專利名稱：用于治療阿爾茨海默病的具有較高安全性的經(jīng)鼻腔內(nèi)給藥基因疫苗的制作方法
用于治療阿爾茨海默病的具有較高安全性的經(jīng)鼻腔內(nèi)給藥基因疫苗 技術(shù)領(lǐng)域0001本發(fā)明是有關(guān)一種基于負(fù)鏈RNA病毒載體的用于阿爾茨海默病的治療 性基因疫苗。 技術(shù)背景0002隨著日本急速步入老齡化社會(huì)，老年性癡呆癥及其護(hù)理問題日漸成為 巨大的社會(huì)問題。據(jù)報(bào)道，在日本，65歲以上的老人中有10%患有老年性 癡呆癥。阿爾茨海默病是導(dǎo)致老年性癡呆癥的兩大原因之一，約占老年性 癡呆癥患者的50%,但目前尚未推出有效的治療方法。0003阿爾茨海默病的病理學(xué)改變有以下3點(diǎn)特征即神經(jīng)元細(xì)胞的萎縮/ 脫落；由|3淀粉樣蛋白(amyloid)(以下簡(jiǎn)稱為A|3 )凝集和沉淀所引起的老 年斑的形成；由異常tau蛋白質(zhì)引起的神經(jīng)元纖維性病變。阿爾茨海默病患 者腦內(nèi)生成的(3淀粉樣蛋白質(zhì)主要是由(3及Y分泌酶裂解P淀粉樣前體蛋白 后產(chǎn)生的40-43個(gè)氨基酸組成的。老年斑的中央為P淀粉樣蛋白，在其周 圍含有膠質(zhì)細(xì)胞，纖維型星形膠質(zhì)細(xì)胞，及營(yíng)養(yǎng)不良的神經(jīng)突起構(gòu)成的凝 集體。目前， 一種較有力的阿爾茨海默病發(fā)病機(jī)制"淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)假說" 認(rèn)為，p淀粉樣蛋白的凝集及沉淀是形成老年斑的主要原因。0004基于該假說，阿爾茨海默病的新型療法-免疫療法尤為受到關(guān)注。該 疫苗療法旨在利用免疫學(xué)手法來清除腦內(nèi)卩淀粉樣蛋白。ELan公司的 Schenk等將前凝集Ap42與佐劑同時(shí)給藥到PDAPP-轉(zhuǎn)基因小鼠的肌肉內(nèi)， 確認(rèn)到了其腦內(nèi)淀粉樣沉淀的減少(專利文獻(xiàn)1以及非專利文獻(xiàn)1 )。在Elan 公司和Wyeth公司等的臨床試驗(yàn)中，將合成A|342肽(AN-1792)和佐劑(QS21) 同時(shí)進(jìn)行肌肉內(nèi)給藥后，在被試驗(yàn)者的血清中發(fā)現(xiàn)了可識(shí)別P折疊結(jié)構(gòu)的 抗A[3抗體(非專利文獻(xiàn)2)。并且報(bào)道了腦的高級(jí)功能也有改善(非專利文獻(xiàn)3)。然而很遺憾，在11期臨床試驗(yàn)中有6% (298名中18名)的患者 出現(xiàn)了腦脊髓膜炎的副作用，并有1例死亡報(bào)告。顧而中斷了上述的臨床 試驗(yàn)。對(duì)死亡患者的腦組織進(jìn)行病理分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，在新皮質(zhì)中沒有老年斑 的存在，而顯示了疫苗的有效性。在老年斑消失的區(qū)域內(nèi)，確認(rèn)到了對(duì)A(3 分解物的小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬作用。該結(jié)果表明結(jié)合于A(3的抗體通過Fc受 體介導(dǎo)，被小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞吞食。0005上述抗A卩抗體對(duì)神經(jīng)元，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，淀粉樣前體蛋白(APP)及 細(xì)胞內(nèi)A(3不發(fā)生反應(yīng)。由此很難判斷，上述副作用是由抗體引起的腦部炎 癥。給藥AN-1792疫苗時(shí)需要一種佐劑。這種佐劑具有很強(qiáng)的免疫賦活作 用，還可誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞性細(xì)胞免疫。由此判斷，上述副作用有可能是由 于佐劑誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫，使反應(yīng)于A卩或APP的TH1型CD4+T細(xì)胞浸潤(rùn)大 腦后導(dǎo)致的，類似于實(shí)驗(yàn)性過^t性腦脊髓炎的腦脊髓膜炎。(非專利文獻(xiàn)4)0006通過AN-1792疫苗試驗(yàn)確認(rèn)了使用Ap肽疫苗療法的病理學(xué)有效性。然 而為了使疫苗適用于臨床應(yīng)用，必須減低腦脊髓膜炎等的副作用。由該觀 點(diǎn)構(gòu)思了 2種新的治療方案。一種是結(jié)合有載體蛋白的Ap肽N末端片段與 Th2佐劑并用的免疫療法(專利文獻(xiàn)2)。其中所述載體蛋白可被T細(xì)胞識(shí)別。 還有一種是包含有腺病毒載體的經(jīng)改良的疫苗接種法(專利文獻(xiàn)3)。其中 所述腺病毒載體包含有編碼由A(3肽和霍亂毒素B亞單位組成的融合蛋白質(zhì) 的核酸。進(jìn)而，本發(fā)明者們還開發(fā)出了一種安全性更高的口服疫苗-腺相 關(guān)病毒載體，該載體包含有編碼誘導(dǎo)體液免疫的Ap肽的肽片斷的DNA(專 利文獻(xiàn)4)。由于上述腺相關(guān)病毒載體疫苗利用TH2細(xì)胞易于被誘導(dǎo)的腸道 粘膜免疫系統(tǒng)，則無(wú)需任何佐劑；并且，通過對(duì)APP轉(zhuǎn)基因小鼠的一次給 藥表現(xiàn)出如下的優(yōu)秀特性，在腸道內(nèi)具有可長(zhǎng)達(dá)6個(gè)月的抗原呈遞作用； 呈現(xiàn)出減低腦內(nèi)淀粉樣沉淀及老年斑形成的效果；且未在其他臟器發(fā)現(xiàn)任 何可被觀察到的炎癥。然而為了使阿爾茨海默病的疫苗療法實(shí)用化，還需 要發(fā)明更加安全有效，更為先進(jìn)的疫苗。000特許文獻(xiàn)1WO 99/2794特許文獻(xiàn)2WO 02/096350特許文獻(xiàn)3WO 2004/0508特許文獻(xiàn)4WO 2004/111250特許文獻(xiàn)5WO 00/70070特許文獻(xiàn)6特開2000-2538特許文獻(xiàn)7WO 2001/072340非特許文獻(xiàn)1SchenkD. et al, Nature 400: 173-177, 1999非特許文獻(xiàn)2Hock C. et al" Nat Med. 8: 1270-1275, 200非特許文獻(xiàn)3Hock C. et al., Neuron 38, 547-554, 200非特許文獻(xiàn)4臨床和研究82(3): 439-444,2005[發(fā)明的公開]0008鑒于上述情況完成了本發(fā)明。本發(fā)明的目的為針對(duì)阿爾茨海默病提供 更加安全有效的疫苗療法。0009為此，本發(fā)明者們經(jīng)過不懈努力，嘗試開發(fā)了針對(duì)阿爾茨海默病的新 型疫苗療法。本發(fā)明者們具有利用仙臺(tái)病毒進(jìn)行既可以用于基因?qū)耄?可以用于基因治療的載體的開發(fā)經(jīng)驗(yàn)。仙臺(tái)病毒是負(fù)鏈RNA病毒。該病毒 只在宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)增殖，因其生活周期中不具有DNA期，所以不會(huì) 整合入染色體內(nèi)。因此，在作為基因?qū)胼d體使用時(shí)，可確保高度的遺傳 安全性。本發(fā)明者們?cè)陂_發(fā)以仙臺(tái)病毒為基礎(chǔ)的基因?qū)胼d體時(shí)，從仙臺(tái) 病毒基因組中敲除了其基因，以提高安全性，提供更適合靶疾患的載體。 通過從基因組中敲除與侵入宿主細(xì)胞有關(guān)的膜融合蛋白(F蛋白質(zhì))的基因， 來提高其安全性，在既可以成功地改良使其不會(huì)引發(fā)二次感染的同時(shí)，也 可以有效的重構(gòu)病毒載體(WO 00/70070)。進(jìn)而，利用仙臺(tái)病毒載體的流感 疫苗(特開2000 - 253876)及AIDS疫苗的開發(fā)也獲得成功。0010IL-10等TH2細(xì)胞因子，在與活體內(nèi)免疫應(yīng)答密切相關(guān)的TH1/TH2 平衡中，發(fā)揮著重要的作用。TH1細(xì)胞產(chǎn)生IFN-y,使細(xì)月包免疫亢進(jìn)。由 TH1細(xì)胞產(chǎn)生的IFN - y,可抑制TH2細(xì)胞的IL-10產(chǎn)生。同時(shí)，TH2細(xì)胞 產(chǎn)生IL-IO，使體液免疫亢進(jìn)。由TH2細(xì)胞產(chǎn)生的IL-IO，可抑制TH1細(xì)胞 產(chǎn)生IFN - y等。本發(fā)明者們嘗試了將編碼A(3和TH2細(xì)胞因子的基因同時(shí)導(dǎo)入上述仙臺(tái)病毒載體，來開發(fā)可抑制細(xì)胞免疫引起的腦脊髓膜炎等副作用的針對(duì)阿爾茨海默病的疫苗。于是本發(fā)明者們構(gòu)筑了編碼Api-43和IL-10 的仙臺(tái)病毒載體，并檢測(cè)了它的效果。首先，將該載體對(duì)24- 25個(gè)月齡的 APP轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行鼻腔內(nèi)給藥，并測(cè)定了給藥4周及8周后的血清中抗 AJ342抗體的水平。對(duì)照組的小鼠中只測(cè)出了較低水平的抗A卩抗體，并且 隨著時(shí)間的推移，其抗體量也逐漸升高。反之，在施用本發(fā)明載體的小鼠 血中，則測(cè)到了較高水平的抗A(3抗體，8周后的抗體水平比4周后的抗體 水平稍有下降。病理組織學(xué)檢查顯示施用本發(fā)明載體后，在前腦葉，頭頂 葉及海馬中的老年斑明顯減少。進(jìn)而，對(duì)腦組織中的A卩量通過ELISA法 也進(jìn)行了測(cè)定。其結(jié)果顯示，腦組織中的AP量明顯減少。同時(shí)使用CD3 和Iba-1作為指標(biāo)進(jìn)一步探討了施用本發(fā)明載體是否會(huì)引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi) 的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。結(jié)果表明，均未產(chǎn)生淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)及小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的 病理性G及端)活化。 0011為優(yōu)秀的特性。第一，該載體在極為高齡的阿爾茨海默病小鼠模型中，具 有使AJ3明顯減少的效果。在上述試驗(yàn)中使用的是接近壽終的24-25個(gè)月齡 的Tg2576小鼠。而以往阿爾茨海默病療法研究中所使用的小鼠的最大月齡 為18個(gè)月。像在這樣高齡的小鼠模型中取得治療效果實(shí)為首創(chuàng)。這些高齡 小鼠的腦內(nèi)沉淀有大量的A(3。因此，本發(fā)明的載體對(duì)阿爾茨海默病病情進(jìn) 展較多的患者也可能發(fā)揮較高的治療效果。第二，本發(fā)明的載體與以往的 疫苗療法相比，在較低的使用量和較少次數(shù)的給藥情況下，也具有治療效 果。例如，在使用以往的A(3肽和佐劑并用的給藥方法時(shí)， 一般需要多次給 藥才可確立其免疫效果。如AN-1792臨床試驗(yàn)中，實(shí)際的給藥次數(shù)為數(shù)次 到十幾次。與之相比，本發(fā)明的載體一次給藥后就表現(xiàn)出顯著的有效性。 進(jìn)而，在腺相關(guān)病毒載體的疫苗療法(WO2004/11125099)中，疫苗接種如本 說明書實(shí)施例所述方法施行了一次給藥，給藥量為5xl0"基因組/個(gè)體。反 之，本說明書所記載的實(shí)施例的施用量為5xl06CIU(Cell Infectious Unit)/個(gè) 體(換算為基因組復(fù)制數(shù)則約5xl(^基因組/個(gè)體)。這兩個(gè)載體的給用量約差 104。第三，實(shí)施例中載體的給藥并未引起小鼠的腦脊髓膜炎。有報(bào)告表明， AN-1792的臨床試驗(yàn)中所觀察到的腦脊髓膜炎在小鼠模型中也被觀察過(M.Shoji, et al., 4她Annual Meeting of Japanese Society of Neurology, May 15-17, 2003)。也有對(duì)正常的非模型小鼠(C57B6鼠)施用A|3肽和佐劑免疫后也出 玉見過腦脊骨4月^炎的凈艮道。(Furlan R, et al., Vaccination with amyloid-beta peptide induces autoimmune encephalomyelitis in C57/BL6 mice, Brain 126: 285-291， 2003)。本說明書所述結(jié)果顯示本發(fā)明的載體對(duì)人體給藥時(shí)也具有 安全性。0012如上所述，本發(fā)明的載體在用量少給藥次數(shù)少的條件下具有較高的A卩 清除效果。在基于仙臺(tái)病毒載體的AIDS病疫苗中，確認(rèn)了其效果部分由于 細(xì)胞免疫所致(WO 2001/072340)。實(shí)施例中使用的載體，為了防止產(chǎn)生副作 用，與細(xì)胞免疫相比，刻意的做了依賴于體液免疫的設(shè)計(jì)，本說明書所描 述的優(yōu)異的疫苗效果在阿爾茨海默病治療疫苗中也顯示出體液免疫的重要 性。通過使用Th2細(xì)胞因子或Th2佐劑來使體液免疫占優(yōu)勢(shì)，可以減低副 作用。顧本發(fā)明提供編碼A卩的負(fù)鏈RNA病毒載體及其應(yīng)用,特別是提供如 下發(fā)明0013(1) 一種負(fù)鏈RNA病毒載體，該載體含有編碼p淀粉樣蛋白的核酸。(2) (1)的負(fù)鏈RNA病毒載體，還包含編碼Th2細(xì)胞因子或其部分 肽的核酸。(3) (2)的負(fù)鏈RNA病毒載體，其中所述Th2細(xì)胞因子或其部分 肽是IL-10或其部分肽。(4) (1) - (3)中的任一載體，其中所述負(fù)鏈RNA病毒是副粘病毒載體。(5) (4)中的載體，其中所述副粘病毒載體是仙臺(tái)病毒載體。(6) (1) - (5)中的任一載體，其中所述(3淀粉樣蛋白是AP43或其部分肽。(7) (1) - (6)中的任一載體，其中所述(3淀粉樣蛋白來源于人。(8) (3) - (7)中的任一載體，其中所述IL-10源于小鼠或人。(9) (1) - (8)中的任一載體，其中所述卩淀粉樣蛋白是序列號(hào)為1 的核苷酸序列所編碼的多肽或其一部分。(10) (3) - (9)中的任一載體，其中所迷IL-10是序列號(hào)為2或3的核普酸序列所編碼的多肽。(11) (1) - (10)中的任一負(fù)鏈RNA病毒載體，包含序列號(hào)為5的核酸。(12) —種組合物，所述組合物包含(l) - (11)中任一項(xiàng)所述的載 體及藥理學(xué)上可容許的承運(yùn)體。(13) (12)中的組合物，包含(i)以可表達(dá)樣式編碼Th2細(xì)胞因子 或其部分肽的核酸，(ii) Th2細(xì)胞因子或其部分肽，或(m)Th2佐劑。(14) (13)中的組合物，包含Th2細(xì)胞因子、其部分肽或Th2佐劑。(15 ) ( 13 )中的組合物，包含以可表達(dá)樣式編碼Th2細(xì)胞因子或其部 分肽的核酸。(16) (15)中的組合物，其中所述Th2細(xì)胞因子是由含有編碼(3淀粉 樣蛋白的核酸的負(fù)鏈RNA病毒載體所編碼的。(17) (15)中的組合物，其中所述Th2細(xì)胞因子是由含有編碼p淀粉 樣蛋白的核酸的負(fù)鏈RNA病毒載體以外的載體所編碼的。(18) (12) - (17)中的任一組合物，該組合物是藥學(xué)組合物。(19) 用于治療和預(yù)防阿爾茨海默病的藥學(xué)組合物，包含(l) - (18) 中的任一項(xiàng)所述的載體。(20 )(19)中的組合物，還包含(i)以可表達(dá)樣式編碼Th2細(xì)胞因子 或其部分肽的核酸，(ii) Th2細(xì)胞因子或其部分肽，或(iii) Th2佐劑。(21) (18)或(20)中的藥學(xué)組合物，是用于鼻腔內(nèi)給藥的藥學(xué)組合物。(22) 是一種使(3淀粉樣蛋白沉淀減退的方法。所述方法包含給藥(1) - (11)中任一項(xiàng)所述的載體，或者包含該載體的組合物的步驟。(23) —種阿爾茨海默病的治療或預(yù)防方法，包括給藥(1) - (11) 中任一項(xiàng)所述的載體或者包含該載體的組合物的步驟。(24) (22)或(23)的方法，所述給藥為鼻腔內(nèi)給藥。 (25 ) (22)或(23)的方法，所述給藥為肌肉內(nèi)給藥。(26) (22) - (25 )中的任一方法，還包含給藥Th2細(xì)胞因子、其部 分肽、Th2佐劑或編碼Th2細(xì)胞因子及其部分肽的載體的步驟。(27) (26)的方法，為施用Th2細(xì)胞因子、其部分肽、或Th2佐劑的方法。(28)(26)的組合物，其中給藥編碼Th2細(xì)胞因子或其部分肽的載體。0014本發(fā)明提供了在給藥量少及給藥次數(shù)少的情況下，可以有效降低p淀 粉樣蛋白沉淀的一種新型負(fù)鏈RNA病毒載體。本實(shí)施例所述載體不會(huì)誘導(dǎo) 中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥，且與以往疫苗給藥相比引起腦脊髓膜炎的可能性低。 本發(fā)明的載體是治療阿爾茨海默病的極為有效的手段。0015本發(fā)明涉及到負(fù)鏈RNA病毒載體。該載體包含編碼(3淀粉樣蛋白的核酸。