專利名稱:Hiv-1感染cd4的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及了一種HIV-1感染CD4+細(xì)胞體外細(xì)胞培養(yǎng)模型與方法。它涉及生命科學(xué)領(lǐng)域、及醫(yī)藥領(lǐng)域。為能夠綜合科學(xué)論證、模擬分析揭示可以根治早期HIV-1感染者、有效治療無(wú)癥狀期HIV-1感染者延長(zhǎng)生存期的綜合治療機(jī)制,和設(shè)計(jì)相關(guān)更有效治療HIV-1感染者的新藥,與建立相關(guān)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)治療HIV-1感染者用藥的新檢測(cè)機(jī)制、方法、標(biāo)準(zhǔn)的,人類艾滋病基礎(chǔ)/臨床/藥物綜合科學(xué)研究,提供相關(guān)綜合科學(xué)研究實(shí)驗(yàn)依據(jù)。設(shè)計(jì)在理論上可以根治早期艾滋病的抗HIV-1藥。
背景技術(shù):
自1983年人免疫缺陷病毒——艾滋病被發(fā)現(xiàn)以來(lái),人類在HIV科學(xué)研究領(lǐng)域,HIV病毒生物學(xué)基礎(chǔ)科學(xué)研究、HIV病毒感染傳播流行病學(xué)科學(xué)研究、HIV病毒傳染病綜合防治與臨床治療醫(yī)藥科學(xué)研究等方面,取得了眾多舉世矚目重大科學(xué)研究成果。但是,客觀的講,人類在根治、預(yù)防艾滋病科學(xué)研究方面,至今沒(méi)有取得解決根本問(wèn)題的科學(xué)研究突破。沒(méi)有科學(xué)研究跡象表明抗HIV治療可以徹底清除患者機(jī)體病毒、治愈HIV感染者。嚴(yán)酷的科學(xué)現(xiàn)實(shí),使當(dāng)今從事HIV科學(xué)研究的眾多學(xué)者,似乎要放棄了治愈HIV感染者的科學(xué)研究夢(mèng)想!雖然抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物的聯(lián)合應(yīng)用可能對(duì)急性期、中期、到晚期的HIV感染者的治療效果顯著,但對(duì)早期無(wú)癥狀HIV感染者治療效果并不確切。因此,這些患者長(zhǎng)期應(yīng)用抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥,可能引發(fā)各種毒性反應(yīng)……,是否利大于弊,尚不清楚。美國(guó)DHHS 2005年4月頒布的,成人青少年HIV-1感染抗病毒指南推薦的抗病毒治療指征對(duì)CD4+T細(xì)胞數(shù)>350/μl、病毒載量>100000cp/ml的患者多數(shù)醫(yī)生不贊成治療,但也有一些醫(yī)生傾向于治療。對(duì)CD4+T細(xì)胞數(shù)>350/μl、病毒載量<100000cp/ml的患者可暫不治療。
高效聯(lián)合抗病毒療法是當(dāng)今實(shí)施艾滋病治療的標(biāo)準(zhǔn)療法。該療法通過(guò)作用于病毒的不同復(fù)制階段、或不同復(fù)制機(jī)制的抗病毒藥物聯(lián)合使用,可以顯著降低HIV/AIDS相關(guān)疾病的感染發(fā)病率和死亡率、能夠顯著延長(zhǎng)感染者的生存期。但是,由于HIV耐藥性毒株的產(chǎn)生,最終導(dǎo)致聯(lián)合抗病毒藥物治療失??;由于HIV感染者機(jī)體存在1%或更多的,難以被或不能被細(xì)胞免疫清除的,長(zhǎng)期慢性HIV病毒感染細(xì)胞、或靜止?jié)摲麳IV病毒感染細(xì)胞儲(chǔ)庫(kù),最終導(dǎo)致聯(lián)合抗病毒藥物治療失?。皇乾F(xiàn)有抗HIV治療不能達(dá)到徹底清除患者機(jī)體病毒的目的,不可治愈HIV感染者的兩個(gè)主要原因。
發(fā)明者認(rèn)為1.應(yīng)用核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、或與其它抗HIV-I藥聯(lián)合治療HIV感染者,病毒RNA在逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中,受核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑核苷酸衍生物摻入互補(bǔ)cDNA鏈干擾,會(huì)極大增加病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制DNA堿基的錯(cuò)配、或丟失等的發(fā)生率,產(chǎn)生更多的HIV-I基因變異突變毒株,是應(yīng)用核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑治療HIV-I感染者,增加產(chǎn)生HIV-I突變毒株、耐藥突變毒株,尚未被揭示的重要分子生物發(fā)生機(jī)制。2.