專利名稱：：多種系干細(xì)胞的分離的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及細(xì)胞分離領(lǐng)域。本發(fā)明還涉及分離各種類型的干細(xì)月包或一且細(xì)月包的方法。
背景技術(shù)：
：已知骨髓含有造血干細(xì)月包和間充質(zhì)干細(xì)月包以及一且細(xì)月包。造血干纟田胞(HSC)可產(chǎn)生各種類型的血液細(xì)胞[l]，而髓間質(zhì)細(xì)月包(MSC)或間充質(zhì)干細(xì)胞能夠分化成若千不同組織，包括軟骨、骨和脂肪[2,3，4]。MSC首先由Friedenstein和他的同事[5]基于它們對(duì)細(xì)月包培養(yǎng)皿的粘附性發(fā)現(xiàn)的。未分化的MSC在形態(tài)上是成纖維細(xì)力包狀，自我更新，并且能夠分化成主要為中胚層起源的結(jié)締組織，即庫(kù)欠骨、骨、和脂肪。還沒(méi)有確定的特異且唯一識(shí)別MSC的細(xì)胞表面蛋白。MSC相關(guān)的特性的多樣性可通過(guò)組織起源、分離方法和實(shí)-瞼室之間的培養(yǎng)條件的差異進(jìn)行解釋[2,6,7，8]。盡管缺乏一致性，但是體內(nèi)擴(kuò)展的MSC表達(dá)CD29、CD44、CD73、CD105、CD106和CD166[9],Y旦缺少造血表面標(biāo)記物如CDllb、CD14、CD31、CD34或CD45或者對(duì)于這些標(biāo)記物是微弱陽(yáng)性的。具有類似于來(lái)自不同源(主要包括骨髓、臍帶血和脂肪組織)MSC的特性的細(xì)胞種群是已知的。盡管由于缺少特性標(biāo)記物而很難鑒別這些細(xì)胞是否屬于不同細(xì)胞類型，但是它們具有一些不同水平的表面標(biāo)記物表達(dá)和各種分化能力，這可能是由于它們的不同分離和培養(yǎng)方法。MSC的分化的可能范圍是不^f義擴(kuò)展至中胚層種系而且擴(kuò)展至內(nèi)胚層和/或外胚層種系。因此，術(shù)i吾"多種系千細(xì)月包或S且細(xì)胞(MLS/PC)"是指這些類型的干細(xì)胞或祖細(xì)胞，其能夠分化為中胚層、外胚層和/或內(nèi)胚層種系。來(lái)源于成熟骨髓的MSC提供了打開(kāi)一個(gè)新的醫(yī)學(xué)策略的可能性，這是因?yàn)樗子诜蛛x和培養(yǎng)、它們的表現(xiàn)型在體外的穩(wěn)定性以及低的或沒(méi)有同種(異體)排斥。實(shí)際上，已經(jīng)積累了MSC在人類和動(dòng)物種的〗氐免疫原性的實(shí)—驗(yàn)i正才居[10]。目前，已經(jīng)在實(shí)施成熟自體同源或同種異體MSC的臨床應(yīng)用，用于治療各種疾病，并且已經(jīng)產(chǎn)生非常理想的結(jié)果[U]迄今，對(duì)于在培養(yǎng)基中分離和擴(kuò)展MSC已經(jīng)開(kāi)發(fā)了若干方法。這些方法是基于利用密度梯度離心[12]、FACs篩選[13，14]、特異細(xì)胞表面抗體[12,15,17,18]、對(duì)昆布氨酸涂覆板的選擇性粘附[19]、Hoechest染料排除和尺寸篩選培養(yǎng)[24]的。依據(jù)臨床應(yīng)用，這些方法潛在的缺點(diǎn)是培養(yǎng)細(xì)胞的異質(zhì)性(不均勻性)、污染的高危險(xiǎn)性、和/或生產(chǎn)的高成本。因此，對(duì)于臨床環(huán)境中應(yīng)用，需要一種新的方法，在較低污染可能性和成本條件下分離高度同源(均勻)細(xì)胞種群。本申請(qǐng)7>開(kāi)了一種新的分離方法，開(kāi)發(fā)用于生產(chǎn)臨床應(yīng)用中具有較低污染可能性和成本的高度同源MLSC種群。該方法不必需利用密度梯度離心、抗體選取、或FACS篩選，而是優(yōu)選主要使用未涂覆的、骨膠原或多熔素涂覆的培養(yǎng)皿和細(xì)分級(jí)細(xì)胞培養(yǎng)基中的自然重力，以根據(jù)它們的細(xì)胞密度來(lái)分離粘附性骨髓細(xì)胞。分離了來(lái)源于單細(xì)胞源集落的MLSC系的若干不同的高度同質(zhì)(均勻)種群并利用該方法乂人人類骨ft進(jìn)4亍擴(kuò)展。這些干細(xì)月包系是自我可更新的并且能夠分化成若干不同種系，如成軟骨種系、成骨(骨原)種系、成月旨肪種系、4申纟至原、寸生(neurogenic)種系和肝原寸生(hepatogenic)種系。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供成熟干細(xì)胞或祖細(xì)胞，其可用來(lái)治療疾病如移植物4元宿主病(graftversushostdisease)、骨關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕'l"生關(guān)節(jié)炎、成骨不全和其他疾病，以及》f復(fù)組織如皮膚、軟骨、骨、月幾肉和神經(jīng)。本發(fā)明涉及一種處理細(xì)胞的生物學(xué)樣品的方法，包括(i)使細(xì)胞樣品沉積在一個(gè)容器中；(ii)將上清液,人該容器轉(zhuǎn)移到另一個(gè)容器；以及(iii)從該上清液分離細(xì)胞，其在所述樣品中具有相對(duì)較低的密度。細(xì)胞的樣品可以與生長(zhǎng)介質(zhì)混合。此外，在上述方法中，步驟(i)和(ii)實(shí)施至少三次，并且從來(lái)自上清液的分離細(xì)胞可以在容器中擴(kuò)展。容器可以具有平底，并且可以涂覆有細(xì)胞粘附劑。細(xì)胞粘附劑可以是帶正電荷或負(fù)電荷的分子。優(yōu)選地，該細(xì)胞粘附劑可以是骨月交原、多熔素(聚賴氨酸，polylysine)、或其他帶電荷的氨基酸，如聚精氨酸(polyarginine)、聚天冬氨酸酯(鹽)(polyaspartate)、聚谷氨f復(fù)酯(鹽)(polyglutamate)或者它們的組合。細(xì)胞的樣品可以從骨髓、外周血、臍帶血、脂肪組織樣品、或細(xì)胞因子活化的外周血獲得，并且可以分離出多種系干細(xì)胞或祖細(xì)月包的單個(gè)集落。在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及分離多細(xì)月包種系干細(xì)月包。該細(xì)月包可以是祖細(xì)月包。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述分離方法可以不包括細(xì)胞樣品的離心步驟。在另一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞的生物學(xué)樣品可以在進(jìn)^f亍任何離心之前獲得。而在另一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)月包的生物學(xué)才羊品可以在進(jìn)行離心之后獲得，優(yōu)選通過(guò)通常用于MSC分離的傳統(tǒng)密度梯度離心方法分離或分《及的單核細(xì)月包。在另一方面，本發(fā)明涉及一種制備內(nèi)胚層、中胚層或外胚層細(xì)胞種系的方法，其中通過(guò)使適當(dāng)誘導(dǎo)或轉(zhuǎn)化/分化介質(zhì)與利用如本文描述的制備方法獲得的分離多種系干細(xì)胞進(jìn)行4妻觸。才艮據(jù)本發(fā)明的以下描述、所附的參考附圖以及4又利要求書(shū)，本發(fā)明這些和其他目的將更充分地被理解。根據(jù)下文給出的詳細(xì)描述和附圖將更充分地理解本發(fā)明，附圖4義以舉例i兌明的方式給出，因此不是對(duì)本發(fā)明的限制，并且其中圖1示出了利用細(xì)分級(jí)培養(yǎng)方法(亞組分培養(yǎng)方法，subfractionculturingmethod)用于從人類骨髓分離多種系千細(xì)胞的總體流程圖。簡(jiǎn)言之，將1ml的人類骨髓與15ml的DMEM-HG、DMEM-LG、或a-MEM(20%FBS)混合并鋪在10cm2細(xì)月包;咅養(yǎng)皿上。在2小時(shí)孵育之后，〗又將上清液轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)亞。再重復(fù)一次。然后將上清液轉(zhuǎn)移到未涂覆的、骨月交原或多熔素涂覆的培養(yǎng)皿。乂人這個(gè)階—?dú)W開(kāi)始，爿夸細(xì)力包孵育l天兩次和2天一次。孵育最^^的上清液直至出現(xiàn)單個(gè)細(xì)月包集落。當(dāng)單個(gè)細(xì)胞集落大到足以轉(zhuǎn)移到6孔一反時(shí)，將細(xì)胞擴(kuò)展至更大玲反以用于進(jìn)一步研究。圖2A-2D示出了,人骨髓分離的多種系干細(xì)胞的形態(tài)特性。(A&B)在骨髓細(xì)胞最后細(xì)分級(jí)之后三天的MLSC。