0016本發(fā)明中的基因，是指編碼遺傳物質(zhì)或轉(zhuǎn)錄單位的核酸?；蚩梢允?RNA或DNA。本發(fā)明中，編碼蛋白的核酸叫做該蛋白質(zhì)的基因?；蛞部?以不編碼蛋白質(zhì)。例如，基因也可以編碼核酶或反義RNA等功能性RNA。 基因可以是天然產(chǎn)生或是人工設(shè)計(jì)的序列。本說明書中的"DNA"包括單鏈 DNA和雙鏈DNA。術(shù)語(yǔ)"編碼蛋白，，是指為便于在適當(dāng)?shù)臈l件下表達(dá)蛋白， 多核苷酸以正義或反義方向包含編碼蛋白質(zhì)氨基酸序列的ORF。0017負(fù)鏈RNA病毒是以負(fù)鏈RNA(與編碼病毒蛋白的有義鏈互補(bǔ)的反義鏈) 為基因組的病毒。負(fù)鏈RNA病毒也可稱為負(fù)鏈。本發(fā)明中所使用的負(fù)鏈 RNA病毒優(yōu)選單鏈負(fù)鏈RNA病毒(也可稱非分節(jié)型(non-segmented)負(fù)鏈 RNA病毒)。所謂單鏈負(fù)鏈RNA病毒指的是以一條負(fù)鏈RNA為基因組的 病毒。包括以下病毒科的病毒副粘病毒一牛(Paramyxoviridae)(包含副粘病毒 屬(Paramyxovirus)、麻滲病毒屬(MorbilHvims)、及忍&,炎病毒屬(Rubulavirus)、 及肺炎病毒屬(Pneumovims)等屬)、彈狀病毒(Rhabdoviridae)科(包含水泡性 病毒屬(Vesiculovirus)、狂犬病毒屬(Lyssavirus)、及熱病毒屬(Ephemerovims) 等)、纖絲病毒科(Filoviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)(流感病毒屬 (Influenza virus)A、 B、 C、及索戈托樣病毒屬(Thogoto-like virus)等包括在內(nèi))、 布尼亞病毒f牛(Bunyaviridae)(包含布尼亞病毒屬(Bunyavims)、漢坦病毒屬 (Hantavirus)、內(nèi)羅病毒屬(Nairovims)、及白蛉病毒屬(Phlebovirus)等)、以及 沙粒病毒科(Arenaviridae)等。0018本發(fā)明中尤其優(yōu)選的負(fù)鏈RNA病毒的具體例子為，包括例如屬于副粘 病毒牙牛的仙臺(tái)病毒(6^Mcte'v/n 9, 4斤i成疫病毒^7VewC(3W/ev/n^), 炎病毒("Mwmps v/n ^，麻滲病毒(iWecw/^ w'nwj， RS病毒(呼吸道^^^4毒 (K邵/rator少，c,'a/ Wms"，牛痙病毒fhWerp&st vz>—，疸熱病毒(必fe附/ er v/ras」，浙吳副流感病毒(SV5) (7WowA:ey para/w/7Me"za Wrws fSK5」j ，人副；克感病 毒1, 2， 3型(7zwmaw/ flraz'"7 we"za (y/ e 7, 2, 3 vr'n^es」,屬于副凈占病毒牙牛 fPflraw_y;rov/n-(iae /a/w7_y); 屬于正粘病毒牙牛fOw/zomjyxoW〃'(iae yh/m7;^的;^感 病毒(/w/7wew加vz'n^);屬于彈狀病毒-牛(7 /za6(iowW(iae 72wn7y」的水泡性口炎 病毒(1^s7'cw/flrv/r—及狂犬病毒(Ka6/es vz>—。0019本發(fā)明優(yōu)選使用副粘病毒。副粘病毒是指屬于副粘病毒科的病毒，或 其衍生物。副粘病毒是一組以非分節(jié)的負(fù)鏈RNA為其基因組的病毒，包括 副粘病毒亞^f(Paramyxovirinae)(包括:呼吸道病毒屬(i ^; /rav/n^)(也稱為副 粘病毒屬(Paramyxov/n^),,腮ji炎病毒屬(7 z^w/av/n^), 和麻滲病毒屬 (Mor&'〃/v/TO力,以及肺病毒亞科(Pneumovirinae)(包括月市病毒屬(尸wewwov/ra》 和間質(zhì)性肺病毒屬(ikfetopwewmovzVw力)。適用于本發(fā)明的副粘病毒的具體實(shí) 例有，仙臺(tái)病毒，新城疫病毒，腮腺炎病毒，麻疹病毒，呼吸道合胞病毒(RS 病毒)，牛痘病毒，疽熱病毒，浙吳副流感病毒(SV5)，和人副；克感病毒1,2,和 3型，等等。更具體地例如，仙臺(tái)病毒(SeV)，人副流感病毒-l(HPIV-l)，人 副流感病毒-3(HPIV-3),海豹瘟熱病毒(phocine distemper vims，PDV)，犬瘟 熱病毒(canine distemper vims ， CDV),;每豚麻滲病毒(dolphin molbillivirus)(DMV)， 小反芻獸疫病毒(peste-des-petits- ruminants virus, PDPR),麻滲病毒(MV)，牛瘟病毒(RPV)，亨德拉病毒(Hendra)，立百病毒 (Nipah)，人副流感病毒-2(HPIV-2),猴副流感病毒5 (SV5)，人副流感病毒 4a(HPIV-4a),人副流感病毒4b (HPIV4b)，腮腺炎病毒(Mumps)，和新城疫 病毒(NDV)。更優(yōu)選的實(shí)例包括選自以下組的病毒仙臺(tái)病毒(SeV)，人副 流感病毒-1 (HPIV-1),人副流感病毒-3(HPIV-3)，海豹瘟熱病毒(PDV)，犬 痙熱病毒(CDV),海豚麻滲病毒(DMV)，小反芻獸疫病毒(PDPR)，麻滲病毒 (MV)，牛瘟病毒(RPV),亨德拉病毒(Hendm),和立百病毒(Nipah Vims)。本 發(fā)明的病毒優(yōu)選屬于副粘病毒亞科(包括呼吸道病毒屬，腮腺炎病毒屬和麻 滲病毒屬)，更優(yōu)選屬于呼吸道病毒屬(也稱副粘病毒屬)的病毒或其衍生物。本發(fā)明可利用的呼吸道病毒屬的病毒包括，人副流感病毒1型(HPIV-1),人副流感病毒3型(HPIV-3),牛副流感病毒3型(BPIV-3),仙臺(tái)病毒(也稱鼠 副流感病毒1型)，猴副流感病毒10型(6Vm/fl" para/"y7we"z" v/rw-7 0， SPIV-10) 等。在本發(fā)明中，最優(yōu)選仙臺(tái)病毒。這些病毒可源自天然林，野生型抹， 突變林，實(shí)驗(yàn)室傳代抹，人工構(gòu)建抹等。0020本發(fā)明中，"載體"是用于將核酸導(dǎo)入細(xì)胞的承運(yùn)體。負(fù)鏈RNA病毒載 體是源自負(fù)鏈RNA病毒的用于將核酸導(dǎo)入細(xì)胞的承運(yùn)體。SeV等的負(fù)鏈 RNA病毒載體作為基因?qū)胗幂d體，具有十分優(yōu)異的特性。由于負(fù)鏈RNA 病毒沒有DNA期，僅在宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，故它們不發(fā) 生染色體整合。因此，不會(huì)造成由染色體異常所導(dǎo)致的癌癥或永生化等安 全問題。負(fù)鏈RNA病毒的這種特征在作為載體使用時(shí)對(duì)其安全性有很大貢 獻(xiàn)。當(dāng)用于表達(dá)外來基因時(shí)，即使在連續(xù)多次傳代后，SeV也幾乎不表現(xiàn) 任何堿基突變。這表明其基因組具有高度穩(wěn)定性，并且能長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)所 插入的外來基因(Yu, D. ef a/., Genes Cells 2, 457-466 (1997》。進(jìn)而，使SeV 衣殼結(jié)構(gòu)蛋白缺失時(shí)，在插入基因的大小及包裝上具有一定靈活性等性質(zhì) 方面具有優(yōu)勢(shì)。傳播型SeV載體，可以導(dǎo)入至少5.5kb的外來基因，并且可 以通過添加轉(zhuǎn)錄單位來同時(shí)表達(dá)兩種或兩種以上的基因。0021已知仙臺(tái)病毒對(duì)嚙齒類動(dòng)物具有致病性，可以引起肺炎。但對(duì)人類不 具有病原性。該觀點(diǎn)可由鼻內(nèi)施用野生型仙臺(tái)病毒不會(huì)對(duì)非人類靈長(zhǎng)類 以及人造成嚴(yán)重的有害作用的報(bào)道中得到支持(Hurwitz, J. L. d Vaccine 15: 533-540， 1997、 Slobod, K. S. et al" Vaccine 22: 3182-3186,2004)。 更引人注目的優(yōu)點(diǎn)還可例舉以下2點(diǎn)。即"高感染性"和"高表達(dá)水平"。 SeV載體通過與細(xì)胞膜糖脂及糖蛋白的唾液酸結(jié)合來進(jìn)行感染，由于唾 液酸在幾乎所有的哺乳動(dòng)物及鳥類細(xì)胞中均有表達(dá)，因此具有廣鐠感染 性，即高感染性。當(dāng)基于SeV復(fù)制子的傳播型載體釋放病毒粒子時(shí)，這 些病毒粒子可以再度感染周圍細(xì)胞。大多數(shù)RNP，在被感染細(xì)胞的細(xì)胞 質(zhì)中被復(fù)制，并隨著細(xì)胞分裂而被擴(kuò)散到子代細(xì)胞，從而可以期待持續(xù) 表達(dá)。SeV載體具有非常廣的組織適用范圍。更進(jìn)一步地，由于具有只 在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的特征性表達(dá)機(jī)制，可使其插入的基因的表達(dá)量非常高(Moriya, C. et al., FEBS Lett. 425(1): 105-111， 1998; WO 00/70070)此 外，通過缺失包膜基因而獲得的非傳播型SeV載體也已經(jīng)回收成功(WO 00/70070; Li， HO, et al., J. Virol. 74(14): 6564-6569,2000)。因此可以對(duì)SeV 載體進(jìn)行改良，使其在維持"高感染性"和"高表達(dá)量"的同時(shí)，提高其"安全性"。0022本發(fā)明的負(fù)鏈RNA病毒載體，包含負(fù)鏈RNA病毒的基因組RNA。術(shù) 語(yǔ)'基因組RNA，是指具有形成包含負(fù)鏈RNA病毒特定病毒蛋白質(zhì)的RNP 的功能的RNA,是具有表達(dá)基因組中的基因的功能的RNA。隨著核酸的復(fù) 制，形成子代RNP。負(fù)鏈RNA病毒的RNA以反義序列編碼其基因。通常， 負(fù)鏈RNA病毒的RNA基因組，在3，前導(dǎo)區(qū)和5，尾隨區(qū)之間含有的病毒 基因以反義序列并列存在。各基因的開放閱讀框(ORF)之間存在 一 組序 列轉(zhuǎn)錄終止序列(E序列)，間插序列(I序列)和轉(zhuǎn)錄起始序列(S序列)， 編碼各基因ORF的RNA可以被轉(zhuǎn)錄成單獨(dú)的順反子。本發(fā)明載體的基 因組RNA,包含該RNA所編碼的基因群的表達(dá)，以及編碼RNA自身 的自主性復(fù)制所必需的病毒蛋白N(核衣殼，又稱核蛋白(NP)), P(磷)和 L(大蛋白)的反義RNA序列。所述RNA還可以編碼形成病毒粒子所必 需的M(基質(zhì))蛋白。進(jìn)而，該RNA還可以編碼病毒粒子感染所必需的包 膜蛋白。負(fù)鏈RNA病毒的包膜蛋白包含，引起細(xì)胞膜融合的F(融合)蛋 白，以及病毒粘附于細(xì)胞所必需的HN(血凝素-神經(jīng)氨酸酶)蛋白或H(血 凝素)蛋白。但是，某些特定類型的細(xì)胞的感染并不需要HN蛋白(Markwell, M.A. a/.， Pro" Natl. Acad. Sci. USA 82(4): 978-982 (1985》，只要有F蛋白 便可以實(shí)現(xiàn)感染。RNA也可以編碼除了 F蛋白和/或HN蛋白以外的包膜蛋 白。0023本發(fā)明的負(fù)鏈RNA病毒載體可以是，例如，負(fù)鏈RNA病毒的基因組 RNA和病毒蛋白形成的復(fù)合體，即核糖核蛋白體(RNP)。 RNP,例如可以 與所需轉(zhuǎn)染試劑一起導(dǎo)入細(xì)胞。這種RNP，更具體地，可以是包含負(fù)鏈 RNA病毒的基因組RNA, N蛋白，P蛋白，和L蛋白的復(fù)合體。RNP導(dǎo) 入細(xì)胞后，在病毒蛋白的作用下，從基因組RNA中編碼病毒蛋白的順 反子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的同時(shí)，基因組也進(jìn)行自我復(fù)制，形成子代RNP。基因組RNA的復(fù)制，可以通過RT-PCR， Northern雜交等檢測(cè)來確認(rèn)RNA拷貝 數(shù)的增加。0024本發(fā)明的負(fù)鏈RNA病毒載體優(yōu)選負(fù)鏈RNA病毒的病毒粒子。術(shù)語(yǔ)"病 毒粒子，，指含有核酸的微小粒子,在病毒蛋白的作用下由細(xì)胞內(nèi)釋放出。負(fù)鏈 RNA病毒的病毒粒子具有這樣的構(gòu)造，其中，具有由上述基因組RNA和病 毒蛋白形成的上述RNP，該RNP被包裹在細(xì)胞膜由來的脂質(zhì)膜(也稱包膜) 中。病毒粒子可以具有傳染性。傳染性是指根據(jù)負(fù)鏈RNA病毒載體的細(xì)胞 粘附能力和膜融合能力，將所含有的核酸導(dǎo)入附著的細(xì)胞內(nèi)的病毒粒子的 能力。本發(fā)明的負(fù)鏈RNA病毒載體可以是具有傳播性或非傳播性的載體。 "傳播性，，是指，病毒載體感染宿主細(xì)胞時(shí)，在該細(xì)胞內(nèi)病毒可以進(jìn)行自我復(fù) 制，并產(chǎn)生感染性病毒粒子。0025例如，分類于副粘病毒亞科的病毒的基因通常概述如下。通常N基因 也可表示為[NP]。呼吸道病毒(i ^/ /ravz'n^) NPP/C/V M F HN - L 腮腺炎病毒(i w^/av/ms」 NP P/V M FHN(SH) L 麻滲病毒(Mo/^7Z/Wms」 NPP/C/V M F H- L0026例如仙臺(tái)病毒的每個(gè)基因的堿基序列的數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)分別為N基因?yàn)?M29343、 M30202、 M30203 、 M30204、 M51331、 M55565、 M69046、和 X1721S; P基因?yàn)镸30202、 M30203、 M30204、 M55565、 M6卯46、 X00583、 X17007、及X17008; M基因?yàn)镈11446、 K02742、 M30202、 M30203、 M30204、 M69046、 U31956、 X00584、及X53056; F基因?yàn)镈00152、 D11446、 D17334、 D17335、 M30202、 M30203、 M30204、 M69046、 X00152、及X02131; HN 基因?yàn)镈26475、 M12397、 M30202、 M30203、 M30204、 M69046、 X00586、 X02808、及X56131; L基因?yàn)镈00053、 M30202、 M30203、 M30204、 M6卯40、 X00587、 X58886。其他病毒編碼的病毒基因有N基因、如CDV、 AF014953; DMV、 X75961; HPIV-1、 DO 1070; HPIV-2、 M55320; HPIV-3、 D10025; Mapuera、 X85128; Mumps、 D86172; MV、 K01711; NDV、 AF064091;PDPR、 X74443; PDV、 X75717; RPV、 X68311; SeV、 X00087; SV5、 M81442;及Tupaia、 AF079780; P基因、如CDV、 X51869; DMV、 Z47758; HPIV-1、 M74081; HPIV-3、 X04721; HPIV-4a、 M55975; HPIV-4b、 M55976; Mumps、 D86173; MV、 M89920; NDV、 M20302; PDV、 X75960; RPV、 X68311; SeV、 M30202; SV5、 AF052755;及Tupaia、 AF079780; C基因、 如CDV、 AF014953; DMV、 Z47758; HPIV-1、 M74081; HPIV-3、 D00047; MV、 AB016162; RPV、 X68311; SeV、 AB005796;及Tupaia、 AF079780; M基因、如CDV、 M12669; DMV、 Z30087; HPIV-1、 S38067; HPIV-2、 M62734; HPIV-3、 D00130; HPIV-4a、 D10241; HPIV-4b、 D10242; Mumps、 簡(jiǎn)171; MV、 AB012948; NDV、 AF0柳19; PDPR、 Z47977; PDV、 X75717; RPV、 M34018; SeV、 U31956;及SV5、 M32248; F基因、如CDV、 M21849; DMV、 AJ224704; HPN-1、 M22347; HPIV-2、 M60182; HPIV-3、 X05303、 HPIV-4a、 D49821; HPIV-4b、 D49822; Mumps、 D86169; MV、 AB003178; NDV、 AF048763; PDPR、 Z37017; PDV、 AJ224706; RPV、 M21514; SeV、 D17334;及SV5、 AB021962; HN(H或G)基因、如CDV、 AF112189; DMV、 AJ224705; HPIV-1、 U709498; HPIV-2、 D000865; HPIV-3、 AB012132; HPIV-4A、 M34033; HPIV-4B、 AB006954; Mumps、 X99040; MV、 K01711; NDV、 AF204872; PDPR、 Z81358; PDV、 Z36979; RPV、 AF132934; SeV、 U06433;及SV-5、 S76876。但是，已知每種病毒有多種毒林，并由于毒林 之間的差異，所以除上述序列以外還存在著包括其他序列的基因。 0027這些病毒蛋白的ORF可以在基因組RNA中借助上述E-I-S序列而排列 成為反義序列。