在HIV感染者機(jī)體存在、在應(yīng)用核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑治療HIV感染者機(jī)體存在,難以被或不能被細(xì)胞免疫有效清除的,長(zhǎng)期慢性HIV病毒感染細(xì)胞、靜止?jié)摲麳IV病毒感染細(xì)胞儲(chǔ)庫(kù),其中某些細(xì)胞是HIV基因變異缺陷病毒所感染的細(xì)胞。某些整合在感染宿主細(xì)胞染色體上的HIV前缺陷病毒DNA,在感染細(xì)胞被激活啟動(dòng)染色體復(fù)制時(shí)、帶動(dòng)整合在染色體上的HIV前缺陷病毒DNA鏈一同復(fù)制,宿主細(xì)胞的DNA修復(fù)酶,可以修復(fù)HIV前缺陷病毒DNA鏈中缺失核苷酸部位,使HIV前缺陷病毒缺失核苷酸的變異基因得到修復(fù),進(jìn)而能夠轉(zhuǎn)錄復(fù)制HIV病毒、致死被感染宿主細(xì)胞,再感染、致死其它宿主細(xì)胞;是HIV感染者機(jī)體存在長(zhǎng)期慢性HIV病毒感染細(xì)胞、靜止?jié)摲麳IV病毒感染細(xì)胞儲(chǔ)庫(kù),其中某些細(xì)胞可以被激活激活、轉(zhuǎn)錄復(fù)制HIV病毒的,一種極重要的分子生物激活發(fā)生機(jī)制。3.模擬HIV-I感染者病毒和CD4+細(xì)胞動(dòng)力學(xué)抗HIV-I藥治療機(jī)制,體外傳代培養(yǎng)HIV-I感染細(xì)胞,實(shí)施相關(guān)科學(xué)研究實(shí)驗(yàn),能夠?yàn)樯鲜?./2.HIV綜合科學(xué)論證,提供相關(guān)科學(xué)研究實(shí)驗(yàn)依據(jù)。4.上述1./2./3.HIV科學(xué)研究的可行性科學(xué)分析理論依據(jù)是現(xiàn)代分子遺傳學(xué)不需要科學(xué)論證的基本科學(xué)常識(shí);不存在任何不可實(shí)施的現(xiàn)代生物科學(xué)技術(shù)難點(diǎn)。5.設(shè)計(jì)在理論上可以根治早期艾滋病的抗HIV-1藥。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開(kāi)了一種HIV-1感染CD4+細(xì)胞體外細(xì)胞培養(yǎng)模型與方法。是分別應(yīng)用取自HIV-I感染者最初急性期的人PBMC細(xì)胞、長(zhǎng)期無(wú)癥狀期的人PBMC細(xì)胞、終末期的人PBMC細(xì)胞,取自未感染HIV-I者的正常健康人PBMC細(xì)胞、同性戀者的人PBMC細(xì)胞、靜脈吸毒者的人PBMC細(xì)胞;傳代人CD4+細(xì)胞系,例如人T淋巴細(xì)胞系MT4;分別應(yīng)用胎牛血清,HIV-I感染者最初急性期的人AB血清、長(zhǎng)期無(wú)癥狀期的人AB血清、終末期的人AB血清,未感染HIV-I者的正常健康人AB血清、同性戀者的人AB血清、靜脈吸毒者的人AB血清;分別設(shè)計(jì)分別針對(duì)未感染HIV-1者的不同群體最初感染病毒的生命個(gè)體、感染HIV-1者的不同病毒感染致病期的人體,能夠做HIV-I感染者病毒和CD4+細(xì)胞動(dòng)力學(xué)、分子生物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析的體外傳代細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。建立能夠被HIV-1科學(xué)研究應(yīng)用于綜合模擬揭示未感染HIV-1者的不同群體最初感染病毒的生命個(gè)體、感染HIV-1者的不同病毒感染致病期的人體,擁有不同的病毒感染復(fù)制、致病、治療免疫應(yīng)答細(xì)胞活性與細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)微環(huán)境的改變,和不同的病毒感染復(fù)制、致病、治療免疫應(yīng)答細(xì)胞活性與細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)微環(huán)境/CD4+細(xì)胞動(dòng)力學(xué)機(jī)制的,綜合科學(xué)研究實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。設(shè)計(jì)在理論上可以根治早期艾滋病的抗HIV-1藥。
本發(fā)明的目的是,提供一種HIV-1感染CD4+細(xì)胞體外細(xì)胞培養(yǎng)模型與方法。建立能夠被HIV-1科學(xué)研究應(yīng)用于綜合模擬揭示未感染HIV-1者的不同群體最初感染病毒的生命個(gè)體、感染HIV-1者的不同病毒感染致病期的人體,擁有不同的病毒感染復(fù)制、致病、治療免疫應(yīng)答細(xì)胞活性與細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)微環(huán)境的改變,和不同的病毒感染復(fù)制、致病、治療免疫應(yīng)答細(xì)胞活性與細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)微環(huán)境/CD4+細(xì)胞動(dòng)力學(xué)機(jī)制的,綜合科學(xué)研究實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。為能夠綜合科學(xué)論證、模擬分析揭示可以根治早期HIV-1感染者、有效治療無(wú)癥狀期HIV-1感染者延長(zhǎng)生存期的綜合治療機(jī)制,和設(shè)計(jì)相關(guān)更有效治療HIV-1感染者的新藥,與建立相關(guān)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)治療HIV-1感染者用藥的新檢測(cè)機(jī)制、方法、標(biāo)準(zhǔn)的,人類艾滋病基礎(chǔ)/臨床/藥物綜合科學(xué)研究,提供相關(guān)綜合科學(xué)研究實(shí)驗(yàn)依據(jù)。設(shè)計(jì)在理論上可以根治早期艾滋病的抗HIV-1藥。