細(xì)胞具有成纖維細(xì)胞狀的形態(tài)。放大(A)40X和(B)200X。(C)在第7天具有稠密和均勻形態(tài)的達(dá)到鋪滿的細(xì)胞。在分離的MLSC的六次傳代之后，相比于處于較早傳代的MLSC,小部分(少于2~3%)的MLSC的形態(tài)變成更寬和更大的形狀。分離和擴(kuò)展MLSC的形態(tài)是紡4垂形^!犬，類似于已知的髓間質(zhì)干細(xì)月包。圖3A-3D示出了四種已建立的來(lái)自骨髓的多種系干細(xì)胞系的形態(tài)。稱為A.D4(#l)、B.D4(#3)、C.D5(#1)和D.D5(#2)的四種已建立的多種系干細(xì)胞系(生長(zhǎng)至約70~80%匯合)的照片。已建立的多種系干細(xì)胞系的形態(tài)是紡錘形并且這些干細(xì)胞生長(zhǎng)如其他成纖維細(xì)爿包一才羊快。圖4示出了通過(guò)細(xì)分級(jí)i咅養(yǎng)方法來(lái)自骨髓的分離MLSC的纟田月包表面蛋白。流式細(xì)胞儀分析表明，MLSC對(duì)于典型MSC整聯(lián)蛋白(CD29)和基質(zhì)受體(CD44和CD105)—貫是陽(yáng)性。HMSC8292(CambrexBioScience,Walkersville,MD,USA)細(xì)月包用作對(duì)照。已知典型MSC表達(dá)的細(xì)胞表面蛋白也在MLSC中被表達(dá)，表明MLSC可能具有MSC特性。圖5示出了在通過(guò)細(xì)分級(jí)培養(yǎng)方法乂人骨髓分離的MLSC上沒(méi)有觀察到造血干細(xì)胞表面蛋白。流式細(xì)胞儀分析表明，MLSC對(duì)于用于早期造血干細(xì)胞的HLA-DR和CD34標(biāo)記蛋白是陰性的。HMSC8292(CambrexBioScience,Walkersville,MD,USA)細(xì)月包用作對(duì)照。這些結(jié)果表明，分離的MLSC不具有造血干細(xì)胞表現(xiàn)型。圖6示出了在通過(guò)細(xì)分級(jí)培養(yǎng)方法從骨髓分離的MLSC系上觀察到的細(xì)胞表面蛋白CD31(PECAM)表達(dá)的比較。D4(#1)、D4(#3)、D5(#2)和D5(#2)(具有FGF)的CD31的表達(dá)通過(guò)FACS分析進(jìn)4亍才企觀'J。已建立的MLSC系D4(弁3)對(duì)于CD31是樣l弱陽(yáng)性，而其他MLSC系是陰性的。生長(zhǎng)介質(zhì)中的FGF增加D5(#2)的CDM的表達(dá)。這些結(jié)果表明，D4(#3)在分化能力和/或細(xì)胞功能上具有不同的細(xì)月包4爭(zhēng)性。圖7示出了在通過(guò)細(xì)分級(jí)培養(yǎng)方法/人骨髓分離的MLSC系上觀察到的細(xì)月包表面蛋白CD105(SH2)表達(dá)的比專交。D4(弁l)、D4(弁3)、D5(#2)禾口D5(#2)(具有FGF)的CD105的表達(dá)通過(guò)FACS分斗斤進(jìn)行檢觀'J。已建立的MLSC系D5(#1)表現(xiàn)出中等水平的CD105表達(dá)，而其j也干細(xì)月包系表iE見(jiàn)出高水平的CD105。這些結(jié)果表明，D5(#1)在分化能力和/或細(xì)胞功能上具有不同的細(xì)胞特性。圖8示出了在通過(guò)細(xì)分級(jí)培養(yǎng)方法乂人骨髓分離的MLSC系上XC察到的纟田月包表面蛋白CD73(SH3,SH4)表達(dá)的比專交。D4(弁l)、D4(#3)、D5(#2)禾口D5(#2)(具有FGF)的CD73的表達(dá)通過(guò)FACS分析進(jìn)行4全測(cè)。已建立的MLSC系D4(弁1)表現(xiàn)出非常低水平的CD73表達(dá)，并且D4(弁3)和D5(弁2)表現(xiàn)出中等水平，而D5(弁1)一點(diǎn)也不表達(dá)。這些結(jié)果表明，每一個(gè)千細(xì)胞系在分化能力和/或細(xì)胞功能上具有獨(dú)特的細(xì)"包特性。圖9示出了在通過(guò)細(xì)分級(jí)培養(yǎng)方法從骨髓分離的MLSC系上觀察到的細(xì)月包表面蛋白CD34表達(dá)的比專交。D4(#l)、D4(#3)、D5(#2)和D5(#2)(具有FGF)的CD34的表達(dá)通過(guò)FACS分析進(jìn)行檢測(cè)。已建立的MLSC系D4(#1)、D4(弁3)和D5(弁2)表現(xiàn)出低水平的CD34表達(dá)，而D5(#1)表現(xiàn)出沒(méi)有CD34表達(dá)。這些結(jié)果表明，每一個(gè)千細(xì)胞系在分化能力和/或細(xì)胞功能上具有獨(dú)特的細(xì)胞特性。圖10A-10D示出了分離MLSC的成軟骨分化。利用甲苯胺藍(lán)(Toluidine-blue)的組織化學(xué)染色表明，成壽欠骨分化的MLSC對(duì)于該染色是高度陽(yáng)性的(在成軟骨i秀導(dǎo)后21天進(jìn)4亍測(cè)試)。(A&B)在常身見(jiàn)介質(zhì)(常*見(jiàn)血清《且，regularmedium)中生長(zhǎng)的細(xì)月包團(tuán)塊。(C&D)在成軟骨誘導(dǎo)介質(zhì)中生長(zhǎng)的細(xì)胞團(tuán)塊。結(jié)果表明，在成軟骨誘導(dǎo)介質(zhì)中生長(zhǎng)的MLSC分泌高水平的蛋白聚糖(proteoglycans)并且可^皮分化成專欠骨細(xì)胞。圖11A-11D示出了分離MLSC的成骨分化。在成骨i秀導(dǎo)后21天，利用馮.科薩染劑(vonKossastain)的組織化學(xué)染色顯示出存在與成骨分化的MLSC中基質(zhì)有關(guān)的礦物。(A&B)在常規(guī)介質(zhì)中生長(zhǎng)的細(xì)胞團(tuán)塊。(C&D)在成骨誘導(dǎo)介質(zhì)中生長(zhǎng)的細(xì)胞團(tuán)塊。結(jié)果表明，在成骨誘導(dǎo)介質(zhì)中生長(zhǎng)的MLSC可生成高水平的鈣并且可凈皮分4b成骨細(xì)月包。圖12A-12D示出了分離MLSC的成脂肪分化。利用油紅-O(Oilred-O)的組織化學(xué)染色表明，成脂肪分化的MLSC對(duì)于該染色是高度陽(yáng)性的(在成脂肪誘導(dǎo)后21天進(jìn)行測(cè)試)。(A&B)在常規(guī)介質(zhì)中生長(zhǎng)的細(xì)胞團(tuán)塊。(C&D)在成脂肪誘導(dǎo)介質(zhì)中生長(zhǎng)的細(xì)胞團(tuán)塊。結(jié)果表明在成脂肪"i秀導(dǎo)介質(zhì)中生長(zhǎng)的MLSC可產(chǎn)生中性脂類液泡并且可一皮分化成脂肪纟田月包。圖13A-13I示出了分離MLSC的神經(jīng)原性分化。利用GFAP、Nestin(巢蛋白)、和NeuN抗體的免疫組織學(xué)染色表明，用FGF生長(zhǎng)的神經(jīng)原性分化的MLSC對(duì)于該染色是高度陽(yáng)性的(在神經(jīng)原性i秀導(dǎo)后7天和14天進(jìn)4亍測(cè)試)。(A，D&G)在標(biāo)準(zhǔn)i咅養(yǎng)基中生長(zhǎng)并用所述抗體孵育的MLSC。(B,E&H)在神經(jīng)原性-漆導(dǎo)后7天用每一種抗體染色的細(xì)胞。(C,F&I)在神經(jīng)原性誘導(dǎo)后14天用每一種抗體染色的細(xì)胞。結(jié)果表明，在神經(jīng)原性誘導(dǎo)介質(zhì)中生長(zhǎng)的MLSC可分別合成神經(jīng)月交質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白、月交質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、早期和晚期神經(jīng)細(xì)月包標(biāo)i己蛋白、Nestin和NeuN，并且可^皮分化成一申經(jīng)細(xì)月包。圖14A-14I示出了用FGF生長(zhǎng)的分離MLSC的神經(jīng)原性分化。利用GFAP、Nestin、和NeuN抗體的免疫組織學(xué)染色表明，用FGF生長(zhǎng)的神經(jīng)原性分化的MLSC對(duì)于該染色是高度陽(yáng)性的(在神經(jīng)原性-秀導(dǎo)后7天和14天進(jìn)4亍測(cè)試)。(A,D&G)在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)并用所述抗體孵育的MLSC。(B,E&H)在3申經(jīng)原性:秀導(dǎo)后7天用每一種抗體染色的細(xì)胞。(C,F&I)在神經(jīng)原性諸導(dǎo)后14天用每一種抗體染色的細(xì)胞。