離基因組RNA 3，端最近的ORF僅需要位于3'前導(dǎo)區(qū)和該 ORF之間的S序列，而不需要E序列或I序列。離基因組RNA5，端最近的 ORF只需要位于5，尾隨區(qū)和該ORF之間的E序列，不需要I序列和S序列。 而且，兩個(gè)ORF可以作為單個(gè)順反子例如使用內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES) 序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。此時(shí)，這兩個(gè)ORF之間則不需要E-I-S序列。例如在野生 型副粘病毒中，典型的RNA基因組以反義順序依次包含3，前導(dǎo)區(qū)和編碼N、 P、 M、 F、 HN、和L蛋白的ORF,及5，尾隨區(qū)。本發(fā)明的基因組RNA中， 基因的排列并不限于此。但優(yōu)選與野生型病毒一樣，在3'前導(dǎo)區(qū)之后的依 次編碼N、 P、 M、 F、 HN、和L蛋白的ORF,其后是5，尾隨區(qū)。但有些負(fù)鏈RNA病毒并不包含所有6種病毒基因，即便如此也優(yōu)選將這些病毒基因如上述野生型病毒同樣排列。通常持有N、 P、和L基因的載體，可以在 細(xì)胞內(nèi)從RNA基因組自主表達(dá)基因，還可由此復(fù)制基因組RNA。進(jìn)而，在 編碼F基因和HN(或H)基因以及M基因等包膜構(gòu)成蛋白的基因的作用下， 形成感染性病毒粒子，并將它們釋放到細(xì)胞外。因此，稱該載體為傳播型 病毒載體?？梢詫⒕幋a包括Ap或IL-10在內(nèi)的多肽的基因如后所述插入到 該基因組中的非蛋白編碼區(qū)域。0028此外本發(fā)明的負(fù)鏈RNA病毒載體可以缺損野生型負(fù)鏈RNA病毒中的 一個(gè)或多個(gè)基因。病毒基因組RNA,只要編碼RNP重構(gòu)時(shí)所必須的病毒蛋 白(N,L及P)，即使不編碼包膜構(gòu)成蛋白也可在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制，并表達(dá)基 因。例如根據(jù)病毒種類不同，可例舉至少可以缺失下列至少一種編碼F、 H、 HN、 G、 M、及Ml等的包膜構(gòu)成蛋白基因的載體(WO 00/70055及WO 0(V70070; Li， H,O. et al., J. Virol. 74(14): 6564-6569， 2000)。具體地，不含 M、 F、 HN基因或它們的任意組合的病毒載體，也是本發(fā)明優(yōu)選使用的載 體。這種病毒載體可以通過，例如外源性提供缺陷基因產(chǎn)物來重構(gòu)。如此 制備的病毒載體和野生型病毒一樣，粘附于宿主細(xì)胞后，引起細(xì)胞融合。 但由于導(dǎo)入細(xì)胞中的載體基因組中缺失有病毒原本具有的某一基因，它們 不會(huì)形成與原來的病毒一樣具有感染力的子代病毒粒子。因此，這種病毒 是一種一次性基因?qū)氲陌踩珜?shí)用型病毒載體?；蚪M中缺失的基因，例 如可以是F基因和/或HN基因。例如，通過將表達(dá)F基因缺失型重組負(fù)鏈 RNA病毒基因組的質(zhì)粒載體，與F蛋白表達(dá)載體和NP、 P、 L蛋白表達(dá)載 體一起轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，可以重構(gòu)病毒載體(W000/70055和WO00/70070; Li, H.-O. " a/., J. Virol. 74(14) 6564-6569 (2000))。也可以通過，例如，利用已經(jīng) 在其染色體中整合了 F基因的宿主細(xì)胞來制備病毒。以外源性方式供應(yīng)這 些蛋白時(shí)，這些蛋白的氨基酸序列不必與病毒序列相同，可以使用突變基 因或者其他病毒來源的同源基因作為代用品，只要它們的核酸導(dǎo)入活性與 天然型相同或更高即可。0029此外，本發(fā)明的病毒載體可以制成包含下述包膜蛋白的載體，所述包 膜蛋白可與衍生該載體基因組的病毒的包膜蛋白不同。例如，在重構(gòu)病毒時(shí)，可以通過在包裝細(xì)胞中表達(dá)除了載體來源病毒的包膜蛋白以外的其它 包膜蛋白來制備包含所需包膜蛋白的病毒載體。對(duì)這類蛋白無(wú)特殊限制， 可以包括其它病毒的包膜蛋白，例如，水泡性口炎病毒(VSV-G)的G蛋白(J.Virology 39: 519-528,1981)。本發(fā)明的病毒載體，包括含有VSV-G等包膜 蛋白的假型病毒載體，所述包膜蛋白來自與衍生該基因組的病毒不同的病 毒。通過設(shè)計(jì)使上述包膜蛋白不被病毒RNA基因組編碼時(shí)，病毒粒子感染 細(xì)胞后不會(huì)表達(dá)這些蛋白。0030本發(fā)明的病毒載體可以是，例如，在其包膜表面含有如下蛋白的載體， 所述蛋白例如為粘附因子，配體，受體等可以附著于特定細(xì)胞的蛋白質(zhì)，抗體或其片段；或者是，嵌合蛋白，其中所述蛋白位于細(xì)胞外區(qū)域，而源 自病毒包膜的多肽位于細(xì)胞內(nèi)區(qū)域。由此，還可以制備靶向特定組織的載 體。所述蛋白可以由病毒基因組編碼，或者也可以通過在重構(gòu)病毒時(shí)，通 過表達(dá)病毒基因組以外的基因(例如，其他的表達(dá)載體或宿主染色體上的基 因)來供給。0031本發(fā)明的載體所含的任一病毒基因可以通過修飾野生型基因而獲 得，例如為了降低病毒蛋白的免疫原性，或者提高RNA轉(zhuǎn)錄效率或復(fù) 制效率。具體而言，例如，在負(fù)鏈RNA病毒載體中，可通過修飾至少一 種復(fù)制因子N基因，P基因和L基因來增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄或復(fù)制功能。包膜蛋 白之一的HN蛋白具有血凝素和神經(jīng)氨酸酶兩種活性；但是，當(dāng)4吏前一 種活性降低時(shí)，可以提高病毒在血液中的穩(wěn)定性；當(dāng)改變后一種活性時(shí)， 可以調(diào)控其感染能力。通過修飾F蛋白，可以調(diào)控膜融合能力。例如， 通過分析可成為細(xì)胞表面抗原分子的F蛋白或HN蛋白的表位，以此來 制備一種使上述蛋白抗原性減弱了的病毒載體。并且，為抑制二次放出 粒子或VLP (病毒樣粒子)的放出，也可在病毒基因中導(dǎo)入溫度敏感性 突變(WO 2003/025570)。例如、在M基因中導(dǎo)入G69E、 T116A、及A183S; 在HN基因中導(dǎo)入A262T、 G264、及K461G;在P基因中導(dǎo)入L511F;在 L基因中導(dǎo)入N1197S及K1795E等突變。當(dāng)然，可導(dǎo)入的溫度敏感性突變 并不限于此。(參照WO 2003/025570)。0032本發(fā)明的載體可以缺失輔助基因。例如，通過敲除V基因(一種SeV輔助基因)，可以在不影響培養(yǎng)細(xì)胞中的基因表達(dá)和復(fù)制的情況下，使SeV對(duì)宿主如小鼠的致病性顯著降低(Kato, A. " a/., 1997, J. Virol. 71: 7266-7272, 1997; Kato， A. ^"/.，EMBO J. 16: 578-587， 1997; Curran， J. WO 01/04272, EP1067179)。這種減毒載體特別優(yōu)選作為體內(nèi)或回體(ex Wvo)基因?qū)胗脽o(wú)毒性病毒載體來使用。0033本發(fā)明的載體，在上述負(fù)鏈RNA病毒載體的基因組中可以包含編碼外 來基因A(3的核酸。編碼A卩的氨基酸數(shù)不受制限。例如可以是A(31-40、任何多肽都可以用作A(3。所述多肽必須包含來自天然A(3(例如A(343)的氨 基酸序列的連續(xù)6個(gè)或6個(gè)以上氨基酸、優(yōu)選連續(xù)7個(gè)或7個(gè)以上氨基酸、 或連續(xù)8個(gè)或8個(gè)以上氨基酸(Harlow, Antibodies: A laboratory Manual, 1998; Chapter 5 page 76)，以使其顯示對(duì)A卩的抗原性。例如，針對(duì)Aj342(序列號(hào): 27的1-42)的B細(xì)胞表位大半集中在N末端的第1~第15氨基酸序列區(qū)域 內(nèi)(Cribbs,D.H.etal., Int. Immunol. 15(4): 505-14,2003)。所以，作為從載體 表達(dá)的A卩肽，可以優(yōu)選使用包含A(342的第1 ~第15的氨基酸的多肽。此 外還可使其表達(dá)包含A(342的第1 ~第21或第4~第10的氨基酸的多肽(特 開2005-21149)。進(jìn)而，已知可以阻止淀粉樣蛋白纖維形成，具有保護(hù)神經(jīng) 能力的抗A卩單克隆抗體10D5及6C6，可以識(shí)別相當(dāng)于AP42的第3~第6 位的4個(gè)氨基酸表位(EFRH;序列號(hào)27的3-6) (Frenkel, D. et al., J. Neuroimmunol, 88: 85-90, 1998; Frenkel， D. et al.， J. Neuroimmunol, 95: 136-142, 1999)。識(shí)別該同一表位的單克隆抗體508F,也可抑制由A卩導(dǎo)致 的神經(jīng)毒性(Frenkel, D. et al., J. Neuroimmunol. 106: 23-31, 2000)。因此，可 以優(yōu)選使用包含該序列的A卩序列中的6 ~ 8個(gè)氨基酸或以上的多肽。細(xì)胞 免疫表位集中在A卩的C末端區(qū)域。表達(dá)包含A(31-21等的N末端片斷，不 包含A|322 ~43的C末端附近的序歹'K序列號(hào)27的22 ~ 43)的片斷，相對(duì) 而言可以使體液免疫勝過細(xì)胞免疫。本發(fā)明的載體，也可優(yōu)選使用編碼包 含天然A卩肽(A(339、 A(340、 A(341、 Ap42及A^43，分別對(duì)應(yīng)于序列號(hào)27 的1~39、 1—40、 1~41、 1 ~42及1 43)序歹'J的載體。較短的A卩肽片斷， 可以適當(dāng)?shù)嘏c載體蛋白融合制成多肽來提高免疫原性后使用。載體蛋白包含鑰孔蟲戚血藍(lán)蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、兔血清白蛋白(RSA)、人 血清白蛋白(HSA)、雞卵白蛋白(OVA)、血小板球蛋白(TG)等。短肽可由約 1~5個(gè)間隔氨基酸介導(dǎo)與載體蛋白融合?？乖嚯?分泌型時(shí)為成熟多肽) 的長(zhǎng)度范圍(不含載體蛋白部分的氨基酸長(zhǎng))優(yōu)選10 ~ 200個(gè)氨基酸、更優(yōu)選 15 100個(gè)氨基酸、更優(yōu)選20- 80個(gè)氨基酸。0034本載體編碼的Ap多肽優(yōu)選包含確?？蓮募?xì)胞中分泌出來的分泌信號(hào)。 分泌信號(hào)序列可使用白細(xì)胞介素(IL) -2及組織纖溶醇原激活物(tPA) 等所需分泌蛋白的信號(hào)序列，優(yōu)選使用A卩前體蛋白(APP)的N末端 信號(hào)序列。具體地，包含例如序列登錄號(hào)NP-958817的分泌信號(hào)序列(堿 基序列參照，例如序列登錄號(hào)NM-201414)。即適合本發(fā)明的載體為編 碼附加有分泌信號(hào)的A|3肽。0035本發(fā)明的載體還可包含編碼作為外源性基因的Th2細(xì)胞因子和/或抗炎 性細(xì)胞因子的核酸。Th2細(xì)胞因子指的是與1型輔助T纟田月包(Thl細(xì)胞)比較， 優(yōu)先產(chǎn)生2型輔助T細(xì)胞(Th2細(xì)胞)的細(xì)胞因子。具體地，包含IL-4、 IL-5、 IL-6、 IL-9、 IL-IO、及IL-13。本發(fā)明中，載體所編碼的細(xì)胞因子優(yōu)選IL-4、 IL-IO、及IL-13，更優(yōu)選IL-IO。各細(xì)胞因子基因的堿基序列及氨基酸序列 是已知的(IL-4 : NM—000589 、 NP—000580 、 AAH66277 、 AAH67515 、 NP—758858、 NP_067258、 NP—958427; IL-5:薩—000879、 NP—000870、 CAA31210、 NP—034688、 NP—068606; IL-6: NM—000600、 NP—000591 、 XP—518992、 AAB30962、 NP一112445; IL匿9:醒一000590、 NP一000581、 AAH66284、 AAH66287、 NP—032399、 XP—341488; IL-IO: NM—000572、 NP—000563、 CAG46825、 NPJ)34678、 NPJ)36986; IL-13: NM—002188、 NP一002179、 AAB01681、. NP一032381、 NP—446280)。0036由載體所編碼的IL-IO等TH2細(xì)胞因子，可以是全長(zhǎng)(即野生型)， 也可以是部分肽(即活性片段)，只要其保留有所述活性。例如，N末 端的信號(hào)序列可以適當(dāng)?shù)乇黄渌盘?hào)序列置換?；蚣?xì)胞因子作為和其他 肽的融合蛋白來表達(dá)。0037對(duì)載體所編碼的A|3以及IL-IO等細(xì)胞因子的來源沒有限制，也可^f吏用包含小鼠、大鼠、豚鼠、兔、豬、牛、馬、驢、羊、狗、黑猩猩、猴以及人類等在內(nèi)的所有哺乳動(dòng)物。A(3及細(xì)胞因子的來源可以是同種的來 源，也可以是異種來源。但最好使用與給藥對(duì)象相同的同種來源。編碼這 些細(xì)胞因子的核酸的核苷酸序列可從上述數(shù)據(jù)中得到。對(duì)于小鼠IL-IO,還 可從如Genbank序列登錄號(hào)AY410237及NM—010548獲得；人IL-10可從 Genbank序列登錄號(hào)AY029171及NM—000572獲得。本發(fā)明載體適用的r編 碼Ap的核酸」為人ApcDNA(序列號(hào)1)。適用的「編碼IL-10的核酸J為 小鼠IL-10cDNA序列(序列號(hào)2)及人IL-10cDNA序列(序列號(hào)3)。由于 密碼子的簡(jiǎn)并性，具有與上述序列號(hào)1 3的堿基序列不同序列的核酸，， 只要具有與上述堿基序列相同的氨基酸序列，就可以與序列號(hào)1 ~ 3 —樣 適用于本發(fā)明的載體。上述外源性基因的插入?yún)^(qū)域，可選擇例如基因組的 蛋白非編碼區(qū)內(nèi)的適當(dāng)部位。例如，3，-前導(dǎo)區(qū)和最靠近3'末端的病毒蛋白 ORF之間；各種病毒蛋白ORF之間；和/或最靠近5'末端的病毒蛋白ORF 和5，-尾隨區(qū)之間。而且缺欠F或HN基因等的基因組中，外源基因可插入 到該缺陷區(qū)域。將外來基因?qū)敫闭巢《緯r(shí)，優(yōu)選插入基因組的多核香酸 的鏈長(zhǎng)為6的倍數(shù)(J. Virology, 67(8): 4822-4830， 1993 )。插入的外來基因 和病毒ORF之間，應(yīng)配有整套的E-I-S序列。借助E-I-S序列串連插入2個(gè) 或多個(gè)外來基因?；蚪柚鶬RES插入所需外來基因。 0038載體所攜帶的外來基因的表達(dá)水平，可通過添加在該基因上游(負(fù)鏈3， 側(cè))的轉(zhuǎn)錄起始序列的類型來調(diào)節(jié)(WO 01/18223)。也可以通過外來基因插 入基因組內(nèi)的位置加以控制。插入位置越靠近負(fù)鏈3，末端則表達(dá)水平越高； 反之越靠近5'末端則表達(dá)水平越低。因此，為獲得所需的基因表達(dá)量，或 者為了使外來基因與編碼靠近其的病毒蛋白的基因保持最佳組合，可以適 當(dāng)調(diào)整外來基因的插入位置。 一般來說，獲得A(3的高表達(dá)水平是有利的， 顧優(yōu)選將編碼A(3的外來基因與高效轉(zhuǎn)錄起始序列相連，并將其插入負(fù)鏈基 因組3，末端附近。具體地，將外來基因插入3，-前導(dǎo)區(qū)和最靠近3，末端的病 毒蛋白ORF之間；或者插入最靠近3，-末端的病毒基因ORF和第2靠近基 因的ORF之間。野生型副粘病毒中最靠近基因組的3'末端的病毒蛋白基因 是N基因，第2號(hào)靠近的是P基因。另外，在不需要導(dǎo)入基因的高表達(dá)水平的情況下，為獲得最佳期望效果，可以，例如將外來基因插入載體中盡 可能靠近負(fù)鏈基因組5 ，端的位置或選擇低效轉(zhuǎn)錄起始序列來抑制病毒載體 的基因表達(dá)水平。0039為使載體表達(dá)2個(gè)多肽(含有A卩的多肽及含有Th2細(xì)胞因子的多肽)時(shí)， 可以將所述編碼各多肽的核酸插入載體的基因組中。該2個(gè)核酸也可分別 插入各自不同的位置，或由E-I-S序列介導(dǎo)串聯(lián)排列插入到一個(gè)位置。此時(shí) 優(yōu)選使用轉(zhuǎn)錄起始效率高的S序列。例如3'-UCCCACUUU-5，(負(fù)鏈RNA; 序歹'J號(hào)6) 、 3，-UCCCAGUUU-5，(負(fù)鏈RNA ; 序歹'J號(hào)7)、 或 3'-UCCCACUTJA-5，(負(fù)鏈RNA;序列號(hào)8)。0040本發(fā)明的載體，在插入編碼A(3及Th2細(xì)胞因子的基因的位置之外還可 持有其他外來基因。對(duì)這樣的外來基因沒有特殊限制。例如，可以是監(jiān)控 載體感染的標(biāo)記基因或是細(xì)胞因子及激素等免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)基因。本發(fā)明的 載體可以持有編碼信號(hào)傳遞調(diào)節(jié)因子、細(xì)胞因子、激素、受體、抗體、及 它們的片段的一個(gè)或多個(gè)基因。