1.模擬HIV-I感染者病毒和CD4+細(xì)胞動(dòng)力學(xué),實(shí)施體外傳代培養(yǎng)HIV-I感染人PBMC細(xì)胞10代、或HIV-I感染MT4細(xì)胞10代,對(duì)最終傳代培養(yǎng)沒(méi)有被HIV-I感染致死的活細(xì)胞計(jì)數(shù)、HIV-I感染PCR檢測(cè),陽(yáng)性表達(dá)的活細(xì)胞-計(jì)數(shù);模擬核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑治療HIV-I感染者病毒和CD4+細(xì)胞動(dòng)力學(xué),實(shí)施體外傳代培養(yǎng)HIV-I感染人PBMC細(xì)胞+核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑10代、或HIV-I感染MT4細(xì)胞+核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑10代,對(duì)最終傳代培養(yǎng)沒(méi)有被HIV-I感染致死的活細(xì)胞計(jì)數(shù)、HIV-I感染PCR檢測(cè),陽(yáng)性表達(dá)的活細(xì)胞-計(jì)數(shù)。證實(shí)應(yīng)用核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑治療HIV-I感染者,會(huì)極大增加病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制DNA堿基的錯(cuò)配、或丟失等的發(fā)生率,產(chǎn)生更多的HIV-I基因變異突變毒株,是應(yīng)用核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑治療HIV-I感染者,增加產(chǎn)生HIV-I突變毒株、耐藥突變毒株,尚未被揭示的重要分子生物發(fā)生機(jī)制。
2.應(yīng)用加IL-2、PHA培養(yǎng)液,體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)1.最終傳代培養(yǎng)沒(méi)有被HIV-I感染致死的活細(xì)胞,直至出現(xiàn)某個(gè)感染細(xì)胞內(nèi)的HIV-I缺陷病毒基因發(fā)生回復(fù)突變、可以復(fù)制病毒致死培養(yǎng)細(xì)胞,再感染、致死其它培養(yǎng)細(xì)胞;證實(shí)HIV-I感染者機(jī)體存在,某些難以被或不能被細(xì)胞免疫有效清除的,長(zhǎng)期慢性HIV-I病毒感染細(xì)胞、靜止?jié)摲麳IV-I病毒感染細(xì)胞,是HIV-I基因變異缺陷病毒所感染細(xì)胞。進(jìn)而證實(shí)應(yīng)用核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、或與其它抗HIV-I藥聯(lián)合治療HIV-I感染者,能夠增加機(jī)體存在的HIV-I基因變異缺陷病毒長(zhǎng)期慢性感染細(xì)胞、靜止?jié)摲腥炯?xì)胞-儲(chǔ)庫(kù),是其不可治愈HIV-1感染者,尚未被揭示的重要原因。
3.分別采用未感染HIV-1正常健康者的人血清、同性戀者的人血清、靜脈吸毒者的人血清,分別實(shí)施實(shí)驗(yàn)1./2.體外細(xì)胞培養(yǎng)模型實(shí)驗(yàn);分別采用感染HIV-1者的最初急性期的人血清、長(zhǎng)期無(wú)癥狀期的人血清、終末期的人血清,分別實(shí)施實(shí)驗(yàn)1./2.體外細(xì)胞培養(yǎng)模型實(shí)驗(yàn);建立能夠被HIV-1科學(xué)研究應(yīng)用于綜合模擬揭示未感染HIV-1者的不同群體最初感染病毒的生命個(gè)體、感染HIV-1者的不同病毒感染致病期的人體,擁有不同的病毒感染復(fù)制、致病、治療免疫應(yīng)答細(xì)胞活性與細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)微環(huán)境的改變,和不同的病毒感染復(fù)制、致病、治療免疫應(yīng)答細(xì)胞活性與細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)微環(huán)境/CD4+細(xì)胞動(dòng)力學(xué)機(jī)制的,綜合科學(xué)研究實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。設(shè)計(jì)在理論上可以根治早期艾滋病的抗HIV-1藥。