結(jié)果表明，在具有FGF的神經(jīng)原性誘導(dǎo)介質(zhì)中生長(zhǎng)的MLSC可分別合成神經(jīng)力交質(zhì)細(xì)月包特異性蛋白、月交質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、早期和晚期神經(jīng)細(xì)月包標(biāo)記蛋白、Nestin和NeuN,并且可一皮分化成神經(jīng)細(xì)月包。圖15A-15D示出了在肝原性-秀導(dǎo)介質(zhì)中生長(zhǎng)的分離MLSC的形態(tài)變化。在肝原性誘導(dǎo)介質(zhì)中生長(zhǎng)后14天觀察形態(tài)變化。(A)在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的MLSC的形態(tài)。(B，C&D)在肝原性誘導(dǎo)介質(zhì)中生長(zhǎng)14天的MLSC的肝臟形態(tài)變化。結(jié)果表明，在肝原性i秀導(dǎo)介質(zhì)中生長(zhǎng)的MLSC可分化成肝細(xì)胞。圖16A-16F示出了通過(guò)RT-PCR分析觀察到的軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肝細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞特異性基因表達(dá)?？俁NA通過(guò)RT-PCR分析(A)II型骨膠原(成軟骨的，500bp)、(B)骨橋蛋白(成骨的，330bp)、(C)過(guò)氧化物酶體增殖子活化的受體(PPAR^2)(成脂肪的，352bp)、(D)神經(jīng)絲分子(NF-M)(神經(jīng)原性的，430bp)以及(E)曱胎蛋白(aFP)(肝原性的，216bp)的表達(dá)。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的表達(dá)用作內(nèi)部對(duì)照。M:DNA分子大小標(biāo)記物；N:未i秀導(dǎo)的；C:成4欠骨的；O:成骨的；A:成脂肪的；Ne:神經(jīng)原性的；以及H:肝原性的。這些結(jié)果有力地表明，分離的MLSC可在每一種特定分化條件下表達(dá)細(xì)胞特異性基因并且可被分化成多種系。圖17示出了分離MLSC系的細(xì)月包因子分泌。利用Q廳tikine⑧H膽anTGF-(31、b-NGF、LIF、ILIO、HGF、IL2、TGF-a、和IL12，對(duì)MLSC培養(yǎng)物上清液的等分樣品通過(guò)ELISA進(jìn)行分析。TGF-(31、LIF、TGF-a和IL10表現(xiàn)出高水平的分泌，而其他表現(xiàn)出低的或沒(méi)有分泌。通過(guò)分離MLSC的高水平TGF-pi分泌表明，這些干細(xì)胞可在抑制T細(xì)胞活化中起作用。而且，相對(duì)高7jc平的其他細(xì)月包因子如LIF、TGF-a和ILIO表明這些細(xì)刀包可以具有免疫調(diào)節(jié)活性。具體實(shí)施例方式在本申"i青中，"一個(gè)"和"一種"用來(lái)指單個(gè)和多個(gè)目標(biāo)。如本文使用的，"體樣(身體樣品，bodilysample)"是指獲自哺乳動(dòng)物的期望用來(lái)分離單個(gè)細(xì)胞型的任何樣品。這樣的體樣包括骨髓樣品、外周血、臍帶血、脂肪組織樣品、和細(xì)胞因子活化的外周血。如本文使用的，"細(xì)胞的樣品(細(xì)月包樣品)"是指任4可沖羊品，其中包含不同類型細(xì)胞的混合物，包括骨髓樣品、外周血、臍帶血、脂肪組織樣品、和細(xì)胞因子活化的外周血。如本文使用的，細(xì)胞的"同源(均勻)"種群通常表明，相同類型的細(xì)胞存在于該種群中?；旧贤吹目梢员硎炯s80%同源，或約85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5。/。、99.6%、99.7%、99.8%、或99.9%同源。如本文使用的，"低密度細(xì)胞"是指具有比樣品中的其他細(xì)胞更低的密度并且是分離目標(biāo)的細(xì)胞。低密度細(xì)胞包括但不限于多種系干細(xì)月包、-且纟田月包、其他髓間質(zhì)細(xì)月包。如本文使用的，"MLSC"是指多種系干細(xì)胞。如本文使用的，"MLSC/PC"是指多種系干細(xì)胞或祖細(xì)胞。如本文使用的，"MSC"是指髓間質(zhì)細(xì)胞或間充質(zhì)干細(xì)胞(這些術(shù)語(yǔ)可互換4吏用)。細(xì)分級(jí)技術(shù)(subfractionationtechnique)本申請(qǐng)描述了一種新的方法，即細(xì)分級(jí)培養(yǎng)方法，用于乂人體樣或來(lái)源于如人類骨髓分離高度同源的多種系干細(xì)胞(MLSC)種群。從1ml的骨髓抽吸物建立了共16個(gè)骨髓細(xì)胞系。在這16個(gè)樣品中，對(duì)通過(guò)FACS分析表現(xiàn)出不同表現(xiàn)型的4個(gè)細(xì)胞系進(jìn)一步表征。所有這些細(xì)胞系表現(xiàn)出多種系干細(xì)胞的特性，如自我更新能力和分化成中胚層、外胚層和內(nèi)胚、層種系細(xì)月包的能力。已經(jīng)知道，骨髓MSC很難在沒(méi)有污染的情況下通過(guò)造血細(xì)胞進(jìn)行分離[20,21]。對(duì)于臨床環(huán)境中的應(yīng)用，為了防止免疫原性問(wèn)題并且為了正確地評(píng)價(jià)臨床效果，具有同源的MSC種群很重要。傳統(tǒng)地，MSC的同源種群的分離是通過(guò)MSC特異性抗體柱純化來(lái)實(shí)現(xiàn)的。然而，即4吏這種方法也是不足夠的，因?yàn)檫€沒(méi)有這樣完好的MSC特異性抗體是可利用的。用于乂人生物學(xué)樣品如骨髓樣品分離MLSC的本發(fā)明方法的原理是這樣的，多種系干細(xì)胞或祖細(xì)胞具有低細(xì)胞密度，因此它們可以以此為基礎(chǔ)A^樣品的其他細(xì)胞中分離出來(lái)。例如，成熟MSC比快速自我更新(RS)細(xì)胞更大[22，23]。已知RS細(xì)胞具有更大的對(duì)于多種系分化的能力。在另一方面，使用骨膠原或多熔素涂覆的培養(yǎng)亞，以便獲得更多粘附性千細(xì)胞。申請(qǐng)人已發(fā)現(xiàn)，相比于未涂覆培養(yǎng)i的表面，任何帶電荷的培養(yǎng)物表面(正或負(fù))有助于千細(xì)月包附著至其。相比于未涂覆培養(yǎng)皿，更多細(xì)胞附著至骨膠原或多熔素涂覆的培養(yǎng)皿，分別大致為約2-3倍(數(shù)據(jù)未示出)。依據(jù)獲得單細(xì)胞來(lái)源的髓細(xì)胞集落，利用其他人類骨髓抽吸物和三種不同的小鼠骨髓樣品抹獲得相似結(jié)果(凄t據(jù)未示出)，表明這種方法與其他骨髓抽吸物是一致的，并且也可用來(lái)分離在其他物種中的MLSC。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，培養(yǎng)皿的底部可以涂覆正電荷的氨基酸如多熔素、聚精氨酸、或負(fù)電荷的氨基酸如聚天冬氨酸酯(鹽)、粘附至培養(yǎng)皿的底部。為了實(shí)施本發(fā)明的細(xì)分級(jí)培養(yǎng)方法，不必需采用^壬Y可類型的離心以從樣品中預(yù)除去任何類型的細(xì)胞如紅細(xì)胞或白細(xì)胞，因?yàn)榇蠖嗥鄑更重或更密實(shí)的細(xì)月包可第一、二的2小時(shí)孵育步吞聚中除去。因此，本發(fā)明體系的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于，可以避免傳統(tǒng)1吏用的梯度離心和單核纟田月包分纟及步備聚(其可^^夸〉'虧染對(duì)勿^口Picoll、Fiscoll或Ficoll陽(yáng)Hypaque引入細(xì)胞培養(yǎng)物中。因此，本發(fā)明的細(xì)分級(jí)培養(yǎng)方法是一種簡(jiǎn)單、有效和經(jīng)濟(jì)的方案，用于,人體樣(優(yōu)選為骨髓樣品)分離高度同源MLSC?？商鎿Q地，通過(guò)傳統(tǒng)的MSC分離的密度梯度離心方法分離/分級(jí)的單核細(xì)胞也可》支入Dl培養(yǎng)皿中以獲得單細(xì)月包源集落，然后分離千細(xì)胞或祖細(xì)胞的同源種群。因此，分級(jí)培養(yǎng)方法可利用通過(guò)傳統(tǒng)密度梯度離心分級(jí)的單核細(xì)胞來(lái)加以應(yīng)用。本申請(qǐng)描述了在分離單細(xì)胞源干細(xì)胞系的細(xì)胞表面蛋白表達(dá)中的特性的多樣性，其表明在生物學(xué)樣品(尤其是骨髓樣品)中存在若干不同類型的多種系干細(xì)胞或祖細(xì)胞(都是示例性的)。分離的MLSC對(duì)于CD34、HLA-DR、CD73、CD31、CD166、HLAI類通常是陰性的或才莫糊陽(yáng)性的，而對(duì)于CD44、CD29、CD105是高度陽(yáng)性的。