專利名稱：產生l-蘇氨酸的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于發(fā)酵工業(yè)中的技術。更具體而言，本發(fā)明涉及通過使用
埃希氏菌屬C&c/zer/c/^)細菌的發(fā)酵有效產生L-蘇氨酸的方法。L-蘇氨酸是必
需氨基酸之一，并且作為用于醫(yī)學目的的營養(yǎng)混合物中的成分是有用的。還 將其以多種方式使用作為動物飼料添加劑，和作為制藥工業(yè)和化學工業(yè)中的
反應劑。
背景技術：
L-氨基酸例如L-蘇氨酸和L-異亮氨酸是通過使用產生氨基酸的細菌的發(fā) 酵以工業(yè)方法產生的，所述細菌例如具有產生這些L-氨基酸的能力的棒狀桿 菌型細菌(coryneform bacteria)或埃希氏菌屬細菌。作為這些產生氨基酸的細 菌，使用從自然界分離的細菌菌林或這些細菌菌抹的人工突變體。使用細菌 菌株的重組體以改進生產力(productivity)，所述重組體中通過基因重組等增強 了 L-氨基酸生物合成酶。
具體而言，產生L-蘇氨酸的埃希氏菌屬細菌的突變菌抹是已知的，例如 6-二甲基氨基噪呤(6-dimethylaminopurine)抗性菌才朱(Japanese Patent Laid-open (Kokai) No. 5-304969)和疏螺旋體素(borrelidin)抗性菌抹(國際專利公開 WO98/04715)。使用重組埃希氏菌屬細菌產生L-蘇氨酸的方法是已知的，具 體而言在使用的菌抹中通過使用質粒來擴增蘇氨酸操縱子(US5,175,107),或 在使用的菌株中通過使用質粒來擴增磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因和天冬氨酸 酶基因(美國專利申請?zhí)?002/0110876)。
作為大腸桿菌中涉及L-蘇氨酸生物合成的酶的編碼基因，已知天冬氨酸 激酶III基因(lysC)、天冬氨酸半醛脫氫酶基因(aspartate semialdehyde dehydrogenase gene) (asd)、天冬氨酸激酶I-高絲氨酸脫氫酶基因(thrA)、高絲 氨酸激酶基因(thrB)和蘇氨酸合酶基因(thrC)等。thrA、 thrB和thrC (thrABC) 構成蘇氨酸操縱子。蘇氨酸操縱子形成弱化子結構(attenuatorstructure),并且 其在培養(yǎng)基中的表達受異亮氨酸和蘇氨酸抑制。已知將此弱化區(qū)的前導序列
或弱化子從蘇氨酸操縱子去除時，發(fā)酵產率得到改進(美國專利號5,538,873, Biotechnology Letters, Vol. 24, No. 21, November 2002,和國際專利公開 WO05/049808)。
迄今為止，已經開發(fā)的用于產生L-蘇氨酸的方法包括使用分批培養(yǎng)， 其使用初始含有所有營養(yǎng)物的發(fā)酵罐；補料分批培養(yǎng)，其使用初始含有預定 營養(yǎng)物并且用一種或多種額外營養(yǎng)物進行連續(xù)補料的發(fā)酵罐(美國專利號 5,538,873和歐洲專利號593792);和調節(jié)糖濃度的方法，從而使糖濃度保持 在預定水平或更低(國際專利公開WO05/014840和國際專利公開 WO05/014843)。此外，已開發(fā)的產生L-蘇氨酸的其它方法是對培養(yǎng)基進行補 料的方法，或向培養(yǎng)基添加營養(yǎng)物的方法，從而將磷酸和碳源作為生長限制 因子(美國專利號5,763,230)。
疏是細菌細胞生長的必需因子，并且通常以硫酸銨的形式包含在用于L-蘇氨酸發(fā)酵的培養(yǎng)基中。然而，就L-蘇氨酸的發(fā)酵產生而言，在發(fā)酵培養(yǎng)基 中調節(jié);s危濃度和降低辟"農度的作用是未知的。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供通過使用具有產生L-蘇氨酸的能力的埃希氏菌屬細 菌有效產生L-蘇氨酸的方法。
