專利名稱：：檢測hpv的方法及探針，引物和試劑盒的制作方法專利說明檢測HPV的方法及探針，引物和試劑盒發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及人乳頭狀瘤病毒(HPV)感染的檢測和鑒別領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：子宮頸癌是婦女的第二最常見惡性腫瘤，僅次于乳腺癌。子宮頸癌的獨(dú)特之處是，它是在幾乎所有病例和全球的前體病變中發(fā)現(xiàn)HPVDNA的第一種重要實(shí)體瘤。已經(jīng)表征了超過100種HPV類型，并以分離的時間次序編號。HPV是趨上皮的，僅僅感染皮膚(皮膚類型)或呼吸道和肛門生殖道的粘膜(粘膜類型)。已知超過40種HPV類型會感染子宮頸。基于誘導(dǎo)的良性的、惡化前的或惡性的病變，將HPV分別分成低危(例如，HPV類型6，11，42，43和44)和高危類型(例如，類型16，18，31，33和45)。高危類型占所有侵入性子宮頸癌的超過99％。因此，HPV類型的檢測和鑒別是非常重要的。高危類型定義為總是發(fā)現(xiàn)在高度SIL(鱗狀上皮內(nèi)的病變)和原位癌中，而低危類型主要發(fā)現(xiàn)在低度SIL中。該流行病學(xué)觀察得到了分子發(fā)現(xiàn)的支持。例如，來自低危類型6和11的E6和E7蛋白結(jié)合p53和pRB，該結(jié)合過于微弱，難以體外使角質(zhì)形成細(xì)胞永生，或體內(nèi)誘導(dǎo)惡性轉(zhuǎn)化(Woodworth等，1990)。低危HPV類型的環(huán)狀ds-DNA基因組保持是附加體，而高危HPV類型的基因組能整合進(jìn)人基因組中。通常根據(jù)Papanicoloau(PAP)系統(tǒng)，篩選子宮頸的惡性的和惡化前的病癥。通過光學(xué)顯微鏡術(shù)檢查子宮頸涂片，按照病變嚴(yán)重性的遞增尺度，將含有形態(tài)學(xué)上異常的細(xì)胞的標(biāo)本分成PAPI至V。該細(xì)胞形態(tài)學(xué)的方法是一種間接方法，測量HPV感染的可能結(jié)果。因此，HPVDNA檢測和分型在二級篩選中是重要的，以便選擇進(jìn)行監(jiān)視(隨訪)和治療的患者。這意味著，應(yīng)當(dāng)分析歸入PAPII(非典型性鱗狀細(xì)胞化生)或更高級別的子宮頸涂片，得到低危和高危HPV類型。隨訪研究已經(jīng)證實(shí)，僅僅高危HPV類型參與細(xì)胞學(xué)上正常的子宮頸細(xì)胞向高度SIL的發(fā)展(Remminck等，1995)。這些結(jié)果表明，高危HPV類型的存在是子宮頸癌發(fā)展和檢測的預(yù)后標(biāo)記。通過培養(yǎng)來診斷HPV是不可行的。另外，通過檢測HPV抗體進(jìn)行診斷，似乎受到不充分的靈敏度和特異性的阻礙。診斷HPV感染的直接方法主要是基于病毒DNA基因組的檢測，其中使用不同形式的DNA/DNA或RNA/DNA雜交，進(jìn)行或不進(jìn)行HPVDNA的事先擴(kuò)增。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)是能非常有效地擴(kuò)增微量靶DNA的方法?，F(xiàn)在，主要有3對不同的引物用于HPVDNA的通用擴(kuò)增(″廣譜引物″)。3個這樣的引物對(MY11/MY09，GP5/GP6和SPF1O系統(tǒng))是針對不同HPV類型的LI區(qū)域中的保守區(qū)(Manos等，1989；VandenBrule等，1990，WO9914377)。也使用PGMY系統(tǒng)，它是MY09/11的改進(jìn)(參見Gravitt，P.，2000.Improvedamplificationofgenitalhumanpapillomaviruses.J.Clin.Microbiol.38357-361)。另一個引物對CPl/CPllg是針對E1區(qū)域中的保守區(qū)(Tieben等，1993)，但是不經(jīng)常使用CPI/II。存在幾種鑒別不同HPV類型的方法。通過僅識別一種特定類型的PCR引物，可以對HPVDNA進(jìn)行分型。該方法稱作類型特異性的PCR。已經(jīng)對HPV類型6，11，16，18，31和33描述了這樣的方法(Claas等，1989；Cornelissen等，1989；Falcinelli等，1992；VandenBrule等，1990；Young等，1989)。該引物分別是針對類型6，11，16，18，31和33的HPV基因組的E5，L1，E6，L1，E2和E1區(qū)域(Baay等，1996)。另一種方法是，通用擴(kuò)增來自所有HPV類型的基因組部分，然后分別與區(qū)分致癌組和非致癌組的類型特異性探針的兩種混合物雜交。已經(jīng)描述了一種類似的分型方法，不需要事先擴(kuò)增HPVDNA。在雜交體捕獲測定中(HybridCaptureSharpAssay；Digene，SilverSprings，MD)，測試每個樣品的″高?！錒PV類型組(例如16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59和68)和另一個″低?！錒PV類型組(例如6，11，42，43和44)(Cox等，1995)。在WO9914377中公開的檢測和分型系統(tǒng)，使用PCR擴(kuò)增步驟、和與類型特異性探針的反向線印跡雜交。目前，人乳頭狀瘤病毒的正式分類是基于來自L1區(qū)域的291bp片段的序列分型(Chan等JVirol.1995May；69(5)3074-83，DeVilliers等，Virology.2004Jun20；324(1)17-27)。這些序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析，允許將不同HPV類型分類。作為定義，如果2種HPV分離物之間在該區(qū)域的序列差異高于10％，則將它們分成不同類型。因此，如果序列與任意已知HPV類型的差異超過10％，則將它歸入一種新的HPV類型。差異在2-10％之間的HPV分離物，歸入不同亞型。最后，如果序列變異低于2％，將2種分離物歸入相同亞型中，作為不同變體。仍然需要改進(jìn)的檢測和分型系統(tǒng)。發(fā)明簡述本發(fā)明涉及對可能存在于樣品中的任意HPV核酸進(jìn)行分型的方法，所述方法包含下述步驟使任意這樣的核酸接觸至少一種能與HPV的D區(qū)域特異性地雜交的探針，所述區(qū)域表示在圖1中，然后基于這樣得到的雜交結(jié)果，分析HPV類型。本發(fā)明還涉及一種方法，其中在雜交步驟之前，進(jìn)行擴(kuò)增步驟，以擴(kuò)增可能存在于生物樣品中的任意HPV核酸。這樣，本發(fā)明涉及對可能存在于生物樣品中的任意HPV核酸進(jìn)行檢測和/或分型的方法，所述方法包含下述步驟(i)擴(kuò)增樣品中的多核酸片段，其包含任意HPV核酸的B區(qū)域，所述B區(qū)域表示在圖1中，和(ii)使來自步驟(i)的任意擴(kuò)增的片段接觸至少一種能與HPV的B區(qū)域特異性地雜交的探針，所述B區(qū)域表示在圖1中。本發(fā)明也涉及對可能存在于生物樣品中的HPV進(jìn)行檢測和/或分型的方法，所述方法包含(i)使用下述引物，擴(kuò)增HPV的多核酸片段-5’引物，其特異性地雜交于HPV16的基因組的‘A’區(qū)域，所述‘A’區(qū)域表示在圖1中，和-3’引物，其特異性地雜交于至少一種HPV類型的基因組的‘C’區(qū)域，所述‘C’區(qū)域表示在圖1中；(ii)使來自步驟(i)的擴(kuò)增的片段與至少一種探針雜交，所述探針能與HPV的‘B’區(qū)域或‘D’區(qū)域特異性地雜交，所述區(qū)域表示在圖1中。本發(fā)明還涉及一種方法，其中進(jìn)行放大步驟，以放大用于檢測探針與可能存在于生物樣品中的任意HPV核酸的雜交的任意信號?？梢栽谟谢驔]有擴(kuò)增可能存在于樣品中的任意HPV核酸的步驟的情況下，進(jìn)行信號放大。本發(fā)明還涉及對可能存在于生物樣品中的任意HPV核酸進(jìn)行分型的方法，所述方法包含，在任意分型步驟之前或同時，檢測任意HPV核酸在樣品中的存在的步驟。本發(fā)明還涉及寡核苷酸探針和引物，其能實(shí)現(xiàn)所述的檢測和/或鑒別HPV的方法。本發(fā)明還涉及進(jìn)行所述擴(kuò)增和雜交步驟所依據(jù)的方案。雜交步驟的一種形式是，例如，反向雜交形式。本發(fā)明還涉及試劑盒，其包含用于實(shí)施本發(fā)明的引物和/或探針和/或說明書。圖1解釋了不同的HPV序列與HPV16序列Genbank登記號K02718.1的序列的比對，并顯示了A，B，C和D區(qū)域的位置。圖2解釋了B區(qū)域的系統(tǒng)樹，圖3解釋了PCR產(chǎn)物的一個實(shí)例，使用單一PCR引物，圖4解釋了凝膠多路PCR，圖5解釋了使用線性探針測定可能得到的結(jié)果，圖6解釋了使用Luminex(基于珠子的)方案，對DNA進(jìn)行檢測和分型的通用方法，圖7解釋了一種可行的HPV″MPF″基因型分析測定；和圖8HPV解釋了HPV類型16，18，26，31，33和35的″MPF″基因型分析圖譜。發(fā)明詳述本發(fā)明一般地涉及對可能存在于生物樣品中的任意HPV核酸進(jìn)行檢測和/或分型的方法，所述方法包含下述步驟使存在的任意這樣的核酸接觸至少一種能與HPV基因組的D區(qū)域特異性地雜交的探針，所述D區(qū)域表示在圖1中，然后檢測任意可能發(fā)生的特異性的雜交，以確定樣品中是否存在HPV核酸，以及它可能屬于何種HPV類型。優(yōu)選地，所述探針能特異性地雜交于HPV基因組的B區(qū)域。我們已經(jīng)確定，HPV基因組的77個核苷酸組成的D區(qū)域(參見圖1)，和尤其是引物間B區(qū)域的31個核苷酸，是關(guān)于HPV分型的重要信息。本發(fā)明的方法因而通常包含，使來自HPV的核酸與探針雜交，所述探針能與HPV的D區(qū)域和/或B區(qū)域雜交，所述雜交事件，或甚至在沒有雜交事件的情況下，會提供辨別不同HPV類型的信息。在可以發(fā)生探針的特異性雜交的反應(yīng)條件下，發(fā)生探針與靶核酸的雜交?？梢栽诓煌姆直媛仕?，對樣品中存在的HPV類型進(jìn)行分析。分析的分辨率可以是適用于鑒別單獨(dú)的HPV類型，例如，HPV16，18，或HPV1。也可以在更低的分辨率進(jìn)行類型的分析，例如鑒別個體是否具有特定種類的HPV類型例如，高危癌癥類型或低危癌癥類型，或皮膚類型。盡管本發(fā)明的分型測定能適當(dāng)?shù)靥峁┰跇悠分邪l(fā)現(xiàn)的所有特定類型的信息，但是它不一定(從使用者的觀點(diǎn)看)能辨別精確的HPV類型，測定的結(jié)果可能僅僅需要在HPV類型的分類水平。本發(fā)明因而涉及HPV分型的方法，所述方法允許鑒別高危HPV類型，不需要指出在樣品中存在何種具體的高危類型。高危類型(總是在高度SIL[鱗狀上皮內(nèi)的損害]和原位癌中發(fā)現(xiàn)的那些)的種類包括HPV16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，66，和68。低危類型(主要在低度SIL中發(fā)現(xiàn))的種類包括類型HPV6，11，34，40，42，43，44，53，54，70，和74。優(yōu)選地，在本發(fā)明中使用的特異性的探針能特異性地雜交于HPV基因組中77個核苷酸組成的″D″區(qū)域、合適地雜交于31個核苷酸組成的″B″區(qū)域，其中所述區(qū)域給出在圖1的序列中。這些區(qū)域與HPV16參照序列K02718的核苷酸6543-6619(D區(qū)域)和6566-6596(B區(qū)域)相相應(yīng)。應(yīng)當(dāng)理解，本文中使用圖1的編號指示D和B區(qū)域，包括沒有特別列出的、且可能與HPV參照序列或給定的其它序列不同的其它HPV序列中的等同區(qū)域?；诶缗c圖1序列的序列同源性或同一性，可以鑒別出另一個HPV基因組中的等同的A，B，C或D區(qū)域。技術(shù)人員可以容易地進(jìn)行核酸同一性/同源性的序列對比，例如，使用BLAST和BLAST2.0算法，它們分別記載在Altschul等，Nucl.AcidsRes.253389-3402(1977)，和Altschul等，J.MoI.Biol.215403-410(1990)?？梢允褂肂LAST和BLAST2.0，例如利用缺省參數(shù)，以確定本發(fā)明的多核苷酸的序列同一性百分比。用于進(jìn)行BLAST分析的軟件，可從國家生物技術(shù)信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)公開得到。因而，可以看出本發(fā)明涉及探針和探針的應(yīng)用，所述探針能特異性地雜交于HPV的D區(qū)域、合適地雜交于B區(qū)域，所述區(qū)域表示在圖1中，或能特異性地雜交于另一個HPV基因組中的等同區(qū)域，所述等同區(qū)域通過核酸同一性和/或同源性進(jìn)行評定。為了避免懷疑，單個地要求保護(hù)本文所述的所有探針、和分成(在適當(dāng)時)至少5，10，15，20，25，30，35，40個探針的組，各組從探針列表中選擇。本發(fā)明也涉及核酸片段，其基本上由分離的77個堿基對組成的D區(qū)域和分離的31個堿基對組成的B區(qū)域組成，任一個區(qū)域都是單鏈或雙鏈核酸形式，作為RNA或DNA，也涉及這些核酸片段區(qū)域在HPV分型中的應(yīng)用。本發(fā)明的一個特征是探針的選擇。特異性地雜交于HPV基因組的優(yōu)選D或B區(qū)域的探針，優(yōu)選地能提供關(guān)于存在的HPV株的類型的信息(通過雜交結(jié)果)，無論是單獨(dú)的，還是與來自另一種或多種探針的信息相組合。關(guān)于HPV類型的信息優(yōu)選地從探針與靶核酸的雜交的陽性檢測得到，但是也可以從特定探針沒有雜交得到。適宜地，本發(fā)明的探針能特異性地雜交僅一種HPV類型的基因組的D區(qū)域和/或B區(qū)域，從而當(dāng)該類型存在于生物樣品中時，能實(shí)現(xiàn)該HPV類型的特異性鑒別。因而，本發(fā)明的一個實(shí)施方案涉及對可能存在于生物樣品中的任意HPV核酸進(jìn)行分型的方法，所述方法包含下述步驟使任意的這樣的核酸接觸至少一種探針，所述探針能特異性地雜交僅一種HPV類型的基因組的D區(qū)域和/或B區(qū)域，所述區(qū)域表示在圖1中，然后基于這樣得到的雜交結(jié)果，分析HPV類型。