專利名稱：用于單個(gè)微生物的快速檢測(cè)和鑒定而無需初步培養(yǎng)的裝置的制作方法
用于單個(gè)微生物的快速檢測(cè)和鑒定而無需初步培養(yǎng)的裝置
背景技術(shù)：
1.發(fā)明領(lǐng)域
現(xiàn)代微生物診斷學(xué)合分析用于存在于不同樣本中的微生物的檢測(cè)、計(jì)數(shù)和鑒定。在醫(yī)學(xué)診斷學(xué)和獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域內(nèi)，這些生物是人或動(dòng) 物血液、內(nèi)臟器官、皮膚、組織、呼吸器官等中的致病微生物或危險(xiǎn) 微生物。在工業(yè)微生物學(xué)領(lǐng)域，微生物通常污染技術(shù)方法、材料、設(shè) 備和成品。在環(huán)境分析中，通常存在水、室內(nèi)和室外空氣以及各種表 面的微生物污染。在流行病學(xué)和生物防御中-來自人體或環(huán)境的傳染性 致病微生物。
微生物學(xué)分析的時(shí)間、質(zhì)量和靈敏度因兩個(gè)原因是至關(guān)重要的。 首先，成千上萬的國內(nèi)微生物實(shí)驗(yàn)室每年花費(fèi)數(shù)十億美元用于工業(yè)中 的產(chǎn)品和流程質(zhì)量控制以及污染和腐敗的預(yù)防。這些實(shí)驗(yàn)室也花費(fèi)錢 以提供用于人、動(dòng)物、植物、食品、個(gè)人護(hù)理用品、土壤和環(huán)境的診 斷檢測(cè)?？焖?、可靠、流水線診斷檢測(cè)長(zhǎng)期可節(jié)約公司數(shù)百萬美元。 第二 ，既使在象美國 一樣高度發(fā)達(dá)的國家中數(shù)千人也由于長(zhǎng)時(shí)間的診 斷造成的醫(yī)療延遲而死亡。通過減少進(jìn)行這些微生物診斷檢測(cè)所花費(fèi) 的時(shí)間將導(dǎo)致分析可靠性和靈敏度的增加。最終，這可在世界范圍內(nèi) 挽救數(shù)千人的生命。
本發(fā)明是用于微生物的快速檢測(cè)和鑒定而無需初步培養(yǎng)的裝置。
2.相關(guān)領(lǐng)域的描述
可將用于微生物的檢測(cè)、計(jì)數(shù)和鑒定的現(xiàn)代方法分成兩大部分 1)需要初步培養(yǎng)(富集)以產(chǎn)生可檢測(cè)量的細(xì)胞的方法和裝置；2)因 為其能夠分析少至單個(gè)細(xì)胞從而不需要初步培養(yǎng)的方法。
第一組包括在固體或液體常規(guī)或選擇營養(yǎng)培養(yǎng)基中的培養(yǎng)。其也
包括幾種免疫學(xué)方法。實(shí)例是乳汁和紅細(xì)胞凝集、磁顆粒上的抗體、
酶聯(lián)免疫測(cè)定法如ELISA和Western印跡法、和"deepstick，，法。第 一組也包括脂肪酸的層析法、紅外拉曼和FTIR光語學(xué)、質(zhì)語法和ATP-、 生物-和化學(xué)發(fā)光法。這些方法需要數(shù)百至數(shù)百萬純細(xì)胞來進(jìn)行某些微 生物的檢測(cè)，從而需要長(zhǎng)時(shí)間(許多小時(shí)或天)的初步培養(yǎng)。
第二組方法和裝置不需要初步培養(yǎng)，因?yàn)樗鼈兡軌驒z測(cè)和/或鑒定 甚至單個(gè)細(xì)胞。這些方法和裝置由成組的核酸方法如PCR和其不同的 修飾、外熒光(Epi-fluorescent )法(熒光底物法(fluorogenic substrate method)、免疫熒光法)和成組的流式細(xì)月包計(jì)量術(shù)組成。
除了其他缺點(diǎn)外，無需初步培養(yǎng)的細(xì)胞檢測(cè)和/或鑒定方法通常需 要非常昂貴和復(fù)雜的設(shè)備以及高水平專業(yè)工作。例如，用于PCR的裝 置包括昂貴的熱循環(huán)儀和復(fù)雜的熒光計(jì)。PCR也只用于鑒定目的。使 用PCR進(jìn)行最初污染的計(jì)數(shù)是不可靠的。PCR對(duì)于可污染檢測(cè)本身的 生物是非常敏感的。
外熒光通常只需要熒光顯微鏡來檢測(cè)用熒光染料或熒光抗體 (Ab+熒光染料)標(biāo)記的單個(gè)細(xì)胞。然而，存在的熒光物質(zhì)的量受到細(xì)胞 體積或細(xì)胞表面的限制。小體積的目標(biāo)(單個(gè)微生物)使單個(gè)細(xì)胞的 檢測(cè)非常困難，特別是大量背景熒光通常存在于大部分樣本中。對(duì)于 外熒光方法，流出細(xì)胞的物質(zhì)或單個(gè)細(xì)胞的酶免疫測(cè)定是不可能的， 因?yàn)檫@些指示劑物質(zhì)立即分散在周圍空間而不是集中在小體積內(nèi)，如 由本發(fā)明提及的小體積內(nèi)。