本發(fā)明的載體，可以直接給藥于活體靶位， 或間接給藥，即將本發(fā)明的載體感染到患者自身來源的細(xì)胞或其他細(xì)胞， 再將該感染細(xì)胞注入靶位(回體)給藥，如此導(dǎo)入基因。0041本發(fā)明的載體對(duì)于治療阿爾茨海默病，防止或阻止其病情發(fā)展提供 了極為先進(jìn)的方法。將本發(fā)明的載體施用于Ap大量沉淀的24 - 25個(gè)月 齡的APPTg小鼠時(shí)，顯示出了非常顯著的A(3沉淀去除效果。該效果僅 通過 一 次鼻腔內(nèi)給藥就得到了確認(rèn)。本發(fā)明的載體可作為對(duì)患者侵襲性 較低的治療手段來使用。由于未在中樞神經(jīng)系統(tǒng)觀察到炎癥反應(yīng)，可進(jìn) 一步證明本載體具有更高的安全性。0042為制備本發(fā)明的載體，可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，在有包含負(fù)鏈RNA病 毒基因組RNA(或其互補(bǔ)鏈)的RNP重構(gòu)時(shí)所必需的病毒蛋白(即N， P，和 L蛋白)存在的條件下，轉(zhuǎn)錄本發(fā)明的編碼負(fù)鏈RNA病毒基因組RNA的 cDNA。病毒RNP可以通過產(chǎn)生負(fù)鏈基因組(即與病毒基因組反義鏈相同) 或正鏈(編碼病毒蛋白的有義鏈)來重構(gòu)。優(yōu)選通過轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生正鏈來提高載體重構(gòu)的效率。RNA末端，優(yōu)選盡可能正確反映天然病毒基因組3，-前導(dǎo)區(qū)和 5，-尾隨區(qū)序列的末端。例如，為了正確調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的5，-末端，可以利用 T7 RNA聚合酶的識(shí)別位點(diǎn)作為轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，也可以在細(xì)胞中表達(dá)該RNA 聚合酶。例如，為了調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的3，-末端，可以在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的3，-末端編 碼自我切割型核酶，以便用該核酶正確切割3'-末端(Hasan, M. K. " a/., J. Gen. Virol. 78: 2813-2820， 1997; Kato， A. e/"/" 1997， EMBO J. 16: 578-587， 1997; Yu, D. " a/., Genes Cells 2: 457-466， 1997)。0043可以按照例如Hasan, M. K. et al., J, Gen. Virol. 78: 2813-2820, 1997; Kato, A. et al.， EMBO J. 16: 578-587， 1997;和Yu， D. et al., Genes Cells 2: 457-466中記載的方法構(gòu)建攜帶有外來基因的重組仙臺(tái)病毒載體。0044首先，制備包含目的外來基因的cDNA堿基序列的DNA樣品。優(yōu)選此 DNA樣品在25ng/pl或更高的濃度，可以通過電泳確認(rèn)為單一質(zhì)粒。下面 是一個(gè)利用NotI位點(diǎn)將外來基因插入到編碼病毒基因組RNA的DNA中的 實(shí)例。當(dāng)目的cDNA堿基序列中包含Notl識(shí)別位點(diǎn)時(shí)，優(yōu)選事先用定點(diǎn)誘 變法等來改變?cè)搲A基序列以除去該位點(diǎn)，但不改變所編碼的氨基酸序列。 目標(biāo)基因片段通過PCR從所述DNA樣品擴(kuò)增并回收。通過在一對(duì)引物對(duì) 的5'區(qū)添加Notl位點(diǎn)，使擴(kuò)增片段的兩個(gè)末端都為Notl位點(diǎn)。引物中包括 E-I-S序列或其片段，使外來基因插入病毒基因組之后，在外來基因的ORF 和其兩側(cè)病毒基因ORF之間各有一個(gè)E-I-S序列。0045例如，正向的合成的DNA序列在5，-末端包含任意兩個(gè)或多個(gè)核苷酸 (優(yōu)選4個(gè)核苦酸，更優(yōu)選ACTT,不包括GCG和GCC等來自Notl識(shí)別位 點(diǎn)的序列)，以確保被Notl切斷。在該序列的3，-末端添加Notl識(shí)別序列 gcggccgc。另外，在3，-側(cè)還添加任意9個(gè)核苷酸或9力。6的倍數(shù)個(gè)核苷酸 作為間隔序列。進(jìn)一步地，還在3，-末端添加所需cDNA的ORF的約25個(gè) 核苷酸的序列，它從起始密碼子ATG開始并包括ATG。優(yōu)選地，從所需cDNA 選取約25個(gè)核苷酸以使正向的合成的寡DNA的3，-末端的最后一個(gè)核苷酸 為G或C。0046反向的合成的DNA序列在5'末端包含任意兩個(gè)或多個(gè)核苷酸(優(yōu)選4 個(gè)核苷酸，更優(yōu)選ACTT,不包括GCG和GCC等來自Notl識(shí)別位點(diǎn)的序 列)。在該序列的3，-末端添加Notl識(shí)別序列'gcggccgc，。另外，在3，-末端還 添加寡DNA片段以調(diào)整長(zhǎng)度。該寡DNA的長(zhǎng)度如下設(shè)計(jì)最終PCR擴(kuò)增 產(chǎn)物的Notl片段，包括添加的E-I-S序列，總鏈長(zhǎng)為6的倍數(shù)個(gè)核苷酸(所 謂"6的法則"；Kolakofski， D., " a/., J. Virol. 72:891-899, 1998; Calain, R and Roux, L., J. Virol. 67:4822-4830， 1993)。當(dāng)在插入該引物中的寡DNA片段3，畫 末端添力。E-I-S序列時(shí)，仙臺(tái)病毒S序列的互補(bǔ)序列優(yōu)選 5，-TTTCACCCT-3，(SEQIDNO: 9), 5，-TTTGACCCT-3，(SEQ ID NO: IO)或 者5，-ATTCACCCT-3，(SEQ ID NO: 11); I序列的互補(bǔ)序列優(yōu)選5，-AAG-3，； E序列的互補(bǔ)序列優(yōu)選5，-TTTTTCTTACTACGG-3，(SEQ ID NO: 12);進(jìn)一 步在該3'-末端添加自所lTxDNA序列終止密碼子起反向計(jì)數(shù)的約25個(gè)核 芬酸的互補(bǔ)序列，使其最后一個(gè)核苦酸為G或C，制得反向的合成的DNA 的3，末端。0047PCR可以利用Taq聚合酶或其它DNA聚合酶，按照常規(guī)方法進(jìn)行。擴(kuò) 增的目的片段用Notl消化，然后插入pBluescript(商標(biāo))(Stratagene)等質(zhì)粒載 體的NotI位點(diǎn)。所得PCR產(chǎn)物的堿基序列用測(cè)序儀確認(rèn)，選出具有正確序 列的質(zhì)粒。質(zhì)粒中的插入片段用Notl切出，克隆到包含基因組cDNA的質(zhì) 粒的NotI位點(diǎn)。也可以不利用質(zhì)粒載體，直接將所述片段插入NotI位點(diǎn)， 獲得重組仙臺(tái)病毒cDNA。0048例如，重組仙臺(tái)病毒基因組cDNA可以根據(jù)文獻(xiàn)記載的方法構(gòu)建(Yu, D. a/.， Genes Cells 2: 457-466, 1997; Hasan， M. K. a/., J. Gen. Virol. 78: 2813-2820, 1997)。例如，首先將含有Notl識(shí)別位點(diǎn)的18bp間隔序列 (5'-(G)-CGGCCGCAGATCTTCACG-3'; SEQ ID NO: 13)克隆到仙臺(tái)病毒基 因組cDNA(pSeV(+))中前導(dǎo)序列與N蛋白ORF之間，得到帶有源自S肝炎 病毒反基因組鏈的自我切割型核酶位點(diǎn)的質(zhì)粒pSeV18+b(+)(Hasan, M. K." "/., 1997, J. General Virology 78: 2813-2820)。將外來基因片,殳插入 pSeV18+b(+)的Notl位點(diǎn)，能獲得含有所需外來基因的重組仙臺(tái)病毒cDNA。0049如上制備的編碼重組病毒基因組RNA的DNA，在上述病毒蛋白(L、 P 和N)存在的情況下，在細(xì)胞內(nèi)被轉(zhuǎn)錄，以重構(gòu)本發(fā)明的載體。本發(fā)明提供， 用于制備本發(fā)明載體的、編碼本發(fā)明載體中病毒基因組RNA的DNA。本 發(fā)明還涉及將編碼載體基因組RNA的DNA用于制備本發(fā)明載體的用途。 重組病毒可以按照公知的方法重構(gòu)(WO 97/16539; WO 97/16538; WO 00〃0055; WO 00〃0070; WO 01/18223; WO 03/025570; Durbin, A. R et al" Virology 235: 323-332, 1997; Whelan, S. P. et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 8388-8392, 1995; Schnell. M. J. et al., EMBO J. 13: 4195-4203, 1994; Radecke, R et al., EMBO丄14: 5773-5784, 1995; Lawson, N. D. et al" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4477-4481， 1995; Garcin， D. et al., EMBO J. 14: 6087-6094, 1995; Kato, A. et al., Genes Cells 1: 569-579, 1996; Baron， M. D. and Barrett, T,, J. Virol. 71: 1265-1271, 1997; Bridgen, A. and Elliott, R. M.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 15400-15404， 1996; Hasan, M. K. et al" J. Gen. Virol. 78: 2813-2820, 1997; Kato, A. et al" EMBO J. 16: 578-587, 1997; Yu, D. et al" Genes Cells 2: 457-466, 1997; Tokusumi, T. et al., Vims Res. 86: 33-38, 2002; Li, H,O. et al.， J. Virol. 74: 6564-6569, 2000)。使用這些方法能從DNA重構(gòu)負(fù)鏈RNA病毒， 包括副流感病毒、水皰性口炎病毒、狂犬病毒、麻滲病毒、牛瘟病毒和仙 臺(tái)病毒。本發(fā)明載體可以用這些方法重構(gòu)。當(dāng)病毒載體DNA中缺失F、 HN 和/或M基因時(shí)，無(wú)法形成感染性病毒粒子，但可以將這些缺失了的基因和 /或編碼其它病毒包膜蛋白的基因?qū)胨拗骷?xì)胞并表達(dá)，從而能產(chǎn)生感染性 病毒粒子。0050具體地，所述病毒可以如下步驟制備(a)在表達(dá)N、 P和L蛋白的細(xì)胞 中轉(zhuǎn)錄編碼負(fù)鏈RNA病毒基因組RNA(負(fù)鏈RNA)或其互補(bǔ)鏈(正鏈)的 cDNA， (b)從這些細(xì)胞或其培養(yǎng)上清中回收包含基因組RNA的RM>復(fù)合體。 為了進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，將編碼基因組RNA的DNA連接到適當(dāng)?shù)膯?dòng)子的下游。 如此轉(zhuǎn)錄的基因組RNA,在有N, L和P蛋白存在的情況下復(fù)制形成RNP 復(fù)合體。然后，在有M、 HN和F蛋白存在的情況下，形成包裹在包膜中的 病毒粒子。例如，可以將編碼基因組RNA的DNA連接到T7啟動(dòng)子的下游， 然后通過T7 RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄成RNA 。除了包含T7聚合酶識(shí)別序列的啟 動(dòng)子以外，可以利用其它任何所需的啟動(dòng)子?；蛘撸部梢杂皿w外轉(zhuǎn)錄的RNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞。N、 L及P蛋白質(zhì)也可通過質(zhì)粒等適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體在細(xì)胞 內(nèi)表達(dá)。啟動(dòng)子的具體實(shí)例，包含CMV及CAG啟動(dòng)子(Niwa，H. etal.Gene. 108: 193-199,1991;專利/>開1995, 3-168087)。0051從DNA開始的基因組RNA的轉(zhuǎn)錄所必需的T7 RNA聚合酶等酶類， 可以通過例如，轉(zhuǎn)導(dǎo)能表達(dá)它們的質(zhì)粒載體或病毒載體，或者將其基因整 合入細(xì)胞染色體以便能誘導(dǎo)它們的轉(zhuǎn)錄，然后在病毒重構(gòu)時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)來提 供?；蚪MRNA以及病毒重構(gòu)所必需的病毒蛋白，可以例如通過轉(zhuǎn)導(dǎo)能表 達(dá)它們的質(zhì)粒來提供。在供給這些病毒蛋白時(shí)，可以使用輔助病毒，例如 野生型負(fù)鏈RNA病毒或一些變異的負(fù)鏈RNA病毒，但這有可能導(dǎo)致這些 病毒的混入，因此并不優(yōu)選這種方法。0052將表達(dá)基因組RNA的DNA導(dǎo)入細(xì)胞的方法包括，例如(i)制備能被 目的細(xì)胞攝入的DNA沉淀的方法，(ii)制備包含DNA的帶正電的復(fù)合體的 方法，所述復(fù)合體具有較低細(xì)胞毒性且適于目的細(xì)胞的攝入，和(iii)利用電 脈沖在目的細(xì)胞膜上瞬時(shí)開孔的方法，孔的大小僅足以讓目的DNA分子通過。0053方法(ii)中可以使用各種轉(zhuǎn)染試劑，例如DOTMA (Roche), Superfect (QIAGEN #301305), DOTAP, DOPE, DOSPER (Roche #1811169)等。方法(i) 中，可以用磷酸鈣進(jìn)行轉(zhuǎn)染，用這種方法導(dǎo)入細(xì)胞的DNA被吞噬體攝入， 但已知足量的DNA也能^皮攝入細(xì)胞核中(Graham, F. L. and Van Der Eb, J.， 1973, Virology 52: 456; Wigler， M. and Silverstein, S.， 1977， Cell 11: 223)。 Chen 和Okayama研究了導(dǎo)入技術(shù)的最佳條件，他們報(bào)道說(l)細(xì)胞和共沉淀物 的溫育條件為2~4% C02, 35°C, 15~24hr， (2)環(huán)狀DNA比線性DNA 活性更高，和(3)當(dāng)沉淀混合液中DNA濃度為20-30昭/ml時(shí)，可形成最佳 沉淀(Chen, C. and Okayama， H., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 2745)。方法(ii)適于 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。已知更早的方法是配制具有所需DNA濃度比的DEAE-葡聚糖 (Sigma #D-9885 M.W. 5xl0"混合液進(jìn)行轉(zhuǎn)染。由于大多數(shù)復(fù)合體在內(nèi)體中 降解，可以加入氯奮來提高轉(zhuǎn)染效力(Calos,M.R, 1983， Proc. Natl. Acad. Sci. USA80: 3015)。方法(iii)被稱為電穿孔方法，由于沒有細(xì)胞選擇性，它比方法(i)和(ii)應(yīng)用更廣。可通過優(yōu)化脈沖電流的持續(xù)時(shí)間、脈沖形式、電場(chǎng)強(qiáng)度(電極間空隙，電壓)、緩沖液的導(dǎo)電率、DNA濃度和細(xì)胞密度使轉(zhuǎn)染效力最大化。0054在上述三種方法中，方法(ii)操作簡(jiǎn)單，并且能用大量的細(xì)胞檢測(cè)大量 樣品，因此轉(zhuǎn)染試劑適用于在重構(gòu)載體時(shí)將DNA導(dǎo)入細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染試劑優(yōu) 選但不限于Superfect Transfection Reagent (QIAGEN，目錄號(hào)301305)或 DOSPER Liposomal Transfection Reagent (Roche,目錄號(hào)1811169)。0055具體地，可以4會(huì)下述方法從cDNA重構(gòu)病毒0056在6—24孔塑料板或100mm Petri培養(yǎng)皿中，用4及限必需培養(yǎng)基(MEM) 將猴腎細(xì)胞LLC-MK2培養(yǎng)至100%鋪滿，所述培養(yǎng)基含有10%胎牛血清 (FCS)和抗生素(100U/ml青霉素G和100昭/ml鏈霉素)。將表達(dá)T7聚合酶 的重組痘苗病毒vTF7-3在l嗎/ml補(bǔ)骨脂素存在的情況下于UV中暴露20 分鐘滅活，然后以2 PFU/細(xì)胞的量感染細(xì)胞(Fuerst, T. R. " a/.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8122-8126,1986; Kato， A. " a/,, Genes Cells 1: 569-579, 1996)?？