可以選則口服、外用或者注射的方式進行。含有蝦青素的動物不只限于蟹和蝦，還有多種甲殼類動物也用蝦青素裝扮自己。例如北極洋里的磷蝦，培植產(chǎn)品如紅發(fā)夫酵母，綠藻雨生紅球藻以及一些通過有機合成而得的產(chǎn)品。當利用這些甲殼類動物或磷蝦獲取蝦青素時，需要花很多成本和工作，在捕捉和萃取過程中，需要把蝦青素與有毒物質(zhì)(如脂質(zhì)等)分離出來。此外，如果從一些孢子類生物，如法夫孢當中提取蝦青素時，收集和提取蝦青素的成本很高，因為這類孢的細胞壁很厚，不易萃取，而且蝦青素產(chǎn)量也低。蟲下青素的結(jié)構(gòu)式5在有機體中，雨生紅球藻是蝦青素含量較高的生物之一(細胞干重的0.5~2%)。這種蝦青素主要分布在雨生紅球藻的雙長鏈酯中(70%的小部分類胡蘿卜素)，以及少量單長鏈酯(10%的小部分類胡蘿卜素)當中。游離的蝦青素(5。/。的小部分類胡蘿卜素)則以P胡蘿卜素、角黃素和黃體素的形式存在。(請參考Cyanotech微藻公司的BioAstin⑧(產(chǎn)品名)產(chǎn)品/北約玫瑰(產(chǎn)品名)產(chǎn)品，技術(shù)簡訊#15)。由于雨生紅球藻細胞的特性，從雨生紅球藻萃取蟲下青素非常困難。此外，雨生紅球藻蝦青素的形成需要高強光照，必須在特殊條件下才能完成，也就是說從雨生紅球藻當中萃取蝦青素的成本較高。因為這些原因，從成本分析來看，從生物資源得到的蝦青素不如用有機方法合成蝦青素的性價比高。但是，由于在合成過程中需要把蝦青素喂養(yǎng)給魚類或貝類海鮮食用，或者作為食物添加劑使用，因此，用有機合成方法合成蝦青素會產(chǎn)生副產(chǎn)品，此外，由于一些消費者傾向于自然產(chǎn)品，有機合成方法生產(chǎn)的產(chǎn)品就不能滿足他們的需求。因此，市場迫切需求一種價格低廉，無污染，而且是取材于自然的蝦青素。這里需要說明的是，除了動物之外，某些植物中也含有蝦青素和胡蘿卜素酮，特別是在毛茛科植物屬系，比如側(cè)金盞花、春側(cè)金盞花、夏側(cè)金盞花、巴勒斯坦側(cè)金盞花等毛茛科植物屬系家族中的花瓣當中也含有蝦青素。雖然側(cè)金盞花屬植物種類的花朵中含有蝦青素，是良好的著色劑，但同時也含有毒性物質(zhì)強心甾。由于強心甾分布在植物的花瓣中，因此花朵不能不經(jīng)過處理直接用于喂養(yǎng)魚類或其它動物，因為高濃度的強心甾對動物有毒性。因此，從側(cè)金盞花中萃取蝦青素之前，首先就要降低或除去毒性物質(zhì)強心甾。春側(cè)金盞花是擁有黃色花朵的側(cè)金盞花物屬系的一種，從側(cè)金盞花干花顆粒當中可以萃取出蝦青素及強心甾。強心甾雖然有毒性，卻也可以用于醫(yī)學治療。在藥草醫(yī)療中，法國和德國是側(cè)金盞花的主要消費國，而保加利亞、匈牙利、俄羅斯、羅馬尼亞和烏克蘭是側(cè)金盞花主要的供應(yīng)國。目前，大量的春金盞花是從野外采集，而非人工培植，在羅馬尼亞、俄羅斯和烏克蘭尤其如此。1998年以前，由于俄羅斯對春側(cè)金盞花的無節(jié)制開采導致春金盞花數(shù)量大量減少，危?？舍?。很多國家已經(jīng)把春金盞花列入"紅皮書"當中(瀕危物種)，"紅皮書"詳細講述了禁止開采的側(cè)金盞花的范圍，一些國家甚至制定法律明文規(guī)定禁止在野外開采春側(cè)金盞花。人工栽培或者大規(guī)模養(yǎng)栽培側(cè)金盞花屬物種非常困難，這是由于側(cè)金盞花的種子成熟后很容易脫落，導致獲取種子困難，再加上種子萌發(fā)困難(包括種子儲存12個月后完全失去生命力)，收獲期長(播種后過4年左右才能開花)，以及產(chǎn)量低等種種原因造成的。從側(cè)金盞花屬的花瓣當中萃取蝦青素的的另一個問題是花朵收集必須人工進行，以防止收獲的不是花朵，而是其它組織。簡而言之，當前，這種植物不能大規(guī)模生長，也不能進行機械收割。美國專利文獻(美國專利號5，452，565)當中，該專利的發(fā)明人莫森提到一種新改良的夏側(cè)金盞花，這種夏側(cè)金盞花據(jù)說每朵花有1822個花瓣，且每朵花當中平均可萃取出200350UG的蝦青素。該專利也闡述了萃取蝦青素的方法。這些資料已經(jīng)于1990年7月18日記錄在在阿伯丁的英國食品工業(yè)與海洋細菌菌種保藏中心的資料當中，按照"布達佩斯條約"其獲取號為NC頂B40309。他將能夠萃取出蟲下青素的所有側(cè)金盞花統(tǒng)統(tǒng)稱為"洛德斯紅(Lodersred)".1998年8月28日，文件號為19981166的文件當中提到，這些植物也遵從植物育種者權(quán)利法的規(guī)定。2000年6月5日其獲得授予號6243。該授予號將于2025年12月31日到期。巴勒斯坦側(cè)金盞花植物鮮紅的花瓣當?shù)幕ǘ淠茌腿〉疆a(chǎn)生蝦青素之外，以及其它鮮紅花瓣中的羥基類胡蘿卜素和羥基胡蘿卜素酮，在鮮艷的花朵當中以長鏈不飽和脂肪酸酯的形態(tài)出現(xiàn)。迄今為止，人們還沒嚴格研究過這種側(cè)金盞花植物屬系的植物是否可以作為大量的商業(yè)生產(chǎn)蝦青素的來源。本發(fā)明的發(fā)明者現(xiàn)在己經(jīng)在研究這種植株，并發(fā)現(xiàn)這種植株可以通過改良，改良之后其蝦青素的含量大大增加，且毒性物質(zhì)的含量則大量減少。我們將在以后詳細對這些改良后的植物進行描述。本發(fā)明的簡要概述本發(fā)明涉及一種花朵中含有更多蝦青素的植物巴勒斯坦側(cè)金盞花，以及從這些巴勒斯坦側(cè)金盞花植物中提取奸青素和胡蘿卜素酮的方法。一般的巴勒斯坦側(cè)金盞花花朵直徑大約有1.9cm，花瓣中環(huán)繞著雄蕊和雌蕊，且有含有芍藥花青素的"花眼"，每朵花有812個花瓣。這些花朵每克花含有約0.21毫克的蝦青素，每千克干花含有7.9克的蝦青素，干花瓣含有約1015%水分。而本發(fā)明當中的巴勒斯坦側(cè)金盞花的花朵直徑從8cm12cm不等，花眼直徑平均為1.4cm，花瓣數(shù)約為8瓣，蝦青素含量至少0.4mg/花(干花)，或每千克干花瓣含有17.6g蝦青素。從一朵花朵當中提取的類胡蘿卜素當中，7590%為單酯、雙酯或游離的蝦青素，510%的黃體素、2.55%千重的蝦青素、少于1%的金盞花紅素、3-羥基海膽酮和4-羥基海膽酮、e-類胡蘿卜素。根據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，這種花的花朵中的蝦青素濃度(g/千克植物細胞干重)較高，蝦青素產(chǎn)量也較大(g/ha)，而萃取成本較低，反之能夠降低油性樹脂里的胡蘿卜素酮和強心甾。