流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)(Flow Cytometry)基于非常復(fù)雜的光電子學(xué)系
統(tǒng)。流式細(xì)胞儀由復(fù)雜的聚光裝置、電子元件、復(fù)雜的水動(dòng)力系統(tǒng)和 高速計(jì)算機(jī)組成。不同類型的流式細(xì)胞儀的價(jià)格在$50，000至 $140, 000的范圍內(nèi)。流式細(xì)胞儀可在一個(gè)單個(gè)細(xì)胞流過各自具有10 微米直徑的通道過程中對(duì)其進(jìn)行分析。通道的尺寸是如此狹窄以至于 其需要17個(gè)小時(shí)才能使100ml液體通過，即使流速為每秒20米。因 此，流式細(xì)胞儀目前用于血液學(xué)，因?yàn)檠杭?xì)胞的量大(5-6百萬個(gè)/ml) 和或多或少穩(wěn)定的濃度。同樣，流式細(xì)胞儀在細(xì)胞學(xué)中作為細(xì)胞混合
物的分選器是非常有效的。流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)在微生物學(xué)中的使用不容 易。在微生物學(xué)中通常不使用這些儀器，因?yàn)槲⑸锟膳c其他顆粒產(chǎn) 生群集體并且可與天然顆?；蛩兰?xì)胞混雜在一起。如果樣本中細(xì)胞的 濃度非常低，分析的時(shí)間急劇增加。因此，對(duì)于流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)的微 生物學(xué)應(yīng)用，需要初始濃聚或甚至富集。微生物在尺寸和形狀上的變 化也比血細(xì)胞豐富得多，因此，經(jīng)常發(fā)生錯(cuò)誤。
已知，并且目前已用于實(shí)踐中，將樣本分成小體積有助于更快地 檢測(cè)細(xì)胞濃度。該效應(yīng)基于在小體積中達(dá)到可檢測(cè)的濃度比在大體積
中快。美國專利5,716， 798描述了用于在多個(gè)離散的區(qū)上分開的容器 中快速檢測(cè)微生物的方法，可通過在一些區(qū)中進(jìn)行初步培養(yǎng)后達(dá)到可 檢測(cè)的細(xì)胞濃度就微生物的存在與否分別監(jiān)測(cè)所述各區(qū)。該方法與其 他方法相比節(jié)省大約10°/。至40%的時(shí)間。美國專利5， 770，440基于相
同的效應(yīng)。本發(fā)明與這些專利不同在于單個(gè)細(xì)胞的分析。不需要費(fèi)時(shí) 的初步培養(yǎng)或營養(yǎng)培養(yǎng)基。
美國專利4，959，301基于將具有活力的生物實(shí)體的樣本分成微 滴，然后通過培養(yǎng)或通過微滴內(nèi)的單個(gè)實(shí)體的生物化學(xué)反應(yīng)來檢測(cè)實(shí) 體。該方法在一些變體中在少于30分鐘內(nèi)可顯示單個(gè)細(xì)胞。然而，其 在技術(shù)學(xué)上很復(fù)雜的。產(chǎn)生具有不同體積的微滴并且要求對(duì)計(jì)算結(jié)果 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。該方法只可在實(shí)驗(yàn)室中由高度專業(yè)的工作人員使用復(fù) 雜的和昂貴的設(shè)備進(jìn)行再現(xiàn)。
提及的裝置與已知方法相比具有顯著的有利方面
能夠通過著色的或熒光酶或酶免疫測(cè)定檢測(cè)和/或鑒定少至一個(gè) 在微通道中被捕獲的單個(gè)細(xì)胞( 一個(gè)微通道中的一個(gè)細(xì)胞對(duì)應(yīng)于每ml 25， 000, 000個(gè)細(xì)胞的濃度)。因此，不需要初始培養(yǎng)，且可在數(shù)分鐘 內(nèi)達(dá)到可檢測(cè)的濃度。
裝置和分析的價(jià)格比流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)或PCR低IO倍(對(duì)于該診斷 裝置，只需要常規(guī)熒光或光學(xué)顯微鏡)。同樣，需要的試劑的量顯著 低于使用常規(guī)96孔板需要的量。作為結(jié)果，分析是簡(jiǎn)單的并且成本低廉。