梢赃m當(dāng)調(diào)整補(bǔ)骨脂素的添加量和暴露于UV的時(shí)間長(zhǎng)短。感染1 小時(shí)后，將2-60 (ig(更優(yōu)選3-20 )ig)編碼重組仙臺(tái)病毒基因組RNA的DNA 和表達(dá)病毒RNP生成所必需的反式作用病毒蛋白的質(zhì)粒(0.5-24嗎 pGEM-N、 0,25-12嗎pGEM-P和0.5-24 |ig pGEM陽(yáng)L) (Kato, A. " a/., Genes Cells 1: 569-579, 1996)，采用Superfect (QIAGEN)的脂轉(zhuǎn)染方法等進(jìn)行轉(zhuǎn)染。 表達(dá)N、 P和L蛋白的載體的量?jī)?yōu)選比例為2:1:2;質(zhì)粒的量?jī)?yōu)選調(diào)整為， 例如，1-4 jigpGEM-N、 0.5-2嗎pGEM-P、 1-4嗎pGEM-L。0057轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在不含血清的MEM中培養(yǎng)，所述MEM根據(jù)需要，可以含 有100嗎/ml利福平(Sigma)和阿糖胞苷(AraC),優(yōu)選濃度為40嗎/ml的阿糖 胞苷(AmC)(Sigma)，以便將藥物濃度調(diào)整至最佳，從而使痘苗病毒的細(xì)胞 毒性最小而病毒的回收率最高(Kato,A. "a/., 1996, Genes Cells 1: 569-579)。 轉(zhuǎn)染后將細(xì)胞培養(yǎng)48-72hr,然后回收細(xì)胞，凍融三次使細(xì)胞破碎。用含RNP 的細(xì)胞裂解物再度感染LLC-MK2細(xì)胞并培養(yǎng)?；蛘?，回收培養(yǎng)上清，將其添加到LLC-MK2細(xì)胞的培養(yǎng)液中，使其感染細(xì)胞并進(jìn)行培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染可以如 下進(jìn)行例如，與脂轉(zhuǎn)染胺，聚陽(yáng)離子脂質(zhì)體等形成復(fù)合體，然后導(dǎo)入細(xì) 胞。具體地，可以使用各種轉(zhuǎn)染試劑。例如，DOTMA (Roche), Superfect (QIAGEN #301305), DOTAP, DOPE和DOSPER (Roche #1811169)。為了防止 在內(nèi)體中降解，還可加入氯p套(Calos, M. P.， 1983, Pro" Natl. Acad. Sci. USA 80: 3015)。在導(dǎo)入了RNP的細(xì)胞中，進(jìn)行從RNP表達(dá)病毒基因和RNP復(fù) 制的過程，使載體擴(kuò)增。將所得病毒液(上清)稀釋(例如,106-倍)，再使用新 的細(xì)胞反復(fù)進(jìn)行擴(kuò)增，可以完全除去痘苗病毒vTF7-3。將擴(kuò)增重復(fù)例如3 次或3次以上。所得載體可以在-80。C貯存。為了重構(gòu)缺陷了包膜蛋白編碼 基因、不具有傳播能力的病毒載體，可以用表達(dá)該包膜蛋白的LLC-MK2細(xì) 胞進(jìn)行感染，或者可以與表達(dá)該包膜蛋白的質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)染。另一種方法是， 將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞覆蓋在表達(dá)該包膜蛋白的LLK-MK2細(xì)胞上層并進(jìn)行覆層培 養(yǎng)，使缺陷型病毒載體擴(kuò)增(見WO 00/70055和WO 00/70070)。0058回收的病毒的滴度可通過測(cè)定CIU(細(xì)胞感染單位)或血凝素活性(HA) 來確定(WO 00〃0070; Kato, A. " a/" 1996， Genes Cells 1: 569-579; Yonemitsu, Y. & Kaneda, Y" Hemaggulutinating virus of Japan-liposome隱mediated gene delivery to vascular cells. Ed. by Baker AH. Molecular Biology of Vascular Diseases. Method in Molecular Medicine: Humana Press: pp. 295-306， 1999)。攜 帶GFP(綠色熒光蛋白)等標(biāo)記基因的載體，可以利用所述標(biāo)記作為指標(biāo)，直 接計(jì)數(shù)受感染的細(xì)胞來定量(例如，GFP-CIU)。如此測(cè)定的滴度可與CIU做 等同處理(WO 00〃0070)。0059只要能重構(gòu)病毒載體，對(duì)重構(gòu)所用的宿主細(xì)胞無(wú)特殊限制。例如，在 仙臺(tái)病毒載體等的重構(gòu)中，可以使用來自猴腎的LLC-MK2細(xì)胞(ATCC CCL-7)和CV-1細(xì)胞(例如，ATCCCCL-70)、來自倉(cāng)鼠腎的BHK細(xì)胞(例如， ATCC CCL-10)等的培養(yǎng)細(xì)胞、及人體細(xì)胞等。通過在這些細(xì)胞中表達(dá)適當(dāng) 的包膜蛋白，可以獲得包膜中包含這些蛋白的感染性病毒粒子。此外，為 了獲得大量的仙臺(tái)病毒載體，可以用從上述宿主中獲得的病毒載體感染受 精雞卵，從而擴(kuò)增該載體。已經(jīng)開發(fā)了使用雞卵制備病毒載體的方法 (Nakanishi M, " a/" ed. (1993), "State-of-the-Art Technology Protocol inNeuroscience Research III， Molecular Neuron Physiology", Koseisha, Osaka, pp. 153-172)。具體地，例如將受精卵在孵化器中在37-38。C下培養(yǎng)9-12天使其 形成胚。將病毒載體接種到尿嚢腔，進(jìn)一步將該受精卵培養(yǎng)數(shù)日(例如3曰) 使病毒載體繁殖?？筛鶕?jù)所要增殖的重組仙臺(tái)病毒的不同而改變培養(yǎng)時(shí)間 等條件。然后，回收含有病毒的尿嚢液?？梢杂贸Ｒ?guī)方法從尿嚢液中分離 和純化仙臺(tái)病毒載體(Tashiro， M., "Virus Experiment Protocol," Nagai, Ishihama， ed., Medical View Co., Ltd., pp. 68-73,(1995)。0060例如，可以如下重構(gòu)和制備F基因缺失型仙臺(tái)病毒載體(見WO 00/70055 和WO 00/70070)。0061O構(gòu)建F基因缺失型仙臺(tái)病毒基因組cDNA和F基因表達(dá)質(zhì)粒 仙臺(tái)病毒(SeV)的全長(zhǎng)基因組cDNA， pSeV18+b(+) (Hasan, M. K. & a/" 1997, J. General Virology 78: 2813-2820)("pSeV18+b(+)，，也稱"pSeV18+，，)的 cDNA用Sphl/Kpnl消化，回收消化片段(14673bp),將該片段克隆到pUC18, 得到質(zhì)粒pUC18/KS。在pUC18/KS上構(gòu)建F基因缺失位點(diǎn)。F基因的缺失， 通過聯(lián)合應(yīng)用PCR以及連接反應(yīng)來構(gòu)建，結(jié)果F基因的ORF ^皮去除 (ATG-TGA= 1698bp),與例如atgcatgccggcagatga (SEQ ID NO: 14)連4矣，由 此構(gòu)建F基因缺失型SeV基因組cDNA (pSeV18+/AF)。用F基因上游引物 只寸[正向 5'-gttgagtactgcaagagc/序歹'J 號(hào) 15 、 反向 5'-tttgccggcatgcatgtttcccaaggggagagttttgcaacc/序歹'J號(hào)16]及F基因下;捧引物 只寸[正向5'-atgcatgccggcagatga/序歹U號(hào)17、反向5'-tgggtgaatgagagaatcagc/ 序列號(hào)18]進(jìn)行PCR,所得PCR產(chǎn)物通過EcoT221限制酶位點(diǎn)連接。按上 述方法獲得的質(zhì)粒用Sacl和Sail消化，回收含有F基因缺失部位的片段 (4931bp)，將其克隆到pUC18，得到pUC18/dFSS。用DraIII消化該 pUC18/dFSS,回收片段，將其與pSeV18+中包含的F基因區(qū)域的DraIII片 段置換，連接后得到質(zhì)粒pSeV18VAF。0062將外來基因插入到，例如pUC18/dFSS中F基因缺失部位的Nsil和 NgoMIV限制酶位點(diǎn)。為此，例如，可以用尾部為NsiI(NsiI-tailed)和尾部為 NgoMIV(NgoMIV-tailed)的引物擴(kuò)增外來基因片段。0063<2〉制備表達(dá)SeV-F蛋白的輔助細(xì)胞為了構(gòu)建表達(dá)仙臺(tái)病毒F基因(SeV-F)的Cre/loxP誘導(dǎo)型表達(dá)質(zhì)粒，通 過PCR擴(kuò)增SeV-F基因，將擴(kuò)增產(chǎn)物插入到可由CreDNA重組酶誘導(dǎo)基因 產(chǎn)物表達(dá)而設(shè)計(jì)的質(zhì)粒pCALNdLw (Arai, T. " a/., J. Virology 72, 1998, plll5-1121)的唯一 Swal位點(diǎn)，由此構(gòu)建質(zhì)粒pCALNdLw/F。0064為了從F基因缺失型基因組回收感染性病毒顆粒，建立表達(dá)SeV-F蛋 白的輔助細(xì)胞抹?？梢允褂美鏢eV增殖中常用的猴腎細(xì)胞抹LLC-MK2 細(xì)胞。在37。C和5 % C02中用含有下列成分的MEM培養(yǎng)LLC-MK2細(xì)月包 10。/o熱滅活胎牛血清(FBS)、青霉素G鈉(50U/ml)和鏈霉素(50嗎/ml)。由于 SeV-F基因產(chǎn)物具有細(xì)胞毒性，用磷酸鈣法(利用哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)染試劑盒 (Stratagene))將為了能通過Cre DNA重組酶表達(dá)F基因產(chǎn)物而設(shè)計(jì)的上述質(zhì) 粒pCALNdLw/F按已知的方案轉(zhuǎn)染LLC-MK2細(xì)胞。0065將質(zhì)粒pCALNdLw/F (10嗎)導(dǎo)入已在10cm培養(yǎng)亞中培養(yǎng)至40%鋪滿 底的LLC-MK2細(xì)胞中，然后用含10 % FBS的MEM培養(yǎng)基(10ml)在37°C 、 5%。02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。24小時(shí)后將細(xì)胞剝離，懸浮于培養(yǎng)基(10ml) 后，接種到5個(gè)10ml培養(yǎng)皿中，其中一皿為5ml、兩皿為2ml、兩皿為0.2ml， 用含G418 (Gibco-BRL) (1,200嗎/ml)和10% FBS的MEM培養(yǎng)基(10 ml)培 養(yǎng)14天，每?jī)商旄鼡Q一次培養(yǎng)基，選出穩(wěn)定的基因?qū)爰?xì)胞抹。用克隆環(huán) 回收上述培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的G418抗性細(xì)胞?；厥盏母骷?xì)胞克隆均在10cm培 養(yǎng)皿中擴(kuò)增到鋪滿底。0066F蛋白的表達(dá)可以通過齊藤等人(Saito " a/.， Nucl. Acids Res. 23: 3816-3821 (1995); Arai, T. " a/" J. Virol 72, 1115-1121 (1998))的方法，即在 6cm培養(yǎng)亞中將細(xì)胞培養(yǎng)到鋪滿底后，例如用MOI = 3的腺病毒AxCANCre 來感染細(xì)胞。0067〈3〉F基因缺失型SeV/AF病毒的重構(gòu)和擴(kuò)增將上述導(dǎo)入了外來基因的質(zhì)粒pSeV18VAF用以下方法轉(zhuǎn)染LLC-MK2細(xì)胞。將LLC-MK2細(xì)胞以5xl06個(gè)細(xì)胞/皿接種到100mm的Petri培養(yǎng)皿中。 在用T7 RNA聚合酶進(jìn)行基因組RNA的轉(zhuǎn)錄時(shí)，將細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后， 用經(jīng)補(bǔ)骨脂素和長(zhǎng)波長(zhǎng)紫外線(365nm)處理20分鐘的表達(dá)T7RNA聚合酶的 重組痘苗病毒(PLWUV-VacT7: Fuerst, T. R. ef a/., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83， 8122-8126(1986))，以MOI約為2的水平，在室溫下感染1小時(shí)。用例 如裝有5只15瓦燈泡的UV Stratalinker 2400 (商品目錄號(hào)400676 (100V), Stratagene, La Jolla, CA， USA)對(duì)痘苗病毒進(jìn)行紫外線照射。將細(xì)胞用無(wú)血清 MEM洗滌后，將表達(dá)基因組RNA的質(zhì)粒和分別表達(dá)副粘病毒N、 P、 L、 和F+HN蛋白的質(zhì)粒用適當(dāng)?shù)闹D(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染細(xì)胞。這些質(zhì)粒的用量比優(yōu) 選按照上述順序?yàn)?:2丄2:2，但不限于此。例如，表達(dá)基因組RNA的質(zhì)粒 以及表達(dá)N、 P 、 L和F+HN蛋白的質(zhì)粒(pGEM/NP, pGEM/P, pGEM/L和 pGEM/F-HN; WO0(V70070, Kato, A. ^a/" Genes Cells 1, 569-579 (1996))分別 以12嗎、4昭、2嗎、4嗎和4嗎/皿的量進(jìn)行轉(zhuǎn)染。培養(yǎng)數(shù)小時(shí)后，將細(xì)胞 用無(wú)血清MEM洗兩次，在含40|ig/ml胞嘧啶卩-D-阿拉伯呋喃糖苷(AraC: Sigma, St. Louis, MO)和7.5嗎/ml胰蛋白酶(Gibco-BRL, Rockville, MD)的 MEM中培養(yǎng)?；厥者@些細(xì)胞，將細(xì)胞沉淀懸浮于Opti-MEM(l(f個(gè)細(xì)胞/ml)。 將懸浮液反復(fù)凍融三次，與脂轉(zhuǎn)染試劑DOSPER (Boehlinger Mannheim) (106 個(gè)細(xì)胞/25pl DOSPER)混合，在室溫下放置15分鐘后，轉(zhuǎn)染上述克隆了的 表達(dá)F基因的輔助細(xì)胞(106個(gè)細(xì)胞/孔，12孔板)，用不含血清的MEM(含 有40pg/ml AraC和7.5 pg/ml胰蛋白酶)培養(yǎng)，回收上清。缺失了除F以外 的基因，例如HN基因和/或M基因的病毒可以用同樣的方法制備。 0068在制備病毒基因缺失型載體時(shí)，例如，將在其載體基因組中缺失了不 同的病毒基因的兩種或更多種的載體導(dǎo)入同一細(xì)胞時(shí)，每種載體中缺失的 病毒蛋白可以通過另一種載體的表達(dá)來提供。因此，這些載體可以互補(bǔ)缺 失的蛋白，構(gòu)筑具有感染性的病毒顆粒，其結(jié)果通過復(fù)制循環(huán)可以擴(kuò)增這 些病毒載體。換而言之，能以較低成本大量產(chǎn)生各種病毒基因缺失型病毒 載體的混合物。由于這些缺失有病毒基因的病毒與未缺失有病毒基因的病 毒相比具有較小的基因組，它們可以攜帶較長(zhǎng)的外來基因。此外，由于缺 失有病毒基因而缺乏增殖能力的病毒，被釋放到細(xì)胞外以后也只是單純的 被稀釋，而很難維持感染能力，因此它們不會(huì)產(chǎn)生后代，在環(huán)境釋放的管理方面較有利。例如，可以想到分別構(gòu)建能彼此互補(bǔ)的編碼A卩的載體和編碼Th2細(xì)胞因子的載體，用它們進(jìn)行共感染。本發(fā)明提供一種組合物，該 組合物包含編碼包括AP在內(nèi)的多肽的負(fù)鏈RNA病毒載體，還包含編碼Th2 細(xì)胞因子的負(fù)鏈RNA病毒載體。本發(fā)明還提供一種試劑盒，該試劑盒包含 編碼包括A卩在內(nèi)的多肽的負(fù)鏈RNA病毒載體，還包含編碼Th2細(xì)胞因子 的負(fù)鏈RNA病毒載體。這些組合物和試劑盒可用于減少A(3沉淀。0069當(dāng)將傳播型負(fù)鏈RNA病毒載體施用于個(gè)體或細(xì)胞后，由于在治療結(jié)束 時(shí)必須限制該病毒載體的增殖，顧也可以通過給藥RNA-依賴性RNA聚合 酶抑制劑，僅僅特異性的抑制該病毒載體的增殖，而對(duì)宿主不造成損害。0070根據(jù)本發(fā)明的方法，本發(fā)明的病毒載體可以以，例如，lx 105 ClU/ml 或以上，優(yōu)選lx 1(^CIU/ml或以上，更優(yōu)選5xl()eCKJ/ml或以上，更優(yōu)選 1 x 107 CRJ/ml或以上，更優(yōu)選5x 107 ClU/ml或以上，更優(yōu)選lx 108 ClU/m 或以上，更優(yōu)選5x 1()SCIU/ml或以上的滴度，被釋放到病毒生產(chǎn)細(xì)胞的培 養(yǎng)基中。病毒滴度可以用本說明書及其他記載方法測(cè)定(Kiyotani, K. " Virology 177(1), 65-74 (1990); WO00/70070)。0071可以將回收的病毒載體純化使其達(dá)到基本純。