然而，來(lái)自D4和D5培養(yǎng)皿的一些細(xì)胞系表現(xiàn)出不同水平的表面蛋白，這表明在骨髓中可存在若干不同類型的多種系千細(xì)胞或祖細(xì)胞。Hung等人還推測(cè)，骨髓可能包括多族的MSC，其在表面標(biāo)記物分析中不相同[24]。具有不同表面標(biāo)記物的這些MSC可以代表不同的細(xì)胞分化潛力。因此，通過(guò)本發(fā)明的細(xì)分級(jí)培養(yǎng)方法分離單細(xì)胞源同源干細(xì)胞^f吏得有可能分離組織特異干細(xì)胞或定型祖細(xì)胞，只要這些族的細(xì)胞存在于骨髓或其他特異性分離的體樣中，并且培養(yǎng)條件在細(xì)胞表達(dá)期間不改變它們的潛力。MSC處理和細(xì)胞移才直過(guò)程的安全性和效力通過(guò)能夠用特異性質(zhì)來(lái)表征細(xì)胞的亞種群而4尋以改進(jìn)，如在本申i青中i正實(shí)的。本申"i青示出了一種新穎方法，用來(lái)從具有更新和多種系分化成外胚層、中胚層和內(nèi)胚層種系細(xì)胞的能力的任何其他體樣(尤其是骨髓樣品)的來(lái)源于單細(xì)胞MLSC系的高度同源種群。通過(guò)消除密度梯度離心和單核細(xì)胞分級(jí)步驟以及無(wú)需使用抗體來(lái)分離干細(xì)胞，本發(fā)明的細(xì)分鄉(xiāng)及i咅養(yǎng)方法以簡(jiǎn)單、有步丈和經(jīng)濟(jì)的過(guò)禾呈產(chǎn)生更多的MLSC的同源種群以及對(duì)于治療情形更安全的應(yīng)用。用于內(nèi)胚層細(xì)胞種系的豫導(dǎo)、分化/轉(zhuǎn)4匕劑用于內(nèi)胚層細(xì)胞種系的誘導(dǎo)、分化/轉(zhuǎn)化劑包括以下試劑千細(xì)月包生長(zhǎng)因子、制瘤素-M(oncostatin-M)、表皮生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-4、^5咸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin)、石西酉臾(seleniusacid)、BSA、亞油酉交、4元i不血酉吏2-磷酸酉旨(鹽)(ascorbate2-phosphate)、VEGF和地塞米松(dexamethasone),用于以下細(xì)月包型肝纟田月包、月t纟田月包、月夷&泉細(xì)月包、甲狀腺細(xì)胞和腸細(xì)胞。用于中胚層細(xì)自系的"i秀導(dǎo)、分化/轉(zhuǎn)化劑用于中胚層細(xì)胞種系的誘導(dǎo)、分化/轉(zhuǎn)化劑包括以下試劑胰島素、轉(zhuǎn)今失蛋白、硒酸、BSA、亞油酸、TGF-pi、TGF-(33、抗壞血酸2-磷酸酯(鹽)、地塞米松、P-甘油磷酸酯、抗壞血酸2-磷酸酯(鹽)、BMP。以及茚甲新(indomethacine),用于以下細(xì)月包型專欠骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、月旨肪纟田胞、肌肉細(xì)胞和血細(xì)胞。用于內(nèi)胚層細(xì)胞種系的+秀導(dǎo)、另S匕/轉(zhuǎn)化劑用于內(nèi)胚層細(xì)胞種系的誘導(dǎo)、分化/轉(zhuǎn)化劑包括以下試劑聯(lián)丁酰基細(xì)胞周期蛋白AMP、異丁基曱基黃噤呤、人類表皮生長(zhǎng)因子、石威性成纖維細(xì)月包生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)月包生長(zhǎng)因子-8、腦來(lái)源的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、和/或其他神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)因子，用于以下細(xì)胞型神經(jīng)細(xì)胞、皮月夫細(xì)胞、月鹵纟田月包、和眼細(xì)月包。本發(fā)明不局限于通過(guò)本文描述的特定實(shí)施方式的范圍。事實(shí)上，除了本文描述的那些實(shí)施方式之外，對(duì)于本領(lǐng)i或的寺支術(shù)人員來(lái)說(shuō)，才艮據(jù)前述和附圖，本發(fā)明的各種變形將變得顯而易見(jiàn)。這樣的變形落入所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。以下實(shí)施例通過(guò)舉例J兌明本發(fā)明的方式提供，不用于限制本發(fā)明。實(shí)施例實(shí)施例1-MLSC和細(xì)胞培養(yǎng)物的分離在Inha大學(xué)醫(yī)學(xué)院IRB的知會(huì)同意和批準(zhǔn)之后，將取自經(jīng)歷骨髓才全查的患者的髏峰(iliaccrest)的1ml丟棄的人骨髓抽吸物與15ml的完全生長(zhǎng)介質(zhì)進(jìn)行混合物，該完全生長(zhǎng)介質(zhì)為含有高或寸氐葡萄辟唐(GIBCOBRL，life-technologies,MDUSA)的Dulbecco改性的Eagle培養(yǎng)基(DMEM),具有20%胎牛血清(FBS)和1%青霉素/鏈霉素，然后在100mm培養(yǎng)皿中孵育。如圖1所示，在37。C、5。/。C02孵育2小時(shí)后，僅將細(xì)胞培養(yǎng)物上清液轉(zhuǎn)移到未涂覆的、骨月交原或多熔素涂覆的培養(yǎng)亞并孵育2小時(shí)(Dl)。在將該上清液再次轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)亞之后(D2)，將上清液轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)皿，然后孵育1天(D3)。用1天和2天孵育(分別為D4和D5)重復(fù)兩次或更多次。將在D4或D5培養(yǎng)i中生長(zhǎng)的單個(gè)集落首先轉(zhuǎn)移到100mm板，然后在更大培養(yǎng)瓶中保持?jǐn)U展。在100mm板中通常10~14天之后，用0.25%月夷蛋白酶和1mMEDTA(GIBCO-BRL)收獲細(xì)胞，以lxl()6個(gè)細(xì)胞/ml懸浮在10%二曱基亞石風(fēng)(DMSO)和40。/。FBS中，并在液氮中冷凍1ml等分樣品(第1代)。對(duì)于單個(gè)集落的分開(kāi)和分離，利用無(wú)菌注射器使用胰蛋白酶/EDTA達(dá)1-2分4中。一旦細(xì)月包達(dá)到約80~90%4甫滿(confluence),則、夸它們利用月夷蛋白酶/EDTA回收并以50-100個(gè)細(xì)月包/cm2重新鋪》丈(r印late)。實(shí)施例2-流式細(xì)月包〗義分析從單細(xì)胞源集落分離和擴(kuò)展的細(xì)胞通過(guò)流式細(xì)胞儀分析對(duì)一板細(xì)胞表面蛋白在第3代或第4代進(jìn)行表征。通過(guò)胰蛋白酶/EDTA處理從75cm燒瓶收獲細(xì)胞并用PBS洗滌兩次。將細(xì)胞在具有0.1%羊血清的PBS孵育用于封閉，然后用洗滌纟爰沖'液(具有0.4%BSA的PBS)洗滌兩次。在4。C下，用異石克氰酸熒光素(FITC)或藻紅蛋白(PE)-結(jié)合的#元體孵育該細(xì)月包40min。觀'Ji式的4兀y^、包4舌基質(zhì)受體(CD13，CD14,CD105)、整聯(lián)蛋白(CD29)、PECAM(CD31)、ALCAM(CD166)、SH3和SH4(CD73)、Thy-l(CD90)和造血種系標(biāo)記物(CD34,HLA-DR，HLA-1類)(BDBiosciencePharmingen，SanDiego,CA,USA)。然后將細(xì)胞混合物用洗滌緩沖液洗滌兩次，并利用熒光活化的細(xì)胞分選儀(FACS)(具有用于綠色FITC熒光的525nm過(guò)濾器并具有用于紅色PE熒光的575nm過(guò)濾器)進(jìn)行分析。作為對(duì)照，使用人類的間充質(zhì)干細(xì)胞(HMSC8292,CambrexBioScience,Walkersville,MDUSA)。實(shí)施例3_多種系分化的誘導(dǎo)利用第3代或第4代細(xì)胞，將團(tuán)塊培養(yǎng)物分析用于成軟骨、成骨、成脂肪的分化實(shí)驗(yàn)。將在0.5ml培養(yǎng)基中的2xl()S個(gè)細(xì)胞旋降以形成團(tuán)塊。將在含有高葡萄糖和20%FBS的DMEM中以下上清液用于每一個(gè)種系，成軟骨分化介質(zhì)6.25嗎/ml胰島素(SigmaChemicalCo,StLouis,MO，USA)、轉(zhuǎn)《失蛋白(Sigma)、6.25ng/ml竭酸(Sigma)/1.25mg/mlBSA(Sigma)、5.35昭/ml亞油酸(Sigma)、TGF-pl10ng/ml(R&DSystems,Minneapolis,顧，USA)和TGF-(3310ng/ml(R&DSystems,Minneapolis,MN，USA);成骨分化介質(zhì)50pg/ml抗壞血酸2-石壽酸酯(Sigma)、10-8m地塞米爭(zhēng)》(Sigma)、和10mM(3-甘油磷酸酯(Sigma);成脂肪分化介質(zhì)抗壞血酸2-磷酸酯(Sigma)、lO-8M地塞米松(Sigma)和50嗎/ml茚曱新(Sigma)。