本發(fā)明的探針也可以提供有用的信息，前提是它能特異性地雜交于有限數(shù)目類型(例如，僅2種HPV類型)的基因組的D區(qū)域和/或B區(qū)域。例如，這可以實(shí)現(xiàn)這些類型的鑒別，或可以與來自另一種探針的信息相組合，實(shí)現(xiàn)每種類型的特異性鑒別。能給出關(guān)于HPV類型的信息的探針，例如上面的那些，通常視作本文的類型特異性的探針。優(yōu)選的類型特異性的探針能特異性地雜交于僅一種HPV類型的基因組的D區(qū)域和/或B區(qū)域。根據(jù)本發(fā)明另一個優(yōu)選的實(shí)施方案，一種探針能特異性地雜交于僅一種HPV類型的基因組的D區(qū)域，更具體地，特異性地雜交于位于A區(qū)域和C區(qū)域之間的31bpB區(qū)域，如圖1所示?？梢澡b別樣品中不同類型的HPV，其中使所述HPV類型的核酸雜交至少于1種、優(yōu)選至少2種、更優(yōu)選至少3種、更優(yōu)選至少4種、最優(yōu)選至少5種寡核苷酸探針。表4含有特異性地雜交于D區(qū)域的優(yōu)選探針的列表。這些探針可以一起使用，適當(dāng)?shù)卦谙嗤碾s交和洗滌條件下。優(yōu)選的是反向雜交形式，例如，線性探針測定形式。本文列出的所有探針單個地要求保護(hù)。此外，本文也包括探針的所有組合。在表4中列出的探針特異性地雜交于HPV的B和/或D區(qū)域，并能提供關(guān)于樣品中可能存在的HPV靶核酸的具體類型的信息。本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見，可以在所述D或B區(qū)域內(nèi)選擇除了在表4中列出的那些以外的探針，優(yōu)選能特異性地雜交于僅一種HPV-類型和/或能提供關(guān)于HPV類型測定的信息的探針。在本發(fā)明中使用的探針可以具有附加的間隔序列，其不形成探針本身的一部分，但是例如可以允許附著到固體支持物上。間隔區(qū)域可以酶促地或化學(xué)地添加，且可以是探針的5′或3′。適當(dāng)?shù)?，本發(fā)明的探針的應(yīng)用，允許對至少5種不同的HPV類型進(jìn)行分型，優(yōu)選至少6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50或至少51種不同的HPV類型。最優(yōu)選地，本發(fā)明允許辨別超過30種不同的HPV類型，適當(dāng)?shù)爻^35、超過40、超過45、和適當(dāng)?shù)爻^50種不同的HPV類型。適當(dāng)?shù)?，使用本文所述的發(fā)明，可以辨別所有或基本上所有在圖2的系統(tǒng)樹中給出的HPV類型。優(yōu)選地，首先擴(kuò)增存在于樣品中的任意HPV核酸，例如通過PCR或其它合適的擴(kuò)增方法，然后雜交。使用允許擴(kuò)增樣品中的所有HPV核酸(無論類型)的所謂的″廣譜″引物或引物組，可以擴(kuò)增任意的靶核酸。因而，存在于樣品中的HPV核酸包括已經(jīng)從樣品擴(kuò)增的核酸，這從上下文顯而易見(即在雜交前存在擴(kuò)增步驟)。適當(dāng)?shù)?，任意靶DNA的擴(kuò)增包括圖1的31個核苷酸組成的B區(qū)域的擴(kuò)增。因而，在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及對可能存在于生物樣品中的任意HPV核酸進(jìn)行檢測和/或分型的方法，所述方法包含下述步驟(i)擴(kuò)增樣品中的多核酸片段，其包含任意HPV核酸的B區(qū)域，所述B區(qū)域表示在圖1中，和(ii)使來自步驟(i)的任意擴(kuò)增的片段接觸至少一種能特異性地雜交于HPV的B區(qū)域的探針，所述B區(qū)域表示在圖1中。適當(dāng)?shù)兀我獍泻怂岬臄U(kuò)增包括圖1的77個核苷酸組成的片段(即圖1的D區(qū)域)的擴(kuò)增。因而，在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及對可能存在于生物樣品中的任意HPV核酸進(jìn)行檢測和/或分型的方法，所述方法包含下述步驟(i)擴(kuò)增樣品中的多核酸片段，其包含任意HPV核酸的D區(qū)域，所述D區(qū)域表示在圖1中，和(ii)使來自步驟(i)的任意擴(kuò)增的片段接觸至少一種能特異性地雜交于HPV的D區(qū)域的探針，所述D區(qū)域表示在圖1中。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了對可能存在于生物樣品中的HPV進(jìn)行檢測和/或分型的方法，所述方法包含(i)使用下述引物，擴(kuò)增HPV的多核酸片段-5’引物，其特異性地雜交于HPV16的基因組的‘A’區(qū)域，所述‘A’區(qū)域表示在圖1中，和-3’引物，其特異性地雜交于至少一種HPV類型的基因組的‘C’區(qū)域，所述‘C’區(qū)域表示在圖1中；(ii)使來自步驟(i)的擴(kuò)增的片段與至少一種探針雜交，所述探針能與HPV的‘B’區(qū)域或‘D’區(qū)域特異性地雜交，所述區(qū)域表示在圖1中。適當(dāng)?shù)?，待擴(kuò)增區(qū)域包含HPV基因組的D區(qū)域的77個核苷酸6543-6619，其中編號是參照圖1的HPV16參照序列給出，或由該區(qū)域組成，或基本上由該區(qū)域組成。待擴(kuò)增區(qū)域適當(dāng)?shù)夭怀^HPV基因組的片段6543-6619，其中編號是參照HPV16參照序列給出，或其它HPV基因組中的等同區(qū)域。根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實(shí)施方案，所述特異性地雜交于至少一種HPV類型的基因組的A區(qū)域的5′引物的3′末端，位于HPV16的基因組的位置6565(參照株Genbank登記號K02718.1)，或在任意其它HPV基因組的相應(yīng)位置，如圖1所示。根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實(shí)施方案，所述特異性地雜交于至少一種HPV類型的基因組的C區(qū)域的3′引物的3′末端，位于HPV16的基因組的位置6597(Genbank登記號K02718.1)，或在任意其它HPV基因組的相應(yīng)位置，如圖1所示。用于擴(kuò)增樣品中的核酸的優(yōu)選引物包括在表1和2中列出的那些。它們單個地和以組合形式要求保護(hù)。優(yōu)選的是引物對，其包含正向和反向引物。適當(dāng)?shù)兀糜谠谔禺愋苑中椭巴ㄓ玫財U(kuò)增HPV核酸的引物，能擴(kuò)增存在于樣品中的所有HPV核酸。優(yōu)選的是能擴(kuò)增樣品中的所有HPV核酸的引物組，適當(dāng)?shù)兀摻M包含一種或多種來自表1和2列出的集合的引物。任選地，可以使用在表1和2中列出的所有引物。引物組合能適當(dāng)?shù)赜糜谙嗤磻?yīng)條件下。在包含本發(fā)明的D或B區(qū)域的任意合適片段上，可以進(jìn)行核酸的擴(kuò)增。用于擴(kuò)增的優(yōu)選片段的長度小于200個核苷酸，優(yōu)選小于150個核苷酸，優(yōu)選小于100個核苷酸。用于擴(kuò)增的優(yōu)選片段短得足以允許例如在子宮頸涂片和埋入石蠟中的樣品中進(jìn)行檢測。在本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明公開的引物和探針也可以用于定量PCR方案或定量雜交方案。定量PCR(QPCR)允許定量DNA，cDNA，或RNA模板的起始量。QPCR可以基于熒光報道分子的檢測，所述熒光報道分子隨著PCR產(chǎn)物在每個擴(kuò)增循環(huán)中的積累而增加。熒光報道分子包括結(jié)合雙鏈DNA的染料(即SYBRGreenI)或序列特異性的探針(即分子信標(biāo)或TaqMan_探針)。如上所討論的，某些探針可以提供關(guān)于精確HPV類型的信息，例如，如果它們能雜交特定的類型，但是不雜交其它類型(即類型特異性的探針)。也可以使用對D區(qū)域特異探針，來更通用地確定樣品中是否存在任意HPV核酸，而不需要提供分型信息。這樣的探針在本文中可以稱作′通用探針′。然后，使用特異性的分型方法，例如類型特異性的探針或類型特異性的PCR，可以將HPV核酸陽性的樣品具體地分型?；蛘?，可以用通用探針探測樣品，并同時特異性地分型。通用探針可以含有作為核酸探針序列的一部分的肌苷殘基，其允許與靶核酸的雜交的一些靈活性，且可以允許雜交不同HPV類型的D區(qū)域。任選地，在有用時，引物也可以含有肌苷。為了避免懷疑，特異性地雜交于樣品中的任意HPV核酸的D和/或B區(qū)域的探針可以是通用的(如果它們雜交于多種HPV類型的D和/或B區(qū)域，和/或不提供特異性的分型信息)，或?qū)⒃试S未知HPV核酸的類型特異性的探針分型。當(dāng)在分型之前擴(kuò)增靶DNA時，則也可以使用落入優(yōu)選的D或B區(qū)域內(nèi)的通用探針來檢測HPV核酸。本發(fā)明因而也涉及探針或探針組，它們能檢測任意HPV核酸在樣品中的存在。通用探針可以用于檢測HPV核酸，例如，使用DNA酶免疫測定(DEIA)技術(shù)，例如參見本文引作參考的WO991437和例如ClinDiagnVirol.1995Feb；3(2)155-64。該方法可以用于快速且特異性地檢測PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物由引物組產(chǎn)生，其中正向或反向引物含有位于5′末端的生物素。這允許生物素化的擴(kuò)增引物結(jié)合抗生物素蛋白鏈菌素包被的微量滴定孔。用氫氧化鈉使PCR產(chǎn)物變性，這允許去除未生物素化的鏈。特異性的標(biāo)記的寡核苷酸探針(例如用洋地黃毒苷標(biāo)記)與單鏈固定的PCR產(chǎn)物雜交，通過酶標(biāo)記的綴合物和比色或熒光方法，檢測雜交體。在本發(fā)明中，提供了一組適用于測定HPV核酸在樣品中的存在的通用探針，適當(dāng)?shù)兀肈EIA技術(shù)測定。適當(dāng)?shù)?，這樣的探針可以用于相同的反應(yīng)條件下。在表3中給出了優(yōu)選的探針。其中所述的所有探針都單獨(dú)地和組合地要求保護(hù)。本發(fā)明適當(dāng)?shù)靥峁┝吮?中的任意2種探針、適當(dāng)?shù)厝我?、4、和5或更多種探針(優(yōu)選表3中包含的所有探針)的組合，用于HPV的通用檢測(即任意HPV類型的檢測)。在一個分開的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及特異性地雜交于HPV基因組的D區(qū)域的通用探針(例如，表3中的那些)與分型步驟先后或同時組合的應(yīng)用。探針和任意靶DNA之間雜交后，可以通過任意合適的方式，進(jìn)行雜交的檢測。例如，可以檢測地標(biāo)記探針和/或核酸靶。為了輔助檢測，優(yōu)選地，擴(kuò)增靶和/或信號。靶DNA的PCR擴(kuò)增是特別優(yōu)選的。優(yōu)選地，在有固體支持物存在下，進(jìn)行探針和靶之間的雜交，盡管這不是必須的?？梢怨潭ㄌ结樅桶泻怂嶂械囊环N或多種，例如，固定到珠子、平板、載玻片、或微量滴定板上。或者，探針和靶都不固定。雜交可以在液體介質(zhì)背景下進(jìn)行。結(jié)合的檢測可以使用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行，例如使用LuminexTM流式細(xì)胞術(shù)系統(tǒng)(參見，例如，WO9714028和http://www.luminexcorp.com/)。在本文的實(shí)施例中，公開了與基于珠子的檢測系統(tǒng)(例如，Luminex)一起使用的靶特異性的探針，和不同的靶特異性的探針的混合物，它們本身是本發(fā)明的實(shí)施方案?；旌衔锟梢园?-100種不同探針類型，例如，5-70，10-60，20-50種探針類型，包括3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，1920，25，30，35，40，45種或更多種不同探針類型的混合物。如本文所述，偶聯(lián)到間隔序列上的這樣的探針，以及當(dāng)偶聯(lián)到珠子上時，也形成本發(fā)明本身的一部分。用于本發(fā)明的珠子，在本文中也可以稱作微球，適當(dāng)?shù)厥沁m用于流式細(xì)胞術(shù)分析的珠子。珠子適當(dāng)?shù)啬芘悸?lián)到探針上，以檢測探針和靶之間的相互作用。在一個方面，用獨(dú)特的熒光分子或分子的組合標(biāo)記珠子。適當(dāng)?shù)?，通過使用激光激發(fā)珠子內(nèi)的一種或多種熒光染料，能鑒別出在珠子上或內(nèi)部的標(biāo)記。在一個方面，珠子是聚苯乙烯珠。結(jié)合的檢測可以在微陣列的背景下進(jìn)行，使用例如本文引作參考的EP373203，EP386229，EP0804731和EP619321所述的方法。這樣的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實(shí)施方案，前述檢測和/或鑒別HPV的方法的特征也在于，雜交步驟包含反向雜交形式。在一個實(shí)施方案中，將探針固定到固體支持物上的某些位置。在另一個實(shí)施方案中，將探針雜交到珠子上，其中它們不采取彼此相對固定的位置。適當(dāng)?shù)兀缟纤鰯U(kuò)增樣品中的任意HPV核酸，并標(biāo)記擴(kuò)增的HPV多核酸，以便檢測形成的雜交體。根據(jù)該實(shí)施方案，使用至少一種探針，或至少2種、優(yōu)選至少3種、更優(yōu)選至少4種、和最優(yōu)選至少5種探針的集合。當(dāng)使用至少2種探針時，以使它們在相同雜交條件和相同洗滌條件下特異性地雜交它們的靶序列的方式，設(shè)計所述探針。在優(yōu)選的反向雜交測定中，將寡核苷酸探針固定到固體支持物上，作為平行線(Stuyver等，1993；國際申請WO94/12670)。與其它DNA技術(shù)或雜交形式相比，反向雜交形式具有許多實(shí)用的優(yōu)點(diǎn)，尤其當(dāng)優(yōu)選使用探針的組合時，或當(dāng)不可避免地尋求得到相關(guān)信息時。任選地，在需要時，本發(fā)明的檢測和分型方法包括在雜交步驟之后的類型特異性的PCR步驟，例如本文引作參考的WO03014402所述。