本發(fā)明的發(fā)明人進行了勤勉地研究從而達到了前述目的。結果，本發(fā)明 人發(fā)現培養(yǎng)基中的硫濃度能夠影響發(fā)酵結果，并且能夠通過調節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基 中的硫濃度以使其保持在預定水平或更低來改進發(fā)酵期間L-蘇氨酸的產率， 并且由此完成本發(fā)明。
本發(fā)明的目的是提供產生L-蘇氨酸的方法，其包括在含有碳源、氮源 和硫源的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有產生L-蘇氨酸的能力、屬于埃希氏菌屬的微 生物；和從培養(yǎng)物中收集L-蘇氨酸，其中調節(jié)所述培養(yǎng)基中的硫濃度以使其 處于預定水平或更低。
本發(fā)明的又一目的是提供如上所述的方法，其中調節(jié)所述發(fā)酵培養(yǎng)基中 的硫濃度從而卩吏其為0.35 g/L或更低。
本發(fā)明的又一目的是提供如上所述的方法，其中所述微生物是大腸桿菌。
本發(fā)明的又一目的是提供如上所述的方法，其中對所述微生物中的L-蘇 氨酸生物合成酶進行修飾，從而使該酶不受到L-蘇氨酸的反饋抑制。
本發(fā)明的又一目的是提供如上所述的方法，其中所述L-蘇氨酸生物合成
酶選自下組天冬氨酸激酶、高絲氨酸激酶、蘇氨酸合酶和它們的組合。
本發(fā)明的又一目的是提供如上所述的方法，其中所述硫源選自下組硫
酸鹽、硫代硫酸鹽、亞硫酸鹽、半胱氨酸、胱氨酸、谷胱甘肽和它們的組合。 本發(fā)明的又一目的是提供如上所述的方法，其中所述培養(yǎng)方法選自下組
分批培養(yǎng)方法、補料分批培養(yǎng)方法和連續(xù)培養(yǎng)方法。
本發(fā)明的又一目的是提供如上所述的方法，其中所述培養(yǎng)方法是補料分 批培養(yǎng)方法或連續(xù)培養(yǎng)方法，其中將含有硫源的補料培養(yǎng)基添加至發(fā)酵罐中 的培養(yǎng)物。
本發(fā)明的又一目的是提供如上所述的方法，其中所述補料培養(yǎng)基進一步 含有碳源和具有生長促進作用的營養(yǎng)物，并且其中將所述補料培養(yǎng)基連續(xù)地 或間歇地添加至發(fā)酵罐中的培養(yǎng)物，從而使培養(yǎng)物中的碳源濃度在微生物的 對數生長結束之后保持在30 g/L或更低。
本發(fā)明的又一 目的是提供以發(fā)酵液為基礎產生動物飼料添加劑的方法， 其包括
A) 在包含碳源、氮源和硫源的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有產生L-蘇氨酸的 能力、屬于埃希氏菌屬的微生物，
B) 進行發(fā)酵，其中調節(jié)所述培養(yǎng)基中的硫濃度從而使其處于預定水平或 更低，
C) 將粗發(fā)酵液千燥至按重量計10%或更少的水含量。 附圖簡述


圖1顯示最初添加至培養(yǎng)基的硫的量和L-蘇氨酸產率之間的關系。
優(yōu)選實施方案詳述 <1>本發(fā)明的方法
技術領域：
本發(fā)明的方法是產生L-蘇氨酸的方法，通過在含有碳源、氮源和^5克源的 發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有產生L-蘇氨酸的能力、屬于埃希氏菌屬的微生物，從 而在培養(yǎng)基中將L-蘇氨酸產生，其中調節(jié)所述培養(yǎng)基中的硫濃度從而使其保 持在預定水平或更低。在本發(fā)明中，術語"硫濃度"的意思是依據硫原子濃 度的硫源濃度。
用于本發(fā)明的培養(yǎng)基可以是任何培養(yǎng)基，只要其是含有碳源、氮源和硫 源作為營養(yǎng)物的液體培養(yǎng)基，除了調節(jié)所述培養(yǎng)基使其硫濃度保持在預定水 平或更低之外，對培養(yǎng)基不進行具體限定。硫源可以是任何含硫來源。硫酸 的鹽，例如硫酸鹽、硫代硫酸鹽和亞硫酸鹽，以及含硫氨基酸例如半胱氨酸、 胱氨酸和谷胱甘肽是理想的。在這些之中，硫酸銨是特別優(yōu)選的。不對鹽進 行具體限定，并且可使用銨鹽、鈣鹽、鈉鹽、磷鹽、鎂鹽、錳鹽和鐵鹽。此 外，所述培養(yǎng)基可包含僅一類、或兩類或更多類的這些物質。短語"預定水 平或更低"所表示的濃度可以是任何濃度，在該濃度L-蘇氨酸產率與在含有 大量硫的培養(yǎng)基中或常規(guī)發(fā)酵培養(yǎng)基中的產率相比得到改進。具體而言，發(fā)