萃取工藝和加工提高后也有助于降低萃取成本，以及降低強心甾含量。本發(fā)明涉及一種花朵中含有更多蝦青素的植物，即巴勒斯坦側(cè)金盞花。本發(fā)明也提供了選擇和進一歩改良巴勒斯坦側(cè)金盞花的基因構(gòu)成、變體和花朵數(shù)量的方法。在另一個實驗當中，使用一個花瓣進行實驗，對萃取出的油性樹脂類胡蘿卜素這種油性樹脂含有95%以上的蝦青素和胡蘿卜素酮。在本發(fā)明的另一個重大發(fā)現(xiàn)是干花里所含的蝦青素含量是35克/千克干花重，這代表了類胡蘿卜素當中，蝦青素含量的比重大大增強了，而強心甾的含量則降低了。色素含量主要取決于干花或葉子萃取物的含量，可用高效液相色譜法(HPLC)奸青素及其相關(guān)化合物的分離和檢測，主要包括:蝦青素與其雙酯的分離、蝦青素幾何異構(gòu)體以及降解產(chǎn)物的分離，先將干花溶于467nm的丙酮-正己烷溶液當中，萃取蝦青素，再將萃取出來的蝦青素提取液上柱，再正己垸-丙酮淋洗，收集洗脫液。然后再用根據(jù)其高效液相色譜(HPLC)中保留時間和紫外可見吸收光譜的特征峰與標準品對照進行鑒定。下面進行具體的解釋。從花朵中萃取出來的油性樹脂當中的蝦青素到底含C8-C20脂肪酸單酯還是雙酯或者它們的混合物，這在目前還是一個有爭議的問題，換言之，脂肪酸鏈有不同鏈長或不同飽和程度的烯鍵。這里所說的油性樹脂包含濃度很高的游離葉黃素和葉黃素酯，并且99%(99.9%為佳)不含萃取有機溶劑，也就是說有機溶劑只占不到1%(最好是少于1%)。剩下的不含有機溶劑的濃縮液被稱為側(cè)金盞花油性樹脂，或更傾向于被稱為含有蝦青素的側(cè)金盞花油性樹脂。本發(fā)明出來的蝦青素適用于作為食物添加劑、化妝品及醫(yī)療方面的用途。這種成份是將側(cè)金盞花溶于有機溶劑之后進行稀釋，然后除去有機溶劑，萃取出盡可能純凈的含有蝦青素的油性樹脂。所用的稀釋有機溶劑可以是固體，如蠟、碳氫化合物(40C時為固態(tài)，也可以是熾熱溫度下的液體或膠狀物)。濃縮物質(zhì)處于固態(tài)或半固態(tài)，包含占側(cè)金盞花油性樹脂干重210%的蝦青素混合酯(5%為最佳比例)。也就一些人認為，這些濃縮物當中還含有至少一種游離或者酯化形態(tài)存在的類胡蘿卜素，濃度與側(cè)金盞花油性樹脂不一樣。本發(fā)明的類胡蘿卜素的成分在油性樹脂當中的比例增加了近10%，最佳比例是占油性樹脂20%。屬于成倍增長。這里也考慮到了將蝦青素作為人類或動物食物添加劑或著色劑，如雞，土雞等家禽、虹鱒、加吉魚、大馬哈魚等魚類，以及蟲下，龍蟲下，蟹等甲殼類動物。蝦青素這一食物添加劑可以讓動物皮層和肉添上新鮮的顏色，或者給這些動物的蛋類添色，特別是雞蛋。食物添加劑含有如上所述的用有機溶劑稀釋萃取而出的含有蝦青素含量較高，相反強心甾含量較低的側(cè)金盞花油性樹脂。這種食物添加劑可以通過對上述說明的高效液相色譜法(HPLC)方法進行萃取，分解，過濾和除去強心甾，隨后在可食用溶劑(如可食用的植物油)對凈化后的類胡蘿卜素進行分解或散開制作而成。在本發(fā)明中，將蝦青素濃縮液稀釋凈化后的用途之一是將蟲下青素包裝成藥片或膠囊，瓶裝或按瓶裝方式進行口服，它們含有極高的營養(yǎng)價值。本發(fā)明的另一用途可以把這些蝦青素添加到食物當中或者是酒類當中作為食物添加劑，制成可供人類或?qū)櫸锸秤玫募庸ぎa(chǎn)品，會具有很高的營養(yǎng)價值，足以增強體能，讓生理機能更活躍。本發(fā)明的又一方面:稀釋凈化后的巴勒斯坦側(cè)金盞花類胡蘿卜素成分含有可以溶解/散開在稀釋溶劑(可食用的合適溶劑)里面的蝦青素雙酯。這種成分可以從前面說明的濃縮物中精制而成。在某些情況下，這種成分至少含有一種額外的類胡蘿卜素，以游離或酯化形式存在。其中一部分包括存在于面霜、洗面奶或藥膏中的輕微保護性的蝦青素，這種面霜、洗面奶或藥膏適用于熱帶人口皮膚使用，這類成分中的蝦青素數(shù)量一般大約1100mg。本發(fā)明有一些優(yōu)勢和劣勢。本發(fā)明的其中一個好處在于可以大量的生產(chǎn)廉價，高營養(yǎng)的蝦青素濃縮產(chǎn)品，將其廣泛地運用于食品添加，醫(yī)學或者當成是動物的著色劑。使用這種本文所述的改良后的巴勒斯坦側(cè)金盞花植物，能長出蝦青素含量豐富的花瓣。這些花瓣可以作為商業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)蝦青素的來源，使這種商業(yè)生產(chǎn)大有作為之地和高效率。除了上面所說明的突出優(yōu)勢，讀者可以通過下面的說明了解更多方面和特征。定義下文出現(xiàn)一系列的專業(yè)術(shù)語。為了幫助讀者更好的理解本發(fā)明，下面對這些專業(yè)術(shù)語進行一一的解釋。蝦青素"蝦青素"是一種紅色色素，具體成分為3，3'-二羥基-4，4'-二酮基-p，(3'-胡蘿卜素，蝦青素可以與其它胡蘿卜素酮一起分布在側(cè)金盞花油性樹脂中，包含(但不限于)海膽酮，3-羥基海膽酮，側(cè)金盞花紅素，3'-羥基海膽酮和福壽草黃素。一般情況下，蝦青素以單di-c8-c20脂肪酸酯連同少量的游離蝦青素混合物存在。例如，重量占約1~10%的游離和酯化類胡蘿卜素。例子中的植物脂肪酸直鏈中含有8~20%的碳原子，每個分子有03個乙烯不飽和指數(shù)。蝦青素中的脂肪酸是每個鏈條中含有0~3個乙烯不飽和指數(shù)的di-c8-c20脂肪酸。更通常的是，分布在蝦青素中的脂肪酸是一種C12-c18的脂肪酸，這種脂肪酸的每個鏈中含有0-3乙烯不飽和指數(shù)。例子中的這種脂肪酸包括月桂酸，肉豆蔻，棕櫚、棕櫚油酸、硬脂酸、油酸，亞油酸、亞麻酸、與酸含量。蝦青素含量"蝦青素含量"消光系數(shù)為2100時，將含有蝦青素的物質(zhì)溶解于467nm和的己烷當中，并用高效液相色譜法(HPLC)進行測量每千克植物組織干重的克數(shù)。蝦青素含量包括游離蝦青素和各種不同的已經(jīng)酯化的，被稱為酯化蝦青素的成分。類胡蘿卜素"類胡蘿卜素"是一種紅到黃色的能溶解在脂肪里面的色素。強心甾"強心甾"指的是有毒的糖基化類固醇。去葡萄糖桂竹香毒甙"去葡萄糖桂竹香毒甙"是強心甾的一種。萃取"萃取"是指從植物組織從提取一種或多種化學物質(zhì)。有效光照含量"有效光照含量"指的是當跟另外的感光性的成分混合時，能防止紫外線光的光照強度。油性樹脂"油性樹脂"指的是從巴勒斯坦側(cè)金盞花植物從萃取的強心甾和其它成分。