具體實(shí)施例方式
為達(dá)到上述目的,實(shí)施本發(fā)明采用的方案1實(shí)驗(yàn)材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)材料1.1.1體外培養(yǎng)CD4+細(xì)胞取自HIV-I感染者最初急性期的人PBMC細(xì)胞,長(zhǎng)期無(wú)癥狀期的人PBMC細(xì)胞,終末期的人PBMC細(xì)胞;取自未感染HIV-I者的正常健康人PBMC細(xì)胞,同性戀者的人PBMC細(xì)胞,靜脈吸毒者的人PBMC細(xì)胞;傳代人CD4+細(xì)胞系,例如人T淋巴細(xì)胞系MT4。
1.1.2感染培養(yǎng)CD4+細(xì)胞的HIV-I病毒來(lái)自HIV-I感染者血漿與CD4+細(xì)胞共同培養(yǎng);來(lái)自HIV-I感染者PBMC細(xì)胞與CD4+細(xì)胞共同培養(yǎng);來(lái)自傳代培養(yǎng)被HIV-I感染CD4+細(xì)胞;HIV-I毒株,例如HIV-I CNHN24毒株。
1.2藥物和試劑
1.2.1胎牛血清,未感染HIV-I者的正常健康人AB血清、同性戀者的人AB血清、靜脈吸毒者的人AB血清,HIV-I感染者最初急性期的人AB血清、長(zhǎng)期無(wú)癥狀期的人AB血清、終末期的人AB血清;RPMI-2加人AB血清或胎牛血清培養(yǎng)液,RPMI1640加人AB血清或胎牛血清培養(yǎng)液含青霉素-G100U/ml、慶大霉素50μg/ml;Ficoll-Hystopaque密度梯度溶液d=1.077g/ml Pharmacia,把5ml Ficoll液預(yù)先內(nèi)置于25ml離心管內(nèi);EDTA鈉鹽、用生理鹽水配制7.5%抗凝液,把0.1ml抗凝EDTA鈉鹽溶液預(yù)先內(nèi)置于10ml注射器內(nèi);天然非重組人白細(xì)胞介素IL-2;植物凝集素PHA。
1.2.2抗HIV-I藥,例如核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑3TC,為葛蘭素史克制藥公司生產(chǎn)的賀普丁拉米夫定片,每片含100mg3TC。將100mg拉米夫定溶解于50mlRPMI1640培養(yǎng)液中,離心、過(guò)濾獲得3TC濃度為8.7mmol溶液,使用前應(yīng)用RPMI1640培養(yǎng)液稀釋成所需要濃度。
1.3制備生物實(shí)驗(yàn)材料1.3.1制取人PBMC細(xì)胞應(yīng)用預(yù)先內(nèi)置有0.1ml抗凝EDTA鈉鹽溶液的10ml注射器,無(wú)菌抽取未感染HIV-I者靜脈血5ml、或感染HIV-I者靜脈血5ml,加2倍RPMI-2培養(yǎng)液混勻;將其仔細(xì)緩慢加入預(yù)先內(nèi)置有Ficoll液5ml的25ml離心管上層;20℃、400g離心30min;用吸管小心把離心管Ficoll液和血液分界層間的PBMC細(xì)胞吸出,置入新離心管加5倍RPMI-2培養(yǎng)液混勻;20℃、300g離心10min,棄上清液,加5倍RPMI-2培養(yǎng)液混勻;20℃、200g離心5min,棄上清液,用含有10%人AB血清或胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液,配制細(xì)胞懸液1×107/ml、并進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)。
1.3.1制取人血清無(wú)菌抽取未感染HIV-I者靜脈血200ml、或感染HIV-I者靜脈血200ml;分置4只100ml離心管內(nèi),2000g離心10min,離心后4℃低溫靜置60min;然后用血管鉗擠壓血凝塊,擠出內(nèi)含的血清;棄去血凝塊,再分置2只100ml離心管內(nèi),5~10000g離心60min;用一系列過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾,最后用0.1μm孔徑無(wú)菌過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾后;分置于多個(gè)小無(wú)菌高密度聚丙烯容器,放置-70℃冰箱保存?zhèn)溆?。如有特殊?shí)驗(yàn)要求需要,可在實(shí)驗(yàn)前復(fù)溫4℃應(yīng)用親和層析法除去血清中的抗體。