酵培養(yǎng)基中的硫濃度優(yōu)選為0.35 g/L或更低，更優(yōu)選0.25 g/L或更低，特別 優(yōu)選O.IO g/L或更低。本發(fā)明的特征之一是調節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基中的硫濃度。對 于本發(fā)明的方法，可使用分批培養(yǎng)、補料分批培養(yǎng)和/或連續(xù)培養(yǎng)，并且可在 初始培養(yǎng)基中將培養(yǎng)基中的硫濃度調節(jié)至預定水平或更低，或可通過控制補 料培養(yǎng)基中的硫濃度或通過組合使用這些技術將培養(yǎng)基中的硫濃度限定在預 定水平或更低。對于初始培養(yǎng)基和補料培養(yǎng)基可使用相同的硫源，或補料培 養(yǎng)基中的硫源可不同于初始培養(yǎng)基中所使用的硫源。
在本發(fā)明中，補料分批培養(yǎng)指下述培養(yǎng)方法其中在培養(yǎng)期間將培養(yǎng)基 連續(xù)地或間歇地添加至容器中，并且在培養(yǎng)完成之前不從容器中取出 (w他draw)培養(yǎng)基。連續(xù)培養(yǎng)指下述培養(yǎng)方法在培養(yǎng)期間連續(xù)地或間歇地將 培養(yǎng)基添加至容器中，并且從容器中提取培養(yǎng)基(通常而言，以等同于培養(yǎng)基 補料的量)。術語"初始培養(yǎng)基"的意思是在補料分批培養(yǎng)或連續(xù)培養(yǎng)中，添 加補料培養(yǎng)基之前用于分批培養(yǎng)的培養(yǎng)基；術語"補料培養(yǎng)基"的意思是在
進行補料分批培養(yǎng)或連續(xù)培養(yǎng)時，將提供至發(fā)酵罐的培養(yǎng)基。補料培養(yǎng)基可 包含微生物生長所必需的全部或部分成分。在本發(fā)明中，術語"發(fā)酵培養(yǎng)基" 的意思是包含在發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基，并且從此發(fā)酵培養(yǎng)基中收集L-蘇氨酸。 此外，在本發(fā)明中，術語"發(fā)酵罐(fermenter)"的意思是在其中進行L-蘇氨 酸發(fā)酵的容器，并且不限定其形狀?？墒褂冒l(fā)酵罐(fermentation tank)或小型 發(fā)酵罐(jar fermenter)。此外，只要能夠產生和收集L-蘇氨酸，不限定發(fā)酵罐 的容積。
雖然優(yōu)選在全部發(fā)酵過程中始終將硫濃度限定于預定水平或更低，但也 可僅在部分過程中對其進行限定。例如，當本發(fā)明的方法包括細胞增殖階段
(生長期)和L-蘇氨酸產生階段(L-蘇氨酸產生期)時，在L-蘇氨酸產生期將硫濃 度限定于預定水平或更低是足夠的。在生長期(細胞增殖期間)，硫可以以多于 預定的量存在于培養(yǎng)基中，或可將硫濃度限定于預定水平或更低。此外，在
產生L-蘇氨酸的階段中，硫含量無需在此階段的全部時間內始終在前述范圍
內，硫含量在該階段的早期可以在前述水平或更高，并且可隨著培養(yǎng)時間而
降低。此外，在硫不足(runshort)時，可將其間歇地添加。術語"生長期，，用 于本發(fā)明中的意思是自開始培養(yǎng)起3小時，優(yōu)選6小時，特別優(yōu)選10小時之 內的時期，在這段時期中主要消耗碳源用于細菌細胞生長，即，細胞以對數 增殖。術語"L-蘇氨酸產生期"用于本發(fā)明中的意思是自開始培養(yǎng)起在最初3 小時，優(yōu)選6小時，特別優(yōu)選10小時之后的時期，在這段時期主要消耗碳源 用于L-蘇氨酸產生。