芍藥花青素"芍藥花青素"指的是淺藍紅色的，能溶解在水中的花色素，通常分布在每朵側(cè)金盞花花瓣基部的紅斑點里(花朵基部的"花眼")，并通常用于食品工業(yè)中給酸性食品著色?；ò?花瓣"指的是花朵的花冠獨立的組成或部分，通常是彩色或白色的。本發(fā)明的詳細說明以下提供的例子說明僅作為舉例闡述，并非用于限制本發(fā)明保護范圍。本發(fā)明涉及一種新的經(jīng)過改良的巴勒斯坦側(cè)金盞花植物，以及其再生部分。這些植物的花朵花瓣和花頭含有能萃取出蝦青素的成分。相對于一般的(野生)巴勒斯坦側(cè)金盞花植物而言，這些花朵花瓣和花頭當中蝦青素的含量相對較高，相反，毒性物質(zhì)強心甾的含量則較低。花瓣含有的蝦青素異構(gòu)體成分與雨生紅球藻的類似。農(nóng)場養(yǎng)殖的大馬哈魚用側(cè)金盞花蝦青素作為色素上色，其效果跟野生大馬哈魚的相似。優(yōu)化后的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟學和常規(guī)的養(yǎng)殖工作聯(lián)合起來，這樣就開發(fā)出了一種全新的每單元干花可含有3.8%的蝦青素的新興植物。從側(cè)金盞花中提取出來的蝦青素盡管顯示比合成的蝦青素含有較低的生物利用度(比之前低了16-21%)，但它更容易被消費者所接受。從側(cè)金盞花產(chǎn)出的成分經(jīng)過加工，也具有同樣的穩(wěn)定性；而且在冷凍的情況下，比合成的蝦青素得到的色素上色效果更加穩(wěn)定?？傊裕梦r青素作為飼料時，在飼養(yǎng)和后期加工試驗中，這種材料性能更好。由于側(cè)金盞花產(chǎn)品更高的穩(wěn)定性及功能的優(yōu)良性，與合成的蝦青素相比，較低的生物利用度(與合成形式的游離蝦清素相比，這與其脂化形式有關(guān))的不足可以抵消(例如，在小球狀體生產(chǎn)過程中)。舉個例子。經(jīng)過改良后的巴勒斯坦側(cè)金盞花植物能產(chǎn)出更多的花朵，且單個花朵比野生的巴勒斯坦側(cè)金盞花植物花朵大(直徑超過1.5cm)，以下舉出三類產(chǎn)品作為例子解釋。所舉例子的PF31類產(chǎn)品的平均直徑大約是5cm，花眼直徑大于為2cm，PF52類產(chǎn)品的平均直徑大約是5cm，花眼直徑大于為1.5cm，PF52類產(chǎn)品的平均直徑大約是5cm，有直立徑。它們的平均花直徑約4厘米約8厘米，每朵花大約8-12個花瓣，平均蝦青素的濃度約為0.4至0.6mg/朵，首選花朵直徑約5-8厘米，通常約為5-6cm，花眼約為1.4cm，稍大一些的約為1.5厘米。當前發(fā)明的干花至少每朵含0.4mg蝦青素，下面將進一步進行探討，其一般都含有0.4mg0.8mg蝦青素，跟前面提到的專利為巴勒斯坦夏側(cè)金盞花"洛德斯紅"含有約0.15m^0.9mg相比較時，其蝦青素的含量遠遠大于后者。每朵花蝦青素的理想含量是0.5mg到0.8mg，最佳是0.6mg0.8mg。本發(fā)明每千克干花的蝦青素濃度大約是14g到20g，而洛德斯紅約是6~9g/kg。通達2002-2005年夏天對在愛爾蘭的觀察顯示，這種花花期比洛德斯紅早，因此收獲季節(jié)也相應(yīng)早些。從干花中萃取的類胡蘿卜素成分當中，70~90%為單酯或雙酯蝦青素和游離蝦青素，葉黃素的含量約為5~10%，金盞花黃質(zhì)約含2.5~5%，其他金盞花紅素、b類胡蘿卜素、3-羥基海膽酮和4-羥基海膽酮則不到總含量的1°/。。更普通的含量是約8085%重的蝦青素雙酯，約57%的游離蝦青素和葉黃素，約2.5-5%的金盞花黃質(zhì)，每朵少于1X重的金盞花紅素，b類胡蘿卜素，3-羥基海膽酮和4-羥基海膽酮。由于這種C巴勒斯坦側(cè)金盞花花瓣不含有角黃素(e-胡蘿卜素-4，戊二酮)，因此從花瓣中萃取的精華也不含角黃素。同樣的道理，由于紅發(fā)夫酵母和雨生紅球藻存包含角黃素，這些有機體中萃取的成分也含有角黃素。本發(fā)明的目的是通過種植上述植物，以便從植物萃取更高濃度的蝦蝦青素。從以色列戈蘭高地地區(qū)獲得巴勒斯坦側(cè)金盞花菌株種子已經(jīng)存放在英國蘇格蘭阿伯丁，馬察爾德萊爾街23號的NC頂B。那些種子于2005年5月25日收悉，并按照布達佩斯條約其專利目的于2005年8月31日被接受。按照37CRF1.14和35USC122的規(guī)定，申請?zhí)峤唤o專利商標委員會授權(quán)人時，在等候期間人們有權(quán)得到這些存放種子。當此申請被許可后，公眾關(guān)于這些的獲得權(quán)的所有限制都將被撤銷。因此，本發(fā)明的巴勒斯坦側(cè)金盞花植物可以使用這些存放應(yīng)變的種子。本發(fā)明也考慮到了植物的花粉和胚珠以及可再生部分，可再生部分且包含胚芽、分裂組織、花粉、葉、花粉囊、根、根尖，花或由此而來的原物或愈合組織中遴選細胞。本文中的細胞再生的方法己經(jīng)廣為人知，雙子葉植物，如金盞花，特別適合這種再生方法。本發(fā)明中的植物，是將存放上述地點的植株植物種子精心培育出植物，一般花朵大小直徑可達到57cm，每朵花有812片花瓣，每枝花蕊蝦青素平均濃度達0.4mg0.8mg，還含有可用95%的乙醇(約1015%的水分)可萃取出來的強心甾0.193%，而理想的強心甾占有量是只占花朵花瓣的1%或更少量。按照干花重量，標準的巴勒斯坦側(cè)金盞花一般含有0.36%的強心甾，利用95%甲醇可以進行萃取，生成類似于磁麻苷的物質(zhì)。如要提到巴勒斯坦側(cè)金盞花的有益成分，需將萃取出的油性樹脂內(nèi)含有的游離酸脂或油離蝦青素酸脂也考慮在內(nèi)。正如行業(yè)內(nèi)人士所知，油性樹脂是從植物組織中萃取的固態(tài)物質(zhì)，含有以游離態(tài)或酯化形式存在的植物色素，如蝦青素，有時也會帶有少量的其它植物產(chǎn)品和色素，如葉黃素、游離葉黃素和其它類胡蘿卜色素，以及少量的萃取溶液，如己垸和丙酮。下面我們講解一下如何從巴勒斯坦側(cè)金盞花當中萃取油性樹脂。天然蝦青素和其它游離或脂化的葉黃素、類胡蘿卜素都是利用有機溶液燒到熔點，在約110度的環(huán)境下，從干化的巴勒斯坦側(cè)金盞花中萃取，有機溶液含有己烷和丙酮。最好的萃取溶液沒有水融性，比如碳氫己烷，2，3-以及2，4二甲基1-戊烷，2-和3—甲基賴氨酸、正庚烷、環(huán)己烷，1-，2-和3—己烷，l一，2—和3—庚烯等等就是較好的萃取溶液。使用CO萃取溶液有助于把萃取的強心甾數(shù)量降至最低。萃取過程嚴格按照利用有機溶劑從植物中萃取物質(zhì)的規(guī)定。除此之外，也可以利用氣態(tài)的萃取溶劑在氣體包圍的環(huán)境中進行萃取。