所述裝置簡(jiǎn)單易用并且包括只用少量操作就可進(jìn)行常規(guī)過濾。甚 至非專業(yè)人員也可容易地采用該裝置和方法，這對(duì)于廣泛使用是非常 重要的。
用提及的裝置可進(jìn)行許多不同的方法通過焚光或顯色底物檢測(cè) 活細(xì)胞、通過特定的酶和用于其的人造底物進(jìn)行的區(qū)分、通過單個(gè)細(xì) 胞的酶免疫測(cè)定進(jìn)行的鑒定、不同液體或氣體樣本的分析。
這些有利方面提供了使用該裝置和其形式用于醫(yī)學(xué)診斷、工業(yè)、 環(huán)境科學(xué)和生物防御中的優(yōu)良機(jī)會(huì)。
發(fā)明概述
本發(fā)明建立了由微通道板、支持結(jié)構(gòu)元件、過濾器和過濾器支持 物(其在方法進(jìn)行中被純瓊脂塊或營養(yǎng)培養(yǎng)基塊取代)組成的裝置。 所述裝置希望通過在微通道的非常小的體積中提供生物化學(xué)酶學(xué)或酶 免疫測(cè)定反應(yīng)來進(jìn)行微生物的快速檢測(cè)和/或鑒定。甚至可在數(shù)分鐘至
通過在長(zhǎng)形(直徑/長(zhǎng)度=1/10-1/100)、圓柱狀、平行的微通道 中的過濾材料的表面過濾來捕獲微生物，所述微通道兩側(cè)開口并且一 側(cè)附著至過濾材料。微通道板上安裝了多個(gè)微通道(各通道可能的直 徑-l-30iam，長(zhǎng)度100-1000 um,和1平方厘米上的數(shù)目 -IOO，OOO-l,OOO，OOO個(gè))。在完成過濾后，+>開裝置，然后移出過濾 器支持物并用純瓊脂塊替代。預(yù)先用生物化學(xué)指示劑(酶的人造底物-生色的或發(fā)熒光的，取決于方法)試劑填充純瓊脂糖塊(瓊脂)。人
抗體反應(yīng)附著至細(xì)胞表面的酶(用于單個(gè)細(xì)胞的酶免疫測(cè)定)，這開 始了無色人造底物分子至著色的或熒光分子的轉(zhuǎn)化。這些分子聚集在 包含細(xì)胞的微通道的非常小的體積中。微通道的極其小的體積(毫升 的1/25百萬分之一 )允許其在非常短的時(shí)間內(nèi)聚集具有可檢測(cè)濃度的 著色的物質(zhì)或熒光物質(zhì)。 一個(gè)微通道的體積是如此小(在微通道的尺 寸直徑IO微米和長(zhǎng)度500微米的情況下，只有40，000立方孩支米)，以至于在微通道中捕獲的一個(gè)單個(gè)的細(xì)胞對(duì)應(yīng)于每毫升樣本
25， 000， 000個(gè)細(xì)胞的濃度)。包含細(xì)胞和濃縮的著色的(紫色、藍(lán)色、
深藍(lán)色、黑色或其他顏色-取決于所用的生色底物)分子的微通道在常 規(guī)光學(xué)顯微鏡下在明背景上看起來象著色的圓斑。包含細(xì)胞和濃縮的 熒光分子的微通道在熒光顯微鏡下在暗背景上看起來象明亮(藍(lán)色、 綠色、紅色-取決于使用的發(fā)熒光的物質(zhì))的圓斑。著色的斑或焚光斑 (點(diǎn))的數(shù)目對(duì)應(yīng)于初步過濾的樣本中的活細(xì)胞的數(shù)目或通過酶免疫 測(cè)定鑒定的特別危險(xiǎn)的或致病性細(xì)胞的數(shù)目。微通道板的表面上的著 色點(diǎn)或焚光點(diǎn)的簡(jiǎn)單觀察和計(jì)數(shù)允許進(jìn)行低至每樣本一個(gè)單個(gè)細(xì)胞的 濃度的細(xì)胞的快速檢測(cè)和/或鑒定。
附圖的幾個(gè)視圖的概述


圖1.顯示微通道玻璃板的一般結(jié)構(gòu)和形狀。顯示的相對(duì)板較大
的微通道。該板上的通道的實(shí)際尺寸是通道直徑10微米，長(zhǎng)度500 微米，通道之間的距離2微米和通道的數(shù)目為每cm2大約700， 000個(gè)。
圖2.解釋用于微生物的取樣、檢測(cè)和/或鑒定的裝置的主要部分 和一般結(jié)構(gòu)。圖的左側(cè)解釋主要組成部分的位置微通道板、過濾器、 過濾器支持物和瓊脂塊。右側(cè)顯示放大的結(jié)構(gòu)的部分。來自一個(gè)在微 通道中被捕獲的細(xì)胞的熒光分子或著色分子的產(chǎn)物顯示于通道中。
圖3.顯示用著色的分子(左)和熒光分子(右)填充的微通道間 的差異。下面的圖解釋在光學(xué)或熒光顯微鏡下兩種形式看起來的樣子。