與非特異性的引物相比，類型特異性的PCR被設(shè)計用于擴(kuò)增特定的HPV核酸類型，例如僅僅HPV16DNA，所述非特異性的引物可以在HPV分型之前使用，且通常用于擴(kuò)增來自多種HPV類型的核酸。本發(fā)明也涉及類型特異性的引物，它們能擴(kuò)增包含HPV基因組的D和/或B區(qū)域的HPV核酸。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明因而涉及包含下述步驟的方法1擴(kuò)增來自生物樣品中存在的任意HPV的核酸，2檢測生物樣品中存在的任意HPV核酸，3對樣品中的HPV核酸進(jìn)行分型，其中這樣的HPV核酸已經(jīng)通過下述方法檢測到使這樣的核酸接觸至少一種能特異性地雜交于HPV的D區(qū)域、適當(dāng)?shù)仉s交于B區(qū)域的探針，所述區(qū)域表示在圖1中，然后基于這樣得到的雜交結(jié)果，分析HPV類型，和4任選地，使用類型特異性的引物，其對步驟3中未鑒別出的類型是特異性的，擴(kuò)增和檢測樣品中的任意核酸。步驟2和3可以同時進(jìn)行。本發(fā)明也涉及試劑盒，其在本發(fā)明中用于檢測和/或鑒別HPV類型。試劑盒可以包含至少2種引物，所述引物適用于擴(kuò)增來自HPV基因組的核酸，優(yōu)選地，所述引物至少能擴(kuò)增HPV基因組的片段6566-6596，例如，在表1和2中給出的引物。試劑盒可以包含至少2種能特異性地雜交于HPV基因組的片段6543-6619的探針，編號根據(jù)圖1給出。優(yōu)選的探針能允許辨別不同的HPV類型，表4列出了合適的探針。試劑盒可以包含關(guān)于實(shí)現(xiàn)上述HPV鑒別和分型分析方法的說明書，以及上面指出的引物和/或探針。試劑盒可以包含上面給出的至少一種引物和至少一種探針。試劑盒可以包含固定到固體支持物上的本發(fā)明的探針或引物。支持物可以是例如珠子、微量滴定板或載玻片。試劑盒可以包含通用的探針，適當(dāng)?shù)?，?給出的探針。本發(fā)明也涉及用于檢測和/或鑒別可能存在于生物樣品中的HPV的診斷試劑盒，其包含下述組分(i)上面定義的至少一種合適的引物或至少一種合適的引物對；(ii)至少一種合適的探針，優(yōu)選至少2種、更優(yōu)選至少3種、更優(yōu)選至少4種、最優(yōu)選至少5種合適的探針，其任選地固定在固體支持物上。適當(dāng)?shù)?，試劑盒另外包含一種或多種下述組分(iii)雜交緩沖液，或生產(chǎn)所述緩沖液必需的組分，或制備所述緩沖液的說明書；(iv)洗滌溶液，或生產(chǎn)所述溶液必需的組分，或制備所述溶液的說明書；(v)檢測形成的雜交體的工具；(vi)用于將探針附著到固體支持物的已知位置上的工具。下面的定義和解釋有助于更好地理解本發(fā)明。與來自L1區(qū)域的291bp片段的任意已知類型(Chan等，1995)表現(xiàn)出超過10％的序列差異的HPV分離物，分成不同的HPV“類型”。差異在2-10％之間的HPV分離物，歸入不同“亞型”。如果序列變異低于2％，將分離物歸入相同亞型中，作為不同“變體”。當(dāng)應(yīng)用于HPV時，術(shù)語″類型″指上面定義的3種分類中的任一種。待分析的樣品中的靶材料可以是DNA或RNA，例如基因組DNA，信使RNA，病毒RNA或其擴(kuò)增形式。這些分子在本申請中也稱作″核酸″或″多核酸″。眾所周知的提取和純化操作，可以用于從樣品分離RNA或DNA(例如Sambrook等，1989)。根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語″探針″通常指單鏈寡核苷酸，其設(shè)計用于特異性地雜交于HPV多核酸。術(shù)語″引物″通常指能作為合成引物延伸產(chǎn)物的起始位點(diǎn)的單鏈寡核苷酸序列，其與要復(fù)制的核酸鏈互補(bǔ)。引物的長度和序列必須使得它們允許引發(fā)延伸產(chǎn)物的合成。優(yōu)選地，引物的長度是約10-50個核苷酸。具體長度和序列取決于需要的DNA或RNA靶的復(fù)雜性，以及使用引物的條件，例如溫度和離子強(qiáng)度。表述″引物對″或″合適的引物對″在本發(fā)明中指一對引物，其允許擴(kuò)增HPV多核酸片段的一部分或全部，探針能與所述部分結(jié)合。本發(fā)明的探針或引物的″靶″或″靶序列″是HPV多核酸的序列，探針或引物與其完全互補(bǔ)或部分互補(bǔ)(其中部分互補(bǔ)允許一定程度的錯配)。應(yīng)當(dāng)理解，在有些情況下，所述靶序列的互補(bǔ)序列也是合適的靶序列。本發(fā)明的探針適當(dāng)?shù)刂辽倥c它們的靶序列的中央部分互補(bǔ)。在大多數(shù)情況下，探針與它們的靶序列完全互補(bǔ)。術(shù)語″類型特異性的靶序列″指在特定HPV類型的多核酸中的靶序列，與任何其它HPV-類型相比，其含有至少一個核苷酸的差異。探針與HPV多核酸區(qū)域的″特異性地雜交″，指所述探針與該區(qū)域的一部分或整個區(qū)域在使用的實(shí)驗(yàn)條件下形成雙鏈體，且在這些條件下，所述探針不與待分析樣品中存在的多核酸的其它區(qū)域形成雙鏈體。應(yīng)當(dāng)理解，設(shè)計用于特異性地雜交于HPV多核酸區(qū)域的探針，可以完全落入所述區(qū)域內(nèi)，或可以在很大程度上與所述區(qū)域重疊(即與所述區(qū)域之外和之內(nèi)的核苷酸形成雙鏈體)。適當(dāng)?shù)?，探針與核酸靶區(qū)域的特異性的雜交，發(fā)生在嚴(yán)格雜交條件下，例如，3XSSC，0.1％SDS，50℃。技術(shù)人員知道如何改變溫度、探針長度和鹽濃度等參數(shù)，以便實(shí)現(xiàn)特異性的雜交。雜交和洗滌條件是眾所周知的，且示例在Sambrook，等，MolecularCloningALaboratoryManual，SecondEdition，ColdSpringHarbor，N.Y.，(1989)，尤其是其中的第II章。在需要時，可以輕微修改探針的長度或序列，以維持在給定環(huán)境下需要的特異性和靈敏度。本文列出的探針和/或引物可以延伸1，2，3，4或5個核苷酸，例如，在任一個方向(區(qū)域D的上游或下游)。優(yōu)選的嚴(yán)格條件適當(dāng)?shù)厥窃试S類型特異性的探針結(jié)合僅一種HPV類型的條件。因而，在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，對可能存在于生物樣品中的任意HPV核酸進(jìn)行分型的方法包含使任意的這樣的核酸接觸至少一種探針的步驟，所述探針能在嚴(yán)格條件下雜交于HPV的D和/或B區(qū)域。特異性地雜交于本文定義的HPV基因組的D和/或B區(qū)域的探針，適當(dāng)?shù)嘏c靶序列的全長至少95％互補(bǔ)，適當(dāng)?shù)鼐哂写笥?5％的同一性，例如，在它們的長度上與靶HPV序列96％，97％，98％，99％和最優(yōu)選100％互補(bǔ)。本發(fā)明的探針可以與它們的靶序列在所有核苷酸位置互補(bǔ)，可能允許1、2或多個錯配，這取決于例如探針的長度、溫度、反應(yīng)條件和測定的要求。適當(dāng)?shù)?，探針的每個核苷酸可以與它的相應(yīng)靶核苷酸形成氫鍵。優(yōu)選地，通過A∶T和C∶G堿基配對的程度，評定探針與靶的互補(bǔ)性，使得腺嘌呤核苷酸與胸腺嘧啶配對，鳥嘌呤核苷酸與胞嘧啶配對，或反之亦然。在RNA形式，可以用U(尿嘧啶)替代T。例如，當(dāng)肌苷用于通用探針中，或用于引物中時，則互補(bǔ)性也可以通過肌苷(探針)-靶核苷酸相互作用的程度來評定。這樣，可以看出本發(fā)明也涉及對可能存在于生物樣品中的任意HPV核酸進(jìn)行檢測和/或分型的方法，所述方法包含下述步驟使任意的這樣的核酸接觸至少一種探針，所述探針在它的長度上與HPV基因組的D區(qū)域、適當(dāng)?shù)嘏cB區(qū)域具有1或0個核苷酸錯配，所述區(qū)域表示在圖1中，然后基于這樣得到的雜交結(jié)果，分析HPV類型。引物與HPV多核酸區(qū)域的″特異性雜交″指，在擴(kuò)增步驟中，所述引物與該區(qū)域的一部分或整個區(qū)域在使用的實(shí)驗(yàn)條件下形成雙鏈體，且在這些條件下，所述引物不與待分析樣品中存在的多核酸的其它區(qū)域形成雙鏈體。應(yīng)當(dāng)理解，設(shè)計用于特異性地雜交于HPV多核酸區(qū)域的引物，可以完全落入所述區(qū)域內(nèi)，或可以在很大程度上與所述區(qū)域重疊(即與所述區(qū)域之外和之內(nèi)的核苷酸形成雙鏈體)。本發(fā)明的一個實(shí)施方案要求檢測單個堿基對錯配，且嚴(yán)格的探針雜交條件是優(yōu)選的，以僅僅允許精確互補(bǔ)序列的雜交。但是，應(yīng)當(dāng)指出，由于探針的中央部分是它的雜交特性所必需的，當(dāng)使用更長的探針序列時，可以允許探針序列相對于靶序列向探針末端偏離。探針長度內(nèi)可能存在變異。從本領(lǐng)域的常識可以想象所述偏離和變異，但是總應(yīng)當(dāng)實(shí)驗(yàn)地評價，以便檢查它們是否導(dǎo)致與準(zhǔn)確互補(bǔ)探針等同的雜交特性。優(yōu)選地，本發(fā)明的探針的長度是約5-50個核苷酸，更優(yōu)選約10-25個核苷酸。特別優(yōu)選的探針長度包括5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24或25個核苷酸(不計可能存在的任意間隔序列)。本發(fā)明使用的核苷酸可以是核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸和修飾的核苷酸，例如，肌苷或含有基本上不改變它們的雜交特性的修飾基團(tuán)的核苷酸。探針序列在本說明書中表述為從5′至3′末端的單鏈DNA寡核苷酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見，可以原樣使用任意的下面指出的探針，或以它們的互補(bǔ)形式，或以它們的RNA形式(其中用U替代T)使用。通過克隆含有插入片段(包括相應(yīng)的核苷酸序列)的重組質(zhì)粒，可以制備根據(jù)本發(fā)明的探針，如果需要，可以使用足夠的核酸酶，將所述插入片段從克隆的質(zhì)粒切離，并回收它們，例如通過根據(jù)分子量的分級分離。根據(jù)本發(fā)明的探針也可以化學(xué)合成，例如通過常規(guī)的磷酸三酯方法。在文獻(xiàn)中充分記載了擴(kuò)增引物不是必須與模板中的相應(yīng)靶序列準(zhǔn)確匹配、以保證適當(dāng)擴(kuò)增的事實(shí)(Kwok等，1990)。但是，當(dāng)引物與它們的靶序列不是完全互補(bǔ)時，應(yīng)當(dāng)考慮擴(kuò)增的片段具有引物的序列，而不是靶序列的序列?？梢杂眠x擇標(biāo)記(例如生物素)來標(biāo)記引物。使用的擴(kuò)增方法可以是聚合酶鏈反應(yīng)(PCR；Saiki等，1988)，連接酶鏈反應(yīng)(LCR；Landgren等，1988；Wu&Wallace，1989；Barany，1991)，基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA；Guatelli等，1990；Compton，1991)，基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增系統(tǒng)(TAS；Kwoh等，1989)，鏈置換擴(kuò)增(SDA；Walker等，1992)或借助于QB復(fù)制酶的擴(kuò)增(Lomeli等，1989)或本領(lǐng)域已知的任何其它適用于擴(kuò)增核酸分子的方法。用作引物或探針的寡核苷酸也可以包含核苷酸類似物，例如，硫代磷酸酯(Matsukura等，1987)，烷基硫代磷酸酯或肽核酸(EgholmM，BuchardtO，ChristensenL，BehrensC，F(xiàn)reierSM，DriverDA，BergRH，KimSK，NordenB，NielsenPE.PNAhybridizestocomplementaryoligonucleotidesobeyingtheWatson-Crickhydrogen-bondingrules.Nature.1993Oct7；365(6446)566-8)，或可以含有嵌入劑(Asseline等，1984)。隨著大多數(shù)其它變異或修飾導(dǎo)入本發(fā)明的原始DNA序列，這些變異將需要適應(yīng)使用寡核苷酸的條件，以得到要求的特異性和靈敏度。但是，雜交的最終結(jié)果基本上與用未修飾的寡核苷酸得到的結(jié)果相同。這些修飾的導(dǎo)入可能是有利的，以便積極地影響特性，例如，雜交動力學(xué)，雜交體形成的可逆性，寡核苷酸分子的生物穩(wěn)定性，等。術(shù)語″固體支持物″可以指寡核苷酸探針可以偶聯(lián)的任意底物，只要它保持它的雜交特性，且背景雜交水平保持較低。通常，固體底物是微量滴定板(例如在DEIA技術(shù)中)，膜(例如尼龍或硝酸纖維素)或微球(珠子)或芯片。在應(yīng)用于膜或固定之前，可以方便地修飾核酸探針，以便促進(jìn)固定或提高雜交效率。這樣的修飾可以包括同聚物加尾，與不同的反應(yīng)基團(tuán)例如脂族基團(tuán)、NH2基團(tuán)、SH基團(tuán)、羧基偶聯(lián)，或與生物素、半抗原或蛋白偶聯(lián)。如上面討論的，雜交可以發(fā)生在液體介質(zhì)中，探針與靶的結(jié)合可以通過例如流式細(xì)胞術(shù)來評定。術(shù)語″標(biāo)記的″通常指使用標(biāo)記的核酸。標(biāo)記可以如下實(shí)現(xiàn)使用在聚合酶擴(kuò)增步驟過程中摻入的標(biāo)記的核苷酸，例如，如Saiki等(1988)或Bej等(1990)所述，或標(biāo)記的引物，或通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其它方法。標(biāo)記的性質(zhì)可以是同位素(″P，″S，等)或非同位素(生物素，洋地黃毒苷等)?！鍢悠贰蹇梢允强赡芎蠬PV核酸的任意材料，例如，生物材料，例如直接取自人類(或動物)，或在培養(yǎng)(富集)后，或可以是在宿主細(xì)胞中表達(dá)的重組HPV核酸。生物材料可以是例如尿，或來自生殖泌尿道或人或動物體的任意部分的刮片/活檢物。