1.4體外傳代細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)方法1.4.1建立不含有核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑3TC的、MT4-CNHN24毒株體外傳代細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng);建立含有核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑3TC的、MT4-CNHN24毒株體外傳代細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液,調(diào)整MT4細(xì)胞濃度為1×106/ml培養(yǎng)細(xì)胞懸液,每個(gè)50ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入12ml該培養(yǎng)MT4細(xì)胞濃度懸液,僅在第一代細(xì)胞培養(yǎng)瓶中接種濃度為1000TCID50的HIV-I CNHN24毒株;在含有3TC的體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng),加入3TC溶液第1代第2代培養(yǎng)液3TC濃度為0.01umol、第3代第4代培養(yǎng)液3TC濃度為0.02umol、第5代第6代培養(yǎng)液3TC濃度為0.04umol、第7代第8代培養(yǎng)液3TC濃度為0.08umol、第9代第10代培養(yǎng)液3TC濃度為0.16umol。將細(xì)胞培養(yǎng)瓶放置37℃,5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)不含有核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑3TC的、MT4-CNHN24毒株體外傳代細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng),每培養(yǎng)4d為1個(gè)培養(yǎng)世代,取出培養(yǎng)MT4細(xì)胞懸液,先用15~20μm孔徑的篩網(wǎng)濾除被HIV-I感染致死細(xì)胞融合體,再用10μm孔徑的篩網(wǎng)過(guò)濾除去被HIV-I感染致死細(xì)胞碎片、陳舊培養(yǎng)液,注意用培養(yǎng)液沖洗回收留在篩網(wǎng)中的所有活細(xì)胞,離心濃縮為2ml、補(bǔ)充10ml含MT4細(xì)胞的新鮮培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)下一個(gè)世代;第4d后每天在倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)細(xì)胞病變。培養(yǎng)10代后,每4天一次取出培養(yǎng)MT4細(xì)胞懸液,先用15~20μm孔徑的篩網(wǎng)濾除被HIV-I感染致死細(xì)胞融合體,再用10μm孔徑的篩網(wǎng)過(guò)濾除去被HIV-I感染致死細(xì)胞碎片、陳舊培養(yǎng)液,注意用培養(yǎng)液沖洗回收留在篩網(wǎng)中的所有活細(xì)胞,離心濃縮為1ml、補(bǔ)充不含MT4細(xì)胞的新鮮培養(yǎng)液,調(diào)整MT4細(xì)胞濃度為5~8×105/ml后繼續(xù)培養(yǎng);直至倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)細(xì)胞不再出現(xiàn)被HIV-I感染致死細(xì)胞病變。對(duì)最終傳代培養(yǎng)沒(méi)有被HIV-I感染致死的活細(xì)胞計(jì)數(shù)、HIV-I感染PCR檢測(cè),陽(yáng)性表達(dá)的活細(xì)胞計(jì)數(shù)-A-。應(yīng)用不含MT4細(xì)胞的新鮮培養(yǎng)液中加10μg/ml白細(xì)胞介素IL-2、10μg/ml植物凝集素PHA,繼續(xù)培養(yǎng)沒(méi)有HIV-I感染致死的活細(xì)胞,直至再出現(xiàn)被HIV-I感染致死細(xì)胞病變。
含有核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑3TC的、MT4-CNHN24毒株體外傳代細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng),每3d吸取6ml培養(yǎng)上清液,補(bǔ)充6ml不含MT4細(xì)胞的新鮮培養(yǎng)液,每培養(yǎng)6d為1個(gè)培養(yǎng)世代,取出培養(yǎng)MT4細(xì)胞懸液,先用15~20μm孔徑的篩網(wǎng)濾除被HIV-I感染致死細(xì)胞融合體,再用10μm孔徑的篩網(wǎng)過(guò)濾除去被HIV-I感染致死細(xì)胞碎片、陳舊培養(yǎng)液,注意用培養(yǎng)液沖洗回收留在篩網(wǎng)中的所有活細(xì)胞,離心濃縮為2ml、補(bǔ)充10ml含MT4細(xì)胞的新鮮培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)下一個(gè)世代;第4d后每天在倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)細(xì)胞病變。