發(fā)酵培養(yǎng)基包含微生物生長所需的最小量的硫是足夠的；然而，疏的量 可能暫時不足。短語"不足，，的意思是與培養(yǎng)中較早的點相比，硫濃度降低， 并且甚至可能成為"0"。術語"暫時"的意思是，例如，^琉可能在相當于全部 發(fā)酵時間的大約20%、大約40%或至多大約60%的時間內不足。在^L不足的 時期內，雖然濃度可以暫時為O,但是期望的是硫以1 (ig/L或更多、10嗎/L 或更多或100嗎/L或更多的濃度存在于發(fā)酵培養(yǎng)基中。因此，即使硫濃度暫 時成為O,對于任何時期的含硫培養(yǎng)基的培養(yǎng)均包含在以下表述之內"在包 含碳源、氮源和硫源的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)屬于埃希氏菌屬的微生物"。培養(yǎng)基 中的硫濃度能夠通過離子層析方法和熱瓶方法(hot flask method)測量。
此外，根據本發(fā)明，在能夠使用補料分批培養(yǎng)時，可調節(jié)補料培養(yǎng)基中 的硫濃度從而將其限定于預定水平或更低。例如，通過使用補料分批培養(yǎng)限 定硫濃度時，優(yōu)選將發(fā)酵培養(yǎng)基中的硫濃度控制在0.35 g/L或更低，理想的 是0.25g/L或更低，更理想的是0.10g/L或更低。
本發(fā)明中使用的碳源的實例包括糖，例如葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、 麥芽糖、甘露糖、半乳糖、淀粉水解物和糖蜜(molasses)。葡萄糖和蔗糖是特 別優(yōu)選的。此外，有機酸例如乙酸和檸檬酸，和醇例如乙醇，也能夠單獨使 用或與其它碳源組合使用。此外，碳源的原料可以是蔗糖蜜、甜菜糖蜜、高 級糖蜜(high test molasses)和柑橘類糖蜜(citrus molasses)，和天然原料如纖維 素、淀粉、玉米、谷物和木薯淀粉(tapioca)的水解物。此外，溶解在培養(yǎng)基中 的二氧化碳也能夠用作碳源。這些碳源能夠用在初始培養(yǎng)基中和/或補料培養(yǎng)
基中。培養(yǎng)基可包含這些碳源的一種或多種類型。此外，可將相同的碳源用 于初始培養(yǎng)基和補料培養(yǎng)基，或補料培養(yǎng)基的碳源可不同于初始培養(yǎng)基的碳 源。例如，可將葡萄糖用在初始培養(yǎng)基中，而將蔗糖用在補料培養(yǎng)基中。
在本發(fā)明中使用的氮源的實例包括氨、銨鹽例如硫S臾銨、碳酸銨、氯化 銨、磷酸銨、乙酸銨和尿素、硝酸鹽等。用于調節(jié)pH的氨氣和氨水也能夠
用作氮源。此外，也能夠使用蛋白胨、酵母提取物、肉膏(meat extract)、麥芽 提取物(malt extract)、玉米漿(corn steep liquor)、大豆水解物等。培養(yǎng)基可包 含這些氮源的一種或多種類型。這些氮源也能夠用在初始培養(yǎng)基中和/或補料 培養(yǎng)基中。此外，可將相同的氮源用于初始培養(yǎng)基和補料培養(yǎng)基二者，并且 補料培養(yǎng)基的氮源可不同于初始培養(yǎng)基的氮源。
此外，本發(fā)明的培養(yǎng)基除碳源、氮源和硫之外優(yōu)選還包含磷酸源。作為 磷酸源，能夠使用磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀和磷酸聚合物例如焦磷酸。
此外，本發(fā)明的培養(yǎng)基除碳源、氮源和硫之外可包含生長促進因子(具有 生長促進作用的營養(yǎng)物)。能夠使用的生長促進因子包括痕量金屬、氨基酸、 維生素、脂肪酸、核酸以及蛋白胨、酪蛋白氨基酸、酵母提取物、大豆蛋白 水解物。
痕量金屬的實例包括鐵、錳、鎂、鈣、鉀、鈉等。維生素的實例包括維 生素B,、維生素Bs、維生素B6、煙酸、煙酰胺、維生素B,2等?？蓪⑦@些生 長促進因子包含在初始培養(yǎng)基中或補料培養(yǎng)基中。
此外，在使用其生長需要氨基酸等的營養(yǎng)缺陷突變體(auxotrophic mutant) 時，優(yōu)選將所需營養(yǎng)物添加至培養(yǎng)基。具體而言，因為在如下所述能夠用于 本發(fā)明的產生L-蘇氨酸的細菌中，L-蘇氨酸生物合成途徑通常是增強的并且 L-蘇氨酸降解能力通常是減弱的，所以優(yōu)選添加L-賴氨酸、L-高絲氨酸、L-異亮氨酸、L-曱硫氨酸或它們的組合。
初始培養(yǎng)基和補料培養(yǎng)基可具有相同或不同的組成。此外，初始培養(yǎng)基 和補料培養(yǎng)基可具有相同或不同的硫濃度。此外，當在多個階段添加補料培