本發(fā)明的探針集合通常包含至少1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50或更多個探針。所述探針可以應(yīng)用于固體基質(zhì)上的2個或多個(可能與探針的數(shù)量一樣多)不同的和已知的位置。經(jīng)常優(yōu)選地，將2個或多個探針一起應(yīng)用于所述固體支持物的一個且同一個位置。本發(fā)明涉及附著到1個或多個本發(fā)明的探針上的固體支持物。為了設(shè)計具有需要的特性的探針，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的下述有用指南。因?yàn)殡s交反應(yīng)的程度和特異性(例如，本文所述的那些)會受到許多因素的影響，操作一個或多個這樣的因素，可以確定特定探針的準(zhǔn)確靈敏度和特異性、與它的靶是否完美互補(bǔ)。在本文中進(jìn)一步解釋了不同測定條件的重要性和效果。應(yīng)當(dāng)選擇[探針靶]核酸雜交體的穩(wěn)定性，使得與測定條件相容。這可以如下實(shí)現(xiàn)通過避免富含AT的長序列，通過用G∶C堿基對終止雜交體，和通過設(shè)計具有適當(dāng)Tm的探針。應(yīng)當(dāng)選擇探針的起點(diǎn)和終點(diǎn)，使得長度和％GC產(chǎn)生比進(jìn)行最終測定的溫度高約2℃的Tm。探針的堿基組成是重要的，這是由于額外的氫鍵結(jié)合，導(dǎo)致G-C堿基對表現(xiàn)出比A-T堿基對更高的熱穩(wěn)定性。因而，包含更高G-C含量的互補(bǔ)核酸的雜交，在更高的溫度會更穩(wěn)定。當(dāng)設(shè)計探針時，也應(yīng)當(dāng)考慮使用探針的條件，例如，離子強(qiáng)度和溫育溫度。已知雜交程度會隨著反應(yīng)混合物離子強(qiáng)度的增加而增加，雜交體的熱穩(wěn)定性會隨著離子強(qiáng)度的增加而增加。另一方面，能破壞氫鍵的化學(xué)試劑，例如，甲酰胺，脲，DMSO和醇，也會增加雜交的嚴(yán)格性。使用這樣的試劑將氫鍵去穩(wěn)定，可以極大地降低Tm。通常，在比特定雙鏈體的解鏈溫度低約5℃時，發(fā)生長度為約10-50堿基的合成寡核苷酸探針的最佳雜交。在低于最佳的溫度溫育，可以允許錯配的堿基序列雜交，且因此可以導(dǎo)致降低的特異性。需要獲得僅僅在高嚴(yán)格性條件下雜交的探針。在高嚴(yán)格性條件下，僅僅會形成高度互補(bǔ)的核酸雜交體；不會形成沒有足夠程度的互補(bǔ)性的雜交體。因此，測定條件的嚴(yán)格性決定了形成雜交體的2條核酸鏈之間需要的互補(bǔ)性程度。選擇嚴(yán)格性程度，例如使靶和非靶核酸形成的雜交體之間的穩(wěn)定性差異最大化。在本發(fā)明的情況下，需要檢測單個堿基對變化，這需要非常高嚴(yán)格性的條件。探針序列的長度也是重要的。在有些情況下，可能存在來自特定區(qū)域的幾個序列，它們的位置和長度不同，將產(chǎn)生具有需要的雜交特性的探針。在其它情況下，一個序列可能明顯優(yōu)于另一個差別僅僅在于一個堿基的序列。盡管并非完美互補(bǔ)的核酸可能雜交，完美互補(bǔ)的堿基序列的最長延伸通常基本上決定了雜交體穩(wěn)定性。盡管可以使用不同長度和堿基組成的寡核苷酸探針，本發(fā)明的優(yōu)選寡核苷酸探針的長度是約5-50個(更特別是10-25個)堿基，且具有與靶核酸序列完美互補(bǔ)的足夠序列延伸。已知形成抑制雜交的強(qiáng)內(nèi)部結(jié)構(gòu)的靶DNA或RNA區(qū)域是不太優(yōu)選的。類似地，應(yīng)當(dāng)避免具有廣泛的自身互補(bǔ)性的探針。如上面所解釋的，雜交是互補(bǔ)核酸的兩條單獨(dú)的鏈的締合，以形成氫鍵結(jié)合的雙鏈。暗示了如果2條鏈中的一條完全或部分地參與雜交體，則它不太可能參與新雜交體的形成。如果存在足夠的自身互補(bǔ)性，一類探針分子內(nèi)會形成分子內(nèi)和分子間雜交體。通過小心的探針設(shè)計，可以避免這樣的結(jié)構(gòu)。通過設(shè)計探針，使得目標(biāo)序列的主要部分是單鏈，可以極大地增加雜交的速率和程度。可以使用計算機(jī)程序來搜索這類相互作用。但是，在某些情況下，不可能避免這類相互作用。為了用選擇的寡核苷酸探針集合鑒別不同的HPV類型，可以使用本領(lǐng)域已知的任何雜交方法(常規(guī)的斑點(diǎn)印跡，DNA印跡，夾心法，等)。但是，為了獲得快速且容易的結(jié)果，如果涉及大量探針，反向雜交形式可能是最方便的。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，以已知的不同位置(點(diǎn)，線或其它圖案)，將選擇的探針固定到固體支持物上。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，以線形式，將選擇的探針組固定到膜條帶上。所述探針可以單個地或作為混合物，固定到固體支持物的指定位置上。在WO9914377的實(shí)施例4中，公開了上述優(yōu)選方法的一個具體的且非常用戶友好的實(shí)施方案，其可以適用于本發(fā)明?？梢杂蒙锼貥?biāo)記HPV多核酸，然后可以通過生物素-抗生物素蛋白鏈菌素偶聯(lián)，用非放射性顯色系統(tǒng)檢測雜交體。術(shù)語″雜交緩沖液″指，在適當(dāng)嚴(yán)格性條件下，允許探針和樣品中存在的多核酸或擴(kuò)增產(chǎn)物之間發(fā)生雜交反應(yīng)的緩沖液。術(shù)語″洗滌溶液″指能實(shí)現(xiàn)在適當(dāng)嚴(yán)格性條件下形成的雜交體的洗滌的溶液。在本說明書和隨后的權(quán)利要求書中，除非上下文另有要求，詞語“包含”和其變化形式例如“包括”，應(yīng)當(dāng)理解為包括所述的整數(shù)或步驟、或所述的整數(shù)或步驟的組，但是不排除任何其它整數(shù)或步驟、或整數(shù)或步驟的組?！鞍币舶ā坝?.....組成”和“基本上由......組成”的含義。本發(fā)明的實(shí)施方案包括(a)對可能存在于樣品中的任意HPV核酸進(jìn)行分型的方法，所述方法包含下述步驟(i)使任意的這樣的核酸接觸至少一種能與HPV基因組的D區(qū)域特異性地雜交的探針，所述區(qū)域表示在圖1中，和(ii)基于這樣得到的雜交結(jié)果，分析HPV類型；(b)根據(jù)陳述(a)的方法，其中所述探針能雜交于HPV基因組的B區(qū)域，所述B區(qū)域表示在圖1中。(c)根據(jù)陳述(a)或(b)的方法，其中所述探針能特異性地雜交僅一種HPV類型的基因組的D或B區(qū)域。(d)根據(jù)陳述(a)的方法，其中所述探針選自由表4列出的序列組成的列表。(e)根據(jù)任一項(xiàng)前面陳述的方法，其中在雜交之前，擴(kuò)增樣品中存在的任意HPV核酸。(f)根據(jù)陳述(e)的方法，其中所述擴(kuò)增步驟使用選自下組的引物HPV-MPF1F1，HPV-MPF1F2，HPV-MPF1F3，HPV-MPF1F4，HPV-MPF1F5，HPV-MPF1F6，HPV-MPF1F7，HPV-MPF1F8，HPV-MPF1F9，HPV-MPF1F10，HPV-MPF2R1，HPV-MPF2R2，HPV-MPF2R3，HPV-MPF2R4，HPV-MPF2R5，HPV-MPF2R6，HPV-MPF2R7，HPV-MPF2R8。(g)根據(jù)任一項(xiàng)前面陳述的方法，其中在分型步驟之前，證實(shí)樣品中存在HPV核酸。(h)根據(jù)任一項(xiàng)前面陳述的方法，其中探針和靶之間的雜交在有固體支持物存在下進(jìn)行。(i)根據(jù)陳述(h)的方法，其中所述雜交步驟使用反向雜交形式。(j)根據(jù)陳述(h)的方法，其中所述探針固定在珠子上。(k)根據(jù)陳述(j)的方法，其中使用流式細(xì)胞術(shù)分析雜交的檢測。(l)試劑盒，其包含至少2種引物，所述引物適用于擴(kuò)增來自HPV基因組的B或D區(qū)域的核酸。(m)根據(jù)陳述(l)的試劑盒，其中所述引物選自HPV-MPF1F1，HPV-MPF1F2，HPV-MPF1F3，HPV-MPF1F4，HPV-MPF1F5，HPV-MPF1F6，HPV-MPF1F7，HPV-MPF1F8，HPV-MPF1F9，HPV-MPF1F1O，HPV-MPF2R1，HPV-MPF2R2，HPV-MPF2R3，HPV-MPF2R4，HPV-MPF2R5，HPV-MPF2R6，HPV-MPF2R7和HPV-MPF2R8。(n)試劑盒，其包含至少2種探針，所述探針能特異性地雜交于HPV基因組的D區(qū)域或B區(qū)域。(o)根據(jù)陳述(n)的試劑盒，其中所述探針是選自表4的任意2種探針。(p)試劑盒，其包含表1或2的任意引物、或表3的任意探針、和用于實(shí)現(xiàn)上述HPV鑒別和分型分析的方法的說明書。(q)試劑盒，其包含附著在固體支持物上的能特異性地雜交于HPV基因組的D區(qū)域或B區(qū)域的探針。(r)根據(jù)陳述(l)-(q)之一的試劑盒，其另外包含表3的任意探針。(s)適用于陳述A的方法的探針，所述探針選自表4。(t)適用于陳述(e)的方法的引物，所述引物選自表1和2。參考文獻(xiàn)Baay，M.F.D.，W.G.V.Quint，J.Koudstaal，H.Hollema，J.M.Duk，M.P.M.Burger，E.Stolz，andP.Herbrink.1995.Comprehensivestudyofseveralgeneralandtype-specificprimerpairsfordetectionofhumanpapillomavirusDNAbyPCRinparaffin-embeddedcervicalcarcinomas.34745-747.Claas，E.C.J.，W.J.G.Melchers，H.C.vanderLinden，J.Lindeman，andW.G.V.Quint.1989.Humanpapillomavirusdetectioninparafinnembeddedcervicalcarcinomasandmetastasesofthecarcinomasbythepolymerasechainreaction.Am.J.Pathol.135703709.Cornelissen，M.T.E.，J.G.vandenTweel，A.P.H.B.Struyk，M.F.Jebbink，M.Bri&，J.vanderNoordaa，andJ.terschegget.1989.Localizationofhumanpappilomavirustype16DNAusingthepolymerasechainreactioninthecervixuteriofwomenwithcervicalintraepithelialneoplasia.J.Gen.Virol.702555-2562.Cox，J.Th.，A.T.Lorincz，M.H.Schiffman，M.E.Sherman，A.Cullen，andR.J.Kurman.Humanpapillornavirustestingbyhybridcaptureappearstobeusefulintriagingwomenwithacytologicaldiagnosisofatypicalsquamouscellsofundeterminedsignificance.Am.J.ObstetGynecol1995；1641461-1471.Falcinelli，C.，E.Claas，B.Kleter，andW.G.V.Quint.1992.Detectionofthehumanpapillomavirustype16mRNA-transcriptsincytologicalabnormalscrappings.J.Med.Virol.3793-98.Manos，M.M.，Y.Ting，D.K.Wright，A.J.Lewis，T.R.Broker，andS.M.Wolinsky.1989.Theuseofpolymerasechainreactionamplificationforthedetectionofgenitalhumanpapillornaviruses.CancerCells7209-214.Saiki，R.K.，D.H.Gelfland，S.Stoffel，S.J.Scharf，R.Higuchi，G.T.Horn，K.B.Mullis，andH.A.Erlich.1988.Primer-directedenzymaticamplificationofDNAwithathermostableDNApolymerase.Science239487-491.Sambrooketal.1989MolecularCloningALaboratoryManual，2ndEdition，ColdSpringHarbourLaboratoryPressStuyver，L.，R.Rossau，A.Wyseur，M.Duhamel，B.Vanderborght，H.VanHeuverswyn，andG.Maertens.1993.TypingofhepatitisCvirusisolatesandcharacterizationofnewsubtypesusingalineprobeassay.J.Gen.Virol.741093-1102.TiebenL.M.，J.terSchegget，R.P.Minnaar，J.N.BouwesBavinck，RIM.Berkhout，B.J.Vermeer，M.f.Jebbink，andH.L.Smits.1993.DetectionofcutaneousandgenitalHPVtypesinclinicalsamplesbyPCRusingconsensusprimers.J.Virol.Methods42265-280.VandenBrule，A.J.C.，P.J.F.Snijders，R.L.J.Gordijn，O.P.Bleker，C.J.L.M.Meijer，andJ.M.M.Walboomers.1990.Generalprimer-mediatedpolymerasechainreactionpermitsthedetectionofsequencedandstillunsequencedhumanpapillornavirusgenotypesincervicalscrapesandcarcinomas.Int.J.Cancer45644-649.Young，L.S.，I.S.Bevan，M.A.Johnson，P.I.