純化方法包括過濾、離心分離和柱純化等公認(rèn)的純化分離方法或上述方法的組合。"基本純"是指病 毒載體在其樣品中占主要成分。 一般來說，當(dāng)樣品中所含的全部蛋白(作為承運(yùn)體和穩(wěn)定劑加入的蛋白除外)中，來自病毒載體的蛋白比例為10%或以 上，優(yōu)選20%或以上，更優(yōu)選50%或以上，優(yōu)選70%或以上，更優(yōu)選80%或以上，進(jìn)一步優(yōu)選90%或以上時(shí)，可以確定為基本純的病毒載體。病 毒的具體純化方法包括，采用纖維素硫酸酯或交聯(lián)多糖硫酸酯的方法(特公昭JP62-30752、特公昭JP62-33879和特公昭JP62-30753),以及吸附于含有 硫酸巖藻糖的多糖和/或其分解產(chǎn)物上的方法(WO 97/32010)。0072在制備包含載體的組合物時(shí)，該載體可以根據(jù)需要與可藥用承運(yùn)體或 賦形劑混合。"可藥用承運(yùn)體或賦形劑"是指可以與本發(fā)明載體一起給藥，不 明顯抑制該載體的基因?qū)牖钚缘牟牧稀＠?，該載體可以用生理鹽水或磷酸鹽緩沖液(PBS)等適當(dāng)稀釋，制成組合物。當(dāng)載體在雞卵中增殖時(shí)，"可 藥用承運(yùn)體或賦形劑"可以包含尿嚢液。另外，包含載體的組合物還可以含 有去離子水和5%葡萄糖水溶液等承運(yùn)體或賦形劑。進(jìn)一步地，還可以含有 上述以外的植物油、懸浮劑、表面活性劑、穩(wěn)定劑和殺菌劑等。另外，可 以添加防腐劑或其它添加劑。包含本發(fā)明載體的組合物可以用作試劑或藥 物。本發(fā)明涉及抗淀粉狀蛋白沉淀藥物的制作方法。所述抗淀粉樣蛋白沉淀藥物包含編碼AP肽的負(fù)鏈RNA病毒載體或該載體所導(dǎo)入的細(xì)胞以及含 有可藥用承運(yùn)體或賦形劑在內(nèi)的組合物的制造步驟。本發(fā)明還涉及在抗淀 粉樣蛋白沉淀藥物的制造過程中，負(fù)鏈RNA病毒載體及產(chǎn)生該載體的細(xì)胞， 或該載體導(dǎo)入細(xì)胞的使用。0073含有本發(fā)明載體的組成物可以包含生物聚合體等有機(jī)物，羥基磷灰石 (hydroxyapatite)等無(wú)機(jī)物。具體地，包含膠原基質(zhì)，聚乳酸聚合物或共 聚物，聚乙二醇聚合物或共聚物和它們的化學(xué)衍生物，它們的組合，作為 承運(yùn)體。0074本發(fā)明的組合物還可以包含Th2細(xì)胞因子和/或以可表達(dá)樣式編碼Th2 細(xì)胞因子的核酸。所述Th2細(xì)胞因子可以是全長(zhǎng)(野生型)多肽，或保持 活性的部分肽。例如N端和/或C末端氨基酸(例如1-30氨基酸，具體為 1、 2、 3、 4、 5、 10、 15、 20、 25氨基酸)的缺失，不會(huì)影響細(xì)胞因子活性。 并且，N末端的信號(hào)序列可被其他信號(hào)序列適當(dāng)置換。另外，細(xì)胞因子也 可作為與其他的肽的融合蛋白來表達(dá)。編碼Th2細(xì)胞因子的核酸或插入表達(dá)載體，或接續(xù)到肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(actin promoter )、 EF1啟動(dòng)子、CMV啟 動(dòng)子、CAG啟動(dòng)子等適合的啟動(dòng)子。核酸，可包含在負(fù)鏈RNA病毒載體或 任何其他的表達(dá)載體內(nèi)。Th2細(xì)胞因子被負(fù)鏈RNA病毒載體編碼時(shí)，Th2 細(xì)胞因子也可與A卩在同一載體內(nèi)被編碼，或者Th2細(xì)胞因子也可在其它負(fù) 鏈RNA病毒載體內(nèi)被編碼。具體地，編碼A卩的本發(fā)明負(fù)鏈RNA病毒載體 在不編碼Th2細(xì)胞因子的情況下，對(duì)于Thl /Th2的平衡，將Th2細(xì)胞因子 或Th2細(xì)胞因子載體與編碼A(3的本發(fā)明載體組合并共同施用時(shí)，移位到 Th2。例如，可使用的Th2細(xì)胞因子可從如下組中加以選擇。IL-4、 IL-5、 IL-6、 IL-9、 IL-IO、及IL-13、或它們的組合。Th2細(xì)胞因子，還可從IL-4、IL-IO、及IL-13等中優(yōu)選。0075本發(fā)明的組合物還可包含佐劑。具體為，本發(fā)明載體即使不編碼Th2 細(xì)胞因子，也可使用含有Th2佐劑的組合物，使Thl / Th2平4耔轉(zhuǎn)位到Th2。 Th2佐劑指的是相對(duì)1型輔助T細(xì)胞(Thl細(xì)胞)，使2型輔助T細(xì)胞(Th2 細(xì)胞)更具活性化的佐劑。具體地，所述佐劑包含氬氧化鋁(alum)、霍亂毒 素(B亞單位)、曼森血吸蟲卵(Schistosoma mansoni egg)4是取蛋白(例如 Lacto-N-fucopentaose III)等(Grun， J. L. and P. H. Maurer, Cellular Immunol, 121: 134-145， 1989; Holmgren, J. et al.， Vaccine 11:1179-1184, 1993; Wilson, A.D. et al., Vaccine 11: 113-118, 1993; Lindsay, D,S. et al, Int. Arch. Allergy Immunol. 105: 281-288, 1994; Xu-Amano， J. et al.， J. Exp. Med. 178: 1309-1320: 1993; Okano, M. et al.， J. Immunol. 167(l):442-50, 2001)。本發(fā)明的組合物還 可包含任意的其它成分。例如，作為給藥后監(jiān)測(cè)用的標(biāo)記，或免疫系統(tǒng)調(diào) 節(jié)因子、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)因子、細(xì)胞因子、激素、受體、抗體、及它們的片 段等的一種或多種化合物。本發(fā)明的組合物，還可包含編碼信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié) 因子、細(xì)胞因子、激素、受體、抗體、及它們的片段等的一種或多種肽的 一種或多種載體。0076通過將生產(chǎn)的負(fù)鏈RNA病毒或包含該病毒的組合物給藥于個(gè)體，可誘 導(dǎo)對(duì)A(3的免疫應(yīng)答，從而減少A卩的沉淀。載體可與Th2細(xì)胞因子，Th2 細(xì)胞因子表達(dá)載體，以及Th2佐劑組合給藥。載體的給藥，可以是體內(nèi)給 藥，也可由細(xì)胞介導(dǎo)進(jìn)行間接(回體)給藥。所接種的負(fù)鏈RNA病毒載體， 只要持有可從基因組RNA對(duì)所攜帶的抗原多肽基因的表達(dá)能力，則無(wú)需是 感染性病毒粒子，也可以是非感染性病毒粒子及病毒核(包含基因組及與 基因組結(jié)合的病毒蛋白質(zhì)的RNA復(fù)合體)。本說明書中，負(fù)鏈RNA病毒載 體指的是一種復(fù)合體，其在被感染細(xì)胞中可復(fù)制自身的基因組RNA，同時(shí) 具有表達(dá)所攜帶基因的能力。該復(fù)合體包含核蛋白(RNP)，所述核蛋白 (RNP)含有來自負(fù)鏈RNA病毒載體的基因組和基因組RNA的復(fù)制及病 毒在表達(dá)攜帶的基因時(shí)所必須的病毒蛋白。RNP是包含例如負(fù)鏈RNA病毒 的基因組RNA以及N、 L、及P蛋白的復(fù)合體。具體來說，本發(fā)明的負(fù)鏈 RNA病毒載體包括含有基因組RNA及結(jié)合基因組RNA的病毒蛋白(如負(fù)鏈RNA病毒的核衣殼)的感染性病毒粒子、非感染性病毒粒子(也稱病毒樣粒子(VLP))及RNP。即使從病毒粒子中去除包膜的RNP (病毒核)， 一旦導(dǎo)入到細(xì)胞中，便可在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制病毒基因組RNA。 (WO 97/16538; WO 00/70055)。也可將RNP或VLP與所望的例如轉(zhuǎn)染劑組合進(jìn)行接種(WO 00/70055; WO 00/70070)。0077通過細(xì)胞接種載體時(shí)，將負(fù)鏈RNA病毒載體導(dǎo)入適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)細(xì)胞或從 被接種動(dòng)物體內(nèi)采集的細(xì)胞中。在體外(試管或培養(yǎng)i),使負(fù)鏈RNA病毒 感染細(xì)胞時(shí)，感染要在例如培養(yǎng)液或生理鹽水等所需的生理水溶液中，在 體外(或回體)進(jìn)行。MOI (感染復(fù)數(shù)(multiple of infection):即每個(gè)細(xì)月包 的感染病毒數(shù))優(yōu)選1 - 1000的范圍，更優(yōu)選2-500，更優(yōu)選3 -300,進(jìn) 而優(yōu)選5- 100。負(fù)鏈RNA病毒與細(xì)胞短時(shí)間接觸即可。例如1分鐘或以 上，優(yōu)選3分鐘或以上，5分鐘或以上，10分鐘或以上。也可接觸20分鐘 或以上。例如，1-60分鐘，更優(yōu)選約5-30分鐘。也可以4妄觸4交長(zhǎng)時(shí)間， 例如幾天或幾天以上。0078包含病毒基因組RNA在內(nèi)的RNP以及非感染性病毒粒子(病毒樣粒 子(VLP)可用已知的轉(zhuǎn)染劑法導(dǎo)入細(xì)胞。具體如磷酸鈣法(Chen， C. & Okayama， H., BioTechniques 6:632-638, 1988; Chen， C. and Okayama, H., Mol. Cell. Biol. 7: 2745, 1987)、 DEAE-葡聚糖法(Rosenthal, N., Methods Enzymol. 152:704-709, 1987)、各種核糖體轉(zhuǎn)染劑(Sambrook, J. et al.， Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989)、以及電穿孑L法(Ausubel， R et al" In Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, NY, Vol, 1, Ch. 5 and 9， 1994)等本行業(yè)公認(rèn)的 多種技術(shù)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染劑中可添加氯喹以防止在內(nèi)體中的降解。(Calos， M. R， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3015， 1983)。 轉(zhuǎn)染劑包括 DOTMA(Roche) 、 Superfect Transfection Reagent(QIAGEN， Cat No.301305)、 DOTAP 、 DOPE 、 DOSPER(Roche #1811169)、 TransIT-LT 1 (Mirus， Product No.CLONfectin(商品目錄號(hào))(Clontech #8020-1)等。已知包膜病毒在形成病毒粒 子時(shí)，將會(huì)攝取源于宿主細(xì)胞的蛋白，該些蛋白在導(dǎo)入細(xì)胞時(shí)，會(huì)具有某種抗原性，可能是導(dǎo)致細(xì)胞毒性的原因。(J. Biol. Chem.， 272: 16578-16584， 1997)。因此，使用去除包膜的RNP是有利的(WO 00/70055)。0079通過將編碼病毒基因組RNA的表達(dá)載體，及編碼復(fù)制基因組RNA時(shí) 所需的病毒蛋白(N、 P和L蛋白)的表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞，可在細(xì)胞內(nèi)直接 形成病毒RNP 。如此制備導(dǎo)入了病毒載體的細(xì)胞。0080調(diào)制負(fù)鏈RNA病毒載體導(dǎo)入了的細(xì)胞后，可進(jìn)行12小時(shí)-5天的細(xì)胞 培養(yǎng)(優(yōu)選1 - 3天)，使其表達(dá)A(3肽。所得細(xì)胞可直接或作為細(xì)胞提取液 對(duì)動(dòng)物進(jìn)行接種。但優(yōu)選使用表達(dá)A(3肽的細(xì)胞來進(jìn)行接種。也可將具有信 號(hào)肽的Ap肽通過載體加以表達(dá)后，并使其被分泌到細(xì)胞外。導(dǎo)入了載體的 細(xì)胞提取液，可用表面活性液溶解細(xì)胞膜的手法或反復(fù)凍結(jié)-融化等方法制 備。Triton X-100及Nonidet P-40等非離子表面活性劑所適用的濃度范圍為 0.1 ~1%。例如，用PBS清洗后，通過離心回收細(xì)胞塊，在TNE緩沖液 [25mMTris-HCl(pH7.5)、 150mMNaCl、 lmMEDTA、 1% Nonidet P-40]內(nèi)再 度懸浮后，置于冰中10-30分鐘，然后通過孵育懸浮液而得。用做抗原的 蛋白質(zhì)可在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)溶解時(shí)，將制備而得的細(xì)胞提取液離心(10,000xg、 10 分鐘)處理，沉淀濾出不要的不溶成分。所得上清可用于免疫。在不希望使 用表面活性劑的部位，制備細(xì)胞提取液時(shí)，清洗后將細(xì)胞懸浮于PBS中， 經(jīng)5-6次反復(fù)凍結(jié)-溶解，細(xì)胞被破壞后也可制備細(xì)胞提取液。細(xì)胞提取 液可與轉(zhuǎn)染劑一起給藥。0081將產(chǎn)生編碼A(3肽的負(fù)鏈RNA病毒載體的核酸施用于動(dòng)物，并通過在 動(dòng)物體內(nèi)生成由負(fù)鏈RNA病毒載體所表達(dá)的A卩肽，可誘導(dǎo)免疫。產(chǎn)生負(fù) 鏈RNA病毒載體的核酸，指的是表達(dá)生成重組負(fù)鏈RNA病毒載體時(shí)所需 的RNA及蛋白群的核酸組。具體地，所述核酸指包含編碼A(3的負(fù)鏈RNA 病毒載體基因組RNA及其互補(bǔ)鏈(反基因組RNA,即正鏈)的核酸，以及 編碼包含負(fù)鏈RNA病毒基因組RNA在內(nèi)的RNP構(gòu)成蛋白質(zhì)群的核酸的核 酸組。這些核酸都含有可以表達(dá)所編碼的RNA及蛋白質(zhì)所需的啟動(dòng)子。例 如CMV啟動(dòng)子(Foecking， M.K， and Hofstetter H., Gene 45: 101-105, 1986)、 逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR(Shinnik, T. M. et al., Nature, 293: 543-548, 1981)、 EF1啟動(dòng)子、及CAG啟動(dòng)子(Niwa， H. et al., Gene. 108: 193-199, 1991、特開平 3-168087)。作為核酸，優(yōu)選使用質(zhì)粒載體。負(fù)鏈RNA病毒的基因組中優(yōu)選 攜帶有編碼構(gòu)成包含基因組RNA的RNP的病毒蛋白群(典型為N、 L、 P) 的基因，以及親代野生型病毒具有的所有包膜構(gòu)成蛋白的基因。負(fù)鏈RNA 病毒基因組，在缺失有包膜構(gòu)成蛋白的任何一種基因時(shí)，編碼與感染性病 毒粒子的形成相關(guān)的包膜蛋白(例如基因組缺失的包膜蛋白或VSV-G等 其他包膜蛋白)的核酸，可以包含在上述核酸組內(nèi)。通過將這些核酸給藥 于動(dòng)物，可在動(dòng)物體內(nèi)生成重組負(fù)鏈RNA病毒。構(gòu)成含有負(fù)鏈RNA病毒 基因組RNA的RNP的病毒蛋白群，指的是與病毒基因組RNA共同形成 RNP,并構(gòu)成核衣殼(nucleocapsid)的蛋白質(zhì)。這些蛋白是基因組復(fù)制和基因 表達(dá)時(shí)所必需的蛋白群，典型的包含N、 P、 L蛋白。具體地，本發(fā)明涉及 包含以下步驟的方法對(duì)動(dòng)物接種(i)編碼AP的負(fù)鏈RNA病毒的基因組 RNA或其互補(bǔ)鏈的核酸；和(ii)編碼N、 P、 L蛋白質(zhì)的核酸。在這些被 接種的動(dòng)物中，形成含有基因組RNA的RNP,并表達(dá)A卩肽。該基因組也 可以編碼Th2細(xì)胞因子。0082此外，也可接種預(yù)先其中導(dǎo)入了編碼基因組RNA或其互補(bǔ)鏈的核酸和 編碼構(gòu)成上述RNP的病毒蛋白群的核酸的細(xì)胞，或該細(xì)胞的提取液。生成 負(fù)鏈RNA病毒載體的核酸的詳細(xì)情況可參考以下文獻(xiàn)WO 97/16539; WO 97/16538; WO 00/70055; WO 00/70070; WO 01/18223; WO 03/025570; Durbin: A. P. et al., Virology 235: 323-332, 1997; Whelan， S, R et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 8388-8392, 1995; Schnell. M. J. et al.， EMBO J. 13: 4195-4203, 1994; Radecke, F. et al.， EMBO J. 14: 5773-5784, 1995; Lawson, N. D. et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4477-4481， 1995; Garcin, D. et al.