培養(yǎng)10代后,每4天一次取出培養(yǎng)MT4細(xì)胞懸液,先用15~20μm孔徑的篩網(wǎng)濾除被HIV-I感染致死細(xì)胞融合體,再用10μm孔徑的篩網(wǎng)過(guò)濾除去被HIV-I感染致死細(xì)胞碎片、陳舊培養(yǎng)液,注意用培養(yǎng)液沖洗回收留在篩網(wǎng)中的所有活細(xì)胞,離心濃縮為1ml、補(bǔ)充不含MT4細(xì)胞的新鮮培養(yǎng)液,調(diào)整MT4細(xì)胞濃度為5~8×105/ml后繼續(xù)培養(yǎng);直至倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)細(xì)胞不再出現(xiàn)被HIV-I感染致死細(xì)胞病變。對(duì)最終傳代培養(yǎng)沒(méi)有被HIV-I感染致死的活細(xì)胞計(jì)數(shù)、HIV-I感染PCR檢測(cè),陽(yáng)性表達(dá)的活細(xì)胞計(jì)數(shù)-A+。應(yīng)用不含MT4細(xì)胞的新鮮培養(yǎng)液中加10μg/ml白細(xì)胞介素IL-2、10μg/ml植物凝集素PHA,繼續(xù)培養(yǎng)沒(méi)有HIV-I感染致死的活細(xì)胞,直至再出現(xiàn)被HIV-I感染致死細(xì)胞病變。
1.4.1體外系統(tǒng),能夠綜合模擬表達(dá)HIV-I感染者病毒和CD4+細(xì)胞動(dòng)力學(xué)抗HIV-I藥治療機(jī)制A+/A-=a抗HIV-I藥致變異系數(shù)A-,模擬表達(dá)HIV-I感染者病毒和CD4+細(xì)胞動(dòng)力學(xué),機(jī)體存在的HIV-I基因變異缺陷病毒長(zhǎng)期慢性感染細(xì)胞、靜止?jié)摲腥炯?xì)胞-儲(chǔ)庫(kù)。
A+,模擬表達(dá)核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、或與其它抗HIV-I藥聯(lián)合,治療HIV-I感染者病毒和CD4+細(xì)胞動(dòng)力學(xué),機(jī)體存在的HIV-I基因變異缺陷病毒長(zhǎng)期慢性感染細(xì)胞、靜止?jié)摲腥炯?xì)胞-儲(chǔ)庫(kù)。
a抗HIV-I藥致變異系數(shù),模擬表達(dá)HIV-I感染者病毒和CD4+細(xì)胞動(dòng)力學(xué)抗HIV-I藥治療致變異機(jī)制a>1,抗HIV-I藥增加病毒變異發(fā)生率,增加機(jī)體存在的HIV-I基因變異缺陷病毒長(zhǎng)期慢性感染細(xì)胞、靜止?jié)摲腥炯?xì)胞-儲(chǔ)庫(kù);a<1,抗HIV-I藥抑制病毒變異發(fā)生率,減少機(jī)體存在的HIV-I基因變異缺陷病毒長(zhǎng)期慢性感染細(xì)胞、靜止?jié)摲腥炯?xì)胞-儲(chǔ)庫(kù)。
1.4.2參照1.4.1體外系統(tǒng),應(yīng)用取自抗HIV-I藥治療HIV-I感染者PBMC細(xì)胞,應(yīng)用含有20%HIV-I感染者長(zhǎng)期無(wú)癥狀期的人AB血清的RPMI1640培養(yǎng)液,分別建立幾個(gè)應(yīng)用幾種不同的核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、或與其它抗HIV-I藥聯(lián)合用藥,培養(yǎng)HIV-I感染者PBMC細(xì)胞的體外傳代細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)1、2、3對(duì)比分別應(yīng)用幾種不同的核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、或與其它抗HIV-I藥聯(lián)合用藥,培養(yǎng)取自HIV-I感染者PBMC細(xì)胞的體外傳代細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)1、2、3的模擬表達(dá)機(jī)體存在的HIV-I基因變異缺陷病毒長(zhǎng)期慢性感染細(xì)胞、靜止?jié)摲腥炯?xì)胞-儲(chǔ)庫(kù)1A+、2A+、3A+。為HIV-I感染者,選定一個(gè)應(yīng)用抗HIV-I藥致變異相對(duì)最小的、個(gè)體優(yōu)化治療方案。
1.4.3參照1.4.1/1.4.2體外系統(tǒng),博采眾長(zhǎng)、廣泛參照國(guó)際眾多好的體外系統(tǒng)。分別應(yīng)用取自HIV-I感染者最初急性期的人PBMC細(xì)胞、長(zhǎng)期無(wú)癥狀期的人PBMC細(xì)胞、終末期的人PBMC細(xì)胞,取自未感染HIV-I者的正常健康人PBMC細(xì)胞、同性戀者的人PBMC細(xì)胞、靜脈吸毒者的人PBMC細(xì)胞;分別應(yīng)用HIV-I感染者最初急性期的人AB血清、長(zhǎng)期無(wú)癥狀期的人AB血清、終末期的人AB血清,未感染HIV-I者的正常健康人AB血清、同性戀者的人AB血清、靜脈吸毒者的人AB血清;分別設(shè)計(jì)分別針對(duì)未感染HIV-1者的不同群體最初感染病毒的生命個(gè)體、感染HIV-1者的不同病毒感染致病期的人體,能夠做HIV-I感染者病毒和CD4+細(xì)胞動(dòng)力學(xué)、分子生物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析的體外傳代細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。