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孔中，加入擴(kuò)增的生物素化的DNA和dH2O，至總體積17μl(注7μlPCR反應(yīng)物用于檢測)。8.通過上下吸液幾次，輕輕混合反應(yīng)孔。9.在熱循環(huán)儀中在99℃溫育5分鐘，使擴(kuò)增的生物素化的DNA變性。10.在雜交溫度(55℃)溫育反應(yīng)板15分鐘。11.在溫育過程中，通過用冰冷的1xTMAC沖洗2次，準(zhǔn)備過濾板。接著，用冰冷的1xTMAC填充過濾板的每個孔。12.在溫育過程中，通過在1xTMAC雜交緩沖液中稀釋抗生物素蛋白鏈菌素-R-藻紅蛋白至2μg/ml，制備新鮮的報道混合物(注每個反應(yīng)需要75μl報道混合物)，并置于雜交溫度的恒溫箱或水浴中。13.通過將整個反應(yīng)物轉(zhuǎn)移至含有冰冷的洗滌緩沖液的過濾板，終止雜交反應(yīng)。14.轉(zhuǎn)移后，通過插入真空過濾，用冰冷的1xTMAC洗滌緩沖液嚴(yán)格地洗滌過濾板2次。15.向每個孔中加入75μl報道混合物，通過上下吸液幾次，輕輕混合。16.使整個平板達(dá)到室溫約30分鐘。17.在雜交溫度溫育反應(yīng)板30分鐘。18.通過真空過濾，終止溫育。19.通過插入真空過濾，用1xTMAC洗滌緩沖液洗滌2次。20.通過插入真空過濾，將反應(yīng)物溶于1xTMAC洗滌緩沖液。21.根據(jù)系統(tǒng)手冊，在室溫，在LuminexTM100分析儀上進(jìn)行分析。[參見圖6.Wallace等(2005)所述的工作流程的通用概況]測試的靈敏度和特異性是基于探針和靶核酸序列之間的特異性雜交。因此，雜交和洗滌，以及與PE一起溫育，都是該操作的關(guān)鍵步驟。通過優(yōu)化不同的參數(shù)，例如溫度和擴(kuò)散動力學(xué)，調(diào)整該方案，以便使反應(yīng)的特異性和靈敏度最大化。在優(yōu)化的雜交方案中指出了這些調(diào)整(參見下文)。材料A.緩沖液0.1MMESpH4.5(偶聯(lián)緩沖液)過濾器(45μm)除菌，并保存在4℃0.02％吐溫(洗滌緩沖液I)過濾器(45μm)除菌，并保存在室溫20％Sarkosyl過濾器(45μm)除菌，并保存在室溫TEpH8.0(樣品稀釋液)過濾器(45μm)除菌，并保存在室溫4.5xSSC/0.15％Sarkosyl雜交緩沖液(微球稀釋液)過濾器(45μm)除菌，并保存在室溫3xSSC/0.1％Sarkosyl/1mg/ml酪蛋白嚴(yán)格洗滌緩沖液過濾器(45μm)除菌，并保存在4℃1xSSC/0.1％Sarkosyl/1mg/ml酪蛋白洗滌緩沖液過濾器(45μm)除菌，并保存在4℃B.珠子1.使用的珠子類型是L100-C123-01直到L100-C172-01(LuminexTMCorp.，Austin，TX)。C.探針(參見實(shí)施例)1.探針由Eurogentec(Seraing，Belgium)供給。D.設(shè)備方法和方案I.探針偶聯(lián)1.使新鮮的-20℃等分試樣、烘干的PierceEDC[1-乙基-3-[二甲基氨基丙基]碳二亞胺氫氯化物]粉末達(dá)到室溫。2.將胺取代的寡核苷酸(″探針″或″捕獲″寡聚物)在dH2O中重懸至0.2mM(0.2nmol/μl)。3.通過渦旋和超聲處理，重懸微球原液約20秒。4.將5.0×106微球原液轉(zhuǎn)移至USAScientific微量離心試管。5.通過在≥8000xg微量離心1-2分鐘，沉淀微球原液。6.去除上清液，通過渦旋和超聲處理約20秒，將沉淀的微球重懸于50μl0.1MMES，pH4.5中。7.在dH2O中制備0.2mM捕獲寡聚物的1∶10稀釋液(0.02nmol/μl)。8.將2μl(0.04nmol)1∶10稀釋的捕獲寡聚物加入重懸的微球，并通過渦旋進(jìn)行混合。9.制備20mg/mlEDC在dH2O中的新鮮溶液。最多在使用前1分鐘，將10mgEDC溶于500μldH2O。將與硅膠包裝在一起的10mgEDC等分試樣(粉末)干燥保存在-80℃。10.對于每個反應(yīng)，逐個將2.5μl新配制的20mg/mlEDC加入微球，并通過渦旋進(jìn)行混合(注現(xiàn)在應(yīng)當(dāng)棄去EDC等分試樣粉末)。11.在室溫，在黑暗中溫育30分鐘。12.制備20mg/mlEDC于dH2O中的第二種新鮮溶液。13.對于每個反應(yīng)，逐個將2.5μl新配制的20mg/mlEDC加入微球，并通過渦旋進(jìn)行混合(注現(xiàn)在應(yīng)當(dāng)棄去EDC等分試樣粉末)。14.在室溫，在黑暗中溫育30分鐘。15.將1.0ml0.02％吐溫-20加入偶聯(lián)的微球。16.通過在≥8000xg微量離心1-2分鐘，沉淀偶聯(lián)的微球。17.去除上清液，通過渦旋，將偶聯(lián)的微球重懸于1.0ml0.1％SDS中。18.通過在≥8000xg微量離心1-2分鐘，沉淀偶聯(lián)的微球。。19.去除上清液，通過渦旋和超聲處理約20秒，將偶聯(lián)的微球重懸于100μlTE，pH8.0。20.通過在≥8000xg微量離心1-2分鐘，沉淀偶聯(lián)的微球。21.去除上清液，通過渦旋和超聲處理約20秒，將偶聯(lián)的微球重懸于100μlTE，pH8.0。22.通過血細(xì)胞計數(shù)器，計數(shù)偶聯(lián)的微球a.在dH2O中1∶100稀釋重懸的、偶聯(lián)的微球。b.通過渦旋徹底混合。c.將10μl轉(zhuǎn)移至血細(xì)胞計數(shù)器。d.計數(shù)在血細(xì)胞計數(shù)器的4個大正方形網(wǎng)格中的微球。e.微球/μl＝(4個大正方形中的微球總數(shù))x2.5x100(稀釋因數(shù))(注最大是50,000微球/μl)。23.在黑暗中，在2-10℃保存冷凍的偶聯(lián)微球。II.優(yōu)化的雜交和洗滌方案1.選擇適宜的寡核苷酸偶聯(lián)的微球集合。2.通過渦旋和超聲處理約20秒，重懸微球。3.通過在4.5xSSC/0.15％Sarkocyl雜交緩沖液中稀釋偶聯(lián)的微球原液至每個集合150個微球/μl，制備工作微球混合物(注每個反應(yīng)需要33μl工作微球混合物)。4.通過渦旋和超聲處理約20秒，混合工作微球混合物。5.向每個樣品或背景孔中，加入33μl工作微球混合物。6.向每個背景孔中，加入17μlTE，pH8。7.向每個樣品孔中，加入擴(kuò)增的生物素化的DNA和TE，pH8.0，至總體積17μl(注4μl強(qiáng)烈的50μlPCR反應(yīng)物通常對于檢測是足夠的)。8.通過上下吸液幾次，輕輕混合反應(yīng)孔。9.在熱循環(huán)儀中在95-100℃溫育5分鐘，使擴(kuò)增的生物素化的DNA變性。10.在熱循環(huán)儀中在60℃溫育反應(yīng)板3分鐘。11.將反應(yīng)板轉(zhuǎn)移至在雜交溫度預(yù)熱的熱混合儀(注可以使用8-通道吸管操縱器來同時轉(zhuǎn)移8個孔中的反應(yīng)物)。12.在雜交溫度和500rpm，溫育反應(yīng)板15分鐘。13.在溫育過程中，通過用蒸餾水沖洗，準(zhǔn)備Millipore過濾板。接著，在雜交溫度用200μl3xSSC/0.1％Sarkocyl/1mg/ml酪蛋白洗滌緩沖液填充過濾板的每個孔，并置于雜交溫度的恒溫箱中。14.在溫育過程中，通過在3xSSC/0.1％Sarkocyl/1mg/ml酪蛋白嚴(yán)格洗滌緩沖液中稀釋抗生物素蛋白鏈菌素-R-藻紅蛋白至2μg/ml，制備新鮮的報道混合物(注每個反應(yīng)需要75μl報道混合物)，并置于雜交溫度的恒溫箱或水浴中。15.通過將整個反應(yīng)物轉(zhuǎn)移至在雜交溫度的含有洗滌緩沖液的過濾板，終止雜交反應(yīng)。16.轉(zhuǎn)移后，通過插入真空過濾，用雜交溫度的100μl3xSSC/0.1％Sarkocyl/1mg/ml酪蛋白嚴(yán)格洗滌緩沖液洗滌過濾板2次。17.向每個孔中加入75μl報道混合物，通過上下吸液幾次，輕輕混合。18.在雜交溫度溫育反應(yīng)板15分鐘。19.通過真空過濾，終止溫育。20.通過插入真空過濾，用室溫下的100μl1xSSC/0.1％Sarkocyl/1mg/ml酪蛋白洗滌緩沖液洗滌2次。21.在室溫，將反應(yīng)物溶于100μl1xSSC/0.1％Sarkocyl/1mg/ml酪蛋白洗滌緩沖液中。22.根據(jù)系統(tǒng)手冊，在室溫，在LuminexTM100分析儀上分析50μl。III.讀出1.使用LuminexTM100IS2.3版軟件，讀出數(shù)據(jù)。2.在測量過程中，使用下面的參數(shù)a.樣品體積50μlb.樣品超時60秒c.XY加熱器溫度(℃)35d.雙重鑒別器閘門i.下限8000ii.上限18500e.統(tǒng)計中間值IV.數(shù)據(jù)管理1.將數(shù)據(jù)保存在未加工的CSV文件(逗號分隔的*.csv)中，后者含有LuminexTM100IS2.3軟件提供的所有標(biāo)準(zhǔn)輸出。2.將得到的中間信號轉(zhuǎn)移至Excel文件，用于計算靶/探針比，和信噪比(也參見布局和計算)。本發(fā)明解決了LuminexTM程序的不同項(xiàng)目，包括探針設(shè)計的優(yōu)化和實(shí)驗(yàn)方案的優(yōu)化。在下文中，按照圖2所示的工作流程的次序，表述數(shù)據(jù)。圖6.調(diào)整的工作流程的通用概況實(shí)施例中的結(jié)果說明(布局和計算)下面指出和解釋了涉及的實(shí)施例和權(quán)利要求。將結(jié)果主要表達(dá)為含有原始數(shù)據(jù)的表(MFI＝中間熒光強(qiáng)度)，變量(例如溫度)，探針，和分析的靶，計算值和備注。計算值包括靶/探針比(％靶/探針)和信噪比(信號/噪音)。根據(jù)探針計算靶/探針比，并將各個信號顯示為設(shè)定為100％的陽性對照的百分比(也參見實(shí)施例表15)。也根據(jù)探針計算信噪比。將每個信號除以得到的所有信號的中值(也參見實(shí)施例表16)。靶/探針比和信噪比會給出信號強(qiáng)度和特異性的良好總指標(biāo)。某些實(shí)施例使用來自本文整體引作參考的EP1012348所述的SPF1O引物和探針集合的探針。該專利提供了在本專利申請中使用的技術(shù)的技術(shù)背景。SPF1O引物集合會產(chǎn)生長僅65bp的小擴(kuò)增引物，引物間區(qū)域是22核苷酸。這嚴(yán)重限制了針對所有HPV基因型之間的不同錯配放置探針的可能性。實(shí)施例2目的檢查在雜交步驟之后維持雜交溫度是否對信號特異性具有顯著的積極影響。簡介固定在珠子上的探針和溶液中的變性靶序列之間雜交后，在與報道試劑抗生物素蛋白鏈菌素-R-藻紅蛋白(PE)一起溫育之前，需要洗掉未結(jié)合的物質(zhì)。這通過使用過濾板(MSBVN12，Millipore)來實(shí)現(xiàn)，其中珠子和所有附著的分子都與溶液中的游離分子相分離。反應(yīng)體積較小，因此易受環(huán)境的快速溫度變化的影響。我們檢查了雜交溫度之后溫度的變化的影響。材料和方法使用SPF1O模型系統(tǒng)，研究了低于雜交溫度的溫育對LuminexTM信號的影響。使用LuminexTM珠子，其攜帶HPV31的探針(探針31SLPr31，參見表5a)。該探針對用SPF1O引物集合擴(kuò)增的HPV31序列的鑒別是特異性的。為了評估交叉反應(yīng)性，使用了HPV44和HPV16的擴(kuò)增引物。HPV31和HPV44的靶序列的差異在于1個位置，HPV31和HPV16的靶序列的差異在于4個位置(表5b)。在50℃進(jìn)行雜交，一式兩份地進(jìn)行測定。隨后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案處理一組反應(yīng)物，并在4℃在過濾板中立即洗滌珠子。首先在室溫(RT)溫育重復(fù)組的反應(yīng)物1分鐘，然后在4℃開始相同的標(biāo)準(zhǔn)洗滌。與Wallace等(2005)不同，在將樣品轉(zhuǎn)移至過濾板之后，加入洗滌緩沖液(也參見實(shí)施例3)。結(jié)果結(jié)果如表5c所示。經(jīng)證實(shí)，在雜交后和嚴(yán)格洗滌之前在室溫僅溫育1分鐘，會造成信號的增加，但是也會降低特異性(如觀察到HPV44的更高的信號所證實(shí)的)。這可以通過嚴(yán)格性的降低來解釋，后者由雜交后短暫的溫度下降造成。結(jié)論在雜交步驟后，應(yīng)當(dāng)維持反應(yīng)溫度。雜交后，應(yīng)當(dāng)沒有任何延遲、盡可能快地洗滌珠子，以防止溫度的任何降低。實(shí)施例3目的檢查在雜交之后立即稀釋洗滌是否對信號特異性具有顯著的積極影響。簡介如果沒有在雜交步驟之后立即洗滌，標(biāo)準(zhǔn)的LuminexTM測定操作包含導(dǎo)入非特異性結(jié)合的風(fēng)險(也參見實(shí)施例2)。為了使該風(fēng)險最小化，檢查了雜交之后立即稀釋樣品。材料和方法為了研究該作用，使用了2種LuminexTM珠子的混合物，一種珠子攜帶HPV31的探針(名稱31SLPr31，參見表6a)，另一種珠子攜帶HPV51的探針(名稱51SLPr2，參見表6a)。這些探針分別對用SPF1O引物集合擴(kuò)增的HPV31和HPV51序列的鑒別是特異性的。為了觀察與31SLPr31的可能的交叉反應(yīng)性，使用了HPV44和HPV16的擴(kuò)增引物。HPV31和HPV44和16的靶序列的差異分別在于1個和4個位置(表6b)。為了觀察與51SLPr2的可能的交叉反應(yīng)性，使用了HPV33和HPV16的擴(kuò)增引物。HPV51和HPV44和16的靶序列的差異在于4個位置(表6c)。使用標(biāo)準(zhǔn)方案，在50℃進(jìn)行雜交。隨后，在4℃立即在過濾板中洗滌第一組反應(yīng)物，沒有任何其它洗滌。與Wallace等(2005)不同，在將樣品轉(zhuǎn)移至過濾板之后，加入洗滌緩沖液。如下研究了在雜交步驟之后立即進(jìn)行的額外的直接的和間接的稀釋洗滌操作的影響。對于該直接的和間接的操作程序，在50℃使用洗滌緩沖液(3xSSC/0.1％Sarkocyl/1mg/ml酪蛋白，這是嚴(yán)格洗滌緩沖液)。通過直接操作，洗滌第二組珠子。該直接操作包含，在熱循環(huán)儀中，在雜交溫度，用200μl洗滌緩沖液稀釋雜交混合物(50μl)，隨后將所有稀釋的樣品轉(zhuǎn)移至過濾板。通過間接操作，洗滌第三組雜交反應(yīng)物。