美國專利文獻第5，512，285號當中講述了這種萃取方法，內(nèi)容提到，將液體形態(tài)的四氟甲垸1，1，1，2—四氟乙烷(熔點-26)用做萃取溶劑。超臨界的二氧化碳是人所周知的萃取溶劑，我們在以后的內(nèi)容當中會做進一步的解釋。把萃取溶劑清洗掉后，剩下的萃取物包含高濃度的蝦青素以及游離葉黃素和葉黃素酯，最好的狀態(tài)是99%不含有機溶劑，即有機溶劑(按重量)比重少于1%是較佳的。人們把所剩下的不含有機溶劑的萃取物稱為"側(cè)金盞花油性樹脂"，嚴格而言，人們更傾向于稱之為"含蝦青素的側(cè)金盞花油性樹脂"。從這種花朵的花瓣當中萃取的油性樹脂的類胡蘿卜素含量與上述提到的比例相當。若這種含蝦青素的側(cè)金盞花油性樹脂里分布的類胡蘿卜素含量比花瓣中的類胡蘿卜素含量稍微少些，這意味著類胡蘿卜素比重比油性樹脂的重量少1%。將類胡蘿卜素成分(不含角黃素溶解或分散在稀釋液中)，這種類胡蘿卜素成分里含凈化后的蝦青素，也即是"含蝦青素的側(cè)金盞花油性樹脂"。稀釋劑可以是固體，如蠟，或40攝氏度左右的固態(tài)碳氫化合物，也可以是液態(tài)或膠狀物。例子中所用的液體膠狀物里面含有化妝品生產(chǎn)過程中經(jīng)常用到的物質(zhì)，例如固態(tài)或半固態(tài)凈化后的萃取物質(zhì)、比重約合為210%的側(cè)金盞花油性樹脂蝦青素混合物，其較適宜的比重是5%。在一些試驗中，萃取物里含有至少一種類胡蘿卜素濃縮液，這種濃縮液跟側(cè)金盞花油性樹脂不一樣，是以游離或酯化形態(tài)存在的。因此在某些具體實施方案中使用了一些不是分布在油性樹脂里的類胡蘿卜素，但在后者中類胡蘿卜素數(shù)量含量比油性樹脂里里的類胡蘿卜素含量高出至少10%，若高出20%是比較合適的。所增加的類胡蘿卜素甚至可以是幾倍于油性樹脂里類胡蘿卜素含量。食品添補劑也含少量的類胡蘿卜素，以及含蝦青素的側(cè)金盞花油性樹脂，后者是溶解或分散在可食用稀釋溶劑中。這類食品添補劑制作過程如下首先進行恰當?shù)膬艋?，正前面所述，?jīng)分解、過濾，除去強心甾等步驟，得到油性樹脂，然后把類胡蘿卜素溶解在合適的可食用稀釋溶劑(如植物油)，分解凈化后的類胡蘿卜素。食品添補劑由含蝦青素的側(cè)金盞花油性樹脂精制而成，包含較低的類胡蘿卜素成分，即類胡蘿卜素比重少于1%。14如上所述，含蝦青素的側(cè)金盞花油性樹脂類溶解或分散在可食用溶劑中，分布其中的胡蘿卜素成分營養(yǎng)性價比很高，其含量用單位劑量計算，為了方便口服將其包裝成藥片、膠囊及瓶裝。所謂營養(yǎng)性價比高是指這種物質(zhì)能夠增加身體機能，一般含量是4~500mg。另一方面，稀釋、凈化后的巴勒斯坦側(cè)金盞花類胡蘿卜素成分(這里也包括溶解或散開在溶解劑中的"含蝦青素的側(cè)金盞花油性樹脂")，如可食用的合適溶解劑。這類成分可以使用上述萃取劑制作而成。在一些具體實施方案中，其成分包含至少一份以游離或脂化形式存在的類胡蘿卜素。其中一部成分應(yīng)用在化妝品生產(chǎn)過程中，許多的面霜、洗面奶或藥膏中含有輕微保護性的蝦青素，這適用于熱帶地區(qū)的消費者的皮膚使用。每天服用約1100毫克的蝦青素(每天最佳服用量是210毫克)，這對皮膚有良好的保護功效。在一些具體實施方案中，可食用稀釋溶劑也可以采用可食用的甘油三酸脂油。食物添加劑混合物中含有化學成分為4一KER0-B-I0NENE環(huán)的類胡蘿卜素(例如游離蝦青素，或蝦青素酯，或兩者兼有)，其比重約0.2-40%，2-20%是比較適宜的比例。比較常用的可食用油有蠟大戟油、椰子油、鱈魚肝油、棉花籽油、鯡魚油、橄欖油、棕櫚油、玉米油、豆油、花生油、罌粟子、紅花和向日葵油。在這里，含有高濃度的不飽和脂肪酸效果尤佳，例如，使用含碘值達100-150的油。一般而言，這種混合物都是使用高修剪混合儀器的方法進行制作。如美國專利文獻(美國專利號5，382，714)所示，一些混合溶解劑和添加劑，如乙醇和A-生育酚也可以以分布在于溶劑中的形態(tài)存在。"球狀彈型"也能夠提供這種含蝦青素成分，我們也把這種球狀質(zhì)稱為"微粒粉劑"。"微粒粉劑"中蝦青素比重為0.520%(當比例是1~4%時候較佳)，其中包括游離蝦青素及酯化蝦青素，以及一種或多種類似于側(cè)金盞花油性樹脂里的類胡蘿卜素。正如美國專利文獻(專利號5，270，063)所示，按照所需要的劑量，人們可以混合使用這些微粒粉劑，將它混合到食品中，如即食麥片，或?qū)⑺旌系诫u或其它動物的飼料中。因為美國專利專利文獻(專利號5，849，345，和5，695，794，及5，605，699和5，043，170號已經(jīng)批準這種"微粒粉劑"或其它塊狀的類似成分為飼料添加劑。據(jù)美國專利文獻(專利號4，670，247)資料記載，典型的"微粒粉劑"沒有水溶性，它是通過交叉聯(lián)接的膠質(zhì)，或藻朊酸鹽(如藻朊酸鹽鈉)把含蝦青素的成分制作成膠囊的形狀，從而形成這種不溶于水的"微粒粉劑"。根據(jù)此專利，通過形成一種含有類胡蘿卜素，水，膠質(zhì)和糖的乳狀液，把這種乳狀液進一步制作成沒有水溶性，并含有所需類胡蘿卜素的"微粒粉劑"。此乳狀液轉(zhuǎn)化為從大量淀粉中收集的小滴，收集這些小滴時，小滴中的小分子在微粒子狀永久形成前保持彼此分離。研究人員把含有蝦青素的顆粒從多余的淀粉收集粉粒中分離出來，并將之置于90180攝氏度的溫度下進行加熱處理。加熱處理中，糖里含有的羰基l和明膠分子中游離的酸性氨基發(fā)生化學反應(yīng)，這樣微粒粉劑體的基質(zhì)明膠就不再溶于水。這種方法得到的"微粒粉劑"沒有水溶性，并顯示出更高的抗飼料小子彈壓力的穩(wěn)定性。這個交叉鏈接的過程合理利用了制作微粒粉劑體時所用的成份材料，而不再需要添加交叉鏈接溶劑，或者添加劑。美國專利文獻(專利號5，695，794)提到采用另外一種"微粒粉劑"作為本專利的動物詞料添加劑。因此，直徑約3055微米的"微粒粉劑體"是這樣制作而成將一定量的熾熱蝦青素溶液噴灑在氫化植物油上，如氫化棉花籽油、麥子油、紅花油、豆油等等，這些油也可以含有甘油一/二酯、如從氫化豆類中提煉出來的甘油一/二酯，棉花籽甘油一/二酯，以及檸檬酸和2,6-雙-過氧化叔1-4-甲基苯酚(BHT)，如抗氧化劑。人們也常用其它抗氧化劑，如乙氧喹，維他命E等。在約160F(約70攝氏度)的溫度下，把熾熱混合物灑在噴灑冷卻器的氣旋中，位于哥倫比亞的Niro公司有生產(chǎn)這種冷卻器，在冷卻過程珠江形成固體的在"微粒粉劑"。