建立能夠被HIV-1科學(xué)研究應(yīng)用于綜合模擬揭示未感染HIV-1者的不同群體最初感染病毒的生命個(gè)體、感染HIV-1者的不同病毒感染致病期的人體,擁有不同的病毒感染復(fù)制、致病、治療免疫應(yīng)答細(xì)胞活性與細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)微環(huán)境的改變,和不同的病毒感染復(fù)制、致病、治療免疫應(yīng)答細(xì)胞活性與細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)微環(huán)境/CD4+細(xì)胞動(dòng)力學(xué)機(jī)制的,綜合科學(xué)研究實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。設(shè)計(jì)在理論上可以根治早期艾滋病的抗HIV-1藥。
1.5發(fā)明創(chuàng)新討論1.5.1現(xiàn)有抗HIV治療不能達(dá)到徹底清除患者機(jī)體病毒的目的,不可治愈HIV感染者。是當(dāng)今HIV科學(xué)研究設(shè)計(jì)研制的,核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、或與其它抗HIV-I藥聯(lián)合,治療HIV-I感染者病毒和CD4+細(xì)胞動(dòng)力學(xué)的抗HIV-I藥治療機(jī)制,病毒RNA在逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中,受核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑核苷酸衍生物摻入互補(bǔ)cDNA鏈干擾,會(huì)極大增加病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制DNA堿基的錯(cuò)配、或丟失等的發(fā)生率,產(chǎn)生更多的HIV-I基因變異突變毒株、耐藥突變毒株;使a抗HIV-I藥致變異系數(shù)>1,抗HIV-I藥增加病毒變異發(fā)生率,增加機(jī)體存在的HIV-I基因變異缺陷病毒長(zhǎng)期慢性感染細(xì)胞、靜止?jié)摲腥炯?xì)胞-儲(chǔ)庫(kù),導(dǎo)致聯(lián)合抗病毒藥物治療失敗。是被HIV科學(xué)界疏漏的一個(gè)極重要的科學(xué)研究盲區(qū)。1.4體外系統(tǒng),建立能夠被HIV-1科學(xué)研究應(yīng)用于綜合模擬揭示未感染HIV-1者的不同群體最初感染病毒的生命個(gè)體、感染HIV-1者的不同病毒感染致病期的人體,擁有不同的病毒感染復(fù)制、致病、治療免疫應(yīng)答細(xì)胞活性與細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)微環(huán)境的改變,和不同的病毒感染復(fù)制、致病、治療免疫應(yīng)答細(xì)胞活性與細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)微環(huán)境/CD4+細(xì)胞動(dòng)力學(xué)機(jī)制的,綜合科學(xué)研究實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。將能夠?yàn)榫C合科學(xué)論證、模擬分析揭示可以根治早期HIV-1感染者、有效治療無(wú)癥狀期HIV-1感染者延長(zhǎng)生存期的綜合治療機(jī)制,設(shè)計(jì)有效治療HIV-1感染者的新藥物,制定檢測(cè)治療HIV-1感染者用藥物的新檢測(cè)機(jī)制、方法、標(biāo)準(zhǔn)的,人類艾滋病基礎(chǔ)/臨床/藥物綜合科學(xué)研究,提供相關(guān)綜合科學(xué)研究實(shí)驗(yàn)依據(jù)。可行性科學(xué)分析理論依據(jù)是現(xiàn)代分子遺傳學(xué)不需要科學(xué)論證的基本科學(xué)常識(shí);不存在任何不可實(shí)施的現(xiàn)代生物科學(xué)技術(shù)難點(diǎn)。
1.5.2HIV科學(xué)界,把不能根治、預(yù)防艾滋病,取得解決根本問(wèn)題的科學(xué)研究突破的原因,歸咎于HIV復(fù)制速度快、HIV基因具有高度變異性病毒的產(chǎn)量平均約為1010/天,HIV在體內(nèi)的平均復(fù)制產(chǎn)生周期時(shí)間約為2.6天;體外測(cè)定每6000個(gè)核甘酸在逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中有一次錯(cuò)誤的概率,體內(nèi)測(cè)試顯示每輪復(fù)制過(guò)程可能產(chǎn)生一次突變。可以產(chǎn)生大量具有各種不同基因變異型或表型的毒株,對(duì)藥物抑制壓力、機(jī)體免疫抑制壓力,不斷衍生出新的耐藥毒株、免疫逃逸毒株優(yōu)勢(shì)病毒種株。病毒通過(guò)特異性突變所獲得的選擇性優(yōu)點(diǎn)將對(duì)病毒基因組產(chǎn)生有力的影響。