該間接操作包含，通過將50μl雜交混合物快速轉(zhuǎn)移至已經(jīng)在雜交溫度預(yù)裝200μl洗滌緩沖液的過濾板，進(jìn)行稀釋(也參見Wallace等，2005)。結(jié)果結(jié)果如表6d所示。與標(biāo)準(zhǔn)操作相比，2種額外的洗滌操作都導(dǎo)致了絕對信號的降低，但是同時，信號的特異性顯著增加。直接的和間接的洗滌操作之間沒有顯著差異。在實(shí)踐中，在熱循環(huán)儀中的直接稀釋洗滌更難實(shí)現(xiàn)，因此，間接的稀釋洗滌操作是優(yōu)選的。結(jié)論在雜交之后使用一個額外的稀釋-洗滌步驟，對信號特異性具有顯著的積極影響。鑒于實(shí)踐的原因，間接的稀釋洗滌操作是優(yōu)選的。實(shí)施例4目的檢查在與抗生物素蛋白鏈菌素-R-藻紅蛋白溫育之前，在嚴(yán)格洗滌過程中維持雜交溫度是否對信號特異性具有顯著的積極影響。簡介如上所述的嚴(yán)格雜交之后溫度下降的消極作用，暗示著嚴(yán)格洗滌溫度本身也是影響因素。因此，研究了50℃、室溫或4℃的嚴(yán)格洗滌溫度的影響。材料和方法如下使用SPF10模型系統(tǒng)，研究了在雜交步驟之后、與抗生物素蛋白鏈菌素-R-藻紅蛋白一起溫育之前，不同的嚴(yán)格洗滌緩沖液溫度的影響。為了研究該作用，使用了LuminexTM珠子，其攜帶HPV31的探針(名稱31SLPr31，參見表7a)。該探針對用SPF1O引物集合擴(kuò)增的HPV31序列的鑒別是特異性的。為了觀察與31SLPr31的可能的交叉反應(yīng)性，使用了HPV44和HPV16的擴(kuò)增引物。HPV31和HPV44和16的靶序列的差異分別在于1個和4個位置(表7b)。在50℃進(jìn)行雜交。隨后，將反應(yīng)物集合轉(zhuǎn)移至分別含有50℃、室溫或4℃的洗滌緩沖液的過濾板。結(jié)果結(jié)果如表7c所示。陽性對照信號的絕對水平在50℃和室溫之間沒有差別，在4℃洗滌后輕微下降。但是，在50℃的洗滌導(dǎo)致信號特異性的顯著增加，而在室溫或4℃的洗滌導(dǎo)致信號特異性的降低。因此，在50℃雜交溫度的間接稀釋洗滌操作是優(yōu)選的。結(jié)論在與抗生物素蛋白鏈菌素-R-藻紅蛋白一起溫育之前，在嚴(yán)格洗滌過程中維持雜交溫度，對信號特異性具有顯著作用。實(shí)施例5目的檢查熱混合儀的應(yīng)用是否對信號強(qiáng)度具有顯著的積極作用。簡介通過在反應(yīng)過程中混合組分，可以影響雜交反應(yīng)的動力學(xué)。因此，我們研究了在雜交過程中使用熱混合儀的影響。材料和方法如下使用MPF模型系統(tǒng)，研究了在雜交過程中使用熱混合儀對擴(kuò)散動力學(xué)的影響。使用了2種LuminexTM珠子，其攜帶HPV18的探針(名稱18MLPr7，參見表8a)或HPV51的探針(名稱51MLPr2，參見表8a)。這些探針對用MPF引物集合擴(kuò)增的HPV18和HPV51序列的鑒別是特異性的。將2種珠子混合到一起，并與HPV18和HPV51的MPF擴(kuò)增引物雜交。HPV18和HPV51的靶序列的差別在于7個位置(表8b和c)。一式兩份地測試反應(yīng)。不經(jīng)搖動，在熱循環(huán)儀中變性和雜交一份反應(yīng)物(也參見Wallace等，2005)。在熱循環(huán)儀中變性用于變性的重復(fù)反應(yīng)物，并立即轉(zhuǎn)移至熱混合儀，用于雜交。在50℃進(jìn)行雜交。隨后使用優(yōu)化的雜交和洗滌方案，在50℃立即在過濾板中洗滌珠子。結(jié)果結(jié)果如表8d所示。熱混合儀的使用顯著增加了陽性對照的絕對信號，而背景未受影響。這導(dǎo)致信號特異性的總體增加。這些結(jié)果證實(shí)，通過使用熱混合儀，可以增加(提高)信號強(qiáng)度。結(jié)論熱混合儀的使用對信號強(qiáng)度和特異性具有顯著的積極作用。實(shí)施例6目的檢查在雜交溫度與抗生物素蛋白鏈菌素-R-藻紅蛋白溫育是否對信號強(qiáng)度具有顯著的積極作用。簡介通常，溫度會影響任何反應(yīng)的動力學(xué)，包括用報道物PE檢測雜交體。因此，研究了溫度對PE溫育和隨后的洗滌的影響。材料和方法使用了LuminexTM珠子，其攜帶HPV51的探針(名稱51SLPr2，參見表9a)。該探針對用SPF10引物集合擴(kuò)增的HPV51序列的鑒別是特異性的。為了觀察與該探針的可能的交叉反應(yīng)性，使用了HPV33和HPV16的SPF1O擴(kuò)增引物。HPV51，HPV33和HPV16的靶序列的差異在于4個位置(表9b)。使用本文所述的優(yōu)化的雜交和洗滌方案，一式兩份地在50℃進(jìn)行雜交。嚴(yán)格洗滌后，一組反應(yīng)物與PE在50℃溫育(也參見Wallace等，2005)，另一組與PE在室溫溫育。隨后，在50℃、在過濾板中洗滌珠子。在另一個實(shí)驗(yàn)中，使用優(yōu)化的雜交和洗滌方案，一式兩份地在50℃進(jìn)行雜交。嚴(yán)格洗滌后，將所有反應(yīng)物與PE在50℃溫育(也參見Wallace等，2005)，與PE在50℃溫育后，在50℃洗滌一組反應(yīng)物(也參見Wallace等，2005)，在室溫洗滌重復(fù)組反應(yīng)物。結(jié)果不同溫度的PE溫育具有顯著作用，如表9c所示。與在室溫的PE溫育相比，在50℃雜交溫度的PE溫育會產(chǎn)生更高的絕對信號。但是，信號的特異性沒有顯著差異。因此，在雜交溫度與抗生物素蛋白鏈菌素-R-藻紅蛋白溫育是優(yōu)選的。相反地，溫育之后在室溫或雜交溫度洗滌，沒有顯著作用，盡管這在有些情況下可能更易實(shí)現(xiàn)。溫度對PE溫育之后的洗滌步驟的影響不顯著。絕對信號和特異性似乎不會受到洗滌溫度的影響。結(jié)論在與抗生物素蛋白鏈菌素-R-藻紅蛋白溫育過程中維持雜交溫度，對信號強(qiáng)度有顯著影響，但是對信號特異性沒有影響。PE溫育之后的洗滌溫度沒有顯著影響。實(shí)施例7目的檢查通過1xSSC的最終洗滌，是否可以防止LuminexTM取樣探針的堵塞。簡介在我們的優(yōu)化的雜交和洗滌方案中，在3xSSC中進(jìn)行雜交。在該濃度，SSC會堵塞LuminexTM取樣探針，嚴(yán)重阻礙樣品的處理。因此，研究了更低的SSC濃度對最終洗滌的影響。結(jié)果最初，我們嘗試維持雜交的SSC濃度。但是，由于3xSSC的最終洗滌導(dǎo)致LuminexTM取樣探針的嚴(yán)重堵塞，不能產(chǎn)生顯著數(shù)據(jù)。簡單地用1xSSC進(jìn)行該洗滌步驟，確實(shí)產(chǎn)生了顯著數(shù)據(jù)。因此，由于缺少數(shù)據(jù)，沒有顯示數(shù)據(jù)對比。已經(jīng)研究了其它SSC濃度。結(jié)論1xSSC的最終洗滌會預(yù)防LuminexTM取樣探針的堵塞。實(shí)施例8目的檢查最終洗滌之后在4℃保存已經(jīng)準(zhǔn)備好測量的樣品至少4天，是否對信號具有任何顯著影響。簡介為了增加工作場所的靈活性，我們使用LuminexTM系統(tǒng)，針對直接雜交實(shí)驗(yàn)方案，分析了幾個步驟。更具體地測試的一個操作是，在直接雜交操作的2個步驟之間的保存。因此，我們研究了在4℃保存的影響。材料和方法如下使用SPF1O模型系統(tǒng)，研究了最終洗滌操作后在4℃保存的影響。為了研究該作用，使用了LuminexTM珠子，其攜帶HPV51的探針(名稱51SLPr2，參見表10a)。該探針對用SPF1O引物集合擴(kuò)增的HPV51序列的鑒別是特異性的。為了觀察與51SLPr2的可能的交叉反應(yīng)性，使用了HPV31的擴(kuò)增引物。HPV51和HPV31的靶序列的差異在于4個位置(表10b)。在最終洗滌操作后，在4℃保存反應(yīng)物集合分別0，4，24，和96小時。接著，在室溫測量這些反應(yīng)物集合。結(jié)果結(jié)果如10c所示。如證實(shí)的，最終洗滌步驟之后的保存沒有影響信號強(qiáng)度或特異性。然而，這樣的保存似乎會隨著時間導(dǎo)入非常輕微的粗信號強(qiáng)度的提高。因此，如果需要，可以在最終洗滌步驟之后保存最多4天，維持原始信號。結(jié)論最終洗滌步驟之后的保存對信號強(qiáng)度和信號特異性沒有顯著影響，增加了工作場所的靈活性。探針(間隔物)設(shè)計-簡介LuminexTM系統(tǒng)的關(guān)鍵原理是，將特異性的寡核苷酸探針固定在微珠表面上，其用作獨(dú)特標(biāo)記，這是由于各個珠子類型的彩色組分。在分子規(guī)模，珠子比特異性的寡核苷酸探針大的多。結(jié)果，特異性的探針序列的位置非常接近LuminexTM珠子的表面。由于位阻和各種珠子表面效應(yīng)，例如表面疏水性，該探針位置對于固定的探針和溶液中的靶分子之間的雜交動力學(xué)可能是最佳的。下面的實(shí)施例描述了許多改變探針在珠子表面上的定位的方案，以便優(yōu)化探針和靶之間的雜交動力學(xué)。測試了探針設(shè)計中的下述變體1.使用可變長度的碳間隔物2.使用一種額外的可變長度的寡核苷酸間隔物3.使用可變組成的寡核苷酸間隔物探針具有3個不同的區(qū)域，其具有不同的功能；1.偶聯(lián)基團(tuán)，例如，NH2基團(tuán)，其允許探針共價偶聯(lián)到珠子表面上；2.間隔物，其可以用于建立珠子表面和特異性的探針序列之間的距離，和/或(b)將特異性的探針更多地置于親水環(huán)境中；和3.實(shí)際的靶-特異性的探針序列。對于探針的該部分，適用本領(lǐng)域的正常參數(shù)，例如，探針組成和長度。實(shí)施例9目的確定使用可變長度的碳間隔物的效果。材料和方法使用LuminexTM珠子，其攜帶具有C12間隔物的HPV51探針(名稱51SLPr2，參見表1Ia)或具有C18間隔物的HPV51探針(名稱51SLPr2C18，參見表1Ia)。這些探針對用SPF1O引物集合擴(kuò)增的HPV51序列的鑒別是特異性的。為了觀察與這些探針的可能的交叉反應(yīng)性，使用了HPV33的擴(kuò)增引物。HPV51和HPV33的靶序列的差異在于4個位置(表11b)。結(jié)果結(jié)果如表11c所示。C18間隔物導(dǎo)致絕對信號的降低，但是特異性比C12探針高。發(fā)現(xiàn)該現(xiàn)象不僅存在于51SLPr2C18，而且也存在于具有C18碳間隔物的其它探針(例如33SLPr21C18表11a，c，和d)。結(jié)論不同的碳間隔物長度的使用，對信號特異性具有顯著影響。關(guān)于例如51SLPr2，最佳探針含有C18碳間隔物。實(shí)施例10目的確定可變長度的寡核苷酸間隔物的效果。材料和方法使用LuminexTM珠子，其攜帶具有0、10、20、30或40個胸腺嘧啶組成的間隔物的HPV51探針(名稱51SLPr2，51SLPr2T10，51SLPr2T20，51SLPr2T30，51SLPr2T40，參見表12a)。每個珠子類型攜帶不同的探針變體。這些探針對用SPF1O引物集合擴(kuò)增的HPV51序列的鑒別是特異性的。為了觀察與這些探針的可能的交叉反應(yīng)性，使用了HPV33的擴(kuò)增引物。HPV51和HPV33的靶序列的差異在于4個位置(表12c)。除了SPF1O模型系統(tǒng)以外，還使用如下的MPF模型系統(tǒng)研究了該效應(yīng)。使用LuminexTM珠子，其攜帶具有0、20、30或40個胸腺嘧啶組成的間隔物的HPV52探針(名稱52MLPr2，52MLPr2T20，5MLPr2T30，52MLPr2T40，參見表12b)。每個珠子類型攜帶不同的探針變體。這些探針對用MPF引物集合擴(kuò)增的HPV52序列的鑒別是特異性的。為了觀察與這些探針的可能的交叉反應(yīng)性，使用了HPV16的擴(kuò)增引物。HPV52和HPV16的靶序列的差異在于2個位置(表12d)。結(jié)果結(jié)果如表12e和12f所示。用胸腺嘧啶片段延長間隔物，會顯著增加絕對信號水平。與沒有額外的胸腺嘧啶間隔物的間隔物相比，特異性也顯著增加。與具有不同長度的間隔物相比，需要最少20個胸腺嘧啶殘基來產(chǎn)生最佳信號(例如51SLPr2)?？傊?，當(dāng)它們含有40個核苷酸組成的間隔物時，探針表現(xiàn)最佳(例如51SLPr2，和52MLPr2)。因此，該間隔物長度是優(yōu)選的。結(jié)論不同間隔物的使用，不僅對信號強(qiáng)度有顯著影響，而且也對特異性有顯著影響。關(guān)于51SLPr2Tn，好的探針含有能增加信號強(qiáng)度和特異性的至少20個胸腺嘧啶核苷酸組成的間隔物，通常，至少40個核苷酸組成的間隔物長度表現(xiàn)最佳。實(shí)施例11目的確定改進(jìn)的聚(T)間隔物的使用是否會阻止假陽性反應(yīng)性。簡介眾所周知，許多TaqDNA聚合酶會在合成鏈的3′末端添加一個額外的A-核苷酸。不知道是否也會在3′末端添加多個A，從而產(chǎn)生在3′末端具有寡聚A尾的分子亞群。盡管這樣的分子僅僅代表PCR產(chǎn)物總量中非常小的比例，由于檢測方法的高靈敏度，這些分子可以導(dǎo)致假陰性結(jié)果。這是因?yàn)镻CR產(chǎn)物的這種寡聚A片段和探針的聚(T)間隔物之間發(fā)生雜交的事實(shí)。該P(yáng)CR偽跡發(fā)生在有些樣品中，且難以在PCR水平再現(xiàn)。它似乎依賴于反應(yīng)條件的非常微小的波動。背景在檢測水平是非?？稍佻F(xiàn)的，即PCR產(chǎn)物的產(chǎn)生背景也是非常可再現(xiàn)的。該P(yáng)CR偽跡也可以在線性探針測定(LiPA)系統(tǒng)中造成假陽性結(jié)果，因?yàn)樵撓到y(tǒng)也包含T-加尾的探針，在LiPA測定中，這會導(dǎo)致微弱的與所有探針相同的(背景)信號，無論它們的具體序列。在LuminexTM系統(tǒng)中，也觀察到了這樣微弱的背景信號讀出。因此，研究了改進(jìn)的間隔物的效果。材料和方法使用LuminexTM珠子，其攜帶具有T40間隔物或改進(jìn)的(TTG)13間隔物的HPV18探針(名稱18MLPr7T40和18MLPr7(TTG)13，參見表13a)。這些探針對用MPF引物集合擴(kuò)增的HPV18序列的鑒別是特異性的。選擇(TTG)三聯(lián)體作為替代間隔物，因?yàn)樗憩F(xiàn)出與聚(A)的最差理論結(jié)合效率之一。為了觀察與18MLPr7T40和18MLPr7(TTG)13的可能的交叉反應(yīng)性，使用了源自表現(xiàn)出該假陽性背景的樣品的擴(kuò)增引物(稱作nc8)。結(jié)果結(jié)果如表13b所示。