圖4.該圖顯示已裝配的裝置的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，所述裝置用于通過過
濾取樣和將存在于樣本中的細(xì)胞置于過濾材料表面上的微通道中。
圖5.顯示與圖4中相同的裝置的未裝配的組件。
圖6.顯示圖4和圖5中顯示的裝置的真實(shí)工作模型。
圖7.在進(jìn)行過濾后，將裝置的上部從下部的過濾漏斗移開。移
開過濾器支持物，然后用純瓊脂塊(5)取代。該圖上顯示的裝置是這
些變換的結(jié)果。
圖8.該圖顯示圖7中顯示的裝置的未裝配的組件。
圖9.顯示在過濾過程中裝置的位置具有用于液體樣本的漏斗 的裝置(左)、具有用于加入抗體-酶綴合物的注射器的裝置(中間)、 在空氣(生物氣溶膠)過濾期間的裝置(右)。
圖10.顯示經(jīng)轉(zhuǎn)換用于在微通道中沉積具有生物顆粒(細(xì)胞、病 毒、生物分子)的磁性顆粒的裝置的一般結(jié)構(gòu)，所述生物顆料通過 Ab-Ag相互作用調(diào)節(jié)至磁性顆粒的表面。將磁性顆粒沉積在微通道的 底部和將其與非磁性顆料分開的方法顯示于下面。
發(fā)明詳述
本發(fā)明建立了用于細(xì)胞(所述細(xì)胞以達(dá)到單個(gè)細(xì)胞的濃度存在于 被檢查的樣本中)的快速檢測(cè)和/或鑒定而無需初步培養(yǎng)的裝置。通過 將被檢查的樣本通過裝置進(jìn)行過濾來達(dá)到該目的，所述裝置由微通道 板、過濾器和用于過濾器的支持物(在操作步驟中其被用試劑填充的 瓊脂糖塊取代)組成。裝置被支架圍繞。在過濾過程中，微生物通過 微通道，然后被捕獲在過濾器表面。在完成過濾后，微通道被來自瓊 脂糖塊的試劑充滿，然后細(xì)胞酶和人造底物之間的反應(yīng)開始。因?yàn)槲?通道的極其小的內(nèi)部體積的緣故，這些反應(yīng)的產(chǎn)物(著色的分子或熒 光分子)快速充滿微通道的體積。所述產(chǎn)物快速達(dá)到在光學(xué)或熒光顯 微鏡下可檢測(cè)的濃度。包含細(xì)胞的微通道看起來象著色的點(diǎn)或熒光點(diǎn)， 很容易與空的微通道區(qū)分開。
所述裝置的關(guān)鍵部位是微通道板(圖1)。微通道板由玻璃板制 造，該玻璃板可包含數(shù)千或數(shù)百萬個(gè)微小的、精確制造的通道(孔)。 微通道尺寸和體積的偏差通常不超過1%。通道通常具有1-20微米的 直徑和具有比其直徑長(zhǎng)10-100倍的長(zhǎng)度。 一個(gè)通道的體積可從1000 至300， 000 gm3.微通道板可包含每cm2 100， 000-1， 000， 000個(gè)通道。 通道之間的距離大約為1-2um。板的直徑可改變。通常其為25-47 mm。 板的厚度在0. 2至5 mm的范圍內(nèi)(通常為0. 5 mm)。
捕獲在通道(長(zhǎng)度-500 pk、通道直徑-10 Mk、體積-40， OO0 uk3) 中的一個(gè)單個(gè)的細(xì)胞對(duì)應(yīng)于每ml 25， 000， 000個(gè)細(xì)胞的濃度。因此，
來自一個(gè)細(xì)胞的分析的(著色的或熒光)物質(zhì)的可檢測(cè)濃度可在與
25， 000， 000個(gè)類似的細(xì)胞能夠產(chǎn)生的物質(zhì)的時(shí)間相同的時(shí)間內(nèi)達(dá)到。 該時(shí)間是數(shù)分鐘或數(shù)十分鐘，取決于存在的細(xì)胞和使用的方法。微體 積的效應(yīng)的另一個(gè)實(shí)例可通過肉眼看到的熒光物質(zhì)(來自4-甲基傘 形基(Methylumbelliferyl )乙酸酯的4-甲基傘形酮)的濃度由微通 道(體積=40， 000 ja k3)中的一個(gè)細(xì)胞(巨大芽胞桿菌(Bacillus megatherium))在2分鐘內(nèi)達(dá)到。1毫升(體積=1012 n m3)中的相同 細(xì)胞將在95年后產(chǎn)生相同的濃度。
微通道板由特殊玻璃制造。其對(duì)不同的溶劑或玻璃清潔液具有抗 性。微通道板在物理上也是耐用的。微通道可用黑色無熒光玻璃或無 著色玻璃制造。
微通道因?yàn)橥ǖ?毛細(xì)管)的非常小的直徑而展示極強(qiáng)的毛細(xì)管 作用。事實(shí)上，其毛細(xì)管作用強(qiáng)到足以將水柱提升至百米的高度。甚 至高度粘稠的液體如甘油也可容易地充滿通道。因此，微通道將數(shù)秒 左右充滿來自附著至板下面的瓊脂糖塊的液體。