冷卻后的微粒粉劑體上覆蓋一層防垢介質(zhì)，如熏硅、磷酸鈣、淀粉或纖維素，這些常見的物質(zhì)構(gòu)成"微粒粉劑"的一部分，它們都適合添加到飼料里作為添加劑。每克典型的"微粒粉劑"每克含有10100毫克的蝦青素，1050mg/g則為最佳。將添加了含蝦青素的類胡蘿卜素用作動物詞料，這也是比較常見的做法。上述提到的美國專利文獻(專利號5，849，345號，5，695，794號，5，605，699號以及5，043，170號)列舉了一些對家禽特別有益的飼料。另外美國專利文獻(美國專利號5，935，624號和2，918，370號)對家禽飼料構(gòu)成作了進一步闡述。美國專利文獻(專利號5，258，189號)是關(guān)于在人類即食麥片當中添加胡蘿卜素，把類胡蘿卜素與溶解在植物油的煮熟麥片混合，或直接添加到干麥片中。在同類食物產(chǎn)品中，此專利提到可以按照所需分量用蝦青素類胡蘿卜素成分取代胡蘿卜素。另一種適合作為食物添加劑使用的物質(zhì)是蝦青素成分，這種蝦青素是溶解或分散在可食用溶液中形式存在。這種成分含有一種內(nèi)含蝦青素的葉黃素，與側(cè)金盞花油性樹脂里的酯相比，這是游離的酒精化合物。利用皂化方法，從油性樹脂中萃取游離葉黃素，這種方法已經(jīng)被許多科學家所重視。例如，Tcyczkowskietal在1991年的《家禽科學》70(3):651—654以及美國專利文獻(專利號5，382，714)都提到，通過加入有機溶液，從皂化反應(yīng)后的金盞花油性樹脂中提煉結(jié)晶體黃體素。此外，Ausichetal在美國專利文獻(專利號5，648，564)中發(fā)明了以下方法把含有丙二醇和堿水溶液(氫氧化鉀為佳)與結(jié)晶體形態(tài)存在的黃體素混合，它們兩者發(fā)生反應(yīng)形成了反應(yīng)化合物。該反應(yīng)化合物里面含有至少占75%比重的丙二醇和油性樹脂。通過上述步驟人們可以制作出就是晶體黃體素。以這種方法形成的反應(yīng)化合物必須在6580攝氏度的溫度下保持一段時間(一般至少3小時)，這樣才能讓酯的皂化反應(yīng)充分，形成一種皂化反應(yīng)化合物，此化合物里含有以結(jié)晶體形態(tài)存在的游離葉黃素。把這種皂化萃取物用水進行稀釋，于是具有水溶性的雜質(zhì)溶解在水中，稀釋的同時反應(yīng)混合物黏度也降低了。輕輕地把稀釋后的混合物攪拌混合，直到用過慮的方法分離出葉黃素晶體前。把分離出來的葉黃素晶體用溫水清洗，然后干燥。在把葉黃素從含有葉黃素酯的油性樹脂分離和凈化的過程中，只適宜使用丙二醇(其它有機溶劑除外)。干燥后的葉黃素晶體通常與可食用溶液混合(如所提到的甘油三酸脂)。通常，葉黃素成分占混合物比重約0.135%(110%為佳)。從皂化蝦青素酯萃取游離葉黃素，這是科研人員通常使用的方法。例如，Kamataetal,Comp.Biochem,Physiol，86B(3):587陽591,1987和Yuanetal,J.AgricFoodChem,47;3135,1999都分別在氮氣環(huán)境下對蝦青素酯進行皂化發(fā)應(yīng)。關(guān)于脂肪酸分析，Kamataetal使用0.1N甲醇KOH，在氮氣環(huán)境下，加熱到100攝氏度后再加熱40分鐘，從夏側(cè)金盞花提取蝦青素，蝦青素凈化后，用皂化方法處理該凈化后的蝦青素。皂化后，他又添加0.5NHCl，使樣品含酸性，然后將從石油醚中萃取出來蝦紅素(蝦青素的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化體)。Yuanetal找到了一種皂化方法雨生紅球藻中的色素萃取物中水解蝦青素酯，然后對這種水解物進行皂化反應(yīng)，而不會造成蝦青素嚴重退化或結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變。對于不同濃度U0100mg/1)的色素萃取，在無光氮氣狀態(tài)下，使用0.018N的甲醇氫氧化鈉進行反應(yīng)，蝦青素酯水解能在六小時內(nèi)全部完成。甲醇氫氧化鈉濃度越高，水解反應(yīng)越快，但蝦青素退化也更嚴重。在另一具體實施方案，本專利的花朵的萃取是通過利用親水溶液(如95%甲醇)除去類胡蘿卜素，將花朵干燥，最后提到粉碎后的花瓣可以喂養(yǎng)動物。這樣方法得到萃取物可以用于醫(yī)學用途。不必贅述，熟悉這類技巧的人士可以根據(jù)上面說明，把本發(fā)明的功效發(fā)揮得淋漓盡致。下面具體的實施方案僅作為舉例，而非對這項專利其它發(fā)展空間限制。實施例下列例子進一步闡述了本發(fā)明，但并非用于限制本發(fā)明的權(quán)利要求書中要求保護的范圍。例l:獲取類胡蘿卜素含量低，蝦青素油性樹脂含量高的方法研究人員研究開發(fā)能獲取蝦青素含量高的蝦青素油性樹脂的方法，即發(fā)明出蝦青素的含量高，非蝦青素類胡蘿卜素和強心甾烯類含量較低的方法。在愛爾蘭和歐洲用手工收割的夏側(cè)金盞花中，從每公頃夏側(cè)金盞花"洛德斯紅"當中獲取的蝦青素產(chǎn)量己經(jīng)超過5千克，每朵干花含有蝦青素含量超過1020mg。機械收割花朵(使用改良牧草收割機)和獨瓣花新生代(使用胎緣切除機和氣體分離法)也已經(jīng)實現(xiàn)。對花瓣(手工收割或機械收割的花朵)進行改良，這得以讓每千克夏側(cè)金盞花洛德斯紅干花組織的蝦青素含量從9.3增長到23.0克，并使巴勒斯坦側(cè)金盞花PF52中的蝦青素從16.3增長到38.7克/千克，這比任何其它自然蝦青素來源都高(藻類大約含1.5克/千克，紅發(fā)夫酵母約0.5克/千克)。另外，由于不含綠色組織，萃取所需的有機溶液的量也降低了，不含蝦青素的類胡蘿卜素含量也降低了，從夏側(cè)金盞花"洛德斯紅"和巴勒斯坦側(cè)金盞花PF52中全花中萃取的油性樹脂含有約8.913.6%的不含蝦青素的其他類胡蘿卜素。通過HPLC分析顯示，人工收割的全花含有非蝦青素類胡蘿卜素(主要是黃體素)的最大可降低到1.3。z^，葉綠素含量降低84%。通過磨碎花朵或花瓣，添加己烷，攪拌一定時間(約一小時)，把溶于己垸的類蘿卜素萃取出來，隨后進行真空過濾，除去己烷，這樣生成的油性樹脂當中含有豐富的蝦青素。美國專利專利文獻(專利號5,453，565)里介紹使用了己垸和甲醇來將低類胡蘿卜素成分的方法，并且提出，僅僅使用己烷能把干燥后的色素混合物中的類胡蘿卜素成分降低82%，通過優(yōu)化蝦青素(能溶于己烷)，把強心甾烯類最大程度地分離(大多數(shù)不溶于己烷，除了非酶糖化磁麻苷之外)出去，這樣可以把降低比例增至97%。干燥后的色素混合物溶解在有機溶液或油中，如魚油或植物油，從而把蝦青素提取出來。