團(tuán)塊培養(yǎng)物在37。C、5%C02下進(jìn)行孵育并每3天更換介質(zhì)。對(duì)于神經(jīng)原性分化，在第3代的分離和擴(kuò)展細(xì)胞利用基礎(chǔ)介質(zhì)以1><104個(gè)細(xì)胞的濃度接種到6孔培養(yǎng)板中。在24小時(shí)之后，拋棄基礎(chǔ)介質(zhì)并用神經(jīng)元分化介質(zhì)替換。細(xì)胞用lmM聯(lián)丁酰基細(xì)胞周期蛋白AMP(dbcAMP;Sigma,St.Louis,MO)、0.5mM異丁基甲基黃噤吟(IBMC;Sigma,St.Louis,MO)、20ng/ml人類表皮生長(zhǎng)因子(hEGF;Sigma,St.Louis,MO)、40ng/ml石成性成纖維細(xì)月包生長(zhǎng)因子(bFGF;Sigma,St.Louis，MO)、10ng/ml成纖維細(xì)月包生長(zhǎng)因子-8(FGF-8;PEPROTECHINC，RockyHill,NJ)、10ng/ml腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF;R&DSystems,Minneapolis,MN)進(jìn)4亍i咅養(yǎng)。具有l(wèi)xB27上清液(GIBCOBRL,Gaithersburg，MD)的NEUROBASAL介質(zhì)(GIBCOBRL，Gaithersburg，MD)是用于中4區(qū)一申經(jīng)系統(tǒng)的海馬和其他神經(jīng)元的長(zhǎng)期存活性的無(wú)血清基礎(chǔ)介質(zhì)。對(duì)于干細(xì)胞分化，在第4代的分離和擴(kuò)展細(xì)胞以濃度1"04個(gè)纟田月包鋪入(4妻種于)60mm培養(yǎng)皿中。在24小時(shí)之后，細(xì)月包用分化介質(zhì)處理，該分化介質(zhì)含有20mg/ml干細(xì)胞生長(zhǎng)因子(R&D)、10ng/ml制瘤素-M(R&D)、10ng/ml表皮生長(zhǎng)因子(Sigma)、20ng/ml成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-4(R&D)、10ng/ml石咸性表皮生長(zhǎng)因子(Sigma)、50mg/mlITS+預(yù)混物(BectonDickinson;6.25嗎/ml胰島素、6.25嗎/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白、6.25ng/ml石西酸、1.25mg/mlBSA、5.35mg/ml亞油酸)、0.1(iM抗壞血酸2-石粦酸S旨(Sigma)、1(T8M地塞米松(Sigma)。每3天更換介質(zhì)。實(shí)施例4-組織化學(xué)染色和免疫組織化學(xué)染色組織化學(xué)染色和免疫組織化學(xué)研究在開(kāi)始分化培養(yǎng)之后14天或21天進(jìn)行。在移出分化介質(zhì)之后，團(tuán)塊用PBS洗滌兩次。將團(tuán)i丸嵌入OCT4匕合物(SakuraFinetek,Torrance,CA,USA)并4奪6切片染色。組織用曱苯胺藍(lán)、馮.科薩染劑以及紅油-O染色，以分別顯示成軟骨分化、成骨分化和成脂肪分化。還對(duì)n型人類骨力交原實(shí)施免疫組織化學(xué)染色以i正實(shí)該組織的成專欠骨分化。為了神經(jīng)元細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)染色，接著將所有的孔都用99.9%乙醇固定并用小鼠抗-神經(jīng)元細(xì)月包核抗原(NeuN,10jag/ml)IgG單克隆抗體(Chemicon,Temecula，CA)、小鼠抗-巢蛋白(nestin)(5ng/ml)IgG單克隆抗體(Chemicon,Temecula,CA)和單克隆抗-月交質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP,1:400;Sigma,St.Louis,MO)在室溫下一示^己1小時(shí)。細(xì)月包用PBS漂洗，并利用Histostain-Plusi式劑盒(ZymedLaboratoriesInc.,SanFrancisco,CA)沖企觀'J免疫染色。DAB用作色原體(chromogen)。細(xì)胞用數(shù)碼相才幾拍照以評(píng)價(jià)神經(jīng)元特異性標(biāo)記物的陽(yáng)性表達(dá)。實(shí)施例5_RNA提取和RT-PCR分析利用TRIZOL(InvitrogenCo,Carlsbad,CA,USA)試劑，乂人未分化的和分化的細(xì)力包纟是取總RNA。利用反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)試劑盒(Promega)，互補(bǔ)DNA用總RNA(1ng)進(jìn)行合成。PCR利用設(shè)計(jì)用于以下每個(gè)種系的特異性引物來(lái)實(shí)施col-2(500bp)，正義(有義).5,一AAGATGGTCCCAA八GGTGCTCG-3'(SSI01-FSEQID緣l)和反義.5,—AGCTTCTCCTCTGTCTCC丁TGC-3'(SS10I-RSEQIDNO:2);骨才喬蛋白(330bp),正義.5'-C'TAGGCATCACCTGTG(:CATACC-3'(SS102-FStQIDNO:J)禾口反義.5'-CGTGACCAGTTCATCAGATTCATC-3畫(huà)(SS102陽(yáng)RSEQIDNO:4);PPAR-y2(352bp)正義'5'-GCTGTTATGGGTGAAACTCTG-3'(SS103—FSEQIDN():5)詳口反義.5,_ATAAGGTGGAGATGCAGGCTC-3'(SS103-RSEQIDN():6);GAPDH(350bp),正乂詳口反義.5，_TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'(SS104-RSF,QfDNO:8);NF-M(430bp)正義.5,GAGCGCAAAGACTACCTGAAGA-3'(SS105-FSEQIDNO:9)禾口反義.5,CAGCGAT'rrcTATATCCAGAGCC-3'(SS105-RSEQIDNO:10)-,以及aFP(216bp)正義-5:TCiCAGCCAAAGTGAAGAGGGAAGA-3'(SS()6-FSEQIDNO:l1)和反義，5、CATAGCGAGCAGCCCAAAGAAGAA-3'(SS106-RSEQIDNOd2)。PCR實(shí)施35個(gè)循環(huán)，其中每一個(gè)循環(huán)為在95。C變性1min,在56°C退火1min,以及在72。C伸長(zhǎng)1min。擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上運(yùn)行。實(shí)施例6-結(jié)果實(shí)施例6.1-骨髓細(xì)胞集落的分離和擴(kuò)展為了考察是否可能通過(guò)細(xì)分級(jí)培養(yǎng)方法分離人類骨髓干細(xì)胞或一且細(xì)月包，如圖l所描述的，將骨髓與i咅養(yǎng)介質(zhì)混合并通過(guò)〗又轉(zhuǎn)移細(xì)胞培養(yǎng)物上清液到新的培養(yǎng)皿而保持分級(jí)。這種分級(jí)的原理是基于如下假設(shè)骨髓干細(xì)胞或祖細(xì)胞可能具有低的細(xì)胞密度。通常在Dl和D2培養(yǎng)亞中不可能獲得良好分離的單個(gè)集落。在Dl和D2培養(yǎng)i中乂見(jiàn)察到存在至少少凄t幾種具有不同形態(tài)和尺寸的不同細(xì)胞型，表明在骨髓源粘附單層培養(yǎng)物中的細(xì)胞異源性。D1或D2培養(yǎng)皿中的粘附細(xì)胞分別在從前一培養(yǎng)jnr轉(zhuǎn)移上清液后7~14天或1421天達(dá)到鋪滿。有可能在D3、D4和D5培養(yǎng)皿中獲得良好分離的單細(xì)力包源集落。最初粘附性紡《垂形細(xì)l包在/人前一i咅養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移上清液后的14~21天之間呈現(xiàn)為單個(gè)集落。在D3、D4和D5培養(yǎng)皿中分別出現(xiàn)10個(gè)、3個(gè)和3個(gè)單細(xì)胞源集落。