目前通過工業(yè)生產(chǎn)的、用于影像增強(qiáng)器的微通道板不是很適合發(fā) 明的裝置的微生物學(xué)目的，因?yàn)樗鼈兊耐ǖ朗窃谂c板的表面成特定角 度下生產(chǎn)的。這不能給板讀出器提供在顯微鏡下觀察微通道的整個(gè)內(nèi) 部體積的機(jī)會(huì)。用于觀察通道的最佳角度正好是90。。同樣，為了產(chǎn)
生用于顏色反應(yīng)的無色板，板的生產(chǎn)方法需要改變。
圖1中顯示的微通道板具有只用于說明目的的相對(duì)大和短(小比 率的長(zhǎng)度/寬度)的通道。用于本發(fā)明裝置的微通道板的真實(shí)尺寸為 通道直徑-10 Mm,通道長(zhǎng)度=500 iam， 一個(gè)平方厘米上的微通道數(shù) 目大約為700， 000個(gè)，板直徑為25 min。也可以產(chǎn)生具有其他參數(shù)的 微通道板。 一個(gè)微通道板的目前價(jià)格在$50-$300的范圍內(nèi)。對(duì)于本發(fā) 明裝置的分析目的，各微通道板可使用至少100次。
準(zhǔn)備用于過濾的裝置的主要部分顯示于圖2。裝置由微通道板、 過濾器和用于過濾器的支持物或用人工底物充填的瓊脂塊組成。該結(jié) 構(gòu)由圖3 (裝配的)和圖4 (分開的)中顯示的支架圍繞1 -用塑料制作的用于板、過濾器和過濾器支持物的支架；2 -防止微通道板突 然破壞和支架與板之間的不希望出現(xiàn)的縫隙的橡皮環(huán)；3-微通道板； 4 -用于捕獲細(xì)胞的過濾器；5 -用于能夠通過液體(液體樣本)或 空氣(生物氣溶膠)的過濾器的用塑料或玻璃顆粒制作的支持物；6-用于在過濾期間輕壓用于過濾器的支持物的橡皮環(huán)；7 -用于裝置至 濾液歧管的調(diào)節(jié)的塑料漏斗(也參見圖7)。上部分(l-5)通過螺釘(支 架(1)至漏斗(7))或通過摩擦與塑料漏斗(7)貼靠在一起。
過濾的方法顯示于圖9中。將裝配的裝置附著至用于過濾的歧管。 來自泵的負(fù)壓使液體或空氣樣本通過微通道板。存在于樣本中的細(xì)胞 被捕獲在過濾器表面上的一些微通道中。
當(dāng)過濾步驟完成和不再有液體存在于微通道內(nèi)部時(shí)，將裝置從歧 管取出，然后松解。移走用于過濾器的塑料支持物，將具有人造底物 的塊安裝在其位置(圖7和8 )。所有微通道立即充滿人造底物溶液， 然后活細(xì)胞的酶或通過抗體附著至細(xì)胞表面的酶(酶免疫測(cè)定)之間 發(fā)生反應(yīng)。該過程發(fā)生在圖7-8中顯示的明顯不同(經(jīng)修飾的)的裝 置中。圖7和8示出了裝配的裝置，其包括1 -用于板、過濾器和 過濾器支持物的用塑料制作的支架；2 -防止微通道板的突然破壞和 支架與板之間的不希望出現(xiàn)的縫隙的橡皮環(huán)；3 -微通道板，4 -用 于捕獲細(xì)胞的過濾器，5 -用人造底物充填的瓊脂糖塊，其中的底物 在充滿微通道的溶液中；6 -用于瓊脂塊并附著支架1的板。板6可 向上檸緊在支架1上或通過摩擦力保持就位。在進(jìn)行需要的改變后， 為了在包含被靶定微生物的微通道中產(chǎn)生可檢測(cè)量的著色的分子或熒 光分子，將該經(jīng)改造的裝置置于保溫箱中。
瓊脂塊和人造底物 用于不同酶或酶組以產(chǎn)生可檢測(cè)的吸收劑或熒光分子的濃度的人 造底物是熟知的。人造底物用于酶活性的檢測(cè)、活細(xì)胞檢測(cè)和酶免疫 測(cè)定和ELISA中的鑒定。人造底物的主要特征是其在通過酶轉(zhuǎn)變后產(chǎn) 生著色的分子或熒光分子的能力。許多不同的人造底物基于生色分子例如2-硝基酚、4-硝基酚、5-溴-4-氯-3-雙甲氧苯-引咮(indoxol )、 3-雙甲氧苯吲哚、5-溴-氯3-雙曱氧苯吲哚、6-氯-3-雙甲氧苯吲咮、 5-碘-3-雙甲氧苯吲哚、N-曱基雙甲氧苯p引咮、3， 3'5， 5'-四甲基聯(lián)苯 胺鹽酸鹽、四唑鹽和其他分子。其他人造底物基于熒光分子例如4-甲 基傘形酮、7-氨基-4-甲基香豆素、熒光素、曙紅和其他分子。它們覆 蓋了不同酶(例如糖苷酶、酯酶、磷酸酶、肽酶、硫酸酯酶、脫氫酶 和特殊的酶如辣根過氧化物酶、P-D-半乳糖苷酶或特定的氨基肽酶) 的大部分光鐠。從人造底物產(chǎn)生的一些著色的或熒光分子聚集在細(xì)胞 內(nèi)，而它們中的一些流到外面并收集在細(xì)胞外環(huán)境中。