強心甾烯類的含量減少后的蝦青素能增長魚類生長周期，反之降低死亡率。例2:巴勒斯坦側(cè)金盞花基因的改良在以色列戈蘭高地收集到大花朵的巴勒斯坦側(cè)金盞花種子。種子撒播后，長出更大的花，大花種植交接，并收集新種子。播種新種子，根據(jù)所結(jié)的花朵大小收集種子，同時也保持花朵鮮艷的紅色。這些經(jīng)過挑選的大花朵種子進行繁殖，生產(chǎn)出的后代比一般的巴勒斯坦側(cè)金盞花花朵大3倍(表1，下圖)，圖1改良后的巴勒斯坦側(cè)金盞花與標準巴勒斯坦側(cè)金盞花在花瓣直徑、數(shù)目、蝦青素含量及芍藥花青素含量的區(qū)別(芍藥花青素一般在花朵的黑色中心眼處)。__改良后的巴勒斯坦側(cè)金盞花與標準巴勒斯坦側(cè)金盞花在花瓣直徑、數(shù)目、蝦青素含量及芍藥花青素含量的區(qū)別花的品種花瓣直徑花瓣數(shù)目蝦青素含量蝦青素含量(cm)(mg/朵)(g/kg干花重)芍藥花青素含(g/kg干花重)<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>表2則標示出了改良后的巴勒斯坦側(cè)金盞花大花朵直徑，花眼直徑，花瓣數(shù)，蝦青素含量的最大、最小和平均值。<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>精心挑選出的巴勒斯坦側(cè)金盞花植物與標準的夏側(cè)金盞花雜交，生產(chǎn)出花瓣更大、更容易發(fā)芽的大花朵植物。這些植物不能繁殖，不能用于提供更優(yōu)良的種子。例3:夏側(cè)金盞花的最新產(chǎn)品報道所稱四季夏側(cè)金盞花(高度活躍)和一般夏側(cè)金盞花(欠活躍)的生理活動差異在于類胡蘿卜素數(shù)量和質(zhì)量上的不同。一朵干夏側(cè)金盞花含有的類胡蘿卜素平均大約是0.5%(與其重量的比重)，而常年花種中巴勒斯坦側(cè)金盞花含有0.08%，夏側(cè)金盞花含有0.1%，側(cè)金盞花含有0.2%。此外，春側(cè)金盞花含有大約30種不同的類胡蘿卜素，與之相比較，夏側(cè)金盞花含有8種，巴勒斯坦側(cè)金盞花9種，側(cè)金盞花含有10種。此外，常年物種中缺少的幾種側(cè)金盞花包含主要的強心留，如福壽草毒甙(主要是春側(cè)金盞花強心甾，相當于全部強心甾15~20%的含量)，以及去葡萄糖桂竹香毒。巴勒斯坦側(cè)金盞花花朵收割后(手工收割或者機械收割)，田間里剩下干燥的干，莖和葉子保守數(shù)量達到2噸/公頃，這個數(shù)目的生物量當中約含有0.08%的強心甾。在開花時節(jié)，先對春金盞花進行收割，這時收集到果實當中強心甾含量最高。收割可以實行機械化，使用一種標準的割草式收割機，或者用鐮刀或戰(zhàn)車鐮進行手工收割。新鮮的組織應(yīng)該盡快干燥，以防質(zhì)量下降，可以放在平板干燥器上干燥。干燥后的材料可以直接出售，或切成更小塊的備用物，或通過機械磨碎制粉，或萃取制作成藥草液體萃取物油性樹脂或染料。干燥物用己垸溶液進行萃取后(分離出蝦青素)，隨后干燥除去己烷殘渣，用甲醇萃取花朵粉末，從而可除去占花朵約98%強心甾(剩余物提取到己垸)。從干化后的綠色物料(干，莖和葉)萃取中得到的強心甾后，用這種步驟可以從強心甾中得到約25%的染料產(chǎn)出，這不會造成額外的收割，干燥和加工成本(不包含干燥和甲醇萃取)。從強心甾含量低的物質(zhì)中萃取出己烷，將側(cè)金盞花花朵放在甲醇當中萃取，這樣可以分離出薔薇紅酰胺。從強心甾含量低的巴勒斯坦側(cè)金盞花(要么是粉碎后的花瓣，要么是利用甲醇萃取后的油性樹脂)中可以制作出有機蝦青素，用于有機大馬哈魚養(yǎng)殖。例4:側(cè)金盞花油性樹脂中類胡蘿卜素和脂肪酸成分為了找到所含類胡蘿卜素以及酯化類胡蘿卜素脂肪酸，對巴勒斯坦側(cè)金盞花植物進行化驗分析。下面表3和表4顯示分析結(jié)果。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>游離蝦青素6.4蝦青素3.3金盞花紅素0.8卩胡蘿卜素0.83-羥基海膽酮0.34-羥基海膽酮0.3斑蝥黃質(zhì)0表4蝦青素雙酯成分脂肪酸重量百分比C12:013.5C14:017.3C16:021.1C16:15.0C18:03.5C18:118.3C18:25.5C18:315.6按照結(jié)腸后面鏈上碳原子數(shù)量以及鏈中乙烯不飽和指數(shù)，我們可以確定脂肪酸的具體位置。例5:作為養(yǎng)殖業(yè)添加劑的側(cè)金盞花油性樹脂中蝦青素的穩(wěn)定性在飼養(yǎng)試驗當中，虹鱒被喂養(yǎng)合成的蝦青素或從側(cè)金盞花獲取的蝦青素，食用63天后，將之捕獲，冷凍(2個月)和煙熏前后，用分光光度計(Minoltachromameter)和化學方法(從魚肉除去油脂，利用HPLC分析)檢測出蝦青素水平。在作出處理前，對飼料中原有的蝦青素含量進行調(diào)整，使之達到相同的色素水平。由于魚身長短22不一，色素水平也不一致，在每條魚的三個部位進行了測量(頭部，魚身和魚尾)，結(jié)果如表5所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>這是三個不同位置的平均數(shù)據(jù)從上表中我們很明顯地看出，側(cè)金盞花油性樹脂能產(chǎn)出更穩(wěn)定的色素，特別是在冷凍處理中，食用了合成油性樹脂的魚腰部位的強心甾含量降低了26%，而食用了側(cè)金盞花油性樹脂的只是降低了9%(請見表五)。食用了兩種不同來源的蝦青素的魚含有的蝦青素同質(zhì)異構(gòu)特點是相同?？赡苡捎谒幉课徊煌瑢е吕鋬鲶E冷時更容易促使強心甾降低。例6:食用側(cè)金盞花油性樹脂的強心甾含量干燥后的花朵組織含有0.28%(w/w)的強心甾。經(jīng)過對花朵組織里六種主要的強心甾進行分析，結(jié)果顯示，它們都是毒毛旋花子苷原衍生物毒毛旋花子苷原(配糖體)，雷公藤多甙，磁麻苷，k-毒毛花甙,k-毒毛旋花子甙，鈴蘭毒甙以及一個仍未確認的雷公藤多甙。大部分用于萃取出蝦青素的己烷都不能同時萃取強心甾(這是類胡蘿卜素分離的標準)，所產(chǎn)生的相應(yīng)油性樹脂含量是0.016%，這個百分比是相對于干花重量而言。分析表明得到這個數(shù)值，是因為更多親水性的雷公藤多武不能進行萃取，從而使油性數(shù)值強心甾成份里的毒毛旋花子苷原含量從3.8%(對干花進行甲醇萃取)，升至93.6%。