， EMBO J. 14: 6087-6094, 1995; Kato， A. et al., Genes Cells 1: 569-579, 1996; Baron, M. D. and Barrett, T., J. Virol. 71: 1265-1271, 1997; Bridgen, A. and Elliott, R. M,, Pro" Natl. Acad. Sci. USA 93: 15400-15404， 1996; Hasan， M. K. et al., J, Gen. Virol. 78: 2813-2820, 1997; Kato, A. et al.， EMBO丄16: 578-587, 1997; Yu, D. et al" Genes Cells 2: 457-466, 1997; Tok麵mi， T. et al" Vims Res. 2002: 86; 33-38, 1997; Li， H.-O. et al.， J. Virol" 74: 6564-6569， 2000。0083將生成負(fù)鏈RNA病毒載體的核酸接種于動(dòng)物時(shí)，編碼Ap的負(fù)鏈RNA 病毒的基因組RNA或編碼其互補(bǔ)鏈的核酸，與編碼N、 P、 L蛋白的核酸可 按5: 0.5: 0.5: 2的重量比導(dǎo)入動(dòng)物體內(nèi)。核酸的比例可適當(dāng)調(diào)整。例如 使用表達(dá)質(zhì)粒時(shí)，可用編碼含有編碼A卩的病毒基因組RNA(正鏈或負(fù)鏈) 的質(zhì)粒5嗎~ IOOO嗎，以及N表達(dá)質(zhì)粒0.5嗎 200嗎，P表達(dá)質(zhì)粒0.5嗎 200嗎，L表達(dá)質(zhì)粒2嗎 500嗎進(jìn)行給藥。核酸的給藥，例如可將棵DNA 直接或與轉(zhuǎn)染劑混合后注入實(shí)施。轉(zhuǎn)染劑中含有例如陽(yáng)離子脂質(zhì)體 (lipofectamine)及聚陽(yáng)離子脂質(zhì)體。具體可利用如下試劑DOTMA(Roche)、 Superfect(QIAGEN #301305〉、 DOTAP、 DOPE、 DOSPER(Roche # 1811169)、 TransIT-LTl(Mirus, Product No. MIR 230)。0084本發(fā)明載體的給藥量視疾病種類、患者的體重、年齡、性別、癥狀、 給藥目的、給藥組合物的劑型、給藥方法和導(dǎo)入基因類型等而異。給藥途 徑可以適當(dāng)選擇，例如，經(jīng)皮、鼻腔內(nèi)、經(jīng)支氣管、肌肉內(nèi)、腹腔內(nèi)、靜 脈內(nèi)、及皮下給藥，但不限于此。尤其優(yōu)選肌肉(例如腓腸肌)或皮下給 藥、點(diǎn)鼻或噴霧給藥、手掌或足背皮內(nèi)、脾臟內(nèi)直接給藥、腹腔內(nèi)給藥等。 接種部位可為一到多處，如2-15處均可。接種量可根據(jù)纟皮接種動(dòng)物，接 種部位及接種次數(shù)等適當(dāng)調(diào)整。載體可約105 -約10"CIU/ml，優(yōu)選約107 -約109CIU/ml,更優(yōu)選約lx108 -約5xl()8CIU/ml的范圍內(nèi)的給藥量， 也可與可藥用承運(yùn)體組合給藥。對(duì)人的一次給藥量換算成病毒滴度為lx 104CIU - 5x 1011 CIU (細(xì)胞感染單位),優(yōu)選2x 105CIU - 2x 1010 CIU。給藥次 數(shù)可視其臨床上可容許范圍內(nèi)的副作用，可為一次或多次給藥。1日給藥次 數(shù)也可依此調(diào)整。盡管一次給藥也可收到明顯的效果，但給藥本載體1次 以上，其效果會(huì)更加顯著。0085多次給藥時(shí)可在例如首次給藥約1年后再次給藥。優(yōu)選給藥途徑，例 如為鼻腔內(nèi)或肌肉內(nèi)給藥。為了增強(qiáng)療效可反復(fù)給藥。多次給藥時(shí)優(yōu)選使 用上述攜帶編碼A卩核酸的負(fù)鏈RNA病毒載體，生成病毒載體的核酸，病 毒載體或生成載體的核酸所導(dǎo)入的細(xì)胞，以及細(xì)胞提取液進(jìn)行接種。0086在通過細(xì)胞(例如人細(xì)胞)進(jìn)行接種載體(回體給藥)時(shí)，優(yōu)選對(duì)自身細(xì)胞感染負(fù)鏈RNA病毒載體，并使用104 - 109個(gè)細(xì)胞，或優(yōu)選105 -108個(gè)細(xì)胞或其細(xì)胞提取液。該載體可用于對(duì)人類以外的其它動(dòng)物的接種，給藥量可以根據(jù)目的動(dòng)物和人的體重比或給藥部位體積比(例如，平均值) 換算藥量。含有本發(fā)明載體的組合物的給藥對(duì)象，包括擁有免疫系統(tǒng)的所 望的脊推動(dòng)物(人或非人脊推動(dòng)物)，優(yōu)選鳥類及哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選哺乳動(dòng) 物(包括人或非人哺乳動(dòng)物)。具體地，哺乳動(dòng)物包括人以及猴等非人靈長(zhǎng) 類，小鼠、大鼠等嚙齒類，兔、綿羊、山羊、豬、牛及狗等其他所有的哺乳動(dòng)物。作為給藥對(duì)象的動(dòng)物，例如患有阿爾茨海默病的個(gè)體，A(3水平亢 進(jìn)的個(gè)體，A(3沉淀亢進(jìn)的個(gè)體，具有阿爾茨海默病型變異基因的個(gè)體等。0087通過本發(fā)明的方法可以誘導(dǎo)對(duì)A|3的免疫應(yīng)答。所述對(duì)Ap的免疫應(yīng)答， 可以通過抗A(3抗體的產(chǎn)生，腦組織內(nèi)A(3量的減少以及A卩沉淀的減少等 確認(rèn)。抗A(3抗體的產(chǎn)生，可通過^r測(cè)血液中的抗AP抗體來測(cè)定?？贵w水 平可才艮凈居ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)或?yàn)鹾仗乩誓岱y(cè)定。 ELISA法是將抗原吸著在多孔板上，制備抗血清。將制備的抗血清階段性2 倍稀釋(開始溶液1: 1000)，然后加到多孔板中完成抗原抗體反應(yīng)。為 了進(jìn)行發(fā)色反應(yīng)，將免疫動(dòng)物的抗體與作為2次抗體的由過氧化物酶標(biāo)記 的異種抗體發(fā)生反應(yīng)。吸光度在最大發(fā)色吸光度的1/2時(shí)，根據(jù)抗體的稀 釋倍數(shù)可算出抗體效價(jià)。另外，烏赫特朗尼法是在瓊脂內(nèi)使抗原及抗體擴(kuò) 散，其免疫沉降反應(yīng)結(jié)果呈現(xiàn)白色沉降線。沉降線可以用于測(cè)定發(fā)生免疫 沉降反應(yīng)時(shí)抗血清的稀釋倍數(shù)的抗體效價(jià)。腦組織中的A(3量，可以用例如 腦組織的提取物及Biosource ELIS A kit測(cè)定。0088A卩沉淀(老年斑)的減少效果，可以通過以下方法測(cè)定將腦組織切 片用70%蟻酸處理，用5%&02使內(nèi)源性過氧化物酶失活后，使抗A卩抗體 和切片發(fā)生反應(yīng)，然后用過氧化物酶標(biāo)2次抗體進(jìn)行DNA染色。染色后， 在顯^t鏡下觀察并測(cè)定A(3蓄積部分的面積。與未施用本載體時(shí)相比，如果 測(cè)出蓄積部分面積減少時(shí)，則可判斷A(3的沉積量減少。此外，將 1 -Fluoro-2,5-bis-(3-hydroxycarbonyl-4-hydroxy)styrylbenzene(FSB^與A卩具 有親和性的化合物靜注給藥后、利用MRI觀察在活體內(nèi)的老年斑(Higuchi M et al., Nat. Neurosci, 8(4):527-33， 2005; Sato， K, et al., Eur. J. Med. Chem. 39:573, 2004; Khmk, W. E. et al.， Ann. Neurol. 55(3):306-19, 2004)。如上通過非4曼 襲性沉淀圖像技術(shù)可確認(rèn)本發(fā)明載體的效果。 0089本發(fā)明包含關(guān)于測(cè)定AP免疫反應(yīng)方法的如下步驟。即將本發(fā)明的載體 或包含載體的組合物導(dǎo)入含有AP沉淀的對(duì)象的步驟，以及檢出該對(duì)象體內(nèi)對(duì)該對(duì)象體內(nèi)沉淀的A(3量的檢出步驟。根據(jù)上述方法，可以監(jiān)控對(duì)A卩的 免疫反應(yīng)和/或A(3沉淀的減少效果。


圖1Litmus SalI/Nhelfrg-MtsHNtsPLmut-dFmlL10(以下簡(jiǎn)稱Litmus TS-dF mlL10)的構(gòu)建過程示意圖。在Litmus TS-dF的F基因缺失部位導(dǎo)入突 變使其含有Notl位點(diǎn)，在此插入用Notl切出的mIL-10基因。的構(gòu)建過程示意圖。將插入到pBluescript(商標(biāo))中Notl部位的A(3基因切出、 插入到pSeV18+Notl/TS-dF的Notl部位。圖3pSeV18+A(3/MtsHNtsP511Lmut-dF mILlO (以下筒稱 pSeV18+A卩/TS-dF mILlO)的構(gòu)建過程示意圖。將pSeV18+A(3/TS畫dF和 Litmus TS-dF mILlO用Sail和Nhel切出所需片段進(jìn)行置換。圖4SeV-A(31-43/mlL-10或?qū)φ蛰d體鼻腔內(nèi)給藥4和8周后的APP 轉(zhuǎn)基因小鼠血清中的抗A卩抗體水平示意圖。圖5SeV-A(31-43/mlL-10或?qū)φ蛰d體鼻腔內(nèi)給藥8周后的APP轉(zhuǎn)基 因小鼠前腦葉中的老年斑示意圖。圖6SeV-Api-43/mlL-10或?qū)φ蛰d體鼻腔內(nèi)給藥8周后的APP轉(zhuǎn)基 因小鼠頭頂葉中的老年斑示意圖。圖7SeV-A(31-43/mlL-10或?qū)φ蛰d體鼻腔內(nèi)給藥8周后的APP轉(zhuǎn)基 因小鼠海馬中的老年斑示意圖。圖8SeV-Api-43/mlL-10或?qū)φ蛰d體鼻腔內(nèi)給藥8周后的APP轉(zhuǎn)基 因小鼠老年斑(前腦葉、頭頂葉、及海馬)的定量結(jié)果示意圖。圖9SeV-Ap卜43/mlL-IO或?qū)φ蛰d體鼻腔內(nèi)給藥S周后的APP轉(zhuǎn)基因小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)探討結(jié)果示意圖。前腦葉中的T細(xì)胞浸潤(rùn)以CD3為指示劑進(jìn)行了檢測(cè)。海馬中的神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞的變化以Iba-l 為指示劑進(jìn)行了檢測(cè)。圖1 0SeV-A(31-43/mIL-10或?qū)φ蛰d體鼻腔內(nèi)給藥S周后的APP轉(zhuǎn) 基因小鼠腦組織中的A卩量示意組圖。圖1 1SeV-Af31-43/mlL-10b或?qū)φ蛰d體肌肉內(nèi)給藥4和S周后的 APP轉(zhuǎn)基因小鼠血清中的A卩抗體水平示意圖。圖1 2SeV-Apl-43/mlL-]0或?qū)φ蛰d體肌肉內(nèi)給藥8周后的APP轉(zhuǎn) 基因小鼠前腦葉中的老年斑照片。圖1 3SeV-A卩l(xiāng)-43/mlL-10或?qū)φ蛰d體肌肉內(nèi)給藥8周后的APP轉(zhuǎn) 基因小鼠頭頂葉中的老年斑照片。圖1 4SeV-A(31-43/mlL-10或?qū)φ蛰d體肌肉內(nèi)給藥8周后的APP轉(zhuǎn) 基因小鼠海馬中的老年斑照片。圖1 5SeV-A卩l(xiāng)-43/mlL-10或?qū)φ蛰d體肌肉內(nèi)給藥8周后的APP轉(zhuǎn) 基因小鼠的老年斑(前腦葉、頭頂葉及海馬)的定量結(jié)果示意圖。圖1 6SeV-A卩l(xiāng)-43/mlL-10或?qū)φ蛰d體肌肉內(nèi)給藥8周后的在前腦 葉中的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)探討結(jié)果的照片。圖1 7SeV-A(31-43/mlL-10或?qū)φ蛰d體的肌肉內(nèi)給藥8周后的腦組 織中A卩量的示意組圖。圖1 8SeV-A(31-43/mIL-10鼻腔給藥后的正常小鼠的血清抗AJ3抗 體水平圖。圖1 9編碼細(xì)胞因子的仙臺(tái)病毒治療用載體的鼻腔內(nèi)給藥后的正常 小鼠的血清抗A卩抗體水平示意圖。0090實(shí)施本發(fā)明的最佳形態(tài)通過以下實(shí)施例具體說明本發(fā)明，但并不限于此。本說明書中引用的 文獻(xiàn)可供參照。0091[實(shí)施例1 ]構(gòu)建攜帶A(3基因的負(fù)鏈RNA病毒基因組cDNA。 (1 - l)NotI片段的構(gòu)建(負(fù)鏈RNA病毒載體的轉(zhuǎn)錄信號(hào)的附加)作為模版，通過在人A(3肽1 ~43(序列號(hào)27)中加入淀粉樣蛋白前 體蛋白(APP:序列登記號(hào)AF282245)的分泌信號(hào)(1 ~ 18氨基酸)，作為編碼 分泌型A卩肽(序列號(hào)28)的基因(特開2005-21149;序列號(hào)1),用 phAbeta-Nnotl(序列號(hào)19)和phAbeta-Cnotl(序列號(hào)20)的2種引物進(jìn)行 PCR，將所得PCR產(chǎn)物用Notl消化，然后在pBluescript(商標(biāo))II KS(Stratagene) 中克隆，構(gòu)建了包含仙臺(tái)病毒轉(zhuǎn)錄信號(hào)的A卩肽基因的Notl片段(序列號(hào) 21)。小鼠IL-10(mlL10)也同樣，以mIUO cDNA為模板(序列登記號(hào) NMJ)10548;序列號(hào)2)，用pmlL10-N(序列號(hào)22)及pmlL10-C(序列號(hào) 23)2種引物進(jìn)行PCR。所得PCR產(chǎn)物用Notl消化后、在pBluescript(商標(biāo))II KS(Stratagene)中克隆，構(gòu)建了包含仙臺(tái)病毒轉(zhuǎn)錄信號(hào)的IL10基因的Notl 片段(序列號(hào)24)。 0092序列號(hào)1AAGTCGCTATGACAACACCGCCCACCATGAGTCC 序列號(hào)21gcggccgccaaggttcacttATGCTGCCCGGTTTGGCACTGCTCCTGCTGGCCCGACTTAAccgtagtaagaaaaacttagggtgaaagttcatcgcggccgc 序列號(hào)2GAAAAGCTAA 序列號(hào)22TGCCTG序列號(hào)23TTAGCTTTTCATTTTGATCATCATGTATGCTTC 序列號(hào)24gcggccgccaaagttcaATGCCTGGCTCAGCACTGCTATGCTGCCTGCTCTTGATGATCAAAATGAAAAGCTAAccgtagtaagaaaaacttagggtgaaagttcatcgcggccg0093(1 - 2)在F基因缺失部位插入mILlO NotI片斷將在9個(gè)位點(diǎn)導(dǎo)入了氨基酸突變(M蛋白G69E、 T116A及A183S; HN蛋白A262T、 G264R及K461G; P蛋白質(zhì)L511F; L蛋白N1197S 及K1795E)的 F基因缺失型 SeV載體(WO 2003/025570)的 cDNA(pSeV8+Notl/TSAF)通過Sail及Nhel消化后、亞克隆到了 Litmus38(New England Biolabs)中。接著在所獲得的含有M及HN基因的 Litmus TSAF質(zhì)粒的F基因缺失部位，導(dǎo)入NotI切割位點(diǎn)的突變。模板使 用Litmus TSAF，然后利用F—lit3008—Notl(序列號(hào)25)及R—lit3020—Notl(序 列號(hào)26)2種引物進(jìn)行PCR、由此來導(dǎo)入Notl切割位點(diǎn)(圖1上)。將此Litmus TSAF NotI用NotI消化后，插入mILlO基因的NotI片段(圖1下)。序列號(hào)25: AAGCGGCCGCCTCAAACAAGCACAGATCATGGATG 序列號(hào)26: AGGCGGCCGCTTAATTAACCAAGCACTCACAAGG0094(l-3)構(gòu)建攜帶AP基因的F基因缺失型SeVcDNA在被NotI消化了的pSeV18+Notl/TSAF上的NotI部位插入A卩肽基因的NotI片段，構(gòu)建了攜帶有A卩基因的F基因缺失型SeVcDNA(pSeV18+A(3/TSAF)(圖2)。0095(1-4)構(gòu)建同時(shí)攜帶有A(3基因和IL-10基因的F基因缺失型SeV基因 組cDNA。使用Sail和Nhel消化pSeV18+Ap/TSAF后，回收了不含有M及HN 基因的片段。同時(shí)，用Sail和NheI消化Litmus TSAF-mILlO,并制備了包 含M及HN基因的片段。將該2個(gè)片段連接后，構(gòu)建了攜帶有AP基因和 IL-10基因的F基因缺失型SeV基因組cDNA(pSeV18+A卩/TSAF-mEL10)(圖3)。0096[實(shí)施例2]仙臺(tái)病毒載體的重構(gòu)和擴(kuò)增病毒的重構(gòu)及擴(kuò)增，按照Li等報(bào)告的方法(Li， H,O. et al., J. Virology 74: 6564-6569,2000; WO (XV70070),及改良法(PCT/JP2005/00705)進(jìn)行。由于病毒載體是F基因缺失型，所以使用了提供F蛋白的輔助細(xì)胞。該輔助細(xì)胞是使用Cre/loxP誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)制備的。該系統(tǒng)利用了通過Cre DNA重組酶 誘導(dǎo)表達(dá)基因產(chǎn)物而設(shè)計(jì)的質(zhì)粒pCALNdLw(Arai, T. et al.