養(yǎng)基時，在各個階段所添加的補料培養(yǎng)基的組成可以是相同或不同的。
培養(yǎng)優(yōu)選在通氣條件下進行，發(fā)酵溫度優(yōu)選在20至45°C，特別優(yōu)選在 33至42。C。優(yōu)選將氧濃度調節(jié)到5至50%,更優(yōu)選調節(jié)至大約10%。此外， 進行通氣時優(yōu)選將pH調節(jié)到5至9。如果在培養(yǎng)期間pH降低，例如，可添 加碳酸4丐或堿例如氨氣和氨水以中和培養(yǎng)物。在這些條件下進行培養(yǎng)時，優(yōu)
選進行大約10至120小時，可觀量的L-蘇氨酸積累于培養(yǎng)基中。只要能夠將 L-蘇氨酸從培養(yǎng)基分離和收集，則對積累的L-蘇氨酸的濃度不進行限定，并 且L-蘇氨酸的濃度為50 g/L或更高，理想的是75 g/L或更高，更理想的是 100g/L或更高。
在本發(fā)明中，微生物的培養(yǎng)可以通過種子培養(yǎng)(seed culture)和/或主培養(yǎng) (main culture)來進行，以誘導高于一定水平的L-蘇氨酸積累。種子培養(yǎng)可通 過使用搖瓶等的搖動或通過分批培養(yǎng)來進行。主培養(yǎng)可作為補料分批培養(yǎng)或 連續(xù)培養(yǎng)進行?；蛘?，種子培養(yǎng)和主培養(yǎng)均可作為分批培養(yǎng)進行。
在這些培養(yǎng)方法中，當L-蘇氨酸濃度達到預定水平時，可取出一些發(fā)酵 液，并且可添加新鮮培養(yǎng)基以重復培養(yǎng)。作為新鮮培養(yǎng)基，包含碳源和具有 生長促進作用的營養(yǎng)物(生長促進因子)的培養(yǎng)基是優(yōu)選的，并且其優(yōu)選包含預 定濃度或更低的硫。表述"預定濃度或更低，，的意思是調節(jié)待添加的培養(yǎng)基 從而使發(fā)酵培養(yǎng)基中的硫濃度成為0.35 g/L或更低，理想的是0.25 g/L或更 低，更理想的是0.10g/L或更低。作為碳源，葡萄糖、蔗糖和果糖是優(yōu)選的。 作為生長促進因子，氮源、磷酸、氨基酸等是優(yōu)選的。作為氮源，能夠使用 氨、銨鹽例如硫酸銨、碳酸銨、氯化銨、磷S交銨、乙酸銨和尿素、硝酸鹽等。 此外，作為磷酸源，能夠使用磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀。至于氨基酸，在使 用營養(yǎng)缺陷突變菌抹時，優(yōu)選補充以所需的氨基酸。
當根據本發(fā)明進行補料分批培養(yǎng)或連續(xù)培養(yǎng)時，可將補料培養(yǎng)基的添加 間歇暫停，從而將糖或營養(yǎng)物的供給暫停。優(yōu)選將補料培養(yǎng)基的添加暫停補 料時間(feeding time)的至多30%,理想的是20%，特別理想的是10%。所述 "補料時間，，的意思是從初次添加#卜料培養(yǎng)基開始到最后 一次添加補料培養(yǎng) 基結束的時期。補料培養(yǎng)基添加的暫?？缮儆?0%,并且最優(yōu)選少于10%。 當間歇添加補料培養(yǎng)基時，起初可在預定的時間添加補料培養(yǎng)基，并且可控 制第二次和之后的添加以使其在計算機檢測到pH或溶氧濃度增加時開始。 這種檢測發(fā)現通常發(fā)生在某個添加時期前的添加/暫停時期內發(fā)酵培養(yǎng)基中 的碳源耗盡后，并且因此培養(yǎng)罐(culture tank)中的底物濃度應該自動并且始終 如一地(consistently)保持在低水平(美國專利號5，912，11"。
用于補料分批培養(yǎng)的補料培養(yǎng)基優(yōu)選是包含碳源和具有生長促進作用的 營養(yǎng)物(生長促進因子)的培養(yǎng)基，并且可以包含硫以使發(fā)酵培養(yǎng)基中的硫濃度 保持在預定濃度或更低。表述"預定濃度或更低"用于本文的意思是調節(jié)添
加的培養(yǎng)基從而使發(fā)酵培養(yǎng)基中的硫濃度保持在0.35 g/L或更低，理想的是 0.25g/L或更低，更理想的是0.10g/L或更低的濃度。盡管補料培養(yǎng)基自身的 硫濃度可以在前述濃度范圍之內或之外，優(yōu)選其在前述濃度范圍之內。