這種油性樹脂(含有80ppm蝦青素)對虹鱒的死亡率或生長沒有負面影響，但是研究發(fā)現(xiàn)，濃度超過20倍以上的油性樹脂對成年蝦的死亡率影響很大。用側(cè)金盞花提取的蝦青素喂養(yǎng)一些魚，并進行魚類的強心甾含量分析。在日本，對魚群用加吉魚喂養(yǎng)，并進行強心甾成分含量分析，這種做法實際上把這種研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用到另一類不相關(guān)的商業(yè)魚類種群分析。由于毒毛旋花子苷原親水性很好，強心甾含量取決于肉(頭，魚身，魚尾)以及表層和腸部?，F(xiàn)在已經(jīng)開發(fā)出一種測量魚類強心甾含量成份，減低樣本油脂，使化驗敏感性的方法。分析顯示飼養(yǎng)金盞花油性樹脂的虹鱒肌肉中檢測到的強心甾最低含量也比表層含量稍微高一些。表6用從側(cè)金盞花當中萃取的蝦青素喂養(yǎng)虹鱒，并對虹鱒體內(nèi)的強心含量進行檢測<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>"ppm磁麻苷類似的物質(zhì)n/d沒有檢測結(jié)果這些結(jié)果反映了在治療心率紊亂的疾病時，應(yīng)用側(cè)金盞花強心甾的經(jīng)驗。結(jié)果顯示了在這種疾病中，病人體內(nèi)含有極少的，甚至不含魚類使用含有少量強心甾的蟲下青素，消費者食用這種魚并不會遇到健康風險。因為在標準的200克虹鱒里所含有的強心甾含量比側(cè)金盞花中作為藥草藥品使用時專家推薦的強心8。/^含量還要低。例7:油性樹脂強心甾基因成分降低對栽培選擇出來的巴勒斯坦側(cè)金盞花植物強心甾成分中基因降低進行調(diào)查對235棵植物的強心留含量進行估量，利用改良的堿性3,5-二硝基苯甲酸試劑(Kedde試劑)(水性/甲醇氫氧化鉀里的3,5-二硝基苯甲酰氯酸)進行定量估算，并用一種高通性高效薄層色譜(HPTLC)方法進行定性分析。通過對巴勒斯坦側(cè)金盞花花朵的分析結(jié)果顯示花朵中含有不同含量的強心甾成分，百分比從0.034-0.0464%(w/w)不等，平均值為0.0265%。通過對這些植物自花受粉期以及后代的強心甾成分進行分析，結(jié)果顯示了強心甾成分的遺傳可能性很小，僅達0.76%。換而言之，這種植物物種中有76%是基于基因而表現(xiàn)出來的性狀，并可以通過優(yōu)勝劣汰進行改善，后代中5%最好的植物干花瓣的強心甾成分含量極其低，僅達0.042%，比父代中15%的含量還低。將這些精心選擇出來的植物中繼續(xù)進行優(yōu)良培育，以期進一步把數(shù)值降低。利用高效薄層色譜(HPTLC)對花瓣進行測定分析顯示共有13個株系缺乏六種花朵組織中的強心甾中的一種或更多種。對缺少不同類型的強心甾株系進行雜交(例如，零-A+零-D可以產(chǎn)出既不含A也不含D的雙零重組體)。從78種非互惠性雜種植物中準備了73粒種子，并對這些種子產(chǎn)生的后代進行調(diào)查，并得到HPTLC分析成分和強心甾成分總含量。關(guān)于降低強心甾成分是否可能產(chǎn)生多向性影響，人們另外進行了研究，專門研究這種可能性。對個別含有不同強心甾成分植株的進行分析，結(jié)果顯示強心甾含量與花朵大小(rp^.05)，高度(r=-0.17，p.0.05)，花朵數(shù)量(r=-0.05;p>0.05)，或者蟲下青素含量(r=0.21，p.0.05)都沒有什么關(guān)聯(lián)。這些數(shù)據(jù)顯示從基因遺傳的層面上降低蝦青素含量不會影響側(cè)金盞花中提高蝦青素產(chǎn)量。在另一方面，強心甾很可能是植物中內(nèi)含的抗食草動物，也可能是抗病原體的防御化學成分，因此如果除去強心甾，按照這種假設(shè)，這會導致防御功能下降。為了驗證這種假設(shè)，研究人員按照強心甾成分差異，用純凈的強心甾(a)和個體側(cè)金盞花植株驗證了強心甾含量對單食性/特化種行為(莖點霉側(cè)金盞花)和廣食者/泛化種病原體行為(醉蝶菌核病菌)的影響。研究人員對兩種不同的強心甾(磁麻苷和毒毛旋花子苷原)進行測評，評估其劑量對病原體反應(yīng)的影響。兩者都抑制了醉蝶菌核病菌的生長，而不抑制莖點霉側(cè)金盞花增長。由于后者是田間種植的側(cè)金盞花植物中最重要的病原體，這些數(shù)據(jù)顯示，降低強心甾對疾病問題的影響微乎其微。當研究人員研究野纓蛞蝓時，再次發(fā)現(xiàn)強心甾跟蛞蝓機能或死亡率都沒有關(guān)聯(lián)。確實，研究結(jié)果顯示，蛞蝓吃掉花朵大部分組織，而不吃花基；而在花基里分布著另外一種色素，花色素芍藥素累積一起，這也表明在花基里，這種色素(而非強心甾成分)才是抵制多食性害蟲主要功臣。這些數(shù)據(jù)再次顯示在所種植的強心甾含量較低的金盞花植物，對這作物需要保護，這些保護的作用是很小的。例8:通過萃取超臨界二氧化碳降低強心甾雖然用溶劑(通常為己垸)從自然資源中萃取類胡蘿卜素屬于行業(yè)的標準做法，并取得很高的成效。但用那類溶劑有幾個缺點，如利用高溫除掉大部分的(導致?lián)p失以及人工制品的產(chǎn)生)溶劑剩余物，并保留油性樹脂里面的剩余物。用溶劑萃取的油性樹脂在有機海鮮市場在不受歡迎，而這個市場可以作為蝦青素的自然資源進行開發(fā)。超臨界的二氧化碳萃取需要較低的溫度，但必須足夠溫度進行根據(jù)需求設(shè)計萃取條件，讓蝦青素得到最大的凈化效果。在實驗室進行的試驗中使用這種方法，除去強心甾成分，并通過降低油性樹脂里面的油脂含量而增加蝦青素成分。通過改變溫度(35C65C)、二氧化碳的流速(2—10kg/時)、操作氣壓(200—400KG/cm2),和萃取時間(13小時)，進行了析因研究。在45C，2個小時的萃取，4KG/時，油性樹脂的蝦青素濃度達到最大。蝦青素成分占16.7%，而己烷萃取法的比例是10.6%。產(chǎn)生這種比例提高，是因為油脂萃取降低了，盡管蝦青素更低(6576%)，而用己烷萃取法時，比例是84%。改變操作，進一步優(yōu)化實驗，這把油性樹脂里的類胡蘿卜素成分從0.061叩m(溶液)降低到0.0011ppm(300kg/cm2).大規(guī)模的萃取系統(tǒng)比實驗室規(guī)模的系統(tǒng)效果更好，因此這類技術(shù)規(guī)模擴大能進26一步改善效果。例9:赤霉酸和發(fā)芽巴勒斯坦側(cè)金盞花種子成活率和萌芽率決定長大后的花朵的數(shù)量。