13個″TTG″核苷酸三聯(lián)體的間隔物顯然能幾乎完全消除使用T40間隔物時觀察到的背景信號。結(jié)論替代性的基于T的間隔物例如(TTG)13的使用，對信號特異性具有顯著的積極影響，消除了由富含A的PCR偽跡誘發(fā)的假陽性信號。實(shí)施例12目的檢查在探針5′-或3′-末端放置基于胸腺嘧啶的間隔物，是否會阻止與側(cè)翼于探針-靶結(jié)合位點(diǎn)的富含A的靶區(qū)域結(jié)合。簡介已知在探針/靶中間的錯配對它的結(jié)合能具有最大的影響。接近結(jié)合區(qū)域側(cè)面的錯配更難以辨別。與側(cè)翼于探針/靶結(jié)合區(qū)域的富含A的片段的位置相組合，這可能對探針的選擇性強(qiáng)度有害。因此，我們研究了間隔物位置的影響，以便使它與側(cè)翼于探針-靶結(jié)合位點(diǎn)的富含A的靶區(qū)域的結(jié)合最小化。材料和方法如下使用MPF模型系統(tǒng)，研究了置于LuminexTM珠子和特異性的探針序列之間的探針5′-或3′-末端的間隔物位置的影響。為了研究該影響，使用了LuminexTM珠子，其攜帶具有基于胸腺嘧啶的間隔物的HPV18和HPV45的探針(名稱18MLPr7T40N5，18MLPr7T40N3，45MLPr8T40N5和45MLPr8T40N3，參見表14a)。這些探針分別對用MPF引物集合擴(kuò)增的HPV18和HPV45序列的鑒別是特異性的。為了觀察與18MLPr7T40n的可能的交叉反應(yīng)性，使用了HPV39的擴(kuò)增引物。HPV18和HPV39的靶序列的差異在于2個位置(表14b)。為了觀察與45MLPr8T40n的可能的交叉反應(yīng)性，使用了HPV13，39，和40的擴(kuò)增引物。HPV45和HPV13，39和40的靶序列的差異分別在于3，2，和1個位置(表14c)。結(jié)果結(jié)果如表14d所示。如證實(shí)的，在探針3′-末端(而不是5′-末端)的間隔物，會降低它與側(cè)翼于探針-靶結(jié)合位點(diǎn)的富含A的靶區(qū)域的結(jié)合，影響結(jié)合能(dG)和解鏈溫度(Tm)。靶與間隔物和探針的結(jié)合，可以解釋這些非特異性信號的排除。這些結(jié)果表明，靶與間隔物的結(jié)合，可以妨礙探針特異性，這應(yīng)當(dāng)加以預(yù)防。原則上，使用″TTG″核苷酸三聯(lián)體間隔物，可以涉及類似的機(jī)理。因此，當(dāng)使用基于胸腺嘧啶的間隔物時，間隔物和鄰近特定靶區(qū)域的序列之間微弱交叉雜交，可以增加探針靶雜交體的穩(wěn)定性，產(chǎn)生在探針設(shè)計時應(yīng)當(dāng)考慮的假陽性信號。結(jié)論基于胸腺嘧啶的間隔物在探針5′或3′末端的定位，可以對與側(cè)翼于探針-靶結(jié)合位點(diǎn)的富含A的靶區(qū)域的結(jié)合產(chǎn)生顯著影響。參考文獻(xiàn)CowanLS，DiemL，BrakeMC，CrawfordJT.RelatedArticles.TransferofaMycobacteriumtuberculosisgenotypingmethod，Spoligotyping，fromareverseline-blothybridization，membrane-basedassaytotheLuminexmultianalyteprofilingsystem.JClinMicrobiol.2004Jan；42(1)474-7.DunbarSA.ApplicationsofLuminexTM(R)xMAPtrademarktechnologyforrapid，high-throughputmultiplexednucleicaciddetection.ClinChimActa.2005Aug12；[Epubaheadofprint]TaylorJD，Bril.eyD，NguyenQ，LongK，IannoneMA，LiMS，YeF，AfshariA，LaiE，WagnerM，ChenJ，WeinerMP.Flowcytometricplatformforhigh-throughputsinglenucleotidepolymorphismanalysis.Biotechniques.2001Mar；30(3)661-6，668-9.deVilliersEM，F(xiàn)auquetC，BrokerTR，BernardHU，zurHausenH.Classificationofpapillomaviruses.Virology.2004Jun20；324(1)17-27.Review.WallaceJ，WodaBA，PihanG.Facile，comprehensive，high-throughputgenotypingofhumangenitalpapillomavirusesusingspectrallyaddressableliquidbeadmicroarrays.JMolDiagn.2005Feb；7(1)72-80.表實(shí)施例2表5a.5a.31SLPr31＝SPF10探針31版本31，C12＝12碳原子片段表5b.相同的核苷酸用“-”表示。表5c.表實(shí)施例3表6a.31SLPr31＝SPF10探針31版本31，C12＝12碳原子片段表6b.相同的核苷酸用“-”表示。表6c.相同的核苷酸用“-”表示。表6d.表實(shí)施例4表7a.31SLPr31＝SPF10探針31版本31，C12＝12碳原子片段表7b.相同的核苷酸用“-”表示。表7c.表實(shí)施例5表8a.18MLPr7＝MPF探針18版本7，C12＝12碳原子片段表8b.相同的核苷酸用“-”表示。表8c.相同的核苷酸用“-”表示。表8d.表實(shí)施例6表9a.51SLPr2＝SPF10探針51版本2，C12＝12碳原子片段表9b.相同的核苷酸用“-”表示。表9c.表9d.表實(shí)施例8表10a.51SLPr2＝SPF10探針51版本2，C12＝12碳原子片段表10b.相同的核苷酸用“-”表示。表10c.表實(shí)施例9表11a.51SLPr2＝SPF10探針51版本2，C12＝12碳原子片段，C18＝18碳原子片段表11b.相同的核苷酸用“-”表示。表11c.相同的核苷酸用“-”表示。表11d.表實(shí)施例10表12a.51SLPr2＝SPF10探針51版本2，C12＝12碳原子片段，(T)40＝40個胸腺嘧啶核苷酸組成的片段表12b.52MLPr2＝MPF探針52版本2，C12＝12碳原子片段，(T)40＝40個胸腺嘧啶核苷酸組成的片段表12c.相同的核苷酸用“-”表示。表12d.相同的核苷酸用“-”表示。表12e.表12f.表實(shí)施例11表13a.18MLPr7＝MPF探針18版本7，C12＝12碳原子片段，(T)40＝40個胸腺嘧啶核苷酸組成的片段(TTG)13＝13個胸腺嘧啶-胸腺嘧啶-鳥嘌呤核苷酸三聯(lián)體的片段(共39個核苷酸)表13b.nc8＝在LiPA測定中表現(xiàn)出與所有探針的交叉反應(yīng)的陰性對照8，DNA-＝陰性對照表實(shí)施例12表14a.18MLPr7＝MPF探針18版本7，C12＝12碳原子片段，(T)40＝40個胸腺嘧啶核苷酸組成的片段N5＝5’-末端氨基接頭，N3＝3’-末端氨基接頭，表14b.18MLPr7＝MPF探針18版本7，N5＝5’-末端氨基接頭，N3＝3’-末端氨基接頭，加灰框的序列＝可以結(jié)合胸腺嘧啶間隔物(小寫)和探針序列(大寫)的靶核甘酸，粗體且加下劃線＝與探針序列錯配。表14c.45MLPr8＝MPF探針45版本8，N5＝5’-末端氨基接頭，N3＝3’-末端氨基接頭，加灰框的序列＝可以結(jié)合胸腺嘧啶間隔物(小寫)和探針序列(大寫)的靶核甘酸，粗體且加下劃線＝與探針序列錯配。表14d.表15a和b％靶/探針A1，a＝988/988*100＝100％；A1，c＝19/988*100＝2％表16a和b信噪比A1，a＝988/12(＝中值(988，13，19，5，3，11，14，3))＝82；A1，c＝19/12(中值(988，13，19，5，3，11，14，3))＝2.實(shí)施例13適用于基于珠子的方案的HPV探針，例如適用于基于Luminex的方案表17在本發(fā)明的一個方面，任意的1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21或所有22種上述探針可以用于在相同條件下的基于珠子的多路反應(yīng)中，以同時檢測樣品中存在的任何HPV靶DNA。這樣的珠子集合適用于上述的優(yōu)化的反應(yīng)方案中。可以摻入額外的多碳間隔物。實(shí)施例14HPVMPF擴(kuò)增引物在96孔微量滴定板測定中的通用檢測，DNA酶免疫測定(DEIA)簡介本實(shí)施例描述了8個探針的混合物在用MPF引物進(jìn)行的廣譜PCR后得到的HPV擴(kuò)增引物的通用檢測中的應(yīng)用。(在本工作中，我們將圖1區(qū)域的分析稱作MPF分析，將其中使用的引物和探針稱作MPF引物和探針。擴(kuò)增的區(qū)域是MPF擴(kuò)增引物。以此方式，從本實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的″SPF1O″引物和探針集合鑒別出引物和探針，用于分析L1基因的不同區(qū)域。)材料和方法對于HPVMPF擴(kuò)增引物的通用檢測，從圖1HPV序列的比對，選擇探針。在表3中列出了通用DEIA探針的序列。通過擴(kuò)增含有HPV基因型6，11，13，16，18，26，30，31，32，33，34，35，39，43，44，45，51，52，53，54，55，56，57，58，59，66，67，68，69，70，71和74的HPV質(zhì)粒(由E-M.deVilliers博士，R.Ostrow博士，A.Lorincz博士，T.Matsukura博士，和G.Orth博士饋贈)，或代表HPV基因型7，40，42，61，72，73，81-87，90，91和HPV基因型16的2個變體序列的寡核苷酸序列，得到MPF擴(kuò)增引物。在50μl的終體積中，進(jìn)行HPVDNA擴(kuò)增，其中含有10μl靶DNA，1xPCR緩沖液II(PerkinElmer)，3.0mMMgCl2，0.2mM脫氧核苷三磷酸，10pmol每種正向和反向引物(表1和2)和1.5UAmpliTaqGold(PerkinElmer，Branchburg，NewJersey，USA)。PCR條件如下在94℃預(yù)熱9min，然后是在94℃30秒、在52℃45秒、和在72℃45秒的40個循環(huán)，最后在72℃延伸。通過與8種HPV-特異性的探針混合物(參見表3優(yōu)選的探針)的雜交，檢測由生物素化的MPFPCR引物合成的擴(kuò)增引物。在100μl雜交緩沖液(150mmol/LNaCl，15mmol/L檸檬酸鈉，pH7.0，0.1％吐溫20)中稀釋10微升PCR產(chǎn)物，并在抗生物素蛋白鏈菌素-包被的微量滴定板中在42℃溫育30分鐘。通過用雜交緩沖液洗滌3次，去除未捕獲的物質(zhì)。通過加入100μl變性溶液(100mmol/LNaOH)，使捕獲的雙鏈PCR產(chǎn)物變性，并在室溫溫育5分鐘，然后用雜交緩沖液洗滌3次。在雜交緩沖液中稀釋洋地黃毒苷(DIG)-標(biāo)記的HPV-特異性探針的混合物(參見表3優(yōu)選的探針)，加入孔中，并在42℃溫育45分鐘。洗滌孔3次，加入抗-DIG堿性磷酸酶綴合物，在42℃溫育15分鐘。洗滌5次后，加入底物，在室溫溫育15分鐘。通過加入100μl0.5mmol/LH2SO4，終止反應(yīng)。在微量滴定板讀數(shù)器中，測量在450nm的光密度(OD)。如果OD450比陰性(截止值)PCR對照高2.5倍，則認(rèn)為樣品是陽性的。在每輪中，與樣品一起測試陰性對照以及陽性和臨界陽性對照。結(jié)果HPV基因型6，7，11，13，16，18，26，30-35，39，40，42-45，51-59，66-74，81-87，90，91和HPV基因型16的2種變體序列的所有擴(kuò)增引物，都可與8種選擇的探針的混合物反應(yīng)。討論開發(fā)了8種探針的混合物，用于HPVMPF擴(kuò)增引物的通用檢測。8種選擇的探針在各種HPV基因型的檢測中是成功的，盡管HPV基因型51，57，71，84，87，13，91，11，59，30，44，55，70，52，69，84，86，74和HPV基因型16的2種變體的擴(kuò)增引物表現(xiàn)出與最佳匹配探針的1個核苷酸的錯配。實(shí)施例15HPVMPF基因型分析測定的開發(fā)簡介本實(shí)施例描述了用于同時檢測和鑒別HPV基因型的HPVMPF基因型分析測定。使用MPF引物進(jìn)行HPV廣譜擴(kuò)增后，可以通過與應(yīng)用于反向雜交條帶上的基因型特異性的探針的雜交，檢測和鑒別合成的擴(kuò)增引物。材料和方法探針的選擇基于位于表1和2的正向和反向引物靶序列之間的31bp序列，選擇類型特異性的探針。這些探針序列列在下面的表4和表18中。HPV質(zhì)粒和HPV寡聚物分析選擇的探針的分析靈敏度和特異性。通過使用在5′末端含有生物素基團(tuán)的10種MPF正向引物和8種MPF反向引物進(jìn)行PCR，得到HPVMPF擴(kuò)增引物，參見表1和2。如實(shí)施例1所述，進(jìn)行HPVPCR。HPVMPF反向雜交基因型分析測定的開發(fā)為了同時檢測和鑒別不同的HPV基因型，開發(fā)了反向雜交基因型分析測定。在單個雜交步驟中分析多個探針，需要選擇具有類似雜交特性的類型特異性的探針。在該實(shí)驗(yàn)中，選擇HPV類型16，18，26，31，33，35，39，45，51，52，53，56，58，59，66，68，70，82的探針以及類型53和66的2種證實(shí)探針。除了為證實(shí)選擇的探針以外，探針名稱從HPV類型編號開始。那些探針從′c′開始，隨后是HPV類型編號。除了類型61以外，選擇探針c53L1nPr3；除了類型89以外，選擇探針c66L1nPr5。選擇寡核苷酸探針，并分別用5′或3′末端的聚-T尾排序。將這些探針成平行線固定在硝酸纖維素條帶上。為了控制綴合物和底物的反應(yīng)，將生物素化的DNA也應(yīng)用于該條帶上。在圖7中顯示了可以使用的條帶的可能概要。通過加入10μlNaOH溶液，使10微升PCR產(chǎn)物變性，所述PCR產(chǎn)物含有位于引物5′末端的生物素基團(tuán)。10min后，將反向雜交條帶置于盤中。加入2毫升預(yù)熱的(37℃)雜交緩沖液(3xSSC[1xSSC是15mM檸檬酸鈉和150mMNaCl]，0.1％十二烷基硫酸鈉)，并在54±0.5℃溫育1h。