圖2示出了在骨髓細(xì)胞最終細(xì)分級(jí)后3天,人骨髓分離的多種系干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特性。細(xì)胞具有成纖維細(xì)胞狀形態(tài)。細(xì)胞在第7天達(dá)到具有稠密和同源(均勻)形態(tài)的鋪滿。在分離MLSC的六次傳代之后，相比于4交早傳代的細(xì)月包，少部分(少于2~3%)的MLSC的形態(tài)變?yōu)楦鼘捄透笮螤睢７蛛x和擴(kuò)展的MLSC的形態(tài)是紡名垂形，這類似于已知的髓間質(zhì)干細(xì)胞。一旦大約200~300個(gè)細(xì)胞的集落形成，則將細(xì)胞以如正常成纖維細(xì)胞的細(xì)胞一樣快速進(jìn)行增殖。在從D4和D5培養(yǎng)皿中的單個(gè)集落產(chǎn)生的6個(gè)細(xì)胞系之中，4個(gè)細(xì)胞系通過(guò)FACS分析表現(xiàn)出不同表現(xiàn)型并進(jìn)一步加以表征。在培養(yǎng)皿中處于70-80%鋪滿的這些細(xì)胞系示于圖3中。實(shí)施例6.2-骨髓細(xì)胞系的表現(xiàn)型表征為了表征單細(xì)胞源骨髓細(xì)胞系的表現(xiàn)型，通過(guò)FACS分析對(duì)一板細(xì)胞表面蛋白進(jìn)行分析，總結(jié)在表1中。表1:通過(guò)FACS分析測(cè)定的分離MLSC系的細(xì)胞表面蛋白表達(dá)的總結(jié)<table>complextableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>(N-陰性,L-低,I-中，H-高)結(jié)果表明，表面表達(dá)的總分布外形相似，例如，所有分離的細(xì)月包系老卩只于CD29、CD44、CD73(SH3,SH4)、CD90、CD105(SH2)、CD166和HLA-I類是明顯陽(yáng)性的。然而，在測(cè)試的11個(gè)細(xì)胞表面蛋白中，在9個(gè)細(xì)胞表面蛋白表達(dá)和在CD44和CD90的類似水平的表達(dá)中，每一個(gè)細(xì)胞系具有相對(duì)獨(dú)特的表達(dá)外形。而且，D5(#l)細(xì)月包系對(duì)于CD31、CD34和HLA-DR是陰性的，并且D5(#2)對(duì)CD31、HLA-DR是陰性的，但對(duì)CD34是微弱陽(yáng)性的，而D5(#3)對(duì)于CD31、CD34和HLA-DR是陽(yáng)性的(圖4)。這些結(jié)果表明在人類骨髓中存在若干不同類型的干細(xì)胞。圖5顯示出在通過(guò)本發(fā)明的細(xì)分級(jí)培養(yǎng)方法從骨髓分離的MLSC上沒(méi)有^見(jiàn)察到造血干細(xì)月包表面蛋白。流式細(xì)月包4義分析表明，MLSC對(duì)于用于早期造血干纟田月包的HLA-DR和CD34標(biāo)記蛋白是陰'f生的。HMSC8292(CambrexBioScience,Walkersville，MD,USA)細(xì)胞用作對(duì)照。這些結(jié)果表明分離的MLSC不具有造血干細(xì)胞表現(xiàn)型。至于在分離細(xì)胞種系上的若干代表性表面蛋白標(biāo)記物CD31、CD105、CD73和CD34的表達(dá)，圖6-9示出了它們的對(duì)比結(jié)果。圖6示出了在通過(guò)本發(fā)明細(xì)分級(jí)培養(yǎng)方法從骨髓分離的MLSC系上觀察到的細(xì)月包表面蛋白CD31(PECAM)表達(dá)。D4(#1)、D4(#3)、D5(#1)、D5(弁2)和具有FGF的D5(弁2)的CD31的表達(dá)通過(guò)FACS分析進(jìn)行才企測(cè)。建立的MLSC系D4(弁3)對(duì)于CD31是微弱陽(yáng)性的，而其他MLSC系是陰性的。在生長(zhǎng)介質(zhì)中的FGF增加D5(弁2)的CD31的表達(dá)。這些結(jié)果表明，D4(弁3)在分化能力和/或細(xì)胞功能上具有不同的細(xì)胞特性。圖7示出了細(xì)胞表面蛋白CD105(SH2)表達(dá)的對(duì)比結(jié)果。建立的MLSC系D5(弁l)表現(xiàn)出中等水平的CD105表達(dá)，而其他干細(xì)月包系表現(xiàn)出高水平的CD105。圖8示出了細(xì)胞表面蛋白CD73(SH3，SH4)表達(dá)的對(duì)比結(jié)果。建立的MLSC系D4(弁3)表現(xiàn)出非常低水平的CD73表達(dá)，并且D4(弁3)和D5(弁2)表現(xiàn)出中等水平，而D5(弁l)根本不表達(dá)。圖9示出了細(xì)胞表面蛋白CD34表達(dá)的對(duì)比結(jié)果。建立的MLSC系D4(#3)、D4(弁3)和D5(弁2)表現(xiàn)出低水平的CD34表達(dá)，而D5(#l)沒(méi)有表現(xiàn)出CD34表達(dá)。以上結(jié)果表明，每一個(gè)干細(xì)胞系在其分化能力和/或細(xì)胞功能上具有獨(dú)特的細(xì)胞特性。實(shí)施例6.3-骨髓細(xì)胞系的多種系分化為了確定單細(xì)胞源骨髓細(xì)胞系的分化能力，在各個(gè)細(xì)胞特異性i秀導(dǎo)介質(zhì)中，通過(guò)團(tuán)塊培養(yǎng)系統(tǒng)測(cè)試成庫(kù)欠骨、成骨和成脂肪分化并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)基測(cè)試肝原性分化。所有分離的細(xì)胞系能夠分化成成軟骨種系、成骨種系、成脂肪種系、神經(jīng)原性和肝原性種系(表2)。4個(gè)分離的MLSC系表現(xiàn)出不同水平的分化能力。例如，D5(弁2)干細(xì)胞系能夠分化成軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肝細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞，而其他在成軟骨、神經(jīng)原性或肝原性種系上具有不同水平的分化能力。表2:分離MLSC系的分化能力的總結(jié)<table>complextableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>(N-陰性，L-低，I-中，H-高)實(shí)施例6.4-骨髓細(xì)胞系的成軟骨分化處于第3代或第4代的4個(gè)單細(xì)胞源骨髓細(xì)胞系在成軟骨分化介質(zhì)(6.25|ag/ml月夷島素、轉(zhuǎn)!失蛋白、6.25ng/ml石西酉吏、1.25mg/mlBSA、5.35(ig/ml亞油酸、TGF-卩l(xiāng)10ng/ml、和TGF-(3310ng/ml)中進(jìn)行團(tuán)塊培養(yǎng)。成軟骨分化在處理后14~21天實(shí)現(xiàn)。通過(guò)免疫組織化學(xué)染色的陽(yáng)性甲苯胺藍(lán)組織化學(xué)染色和富II型骨膠原胞外基質(zhì)是明顯的(圖10)。相反在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞系表現(xiàn)出陰性染色。實(shí)施例6.5_骨髓細(xì)胞系的成骨分化處于第3代或第4代的4個(gè)單細(xì)胞源骨髓細(xì)胞系在成骨分化介質(zhì)(50(ag/ml抗壞血酸2-石粦酸酯，ICT8M地塞米^N和10mM(3-甘油磷酸酯)中進(jìn)行團(tuán)塊培養(yǎng)。成骨分化在處理后14-21天實(shí)現(xiàn)。在成骨分化介質(zhì)中生長(zhǎng)的細(xì)胞中的陽(yáng)性馮'科薩染劑染色是明顯的，而在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的對(duì)照細(xì)胞是不明顯的(圖11)。實(shí)施例6.6_骨髓細(xì)胞系的成脂肪分化處于第3代或第4代的4個(gè)單細(xì)胞源骨髓細(xì)胞系在成骨分化介質(zhì)(50|ig/ml抗壞血酸2-石岸酸酯，l(T7M地塞米+>,和50pg/ml茚曱新)中進(jìn)行團(tuán)塊培養(yǎng)。成脂肪分化在處理后14~21天實(shí)現(xiàn)。在成脂肪分化介質(zhì)中的陽(yáng)性紅油-O染色是明顯的，而在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的對(duì)照細(xì)胞沒(méi)有檢測(cè)到染色(圖12)。實(shí)施例6.7-骨髓細(xì)胞系的神經(jīng)原性分化處于第3代或第4代的4個(gè)單細(xì)胞源骨髓細(xì)胞系在神經(jīng)原性分化介質(zhì)(1mM聯(lián)丁?；?xì)胞周期蛋白AMP,0.5mM異丁基假黃。