一般情況下，雖然種子成活率還可以(約3070%)，但發(fā)芽率很低，然而，如果在播種前，用5000ppm的赤霉酸將種子預浸泡24小時預(表7)，發(fā)芽率增至64.7。％。表7預浸泡時間和溫度，預浸泡介質(zhì)中赤霉酸(GA)濃度與巴勒斯坦側(cè)金盞花花朵發(fā)芽率的百分比預浸泡時間溫度(小時)(c)赤霉酸濃度(ppm)24404.310.721.428.0241608.712.525.734.7484013.720.428.740.34816022.328.745.764.7*在室溫下，將種子用甲醇進行24小時赤霉酸孵化，這會增加發(fā)芽率，經(jīng)過處理的種子表面干燥，并可以儲存長久，而不會造成生命力的喪失。例10:除草劑對巴勒斯坦側(cè)金盞花的影響在土壤中噴灑種子殺草劑，試驗顯示嗪草酮(又名滅必凈)農(nóng)藥(3-甲基-4-氨基-6-苯基-4，5-二氫-1，2，4-三嗪-5-酮)是唯一適用于噴酒在側(cè)金盞花上的氨磷汀除草劑。在嗪草酮和磺草靈的比較中，我們發(fā)現(xiàn)，雖然磺草靈對側(cè)金盞花不會造成影響，但它也不能控制雜草生長(表8)表8兩種除草劑濃度對雜草控制和側(cè)金盞花種子萌發(fā)的影響比除草劑處理后)<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>關(guān)于砂含量和土壤PH值對側(cè)金盞花死亡率與嗪草酮對側(cè)金盞花死亡率相比，進行了瓶子試驗(板栗容器)。很明顯，隨著土壤增加(而非PH值)，死亡率也隨之增加。當嗪草酮含量從500降至250g/ha時，植物死亡率降低了，而且雜草控制也保持在合理范圍內(nèi)。當數(shù)值為125g/ha時，雜草控制不再合適。此外，PH高時，有機磷殺蟲劑氯唑磷[O-(5—氯—l-(l-甲基l)-lH-l，2，4三唑-l-基)和嗪草酮之間發(fā)生負面的相互反應(yīng)，但所引起的死亡率也相應(yīng)的減小(表9)。表9使用除草劑嗪草酮(500g/ha)之后，氯唑磷，砂含量和土壤PH值對側(cè)金盞花萌芽之影響(植物/平方米)比較。使用除草劑嗪草酮(500g/ha)之后，氯唑磷，砂含量和土壤PH值對側(cè)金盞花萌芽之影響(植物/平方米)比較。_<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>847577676577766959707880787586697663538087828983747469388679868780727976通過以上的數(shù)據(jù)我們可以看出，在麥子和豆類植物中噴酒嗪草酮，會增加植物的死亡率，特別是在高PH值或者是萌芽遇到大雨或干旱時尤其如此。愛爾蘭考克卡蘭托希爾公司在PH值僅有6.8試驗田進行試驗，測試這種假設(shè)。在抽葉階段，在幼芽上噴酒嗪草酮除草劑[嘉磷塞:(RS)-7-(4，6-二甲氧嘧啶-2羧酸)-3-水楊酸l-2-苯并呋喃-l(3H)]，通常情況下，在通常的時段(三個抽葉期)這能夠測試到幼芽的情況(即是:造成非致命的影響)。當使用了500g/ha的嗪草酮時，幼芽死亡率是30%。發(fā)芽8天后，使用250g/ha的嗪草酮或用100g/ha之后用在帶葉子的巴勒斯坦側(cè)金盞花上施加尿素(氮氣有助于植物的抗壓能力)，表10。降低嗪草酮含量會導致更多雜草生長。2次使用250g/ha的嗪草酮時(播種前后各一次)，雜草能將少，同時也不增加幼芽死亡率。表10<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>以下是上述所引用的專利，應(yīng)用和文章參考資料。名詞前冠詞a/an的使用意味著一個或多個。上述說明和例子僅作為闡述性說明，而不是專利之局限性。本發(fā)明還可能含有其它變化的使用方法，并隨時為熟悉本技能之人士運用。權(quán)利要求1.從巴勒斯坦側(cè)金盞花植物當中萃取(每朵花含0.4～0.6克)蝦青素，以及從花瓣中萃取蝦青素的方法。2.權(quán)利要求1中涉及萃取方法中的蝦青素含量是每朵花0.5mg0.8mg。3.權(quán)利要求2中涉及萃取方法中的蝦青素含量是每朵花0.6mg0.8mg。4.權(quán)利要求1中涉及培植植物、收割花朵或花瓣以及從所收割的花朵或花瓣中提取蝦青素。5.權(quán)利要求1是用己烷萃取蝦青素。6.權(quán)利要求3是用超臨界二氧化碳萃取蝦青素。7.大花朵可以獲得更多的蝦青素，改良巴勒斯坦側(cè)金盞花植株的花朵直徑為4cm到8cm。8.權(quán)利要求7方法中花朵直徑約56cm。9.巴勒斯坦側(cè)金盞花植物或再生部分的花朵含有的蝦青素量約0.4mg0.8mg。10.巴勒斯坦側(cè)金盞花植物或再生部分，根據(jù)專利申請9，再生部分指的是一個或多個從花胚、分裂組織、花粉、葉子、花粉囊、根、根尖和花中選擇的細胞，或者從上述得到的原生物和愈合組織。11.權(quán)利要求9中涉及巴勒斯坦側(cè)金盞花花粉。12.權(quán)利要求9中涉及巴勒斯坦側(cè)金盞花胚珠13.根據(jù)權(quán)利要求9，可以獲得巴勒斯坦側(cè)金盞花植物的種子。14.雜交后的雜交植物，一棵或兩棵母植物指的都是權(quán)利要求9中涉及到的巴勒斯坦側(cè)金盞花植物。15.存儲NCIMB在的巴勒斯坦側(cè)金盞花植物屬種之一"PFPOP"。16.包含凈化后的分散或溶解在稀釋溶劑的蝦青素的類胡蘿卜素成分，這種成分不含斑蝥素黃嘌呤。17.根據(jù)權(quán)利要求16，類胡蘿卜素成分所用的稀釋溶劑是一種油。18.根據(jù)權(quán)利要求17，類胡蘿卜素成分中，蝦青素溶解在上述的油中。19.根據(jù)權(quán)利要求16，類胡蘿卜素成分所涉及的稀釋溶劑是油散開在水中。20.根據(jù)權(quán)利要求16，類胡蘿卜成分中涉及的稀釋溶劑是固體。21.根據(jù)權(quán)利要求16，類胡蘿卜素成分以膠囊的形式做成微粒粉劑。全文摘要一種新的改良植物巴勒斯坦側(cè)金盞花和及其植物種群的種植和特點，以及通過對植物種群進行改良，如增大花朵，以便達到增加花朵中的蝦青素，增加或降低花朵中的類胡蘿卜素的含量的目的。本發(fā)明還闡述了從巴勒斯坦側(cè)金盞花植物的花朵當中萃取蝦青素和其它類胡蘿卜素，同時在生成的萃取物中降低非胡蘿卜素酮和類胡蘿卜素的方法。文檔編號C12P23/00GK101568644SQ200680022116公開日2009年10月28日申請日期2006年5月3日優(yōu)先權(quán)日2005年5月3日發(fā)明者彼特·魏·瓊斯,琳達·福利,約翰·雷頓,西蒙·雷頓申請人:東榮科技有限公司