在Auto-LiPA中，自動化地進(jìn)行所有溫育和洗滌步驟。在54℃，用2ml雜交溶液，將條帶洗滌2次，每次30秒，并洗滌1次30min。在該嚴(yán)格洗滌后，將條帶與2ml堿性磷酸酶-抗生物素蛋白鏈菌素綴合物一起在室溫溫育30min。用2ml沖洗溶液(含有NaCl、Triton和0.5％NaN3的磷酸鹽緩沖液)洗滌條帶2次，并用2ml底物緩沖液洗滌1次。加入2毫升底物(5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯和硝基藍(lán)四唑)，并在室溫溫育30min。通過抽吸底物溶液，并加入2ml蒸餾水，終止反應(yīng)。干燥后，目檢條帶結(jié)果。結(jié)果在反向雜交實(shí)驗(yàn)中使用從HPV類型16，18，26，31，33和35得到的擴(kuò)增引物，以確定從表18選擇的探針的特異性。表18小寫字母不是類型特異性的序列結(jié)果如圖8所示。結(jié)論反向雜交測定至少允許HPV類型16，18，26，31，33和35的陽性鑒別。因而，相應(yīng)的探針也可以同時用于多路反應(yīng)中。通過加入所有其它生殖道HPV類型的探針，可以擴(kuò)展該測定。實(shí)施例16用于檢測13種高危HPV基因型的高危MPFHPVDNA酶免疫測定(HRMPFHPVDEIA)簡介本實(shí)施例描述了13種洋地黃毒苷-標(biāo)記的HPV類型-特異性的寡核苷酸探針的混合物在DNA酶免疫測定(DEIA)中的應(yīng)用，所述測定用于在微量滴定板中特異性地且同時地檢測在廣譜PCR之后得到的13種(選擇的)高危HPV基因型(類型16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，和68)的擴(kuò)增引物，而其它HPV基因型的擴(kuò)增引物保持不被檢測到。材料和方法通用HPV擴(kuò)增后，通過與13種高危HPV-特異性的洋地黃毒苷-標(biāo)記的寡核苷酸探針的混合物(最佳選擇見表19)的雜交，可以在DEIA中檢測合成的生物素化的擴(kuò)增引物。從圖1的HPV序列比對中，選擇這些探針的序列，并列在表19中。有些寡核苷酸探針含有鎖定的核酸(LNA)。表19-高危MPFDEIA探針大寫字母是鎖定的核酸(LNA)修飾DIG是洋地黃毒苷*＝最佳選擇寡核苷酸探針為了評價DEIA的特異性，通過擴(kuò)增含有HPV基因型6，11，16，18，26，30，31，33，34，35，39，43，44，45，51，52，53，54，55，56，58，59，66，67，68，69，70，71和74的HPV質(zhì)粒(由E-M.deVilliers博士，R.Ostrow博士，A.Lorincz博士，T.Matsukura博士，和G.Orth博士饋贈)，或代表HPV基因型7，40，42，61，72，81，82，83，84，85，87，91和HPV基因型16的2個變體序列的寡核苷酸序列，得到MPF擴(kuò)增引物。在50μl的終體積中，進(jìn)行HPVDNA擴(kuò)增，其中含有10μl靶DNA，1xPCR緩沖液II(PerkinElmer)，3.0mMMgCl2，0.2mM脫氧核苷三磷酸，10pmol每種正向和反向引物(表1和2)和1.5UAmpliTaqGold(PerkinElmer，Branchburg，NewJersey，USA)。PCR條件如下在94℃預(yù)熱9min，然后是在94℃30秒、在52℃45秒、和在72℃45秒的40個循環(huán)，最后在72℃延伸5分鐘。在100μl雜交緩沖液(150mmol/LNaCl，15mmol/L檸檬酸鈉，pH7.0，0.1％吐溫20)中稀釋10微升由生物素化的MPFPCR引物合成的PCR產(chǎn)物，并在抗生物素蛋白鏈菌素-包被的微量滴定板中在45℃溫育30分鐘。通過用雜交緩沖液洗滌3次，去除未捕獲的物質(zhì)。通過加入100μl變性溶液(100mmol/LNaOH)，使捕獲的雙鏈PCR產(chǎn)物變性，并在室溫溫育5-15分鐘，然后用雜交緩沖液洗滌3次。在雜交緩沖液中稀釋洋地黃毒苷(DIG)-標(biāo)記的HPV-特異性探針的混合物(參見表3優(yōu)選的探針)，加入孔中，并在45℃溫育45分鐘。用嚴(yán)格洗滌溶液(37.5mmol/LNaCl，3.75mmol/L檸檬酸鈉，pH7.0，0.025％吐溫20)洗滌孔3次，向孔中加入300μl嚴(yán)格洗滌溶液，在45℃溫育45分鐘。用嚴(yán)格洗滌溶液洗滌孔2次，并用雜交緩沖液洗滌孔2次。隨后，加入抗-DIG堿性磷酸酶綴合物，在45℃溫育15分鐘。洗滌5次后，加入底物，在室溫溫育15分鐘。通過加入100μl0.5mmol/LH2SO4，終止反應(yīng)。在微量滴定板讀數(shù)器中，測量在450nm的光密度(OD)。如果OD45O比陰性PCR對照高2.5倍，則認(rèn)為樣品是陽性的。在每輪中，與臨床樣品一起測試陰性對照以及陽性和臨界陽性對照。結(jié)果HPV基因型16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，和68和HPV基因型16的2個變體序列的所有擴(kuò)增引物都可與13種選擇的探針的混合物反應(yīng)，而HPV基因型6，7，11，26，30，34，40，42，43，44，53，54，55，61，66，61，69，70，71，72，74，81，82，83，84，85，87，和91的擴(kuò)增引物保持不被檢測到。討論所述的HRMPFHPVDEIA可以同時檢測HPV高?；蛐?6，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，和68，而其它HPV基因型保持不被檢測到。使用在本申請中所述的新開發(fā)的引物集合進(jìn)行通用PCR后，可以檢測13種選擇的高?；蛐汀Ｊ褂闷渌鼭撛诟呶PV基因型的探針，仍然可以擴(kuò)展該檢測測定。實(shí)施例17通用MPFHPVDEIA和HRMPFHPVDEIA的靈敏度簡介本實(shí)施例描述了通用MPFHPVDEIA和HRMPFHPVDEIA的分析靈敏度的測定，和與SPF1O檢測和分型系統(tǒng)的對比。材料和方法為了評價通用MPFHPVDEIA和HRMPFHPVDEIA的分析靈敏度，通過擴(kuò)增含有HPV基因型18，31，33，35，和45的HPV質(zhì)粒(由E-M.deVilliers博士，R.Ostrow博士，A.Lorincz博士，T.Matsukura博士，和G.Orth博士饋贈)的10倍稀釋液，得到MPF擴(kuò)增引物。根據(jù)Kleter等1998和1999[Kleter，B.，L.J.vanDoom，L.Schrauwen，A.Molijn，S.Sastrowijoto，J.terSchegget，J.Lindeman，B.terHarmsel，andW.G.V.Quint.1999.DevelopmentandclinicalevaluationofahighlysensitivePCR-reversehybridizationlineprobeassayfordetectionandidentificationofanogenitalhumanpapillomavirus.J.Clin.Microbiol.372508-2517；Kleter，B.，L.J.vanDoorn，J.terSchegget，L.Schrauwen，C.vanKrimpen，M.P.Burger，B.terHarmsel，andW.G.V.Quint.1998.Anovelshort-fragmentPCRassayforhighlysensitivebroad-spectrumdetectionofanogenitalhumanpapillomaviruses.Am.J.Pathol.1531731-1739]，進(jìn)行SPF1OPCR和擴(kuò)增引物分析。結(jié)果-見下文使用陰性對照的OD450的2.5倍的邊界，通用MPFHPVDEIA和HRMPFHPVDEIA的計算分析靈敏度分別是12-72ag(相當(dāng)于病毒基因組的約2-15個拷貝的等同物)和48-722ag(相當(dāng)于病毒基因組的約10-150個拷貝的等同物)。尚未確定檢測測試的正式界限。結(jié)果-表20a-e約1個拷貝20a20b20c20d20e討論總之，通用MPFHPVDEIA和HRMPFHPVDEIA具有與SPF1ODEIA和LiPA類似的靈敏度。權(quán)利要求1.對可能存在于生物樣品中的任意HPV核酸進(jìn)行檢測和/或分型的方法，所述方法包含下述步驟(i)擴(kuò)增樣品中的多核酸片段，其包含任意HPV核酸的B區(qū)域或由它組成，所述B區(qū)域表示在圖1中，和(ii)使來自步驟(i)的任意擴(kuò)增的片段接觸至少一種能與HPV的B區(qū)域特異性地雜交的探針，所述B區(qū)域表示在圖1中。2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中樣品中的擴(kuò)增的多核酸片段包含任意HPV核酸的D區(qū)域或由它組成，所述D區(qū)域表示在圖1中。3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中使來自步驟(i)的任意擴(kuò)增的片段接觸至少一種能與HPV的D區(qū)域特異性地雜交的探針，所述D區(qū)域表示在圖1中。4.根據(jù)任一項(xiàng)前述權(quán)利要求的對可能存在于生物樣品中的HPV進(jìn)行檢測和/或分型的方法，所述方法包含(i)使用下述引物，擴(kuò)增HPV的多核酸片段-5’引物，其特異性地雜交于HPV16的基因組的‘A’區(qū)域，所述‘A’區(qū)域表示在圖1中，和-3’引物，其特異性地雜交于至少一種HPV類型的基因組的‘C’區(qū)域，所述‘C’區(qū)域表示在圖1中；(ii)使來自步驟(i)的擴(kuò)增的片段與至少一種探針雜交，所述探針能與HPV的‘B’區(qū)域或‘D’區(qū)域特異性地雜交，所述區(qū)域表示在圖1中。5.根據(jù)任一項(xiàng)前述權(quán)利要求的方法，其中所述探針能特異性地雜交僅一種HPV類型的基因組的D或B區(qū)域。6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述探針選自在表4，5-14，17，18，19中或在任意實(shí)施例中列出的序列組成的列表。7.根據(jù)任一項(xiàng)前述權(quán)利要求的方法，其中所述擴(kuò)增步驟使用選自下組的引物HPV-MPF1F1，HPV-MPF1F2，HPV-MPF1F3，HPV-MPF1F4，HPV-MPF1F5，HPV-MPF1F6，HPV-MPF1F7，HPV-MPF1F8，HPV-MPF1F9，HPV-MPF1F10，HPV-MPF2R1，HPV-MPF2R2，HPV-MPF2R3，HPV-MPF2R4，HPV-MPF2R5，HPV-MPF2R6，HPV-MPF2R7，HPV-MPF2R8。8.根據(jù)任一項(xiàng)前述權(quán)利要求的方法，其中在分型步驟之前，證實(shí)樣品中存在HPV核酸。9.根據(jù)任一項(xiàng)前述權(quán)利要求的方法，其中探針和靶之間的雜交在有固體支持物存在下進(jìn)行。10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述雜交步驟使用反向雜交形式。11.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述探針直接或間接附著在珠子上，任選熒光珠。12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中使用流式細(xì)胞術(shù)分析雜交的檢測。13.包含至少2種引物的試劑盒，所述引物適用于擴(kuò)增來自HPV基因組的B或D區(qū)域的核酸。14.根據(jù)權(quán)利要求13的試劑盒，其中所述引物選自HPV-MPF1F1，HPV-MPF1F2，HPV-MPF1F3，HPV-MPF1F4，HPV-MPF1F5，HPV-MPF1F6，HPV-MPF1F7，HPV-MPF1F8，HPV-MPF1F9，HPV-MPF1F10，HPV-MPF2R1，HPV-MPF2R2，HPV-MPF2R3，HPV-MPF2R4，HPV-MPF2R5，HPV-MPF2R6，HPV-MPF2R7和HPV-MPF2R8。15.包含至少2種探針的試劑盒，所述探針能特異性地雜交于HPV基因組的D區(qū)域或B區(qū)域。16.根據(jù)權(quán)利要求15的試劑盒，其中所述探針是選自表4，5-14，17，18，19中的任一個或任意實(shí)施例的任意2種探針。17.試劑盒，其包含表1或2的任意引物、或表3的任意探針、和用于實(shí)現(xiàn)上述HPV鑒別和分型分析的方法的說明書。18.試劑盒，其包含附著在固體支持物上的能特異性地雜交于HPV基因組的D區(qū)域或B區(qū)域的探針。19.根據(jù)權(quán)利要求13-17之一的試劑盒，其另外包含表3的任意探針。20.適用于權(quán)利要求1-12之一的方法的探針，所述探針選自表3，4，5-14，17，18，19或任意實(shí)施例。21.HPV探針集合，該集合包含至少5種選自下述的探針表3的DEIA探針；表3的優(yōu)選的DEIA探針；表4的探針；表17的探針；表18的探針；表19的探針。22.根據(jù)權(quán)利要求21的HPV探針集合，其包含至少8種來自每個組的探針。23.適用于權(quán)利要求1-12的方法的引物，所述引物選自表1和2。全文摘要本發(fā)明涉及用于對可能存在于生物樣品中的任意HPV核酸進(jìn)行檢測和/或分型的材料和方法，所述方法包含下述步驟(i)擴(kuò)增樣品中的多核酸片段，其包含任意HPV核酸的B區(qū)域或由它組成，所述B區(qū)域表示在圖1中，和(ii)使來自步驟(i)的任意擴(kuò)增的片段接觸至少一種能與HPV的B區(qū)域特異性地雜交的探針，所述B區(qū)域表示在圖1中。文檔編號C12Q1/70GK101160414SQ200680008504公開日2008年4月9日申請日期2006年1月17日優(yōu)先權(quán)日2005年1月18日發(fā)明者B·D·A·科勞,G·E·M·克勒特,W·G·昆特,D·C·J·G·范阿勒維克,H·A·M·范登蒙克霍夫,L·J·范多恩申請人:代夫特診斷實(shí)驗(yàn)室公司,葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司