收集在細(xì)胞內(nèi) 部的分子(四唑鹽、5-碘-3-雙甲氧苯吲哚、熒光素和其他分子)對(duì)于流 式細(xì)胞計(jì)量術(shù)和外熒光法是非常重要的，因?yàn)樗鼈兪辜?xì)胞體著色并使 其更加明顯和/或可檢測(cè)。這是非常少量的分子，因?yàn)槠涫艿郊?xì)胞體積 的限制。這些分子在細(xì)胞內(nèi)的聚集可使細(xì)胞死亡。分子/物質(zhì)的其他組 具有在酶-底物反應(yīng)期間流出細(xì)胞的能力(4-曱基傘形酮、7-氨基-4-甲基香豆素、4-硝基酚和其他分子)。它們不導(dǎo)致細(xì)胞死亡，從而可進(jìn) 行長(zhǎng)時(shí)間收集并達(dá)到很高的濃度。該組人造底物用于產(chǎn)生使用發(fā)明的 裝置進(jìn)行檢測(cè)和鑒定的方法，因?yàn)槿鐖D5中所示，在微通道中收集的 分子使細(xì)胞著色或使它們發(fā)熒光。圖5的左側(cè)顯示被作為顯色反應(yīng)的
結(jié)果的著色分子填充的微通道與無細(xì)胞的微通道之間的差異。下面的 圓圏顯示在顯微鏡下的著色的微通道。圖5的右側(cè)顯示熒光分子填充
的微通道和無細(xì)胞的微通道之間的差異。下面的圓圏顯示在顯微鏡下
焚光分子填充的微通道。
可在用需要的人造底物填充的瓊脂糖圓柱塊幫助下進(jìn)行微通道內(nèi) 的人造底物的遞送(圖2、圖7和圖8)。
充滿瓊脂糖凝膠(瓊脂)的塊的有利方面是溶解的物質(zhì)(底物) 對(duì)瓊脂的分子-聚合物不具有拮抗性，從而可容易地流出并充滿所有微 通道(因?yàn)槠鋸?qiáng)大的毛細(xì)管作用的緣故)；可在各方向上擠壓瓊脂塊， 從而使其很容易地適合過濾器的表面而不產(chǎn)生洞或狹縫。沒有人知道 人造底物不與瓊脂糖分子反應(yīng)。可從瓊脂層切出瓊脂塊或通過以特殊形式固化來制備。瓊脂對(duì)光是透明的，從而可在光學(xué)顯微鏡下使用而 不用移開。
在一些情況下也可使用其他凝膠如明膠、硅膠或聚丙烯酰胺凝膠 或甚至可溶性底物的其他載體如濾紙。
用于顏色(光吸收劑)反應(yīng)的裝置的形式
用于顯色(光吸收劑)反應(yīng)和分子的裝置必須具有無色微通道板 和無色或白色過濾器。無色微通道板和過濾器對(duì)于光是透明的，從而 在光模式中更好地用光學(xué)顯微鏡觀察著色的微通道。
用于熒光反應(yīng)的形式
為了消除可能的背景熒光，在該形式中必須使用黑色微通道板和 黑色過濾器。
用于顆粒(用抗體非磁性、磁性和順磁性微顆粒包被的)的形式
發(fā)明的裝置不僅可用于在農(nóng)i通道中沉積細(xì)胞而且還可沉積用抗體 包被的顆粒。這些顆粒必需顯著小于微通道的直徑?？稍谠\斷劑市場(chǎng) 上廣泛地獲得用特定單克隆抗體(聚丙烯、聚碳酸酯、磁性和其他顆
粒)包被的顆粒。包被的顆粒用于通過Ab-Ag相互作用在其表面上濃 縮抗原(細(xì)菌、病毒、蛋白等)。因此，用被研究的病毒的抗體包被 的顆粒將在其表面吸收病毒，在通過裝置過濾后，其將沉積在孩i通道 中。包被的顆粒為在微通道中沉積不能通過常規(guī)過濾捕獲(因?yàn)樾〕?寸)的小物體如病毒、蛋白和其他生物分子提供了可能性。在具有分 別經(jīng)調(diào)整的病毒或生物分子的、被包被的顆粒在微通道中被捕獲后， 可通過上述的酶免疫測(cè)定法鑒定它們。
可通過磁場(chǎng)將磁性顆粒捕獲在微通道中。在該情況下，顯示于圖 7中的瓊脂塊必須被磁鐵取代。如圖10中顯示，磁鐵必須強(qiáng)到足以將 磁性顆粒從液體拉向微通道的底部。將過濾材料表面上的具有抗原的 磁性顆粒從液流中拉出的能力取決于磁場(chǎng)的能量、鐵、鈷和稀土元素 原子的含量和/或顆粒的尺寸以及液流速度。為了將所有磁性顆粒從液 流中拉出和讓非》茲性顆粒(有機(jī)和無機(jī)物顆粒、無需要的抗原決定子
的活的和死的細(xì)胞以及溶劑分子)流出裝置的流動(dòng)室，可就樣本的特 定需要容易地調(diào)整所有這些參數(shù)。
裝置的該形式具有額外的元件具有用于輸入和輸出載有磁性顆 粒(具有吸引至其表面的細(xì)胞、病毒或分子)的液體的通道的蓋子。 圖10顯示該改造的裝置的結(jié)構(gòu)1 -用于板的支架；2 -防止微通 道板的突然破壞和支架與板過濾器之間的不希望的縫隙的橡皮圏，和 塑料制成的過濾器支持物；3 -微通道板；4 -用于捕獲細(xì)胞的過濾 器；5-具有與瓊脂塊相同尺寸的鐵或稀土元素(釹和釤鈷、釹鐵硼合 金)，磁鐵盤；6 -用于磁鐵或瓊脂塊的板；7 -覆蓋支架1的上部和 形成流動(dòng)室的蓋子；8 -用于輸入和輸出含有具有抗原的磁性顆粒的 液體的通道。