作為碳源，葡萄糖、蔗糖和果糖是優(yōu)選的。作為生長促進因子，氮源、 磷酸、氨基酸等是優(yōu)選的。作為氮源，能夠使用氨、銨鹽例如硫酸銨、碳酸 銨、氯化銨、磷酸銨、乙酸銨和尿素、硝酸鹽等。此外，作為磷酸源，能夠 使用磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀。至于氨基酸，在使用營養(yǎng)缺陷突變菌抹時， 優(yōu)選補充以所需的氨基酸。此外，補料培養(yǎng)基可以是一種類型的培養(yǎng)基，或 兩種或多種類型的培養(yǎng)基的混合物。在使用兩種或兩種類型的補料培養(yǎng)基時， 可將培養(yǎng)基混合并且通過使用一種補料罐(feed can)來添加，或通過使用兩種 或多種補料罐來添加。
此外，在進行補料分批培養(yǎng)時，優(yōu)選進行添加以使糖的量不超過30g/L， 優(yōu)選20 g/L，更優(yōu)選10 g/L的全部補料分批培養(yǎng)基或發(fā)酵培養(yǎng)基。具體而言， 在微生物完成對數生長之后，優(yōu)選將糖濃度控制在前述濃度范圍之內。能夠 通過美國專利號5,912,113中所述方法控制碳源的補料速率(feeding rate)。此 外，優(yōu)選補料糖和磷酸以使其濃度可使糖和磷酸成為細菌細胞生長的限制因 素。磷酸存在于補料培養(yǎng)基中，使得磷/碳(P/C)比率為2或更低，優(yōu)選1.5或 更低，更優(yōu)選1或更低(美國專利號5,763,230)。
在將連續(xù)培養(yǎng)方法用于本發(fā)明時，可將培養(yǎng)基同時取出和添加；或可提 取部分培養(yǎng)基，并且可隨后添加培養(yǎng)基。此外，所述方法也可以是連續(xù)培養(yǎng) 方法，其中將包含L-蘇氨酸和細菌細胞的培養(yǎng)基取出，并且僅將細胞再循環(huán) 至發(fā)酵罐(法國專利號2669935)。作為連續(xù)或間歇添加營養(yǎng)源的方法，使用與 補料分批培養(yǎng)中所用的相同方法。
將培養(yǎng)基間歇取出時，在L-蘇氨酸濃度達到預定濃度時收集部分L-蘇氨 酸，并且添加新鮮培養(yǎng)基以繼續(xù)培養(yǎng)。此外，至于待添加的新鮮培養(yǎng)基的量， 添加新鮮培養(yǎng)基之后，培養(yǎng)中總培養(yǎng)基的最終量等于提取之前培養(yǎng)基的量。 術語"等于"用于本文的意思是提取前培養(yǎng)基的量的大約93至107%。
在將培養(yǎng)基連續(xù)取出時，優(yōu)選在添加營養(yǎng)培養(yǎng)基的同時或之后開始取出。 例如，開始時間是添加開始之后的最多5小時，優(yōu)選3小時，更優(yōu)選1小時。 此外，培養(yǎng)基的取出量優(yōu)選等于添加的培養(yǎng)基的量。
重復使用細菌細胞的連續(xù)培養(yǎng)方法是如下所述的方法在氨基酸濃度達
到預定水平時，將發(fā)酵培養(yǎng)基間歇或連續(xù)地取出，僅取出L-蘇氨酸，并且將
包含細菌細胞的過濾殘余物再循環(huán)(re-circulating)到發(fā)酵罐中，這種方法能夠 通過參考例如法國專利號2669935來進行。
L-蘇氨酸和其它氨基酸的分析能夠通過如Spackman等(Analytical Chemistry 30:1190-1206 (1958))所述的陰離子交換層析然后是茚三酮衍生化 (ninhydrin derivation),或通過i口 Lindroth等(Analytical Chemistry 51:1167-1174) 所述的反相HPLC來進行。
<2>基于本發(fā)明產生的發(fā)酵液產生動物飼料添加劑的方法 基于本發(fā)明產生的發(fā)酵液的動物伺料添加劑能夠通過以下分離方法制備。
L-蘇氨酸分離方法例如離心、過濾、傾析、絮凝或這些的組合能夠用于 去除或減少生物質。
使用已知方法例如旋轉蒸發(fā)器、薄層蒸發(fā)器(thin layer evaporator)、反滲 透(reverse osmosis)或納米過濾(nanofiltration),能夠將通過本發(fā)明獲得的培養(yǎng) 液(broth)提濃(thicken)或濃縮。(FR8613346B、 US4，997,754、 EP410005B、 JP1073646B)