票口令，20ng/ml人類表皮生長(zhǎng)因子，40ng/ml石威性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-8,10ng/ml成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-8、10ng/ml腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子)中進(jìn)4亍團(tuán)塊培養(yǎng)。神經(jīng)原性分化在處理后14~21天實(shí)現(xiàn)。在神經(jīng)原性分化的細(xì)胞中的陽(yáng)性GAFP、NeuN和巢蛋白染色是明顯的，而在標(biāo)準(zhǔn)i咅養(yǎng)基中生長(zhǎng)的對(duì)照細(xì)胞沒(méi)有4全測(cè)到染色(圖13)。此夕卜，圖14示出了用FGF生長(zhǎng)的分離MLSC的神經(jīng)原性分化。用GFAP、巢蛋白、和NeuN抗體的免疫組織學(xué)染色表明，在神經(jīng)原性誘、導(dǎo)后7天和14天進(jìn)行一企測(cè)，用FGF生長(zhǎng)的神經(jīng)原性分化的MLSC對(duì)于該染色是高度陽(yáng)性的。在具有FGF的神經(jīng)原性誘導(dǎo)介質(zhì)中生長(zhǎng)的MLSC也可分別合成神經(jīng)月交質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白(GFAP)早期和晚期神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)記蛋白、巢蛋白和NeuN,并且可分化成神經(jīng)細(xì)胞。這表明用FGF培養(yǎng)分離的細(xì)胞不改變神經(jīng)原性分化能力。實(shí)施例6.8-骨髓細(xì)胞系的肝原性分化處于第3代或第4代的4個(gè)單細(xì)胞源骨髓細(xì)胞系在肝原性分化介質(zhì)中進(jìn)行培養(yǎng)，該分化介質(zhì)含有20mg/ml干細(xì)胞生長(zhǎng)因子(R&D)、10ng/ml制瘤素-M(R&D)、10ng/ml表皮生長(zhǎng)因子(Sigma)、20ng/ml成纖維細(xì)月包生長(zhǎng)因子-4(R&D)、10ng/ml石咸性成纖維細(xì)月包生長(zhǎng)(Sigma)、50mg/mlITS+予貞混物(BeconDickinson;6.25jig/ml胰島素，6.25|ig/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白，6.25ng/ml硒酸，1.25mg/mlBSA,5.35mg/ml亞油酸))、1.0抗壞血酸2-石粦酸酉旨(Sigma)、10-8M地塞米松(Sigma)。每3天更換介質(zhì)(圖15)。實(shí)施例6.9-骨髓細(xì)胞系的軟骨、骨、月旨肪、神經(jīng)元和干細(xì)胞特異性基因表達(dá)為了^f全測(cè)分化的單細(xì)胞源骨髓細(xì)胞系中的軟骨、骨、脂肪、神經(jīng)元和干細(xì)胞特異性基因的表達(dá)，利用第4代或第5代細(xì)胞來(lái)實(shí)施RT-PCR分析。軟骨(II型骨膠原)、骨(骨橋蛋白)、脂肪(PPARy2)、神經(jīng)元(NF-M)和干細(xì)胞(aFP)的種系特異性基因表達(dá)在分化的細(xì)胞中進(jìn)行檢測(cè)(圖16)。相反，這些基因在未分化的對(duì)照細(xì)胞中不表達(dá)。GAPDH的表達(dá)用作內(nèi)部對(duì)照。這些結(jié)果有力地表明，分離的MLSC可表達(dá)在各個(gè)特異性分化條件中的細(xì)胞特異性基因，并且可分化成多種系。實(shí)施例6.10-骨髓細(xì)胞系的細(xì)胞因子的表達(dá)圖17示出了分離MLSC系的細(xì)胞因子分泌。利用QuantikineHumanTGF-卩1、b-NGF、LIF、ILIO、HGF、IL2、TGF-a和IL12對(duì)MLSC培養(yǎng)物上清液的等分試樣(50~100pl)通過(guò)ELISA進(jìn)行分析。TGF-卩1、LIF、TGF-a和ILIO表現(xiàn)出高水平的分泌，而其他表現(xiàn)出低的或沒(méi)有分泌。通過(guò)分離MLSC的高水平TGF-卩1分泌表明，這些干細(xì)胞可在抑制T細(xì)胞活化中起作用。而且，相對(duì)高水平的其他細(xì)胞因子如LIF、TGF-a和ILIO表明這些細(xì)胞可以具有免疫調(diào)節(jié)活性。本文述及的所有參考文獻(xiàn)通過(guò)引用將其全部?jī)?nèi)容結(jié)合于此作為參考。二8Ku寸f」06〖i661poolo...<Jmu3&MouAqpoip!.IS,s二一;9661syl!ss。sff.MOI.nsJisoq§iqOio5fs一一voJinsjduqiscjoUO一3SI:一J^OS140p一sUOJ貧Joq1一Bp3rL^S,SJPH*Hsasslw^pasp一-a,t二^60r，s一H)0e，一H口oJ).xdil一Ksni:一一jqjspou歸嘗一需XL一ilu一fht;」l一suy-{>Ifz"si-f》二o()z！!。sP3VAK〔一一一v,二l-duss一-ml、〈-puclsu〖jol一！5ndsk一nsuts一poJ2一5si一〕1np一Jslod一"一mujoL一一r、jJ。p歸LG-J5。一In！一5A一MS(>>1.w^i卜9EU人9i6f1香U3二dx丄-S亂JO〕一p一odo55tjiipJptuJ一puu"06CIIS「9二9961ASGloqdjo〖AJ1Rluolu!，Gdx3pn一3019〈qlun』cll"aHlof，s一一ooK寸，L1:寸K一6-6618gps-iq一BL5冗一2uxlpgstudflsos>jJ3nocl-當(dāng)一JefJs>lgasv《5gwJ&IHflfplssao一ll3屮lddB一^3〖UJP:s〖pollslsJgsxq015ss.sf^t&3s一JJ、OJegpasA。ym一uv,ssnsxsp〖mjdsx一2tulql2一1joU0=ES1SSS>I〖s>}u5palaPS-1§!-!GMs/S城群每I.SSIS0890S〗4*vmVassdaerP,FallaN,SnoeckH4al,Cha腦cterizatbnandpurificationofosteogeniccellsfrommurinebo加marrowbytwo-colorcellsortingusing關(guān)ti-Sca4monoclonalantibodyandwheatgorm鄉(xiāng)hitiniruBood1994;84:753~763.15*SimmonsPJ,Torok-StortB，Wentificationofstromaledlprecursorsinhumanbonemarrowbyanovelmonoclonalamibody，STRO-l，Blood1991;78:55-62.16.LongMW、Rubin鄉(xiāng)JA，Ash咖fiEAeta〗，R，laUonofhumanbowi"arrow曙derivedosteoprogenitorcellsbyosteogenicgrowthfactors'JCHnnvest簡(jiǎn);95:,—887，17.Wa!krEK，01、veusJ，Lund陽(yáng)Joh加senFetal-The"commonstemcclJ"h》[X)thesisreevaluated:humanfetalbonemarmwcontainsseparatepopulationsoflie，"at鄰(,ieticand軀"nalprogenitors,Blootll附；fE5:24'2'-2435.18.JoyncrCJ，BennettA，TriffittJT，Identificationandenrichmentofhuman《""c甲.ogc'uiiorcdbl)yusingdiflbrtmti:iUonstuge-spojilieruAbs.lhmuH所；21:1-6，19.Reyes\.1，LundT，LenvikTal.PurificationandexvivoexpansionofposlriaudhumanmtirruwniL'sodernaiprogeniUM'L'ens,B〗otxl2001;98:2615'262:5,2t),CkirkBR，Keating:A.Biologyofbonemarr(,wsiroma,AnnNYAeadSci1的5:77():70-7S,21,Phinnu〉,'L)(—i，Kopen.G，hiuicsun壯etal.Plastk'adherentsiromaleeHst'r鍾thebonemarrowofcommonl'vusedstrainsofinbredmice:variationsinyield，g'owlh,and(m-rerm"aLkm.JCdl脇el化m1卿;72:57()'掘，22,CohefDC,ClassR，DiGirolamuCJVIetal'Rapidexpansionofrecyclingstemcellsinculturesuf、，kisUddheraUcellsfromhuu纖bonemaraw.l.'roc.N欲tlAcadSciUSA2,;97:3213—32l乂21ProckopDJ、SekiyaI,andColterDC,lsotetionandch線r"oieriMtionofrapidSyst;〗l'-f加e、vmgs咖edbfron]culturesofhuman隱trowstromalcells.Cytotherapy2,;3(5):393"396.24.HungSC，ChenNJ,HihSLelal,kolalkmandcha隊(duì)ierizaUonofsize-sievedstemcellsfromhumanbonemanrow.S化mCells2002;20:249-258,23,SdwarzEJ，Alex肌cto'(、'M，Pr《)ekopUJal,Multijx麵tol歸rrt)ws咖滅lcellstr咖dut;ecltproduceL-DOPA:engmftraentinamimodelofParEdn咖di織s"HumG瘡Tl化rl柳;H):25,—5教26,Seh、var力EJ,RegerRL，AlexanderGMal,,咖irowstromalcdlsrapidlyIransducedwithasd〖二inactiv緣tingrdravirussynt'h€、si"L-DOPAv/化仏GeneTher2亂;S:l2i4-1223.27.KocON,GersonSL,CooperBWaLR錢pWhematopotatkrwoveiyaftercoinfusionofautoIogousWoodlstemcellsandculture《xpandedmarrowmesenchymalstemcdteinadvancedbreastcuncerpatientsreceivinghigW維chemothorapy.JClinOncol2000;18:307-316.28.HorwitzEM,ProckopDJ,F"zpatrickLAetal,Transplantabil.ifyandtlierapeul'iceffectsofbo加marrow-derivedmesenchymalcdisinchildren'withosteogenesisii，rt't'cta.Natfvkd19外;5:則-313.29.Honv'itz.EM,f'rockop1>J,GordonPLetal.ClinicalresponsestotonemarrowlrtinsplarU加i()ninchildrenwhh.severeosteogenesisimperfecta.Blood2QOI;97:1227—123L本領(lǐng)域的技術(shù)人員僅利用常規(guī)實(shí)驗(yàn)將認(rèn)知或者能夠理解本文中具體描述的本發(fā)明特定實(shí)施方式的許多等同替換。這樣的等同替換也涵蓋在本發(fā)明權(quán)利要求的范圍內(nèi)。權(quán)利要求1.一種處理細(xì)胞的生物學(xué)樣品的方法，包括(i)使所述細(xì)胞的樣品沉積在一個(gè)容器中；(ii)將上清液從所述容器轉(zhuǎn)移到另一個(gè)容器中；以及(iii)從所述上清液中分離細(xì)胞，其在所述樣品中具有相對(duì)較低的密度。2.才艮據(jù)4又利要求1所述的方法，介質(zhì)混合。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,至少三次。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述分離細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)展。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,劑。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法,帶電荷氨基酸的聚合物。其中，將所述細(xì)胞的樣品與生長(zhǎng)其中，實(shí)施所述步驟(i)和(ii)其中，將v^人所述上清液分離出的其中，所述容器具有平底。其中，所述容器涂覆有細(xì)胞粘附其中，所述細(xì)胞粘附劑包括任何8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述細(xì)胞粘附劑是骨膠原、多熔素、聚精氨酸、聚天冬氨酸酯(鹽)、聚谷氨酸酯(鹽)、或者它們的組合。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述細(xì)胞的樣品從骨髓、外周血、臍帶血、脂肪組織樣品、或細(xì)胞因子活化的外周血獲得。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,單個(gè)集落,皮分離。11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,進(jìn)行任何離心之前獲得。12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,進(jìn)行任何離心之后獲得。13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中，多種系干細(xì)月包或3且細(xì)月包的其中，所述細(xì)胞的生物學(xué)樣品在其中，所述細(xì)胞的生物學(xué)樣品在其不包括離心所述細(xì)胞的樣品。14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，包括使步驟(iii)中的所述分離細(xì)胞與結(jié)締組織細(xì)胞轉(zhuǎn)化/分化介質(zhì)相接觸，從而形成中胚層種系細(xì)月包。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中，所述中胚層種系細(xì)胞是結(jié)締纟且織細(xì)月包。16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，所述結(jié)締組織細(xì)胞是軟骨細(xì)胞，而所述轉(zhuǎn)化/分化介質(zhì)是軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化/分化介質(zhì)。17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，所述結(jié)締組織細(xì)胞是脂肪細(xì)胞，而所述轉(zhuǎn)化/分化介質(zhì)是脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化/分化介質(zhì)。18.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，所述結(jié)締組織細(xì)胞是骨19.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，包括使步驟(iii)中所述分離的細(xì)胞與外胚層組織細(xì)胞轉(zhuǎn)化/分化介質(zhì)相接觸，從而形成外胚層種系細(xì)月包。20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中，所述外胚層種系細(xì)胞是神經(jīng)組織細(xì)胞，而所述轉(zhuǎn)化/分化介質(zhì)是神經(jīng)組織轉(zhuǎn)化/分化介質(zhì)。21.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，包括使步驟(iii)中所述分離的細(xì)胞與內(nèi)胚層組織細(xì)胞轉(zhuǎn)化/分化介質(zhì)相接觸，從而形成內(nèi)胚層種系細(xì)月包。22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中，所述內(nèi)胚層種系細(xì)胞是肝原性組織細(xì)胞，而所述轉(zhuǎn)化/分化介質(zhì)是肝原性組織纟田月包轉(zhuǎn)化/分化介質(zhì)。全文摘要本申請(qǐng)公開(kāi)了一種處理細(xì)胞的生物學(xué)樣品的方法，其中所述細(xì)胞包括多種系干細(xì)胞、祖細(xì)胞、其他髓間質(zhì)細(xì)胞，該方法包括使細(xì)胞樣品沉積在容器中；將上清液從該容器轉(zhuǎn)移到另一個(gè)容器；以及從該上清液分離細(xì)胞，其在所述樣品中具有相對(duì)較低的密度。文檔編號(hào)C12N5/00GK101198691SQ200680021325公開(kāi)日2008年6月11日申請(qǐng)日期2006年6月19日優(yōu)先權(quán)日2005年6月17日發(fā)明者宋淳旭申請(qǐng)人:宋淳旭