在圖10的下部顯示了磁鐵工作的原理設(shè)計(jì)方案在磁場(chǎng)中很容易 分離磁性和非磁性顆粒。非磁性顆粒流出小室，而具有抗原的磁性顆 粒被收集在微通道中?？乖瓩z測(cè)和/或鑒定的方法與用于通過上述過濾 捕獲細(xì)月包的方法相同。
實(shí)施例1
液體樣本中微生物污染的檢測(cè)
必須就細(xì)菌或真菌的存在檢測(cè)食品或藥物工業(yè)中的許多不同液體
樣本。將大約100 ml的液體樣本(假定包含微生物)通過圖4、 5和
6中顯示的裝置過濾。液體容易地通過黑色過濾器(孔徑為0.2微米，
纖維素質(zhì)或硝酸纖維素質(zhì)的)，但細(xì)胞在過濾器表面上的通道的底部被
捕獲。在松開該裝置后，移走多孔盤并用預(yù)先充填有4_曱基磷酸傘形
酯和4-甲基醋酸傘形酯(各自0. lml，濃度0. 5 mg/ml)的瓊脂盤替代。
這些發(fā)熒光底物的混合物保證所有活細(xì)胞將被發(fā)現(xiàn)，因?yàn)閮煞N底物對(duì) 應(yīng)于存在于所有活細(xì)胞中的大組酶-酯酶和磷酸酶。來自包含稱為發(fā)熒
光底物的分子的瓊脂塊的液體在數(shù)秒鐘內(nèi)充滿所有微通道。將裝置(在 一些通道中具有微生物細(xì)胞)置于保溫箱(溫度40-45℃)中進(jìn)行 20-30分鐘。在溫育后，將裝置置于具有大約300-MOnm的激發(fā)光和
大約420-480 nm的熒光的熒光顯微鏡下?？赏ㄟ^明亮的藍(lán)色熒光(與 黑暗的"空"微通道相比)容易地區(qū)分包含活細(xì)胞的微通道。甚至可 在30-40分鐘內(nèi)可靠地發(fā)現(xiàn)100ml中的一個(gè)單個(gè)的活細(xì)胞，而通過常 規(guī)的在佩特里細(xì)菌培養(yǎng)皿上培養(yǎng)的方法則需要3-5天。
實(shí)施例2
樣本中大腸桿菌0: 157的鑒定 使用白色硝酸纖維素過濾器和無色微通道板將100 ml液體樣本通 過裝置過濾。將大約2ml標(biāo)準(zhǔn)的針對(duì)大腸桿功0: 157抗原的與辣根過 氧化物酶(HRP)綴合的抗體加入裝置，然后在數(shù)分鐘內(nèi) 一部分一部分緩 慢地通過裝置過濾；如果在一些通道中存在細(xì)胞，那么綴合物(Ab+HRP) 將附著至大腸桿菌0: 157的表面；此后，將50 ml的蒸餾水通過裝置 過濾以洗去剩余的綴合物。將包含3， 3\ 5， 5'-四甲基聯(lián)苯胺的溶液 的瓊脂塊加入裝置以取代過濾器的多孔支持物。在40。 C下溫育35-40
分鐘。溫育后，將具有過濾器的裝置置于光學(xué)顯微鏡(放大倍數(shù)-xioo)下。包含大腸桿菌0: 157的微通道顯示為藍(lán)色的點(diǎn)。其他微通道顯示 為白色的點(diǎn)。使用該方法和裝置甚至可在少于1小時(shí)內(nèi)發(fā)現(xiàn)100 ml 中的一個(gè)細(xì)胞。常規(guī)方法需要在佩特里細(xì)菌培養(yǎng)皿上進(jìn)行至少24-48 小時(shí)的初步培養(yǎng)期。流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)使得微生物學(xué)家能夠?qū)嶋H上在其 剛通過檢測(cè)區(qū)中的激光束后立即發(fā)現(xiàn)用抗體+熒光色素著色的一個(gè)細(xì) 胞；然而，100 ml樣本通過10微米檢測(cè)區(qū)的管口需要許多小時(shí)。流 式細(xì)胞儀的價(jià)格為大約$100， 000。 PCR在大約3-4小時(shí)內(nèi)達(dá)到相同的 結(jié)果，但其涉及復(fù)雜和昂貴的技術(shù)。此外，不同樣本的混合物的PCR 分析的可靠性不是十分的好。
實(shí)施例3
通過包被的磁性顆粒進(jìn)行的檢測(cè)和鑒定 借助于磁性顆粒進(jìn)行的樣本中細(xì)菌、病毒和生物分子的檢測(cè)和鑒 定由幾個(gè)階段組成。第一階段向假定包含被檢測(cè)的生物體或生物分