隨后使用冷凍干燥、噴霧干燥、噴霧粒化(spray granulation)或任何其它 方法處理濃縮的培養(yǎng)液，以提供優(yōu)選自由流動的(free flowing)、細碎的(finely divided)粉末用于動物飼料添加劑。通過使用合適的壓制(compacting)或粒化方 法能夠將這種自由流動的、細碎的粉末轉化成粗?；?coarse-grained)、非常自 由流動的、穩(wěn)定并且基本上無粉塵(largely dust-free)的產品。總而言之，以此 方法將多于90%的水去除，從而使飼料動物添加劑的水含量按重量計少于 10%，優(yōu)選少于5%。
飼料添加劑的蛋白含量按重量計可少于10%，優(yōu)選少于5%,并且L-蘇 氨酸的濃度可多于50%,優(yōu)選多于85%，更優(yōu)選多于95%。 (US5，431,933、 JP1214636B 、 US4,956,471 、 US4,777,051 、 US4946654 、 US5，840358 、 US6，238,714、 US2005/0025878)
不必要必需進行上述分離步驟，但是可以以技術上有利的方式將其組合。
<3>能夠用于本發(fā)明的埃希氏菌屬細菌
能夠用于本發(fā)明的埃希氏菌屬細菌是具有產生L-蘇氨酸的能力的埃希氏 菌屬細菌，并且術語"產生L-蘇氨酸的能力"用在本發(fā)明中的意思是將所述 細菌在培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，在培養(yǎng)基中產生游離L-蘇氨酸的能力，即，將游離
L-蘇氨酸產生至細胞外，其程度使得能夠從培養(yǎng)基收集L-蘇氨酸。優(yōu)選地，
用于本發(fā)明的埃希氏菌屬細菌是經過培育以使該菌抹與野生型菌抹或親本菌
屬相比能夠產生更高的L-蘇氨酸量的菌林。具體而言，優(yōu)選在使用未調節(jié)硫 濃度的通常培養(yǎng)方法時，所述埃希氏菌屬菌抹產生30g/L或更高，更優(yōu)選50 g/L或更高，特別優(yōu)選75 g/L或更高的L-蘇氨酸量。
用于獲得適用于本發(fā)明的埃希氏菌屬細菌的埃希氏菌屬細菌的親本菌抹 無具體限定，其具體實例包括在Neidhardt等(Neidhardt, F.C. " a/.， Eyc/zen'c/^ co// and iS"a//wcwe//a 23^ /z/薩n'膽，American Society for Microbiology, WashingtonD.C.， 1029,表l)的工作中提到的那些菌抹。在這些菌抹之中，例 如，大腸桿菌是優(yōu)選使用的。大腸桿菌的具體實例包括均源自原型野生型菌 抹K12的大腸桿菌W3110 (ATCC 27325)和大腸桿菌MG1655 (ATCC 47076) 等。
為了獲得這些菌抹，能夠從例如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)(地址P.O. Box 1549 Manassas, VA 20108, United States of America)獲得它們。為各細菌菌抹提供一個對應的注冊號，并且使用該注冊 號能夠預定各菌抹。對應于細菌菌抹的注冊號列于美國典型培養(yǎng)物保藏中心 的目錄中。
<3-1>賦予L-蘇氨酸產生能力
在下文中，將描述將L-蘇氨酸產生能力賦予埃希氏菌屬細菌的方法。 為了賦予L-蘇氨酸產生能力，能夠使用已被常規(guī)采用的培育埃希氏菌屬 細菌或棒狀桿菌型細菌的方法，例如獲得全都具有L-蘇氨酸產生能力的營養(yǎng) 缺陷突變體、類似物抗性菌抹(analogue resistant strain)或代謝調控突變菌抹 (metabolism control mutant strain),以及構建其中將L-蘇氨酸生物合成酶的活 性增強的重組菌抹。例如，可對突變或重組菌抹進行修飾，以使L-蘇氨酸生 物合成酶不受到反饋抑制；或可對重組菌林進行修飾，以增強L-蘇氨酸生物 合成酶基因的表達。在通過這些方法培育產生L-蘇氨酸的細菌時，可單獨地 或組合地賦予例如營養(yǎng)缺陷型(auxotrophy)、類似物抗性和代謝調控突變等性 質。在將L-蘇氨酸生物合成酶的活性增強時，可將一種或多種這些酶的活性
增強。此外，如上所述，賦予上述性質和增強酶活性可組合進行。
將產生L-蘇氨酸的能力賦予埃希氏菌屬細菌的方法實例，或通過增強L-蘇氨酸生物合成酶的活性來增強產生L-蘇氨酸的能力的方法實例，將在下進
行說明?？赏ㄟ^如下方法增強酶活性例如，將突變引入編碼該酶的基因或
擴增該基因以使酶的細胞內活性增加。這些能夠通過使用基因重組技術實現。
編碼L-蘇氨酸生物合成酶的基因的實例包括天冬氨酸激酶III基因 (/"C)、天冬氨酸半醛脫氫酶基因(m力、Ar操縱子中包括的天冬氨酸激酶I 基因0/zM， SEQ ID NO: 1的核香酸編號337至2799)、高絲氨酸激酶基因(/Zzr萬, SEQ ID NO: 1的核香酸編號2801至3733)和蘇氨酸合酶基因(^<:, SEQ ID NO: 1的核苷酸編號3734至5020)。括號中所示是這些基因的縮寫名稱?？?將這些基因的兩種或多種引入細菌?？蓪-蘇氨酸生物合成基因引入其中蘇 氨酸降解受到抑制的埃希氏菌屬細菌。其中蘇氨酸降解受到抑制的埃希氏菌 屬細菌的實例包括蘇氨酸脫氫酶活性缺陷的TDH6菌抹(EP1149911A)等。
L-蘇氨酸生物合成酶的酶活性受到作為終產物的L-蘇氨酸的抑制。因此， 為了構建產生L-蘇氨酸的細菌，有益的是對L-蘇氨酸生物合成體系基因進行 修飾從而使編碼的酶不受到L-蘇氨酸的反饋抑制。前述A"、 f/z^和ArC基 因構成蘇氨酸操縱子，并且該蘇氨酸操縱子具有弱化子結構。蘇氨酸操縱子 的表達受到存在于培養(yǎng)基中的異亮氨酸和蘇氨酸的抑制，并且通過弱化作用 抑制。前述修飾能夠通過去除弱化區(qū)中的前導序列(SEQIDNO:6)完成，或通 過去除弱化子(SEQIDNO: 1)完成(國際專利7>開WO02/26993; Biotechnology Letters, Vol. 24, No. 21， November 2002;國際專利/^開WO05/049808、 WO98/04715、 WO03/097839)。具體而言，期望的是修飾蘇氨酸操縱子以從 SEQIDNO: 1的序列中除去核苷酸188至310的序列。或者，修飾蘇氨酸操 縱子以從SEQIDNO: 1的序列中除去核苷酸148至310的序列也是期望的。
天然啟動子存在于蘇氨酸操縱子的上游區(qū)，并且可將其用非天然啟動子 取代(參考WO98/04715)?；蛘?，可構建蘇氨酸操縱子以使涉及蘇氨酸生物合 成的基因的表達受到X噬菌體的阻抑物(repressor)和啟動子的調節(jié)(參考歐洲 專利號0593792)。此外，經修飾從而不受到L-蘇氨酸反饋抑制的埃希氏菌屬 細菌也能夠通過選擇對a-氨基-(3-羥基戊酸(AHV)有抗性的菌抹來獲得(參考 WO03/097839)。
此外，優(yōu)選能夠存在經修飾從而不受到L-蘇氨酸反饋抑制的蘇氨酸操縱
子的多拷貝?；蛘撸瑢⑺霾倏v子連接至強啟動子從而增加表達。能夠通過 使用質粒將其擴增和/或使用轉座子、Mu噬菌體等將其轉移至染色體上來增
加L-蘇氨酸操縱子的拷貝數(US5,175，107)。
此外，經修飾而不受到L-賴氨S交反饋抑制的天冬氨酸激酶III基因(/^C) 是優(yōu)選使用的。這種/，C基因能夠通過美國專利號5,932,453中所述的方法獲得。
除了 L-蘇氨酸生物合成酶之外，還優(yōu)選增強以下基因的表達涉及糖酵 解途徑、TCA循環(huán)或呼吸鏈的基因，調節(jié)基因表達的基因，和糖攝取基因。 對L-蘇氨酸產生具有作用的基因實例包括轉氫酶(^2"S)基因(歐洲專利號 7B712)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因0 epC)(國際專利公開WO95/06114、 US2005-0136518)、磷酸烯醇丙酮酸合酶基因(p戸)(歐洲專利號877090)和棒狀 桿菌型細菌或芽孢桿菌屬(Sa"7/w"細菌的丙酮酸羧化酶基因(國際專利公開 W099/18228;歐洲專利
發(fā)明者加藤直人, 城永佑志, 小山直人, 辻雄一郎 申請人:味之素株式會社