， J. Virol. 72: 1115-1121， 1988),按照Saito等方法(Saito, I. et al., Nucl. Acid Res. 23: 3816-3821, 1995; Arai, T. et al., J. Virol. 72: 1115-1121, 1998),在由 pCALNdLw質(zhì)粒轉(zhuǎn)化了的細(xì)胞中感染表達(dá)Cre DNA重組酶的重組腺病毒 (AxCANCre)0097通過上述方法制備了攜帶有A卩基因的F基因缺失型SeV載體 (SeV18+A(3/TSAF),和同時(shí)攜帶有A(3基因和IL-10基因的F基因缺失型SeV 載體(SeV18+A(3/TSAF-mlL10)。編碼SeV18+A卩/TSAF-mlL10的正鏈DNA 序列號(hào)為4，編碼基因組RNA(負(fù)鏈)的核苷酸序列號(hào)為5。作為對(duì)照， 取代A(3基因和IL-10基因，在F基因缺失部位制備了攜帶LacZ基因的SeV 載體(86￥18+ LacZ /TSAF;也稱為「 SeV LacZ J )。0098[實(shí)施例3]對(duì)阿爾茨海默病試驗(yàn)動(dòng)物模型進(jìn)行SeV-A卩l(xiāng)-"/mlL10鼻腔 內(nèi)給藥及其效果(3 - 1)試^r動(dòng)物及給藥方法使用24 ~ 25個(gè)月齡的APP轉(zhuǎn)基因鼠(Tg2576)(Hsiao， K., et al., Science 274:99-102, 1996)，探討了本發(fā)明的SeV18+A卩/TSAF-mlL10(以下稱為 rSeV-Apl-43/mIL-10」)的效果。將小鼠分為治療組和對(duì)照組，每組各4只 小鼠。對(duì)治療組小鼠進(jìn)行了 SeV-A卩l(xiāng)-43/mlL-10(每只5xl06 CIU)鼻腔內(nèi)給 藥，對(duì)對(duì)照組小鼠進(jìn)行了 SeVLacZ(每只5xl06CIU)鼻腔內(nèi)給藥。0099(3 - 2)測(cè)定血清中的抗A(3抗體在上述處置4-8周后，對(duì)小鼠進(jìn)行了采血，并測(cè)定其血清中的抗 A卩42抗體量。將A(31-42肽(5嗎/mL)吸附在96孔試驗(yàn)平板(Nunc， MaxiSorp) 上。用5。/。脫脂乳/TBS-T緩沖液阻斷后，加入小鼠血清(500倍稀釋)，用過 氧化物酶標(biāo)記的抗鼠IgG抗體進(jìn)行了檢測(cè)。抗體效價(jià)根據(jù)ELISA的吸光度 來測(cè)定評(píng)價(jià)(O.D.450)。0100結(jié)果如圖4所示。與對(duì)照組相比，治療組的每只小鼠的抗體效價(jià)均有明顯增加。0101(3 - 3)SeV-A(31-43/mIL-10的老人斑去除效果對(duì)上述仙臺(tái)病毒載體鼻腔內(nèi)給藥8周后的小鼠(27或28月齡)進(jìn)行了 解剖，并制備了前腦葉皮質(zhì)，頭頂葉及海馬皮質(zhì)的腦組織切片。為了測(cè)定A卩 蛋白或老年斑，對(duì)上述組織的冷凍切片做了如下處理。將組織切片用70% 的蟻酸處理后，用5% 11202使內(nèi)源性過氧化物酶滅活。然后，將組織切片 與兔抗pan-A(3抗體(1000倍稀釋)發(fā)生反應(yīng)，加入過氧化物酶標(biāo)二次抗體， 進(jìn)行DAB染色。將染色了的切片在連接有顯微鏡的3CCD照相機(jī)下觀察， 并測(cè)定各區(qū)域的AJ3蓄積面積，并計(jì)算其面積率。0102切片的染色結(jié)果如圖5 (前腦葉)，圖6(頭頂葉)，圖7(海馬)所示。 A卩沉積面積率如圖8所示。前腦葉，頭頂葉，海馬的老年斑經(jīng) SeV-Aj31-43/mlL-10給藥后，比對(duì)照組明顯減少了 10%-20%。0103(3 - 4)SeV-A(31-43/mlL給藥的安全性探討用上述(3-3)同樣的方法制備了給藥后8周期間(26~27個(gè)月齡)的治療 組及對(duì)照組d 、鼠的前腦葉及海馬組織的冷凍切片。使用抗CD3抗體(T細(xì) 胞)、抗Iba-l抗體(小膠質(zhì)細(xì)胞)，對(duì)冷凍切片進(jìn)行ABC法染色，確認(rèn)是否 有中樞神經(jīng)系統(tǒng)的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)及神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞的變化。如圖9所示， 在治療組及對(duì)照組的前腦葉和海馬中均未觀察到所述T淋巴細(xì)胞(作為pan T細(xì)月包標(biāo)記的CD3陽(yáng)性的細(xì)胞)的浸潤(rùn)。該結(jié)果表明，使用本載體進(jìn)行治療 時(shí)，可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥的可能性極低。作為神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記的 IBA-1陽(yáng)性細(xì)胞的量，在對(duì)照組和治療組之間顯示為同等程度，以此確認(rèn)了 在治療組中未出現(xiàn)極端活化(蓄積)。0104(3 - 5)測(cè)定腦組織中A(3沉淀將小鼠的大腦及小腦沿正中裂切開， 一半在-80。C下迅速冷凍后保存。 將腦半球置于lml的TBS溶液中使其均一化后、用桌型超離心機(jī)在IOO，OOO g下，離心1小時(shí)。保存可溶性級(jí)分(TBS級(jí)分)。將不溶級(jí)分在2。/。SDS中 溶解并均一化后，再在100,000 g下離心1小時(shí)。保存所得的可溶性級(jí)分(2%SDS級(jí)分)。將不溶級(jí)分在70 0/。蟻酸中溶解并均一化后再進(jìn)行100,000 g 下的1小時(shí)離心。保存所得可溶性級(jí)分(蟻酸級(jí)分)。腦組織中的A(340及42, 使用Biosource ELISAkit進(jìn)行測(cè)定。將TBS級(jí)分4倍稀釋；2 % SDS級(jí)分進(jìn) 行400 ~ 2000倍稀釋；蟻酸級(jí)分用lMTris溶液稀釋1000倍。為便于測(cè)定， 將稀釋了的級(jí)分用ELISA稀釋液再進(jìn)行(2 ~ 10倍)稀釋。0105如圖10所示，在SDS級(jí)分，蟻酸級(jí)分，以及TBS級(jí)分中均能確認(rèn)至'j， SeV-A(31-43/mIL-10投藥后腦組織中的Ap水平明顯降低。0106[實(shí)施例4]對(duì)阿爾茨海默病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型進(jìn)行SeV-A卩l(xiāng)-43/mlL10的肌 肉內(nèi)給藥的效果(4 - l)動(dòng)物及給藥方法除給藥途徑以外，與上述鼻腔內(nèi)給藥完全相同，將5xl()SCIU給藥量的 SeV-A卩l(xiāng)-43/mlL-10載體注入后肢大腿月幾肉內(nèi)。0107(4 - 2)測(cè)定血清中抗A卩抗體通過使用與上述鼻腔內(nèi)給藥的相同手法，測(cè)定了 SeV-Api-43/mlL10肌 肉內(nèi)給藥后的小鼠血清中的抗Ap抗體量。其結(jié)果如圖11。 0固(4 - 3)SeV-A卩l(xiāng)-43/mlL10的老年斑消失效果通過使用與上述鼻腔內(nèi)給藥的相同方法，將SeV-Api-43/mIL10載體肌 肉內(nèi)給藥后，探討了腦前葉，頭頂葉，及海馬中的老年斑消失效果。其結(jié) 果如圖12 (前腦葉)，圖13 (頭頂葉)，圖14 (海馬)所示。AJ3沉積面積 率如圖15所示，顯示了各處的A(3沉淀的減少。0109(4 - 4)SeV-Api-43/mIL10給藥安全性的探討與上述鼻腔內(nèi)給藥的方法相同，將SeV-A卩l(xiāng)-43/mlU0載體肌肉內(nèi)給藥 后確認(rèn)了中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)情況。如圖16所示，在對(duì)照組和 治療組中均未觀察到前腦葉中的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。0110(4 - 5)測(cè)定腦組織中的Ap與上述鼻腔內(nèi)給藥的方法相同，將SeV-A(31-43/mIL10載體肌肉內(nèi)應(yīng)合藥 后測(cè)定了腦組織中的AJ340及AP42。結(jié)果如圖17所示。在lt個(gè)可溶性級(jí)分 中，都確i人到A(3水平的減少。0111[實(shí)施例5]對(duì)正常小鼠進(jìn)行SeV-Apl-"/hlL10鼻腔內(nèi)給藥后出現(xiàn)抗體效 價(jià)的上升(5-1)動(dòng)物及給藥方法使用 6 周齡的 C57BL/6N 小鼠檢驗(yàn)了本發(fā)明 SeV18+Api畫43/TSAF-hlL10(以下也稱r SeV-A卩l(xiāng)-43/ML-10」)的效果。將小 鼠分為3組，每組各6只。按組分別對(duì)每只小鼠進(jìn)行了 SeV-Api-43/hIL-lO 鼻腔內(nèi)給藥(組l: 5xl()5ciU/只、組2: 5xl06CIU/^、、組3: 5xl07 CIU/ 乂、)。0112(5 _ 2 )測(cè)定血漿中的抗Ap抗體 給藥前及給藥2, 4,及8周后分別對(duì)小鼠進(jìn)行了采血，并測(cè)定了小鼠 血漿中存在的抗AJ342抗體量。將AJ31-42肽(4)ig/mL)吸附在96孔的試驗(yàn)平 板上(Nunc, MaxiSorp)。用1 %BSA/2 %山羊血清/ TBS -T緩沖液阻斷后， 加入小鼠血漿(300倍稀釋)，用過氧化物酶標(biāo)抗鼠IgG抗體檢測(cè)?？贵w效價(jià) 根據(jù)ELISA的吸光度的測(cè)定來評(píng)價(jià)(O.D.450)。0113結(jié)果如圖18所示，抗A(3抗體量在3個(gè)組中隨著時(shí)間的推移逐漸增加。 通過載體給藥，隨著給藥量的增加抗體量也增加，但在組2 (5xl()SciU/只) 及組3 (5xlO CIU/只)中未觀察到抗體量的明顯差異。該結(jié)果表明.，由于 給藥本發(fā)明的試劑(SeV-Api-43/hlL-10)所產(chǎn)生的對(duì)抗A(3抗體的誘導(dǎo)，不是 特異的只存在于阿爾茨海默病實(shí)驗(yàn)小鼠模型(APP Tg小鼠)中，在正常小鼠 中也獲得了充分的效果。0114[實(shí)施例6]在對(duì)正常小鼠鼻腔內(nèi)給藥過程中編碼對(duì)阿爾茨海默病治療載 體的細(xì)胞因子的效果(6- l)動(dòng)物及給藥方法將編碼有數(shù)個(gè)細(xì)胞因子的基因插入到上述阿爾茨海默病治療載體中。使用6周齡的C57BL/6N小鼠檢驗(yàn)了這些仙臺(tái)病毒載體的效果。將小鼠分為 3組，每組各6只。將仙臺(tái)病毒載體(攜帶有編碼A(3肽基因、以及攜帶有編 碼鼠IL-4、 IL-5、或IL-6基因的載體；分別稱為SeV-A卩l(xiāng)-42/mlL-4、 SeV-A卩l(xiāng)-42/mlL-5、或SeV-A卩l(xiāng)-42/mlL-6)，對(duì)每只小鼠進(jìn)行鼻腔內(nèi)給藥 (5xl06 CIU/10|il)。0115(6 - 2 )測(cè)定血漿中的抗A卩抗體 給藥前及給藥1及2周后，對(duì)小鼠進(jìn)行采血，并測(cè)定小鼠血漿中的抗A卩 抗體量。將A卩l(xiāng)-42肽(4嗎/mL)吸附在96孔試驗(yàn)平板上(Nunc， MaxiSorp)。 用r/。BSA/2。/。山羊血清/TBS -T緩沖液阻斷后，加入小鼠血漿(300倍稀 釋)，用過氧化物酶標(biāo)抗鼠IgG抗體纟全測(cè)。抗體效價(jià)根據(jù)ELISA的吸光度的 測(cè)定來評(píng)價(jià)(O.D.450)。0116結(jié)果如圖19所示?？笰卩抗體量在3個(gè)組中都隨著給藥后時(shí)間的推移 逐漸增加。結(jié)果表明IL-4、 IL-5、及IL-6具有有效誘導(dǎo)抗A(3抗體的效果， 由此優(yōu)選含有同時(shí)攜帶編碼A(3抗原的核酸、和IL-4、 IL-5、 IL-6中之一或 數(shù)個(gè)細(xì)胞因子的核酸的仙臺(tái)病毒載體的制劑，該制劑在阿爾茨海默病的治 療中可誘導(dǎo)抗AP抗體。0117產(chǎn)業(yè)實(shí)用性本發(fā)明提供了可以有效減少A(3沉積的一種新型負(fù)鏈RNA病毒載體。 本發(fā)明的載體可有效地治療阿爾茨海默病。
權(quán)利要求
1. 一種負(fù)鏈RNA病毒載體，該載體含有編碼β淀粉樣蛋白的核酸。
2. 權(quán)利要求1的負(fù)鏈RNA病毒載體，其中所述載體還包含編碼Th2 細(xì)胞因子或其部分肽的核酸。
3. 權(quán)利要求2的負(fù)鏈RNA病毒載體，其中所述Th2細(xì)胞因子或其部分 肽是IL-10或其部分肽。
4. 權(quán)利要求l的載體，其中所述負(fù)鏈RNA病毒載體是副粘病毒載體。
5. 權(quán)利要求4的載體，其中所述副粘病毒載體是仙臺(tái)病毒載體。
6. 權(quán)利要求l的載體，其中所述P淀粉樣蛋白是Aj343或其部分肽。
7. 權(quán)利要求l的載體，其中所述卩淀粉樣蛋白來源于人。
8. 權(quán)利要求3的載體，其中所述IL-IO源于小鼠或人。
9. 權(quán)利要求1的載體，其中所述(3淀粉樣蛋白是序列號(hào)為1的核苷酸 序列所編碼的多肽或其一部分。
10. 權(quán)利要求3的載體，其中所述IL-10是序列號(hào)為2或3的核苷酸序 列所編碼的多肽。
11. 權(quán)利要求1的負(fù)鏈RNA病毒載體，其中所述載體包含序列號(hào)為5的核酸。
12. 包含權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的載體及藥理學(xué)上可容許的承運(yùn) 體的組合物。
13. 權(quán)利要求12的組合物，其中還包括(i)以可表達(dá)樣式編碼Th2細(xì) 胞因子或其部分肽的核酸，(ii) Th2細(xì)胞因子或其部分肽，或(iii)Th2佐劑。
14. 權(quán)利要求13的組合物，其中包含Th2細(xì)胞因子、其部分肽或Th2佐劑。
15. 權(quán)利要求13的組合物，其中包含以可表達(dá)樣式編碼Th2細(xì)胞因子或其部分肽的核酸。
16. 權(quán)利要求15的組合物，其中所述Th2細(xì)胞因子是由包含有編碼p 淀粉樣蛋白的核酸的負(fù)鏈RNA病毒載體所編碼的。
17. 權(quán)利要求15的組合物，其中所述Th2細(xì)胞因子是由包含編碼卩淀 粉樣蛋白的核酸的負(fù)鏈RNA病毒載體以外的載體所編碼的。
18. 權(quán)利要求12的組合物，該組合物是藥學(xué)組合物。
19. 用于治療和預(yù)防阿爾茨海默病的藥學(xué)組合物，包含權(quán)利要求1-11 中任一項(xiàng)所述的載體。
20. 權(quán)利要求19的組合物，還包含(i)以可表達(dá)樣式編碼Th2細(xì)胞因 子或其部分肽的核酸，(ii) Th2細(xì)胞因子或其部分肽，或(iii)Th2佐劑。
21. 權(quán)利要求18或19的藥學(xué)組合物，是用于鼻腔內(nèi)給藥的藥學(xué)組合物。
22. —種使卩淀粉樣蛋白沉淀減少的方法，其中包含給藥權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的載體，或者包含該載體的組合物的步驟。
23. —種阿爾茨海默病的治療或預(yù)防方法，其中包含給藥權(quán)利要求l-11中任一項(xiàng)所述的載體或者包含該載體的組合物的步驟。
24. 權(quán)利要求22或23中所述的方法，所述給藥為鼻腔內(nèi)給藥。
25. 權(quán)利要求22或23中所述的方法，所述給藥為肌肉內(nèi)給藥。
26. 權(quán)利要求22或23的方法，其中還包含給藥Th2細(xì)胞因子、其部分 肽、Th2佐劑或編碼Th2細(xì)胞因子及其部分肽載體的步驟。
27. 權(quán)利要求26的方法，其中所述方法為給藥Th2細(xì)胞因子、其部分 肽、或Th2佐劑的方法。
28. 權(quán)利要求26中所述的組合物，其中給藥編碼Th2細(xì)胞因子或其部 分肽的載體。
全文摘要
本發(fā)明是以提供一種對(duì)阿爾茨海默病具有更高安全性和有效性的疫苗療法為目的。構(gòu)筑攜帶有Aβ基因的負(fù)鏈RNA病毒載體后，以鼻腔內(nèi)給藥方式將其給藥到24-25月齡的APP轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)。在測(cè)定血清中抗Aβ抗體水平時(shí)，與對(duì)照組相比給藥組明顯增高。組織學(xué)探討結(jié)果顯示，前腦葉，頭頂葉，以及海馬中的任一組織內(nèi)，都顯示了給藥本發(fā)明載體所引起的老年斑的顯著減少。腦內(nèi)Aβ水平也有顯著下降。并且，本發(fā)明載體的給藥，沒有引起對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。
文檔編號(hào)C12N15/09GK101228272SQ20068002222
公開日2008年7月23日 申請(qǐng)日期2006年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月20日
發(fā)明者井上誠(chéng), 原英夫, 德炭由美子, 田平武, 米滿吉和, 長(zhǎng)谷川護(hù) 申請(qǐng)人:生物載體株式會(huì)社;國(guó)立長(zhǎng)壽醫(yī)療中心總長(zhǎng)代表的日本國(guó)