子的樣本中加入被抗體包被的磁性顆粒。在該階段，通過Ab-Ag相互作 用將目的物附著至磁性顆粒。第二階段將包含與其他顆粒的混合物 一起的磁性顆粒的液體通過裝置(圖IO)。通過磁場(chǎng)將磁性顆粒在微通 道中分離，而其他顆粒通過輸出通道流出。第三階段抗體-酶綴合物 通過微通道的陣列，然后附著至捕獲在磁性顆粒上的抗原細(xì)菌、病 毒或生物分子。第四階段用透明的過濾器的多孔支持物替代磁鐵并 用蒸餾水洗去過剩的綴合物。第五階段移走用于過濾器的多孔支持 物，然后加入包含對(duì)應(yīng)綴合物的酶的人工底物的瓊脂塊。第六和第七 階段在中35-45° C下溫育裝置15-45分鐘(取決于綴合物和目的物)， 和計(jì)數(shù)著色的或熒光(取決于形式)微通道。 一些微通道中的顏色或 熒光表示在第一階段附著至磁性顆粒的目的物的存在。該方法對(duì)所有 生物目的物例如細(xì)胞、病毒和生物分子通常是通用的。 一些目的物可 具有如此少量的抗原位以至于附著的酶(指示劑分子)不能達(dá)到在顯 微鏡(光學(xué)或熒光)下的可檢測(cè)濃度。該缺點(diǎn)可通過使用更小的微通 道和/或啟用更復(fù)雜的激發(fā)光源(微小UV激光)和光電倍增管(影像增 強(qiáng)器)代替視覺檢測(cè)來改進(jìn)。
權(quán)利要求
1.用于微生物的檢測(cè)和鑒定而無需初步培養(yǎng)的裝置，該裝置通過將微生物沉積在小尺寸(直徑1-30μm；長(zhǎng)度100-1000μm；體積1000-300,000μk3)的微通道并以快速建立可檢測(cè)的指示劑物質(zhì)濃度提供酶或酶免疫檢測(cè)，該裝置包括附著至過濾材料的微通道板；被壓向過濾器的液體和氣體透明支持物和支持所有結(jié)構(gòu)的支架；該支持物轉(zhuǎn)換成充滿人造底物的瓊脂塊，所述底物通過毛細(xì)管作用充滿微通道板的所有微通道并在包含微生物的微通道中開始顯色或熒光反應(yīng)。
2. 權(quán)利要求l的裝置，其中為了在光學(xué)顯微鏡下使光通過裝置和 使著色的微通道更明顯，所述微通道板是無色的并且過濾材料是無色或 白色的。
3. 權(quán)利要求l的裝置，其中當(dāng)熒光分子在含有微生物的微通道中 產(chǎn)生和將熒光顯微鏡用于檢測(cè)微通道中的熒光時(shí)，為了限制背景熒光， 所述微通道板和過濾器是黑色的。
4. 權(quán)利要求l的裝置，其中微通道板和過濾器是黑色的或無色的 或白色的，但為了沉積磁性顆粒，用磁鐵取代用于過濾器的透明支持物， 所述磁性顆粒通過抗體與通過抗體-抗原相互作用附著至所述抗體的細(xì) 胞、病毒或生物分子和抗原(細(xì)胞、病毒或生物分子)結(jié)合。
5. 權(quán)利要求l的裝置，其中用于進(jìn)行顯色或熒光反應(yīng)的微通道板 用于影像增強(qiáng)器的微通道玻璃板，其在通道與板表面之間有90°角度， 并且微通道的體積在1000-300， 000 ni^的范圍內(nèi)。
6. 權(quán)利要求l的裝置，其中用于貯存人造底物和將其轉(zhuǎn)移至微通 道的物質(zhì)可以是能夠保存其中溶解有分子的液體并將其轉(zhuǎn)移至微通道的凝膠(瓊脂糖、明膠、聚丙烯酰胺、硅膠)、紙和多孔材料。
全文摘要
本發(fā)明描述了由微通道板、過濾器和在方法進(jìn)行期間被純瓊脂塊取代的用于過濾器的多孔支持物、和支持結(jié)構(gòu)元件組成的裝置。該裝置希望用于微生物的快速檢測(cè)和/或鑒定。通過在長(zhǎng)的(直徑/長(zhǎng)度＝1/10-1/100)、圓柱狀、平行的、兩側(cè)開口并且一側(cè)附著至過濾器的微通道中過濾來捕獲微生物。微通道板安裝有多個(gè)微通道(各通道可能的直徑＝1-30μm，長(zhǎng)度100-1000μm，和每平方厘米上的數(shù)目為100,000-1,000,000個(gè))。將具有在過濾器的表面上被捕獲的細(xì)胞的微通道板附著至人造底物的瓊脂塊，從而使人造底物的分子充滿所有微通道。捕獲的細(xì)胞從人造底物中產(chǎn)生著色的分子或熒光分子。這些分子被收集在微通道的非常小的體積內(nèi)。微通道的極其小的體積(毫升的1/25百萬分之一)使其可在極短的時(shí)間(數(shù)分鐘)內(nèi)收集可檢測(cè)濃度的著色或熒光物質(zhì)。通過酶-人造底物方法甚至可檢測(cè)來自過濾樣本中的一個(gè)細(xì)胞和/或通過酶免疫測(cè)定法進(jìn)行鑒定。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK101203617SQ200680022162
公開日2008年6月18日 申請(qǐng)日期2006年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月20日
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