沒(méi)有科學(xué)研究跡象表明HIV疫苗可能會(huì)有效預(yù)防HIV感染。最近針對(duì)艾滋病病毒提出一種退而求其次、再退而求其更次的新觀點(diǎn),以預(yù)防病毒的傳播為目的的疫苗三級(jí)預(yù)防,即通過(guò)使用疫苗刺激起機(jī)體的抗HIV免疫力來(lái)抑制體內(nèi)HIV復(fù)制,降低血液中病毒含量。如能夠保護(hù)健康人不被HIV感染當(dāng)然是最理想的疫苗,但如能阻止感染后發(fā)病或阻斷已感染的人發(fā)生艾滋病亦是很好的治療疫苗,而如可以通過(guò)疫苗降低感染者體內(nèi)的病毒量,減少對(duì)他人傳播也不失為具有很好公共衛(wèi)生價(jià)值的疫苗。HIV科學(xué)界在此相關(guān)科學(xué)研究方面,有眾多科學(xué)研究發(fā)現(xiàn),不能一一綜述。作者僅針對(duì)在此相關(guān)科學(xué)研究方面,被HIV科學(xué)界疏漏的另一個(gè)極重要的科學(xué)研究“盲區(qū)”,HIV感染是首先通過(guò)表達(dá)的膜蛋白gp120與CD4+T淋巴細(xì)胞受體特異結(jié)合,觸發(fā)免疫耐受機(jī)制,能夠比HIV具有高度變異性免疫逃逸機(jī)制,更為有效對(duì)抗機(jī)體免疫抑制壓力,作如下綜述出現(xiàn)高滴度的HIV的特有的抗體是HIV原發(fā)性免疫反應(yīng)的特征,它出現(xiàn)在病毒血癥的高峰或稍晚時(shí)間。有趣的是,這最初的抗體反應(yīng)不包括中和抗體。有趣的是,抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥和IL-2治療雖然可以使CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)增加,卻未能使解體Vβ庫(kù)恢復(fù)。應(yīng)用IL-2治療期間CD4+T細(xì)胞的增加來(lái)源于CD4+T細(xì)胞庫(kù)在胸腺外的擴(kuò)增,因?yàn)門細(xì)胞Vβ庫(kù)的PCR分析證明缺失的克隆不能再生。用IL-2和抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥試圖重建T細(xì)胞Vβ庫(kù)的失敗,暗示免疫系統(tǒng)的損傷可能存在閾值,若超過(guò)該閾值,免疫功能便不能重建。間接感染或各種疫苗免疫的HIV感染個(gè)體都有血漿病毒血癥暫時(shí)增加,并且與誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫活性程度相關(guān);類似的發(fā)現(xiàn)也可見(jiàn)于SIV感染的恒河猴中。上述眾多不可被一一綜述HIV科學(xué)研究發(fā)現(xiàn),明確顯示HIV是在感染人體復(fù)制的最初期、還沒(méi)有激發(fā)機(jī)體免疫系統(tǒng)應(yīng)答反應(yīng)之前,會(huì)首先通過(guò)表達(dá)的膜蛋白gp120與CD4+T淋巴細(xì)胞受體特異結(jié)合,觸發(fā)免疫耐受機(jī)制,導(dǎo)致感染機(jī)體免疫系統(tǒng)針對(duì)HIV感染復(fù)制應(yīng)答延遲,尤其是體液免疫應(yīng)答反應(yīng)延遲、不能首先產(chǎn)生針對(duì)gp120的中和抗體、抑制gp120與CD4+T淋巴細(xì)胞受體特異結(jié)合;進(jìn)而使HIV能夠在機(jī)體免疫系統(tǒng)形成針對(duì)gp120的中和抗體免疫抑制應(yīng)答之前,還沒(méi)有被CTL細(xì)胞免疫有效抑制時(shí)、能夠過(guò)度復(fù)制HIV最終會(huì)達(dá)到病毒血癥峰值。作者認(rèn)為可能是在此期間由于HIV過(guò)度表達(dá)所編碼的超抗原,能夠與某些特定的T淋巴細(xì)胞受體Vβ克隆反應(yīng),誘導(dǎo)抑制性T淋巴細(xì)胞,建立進(jìn)一步的免疫耐受機(jī)制;并且誘導(dǎo)傳染性免疫耐,與導(dǎo)致某些特定的T淋巴細(xì)胞受體Vβ克隆損傷、漸至枯竭,從而使T細(xì)胞Vβ庫(kù)不可被再生恢復(fù);因而確實(shí)存在HIV感染者免疫系統(tǒng)的損傷閾值,若超過(guò)該閾值,HIV感染者的免疫功能便不可被恢復(fù)重建。作者認(rèn)為HIV感染者急性期達(dá)到病毒血癥峰值期,可能是使T淋巴細(xì)胞受體Vβ克隆損傷、轉(zhuǎn)向漸至枯竭不可被重建損傷,至無(wú)癥狀期達(dá)到免疫系統(tǒng)的損傷不可被重建閾值。因而作者認(rèn)為在HIV感染者急性期、至達(dá)到免疫系統(tǒng)的損傷不可被重建閾值之前,可能會(huì)存在一個(gè)可以被抗HIV藥有效根治、能夠重建HIV感染者受損免疫系統(tǒng)的,很暫短的效治根治HIV感染者的窗口期。
1.4體外系統(tǒng),建立能夠被HIV-1科學(xué)研究應(yīng)用于綜合模擬揭示未感染HIV-1者的不同群體最初感染病毒的生命個(gè)體、感染HIV-1者的不同病毒感染致病期的人體,擁有不同的病毒感染復(fù)制、致病、治療免疫應(yīng)答細(xì)胞活性與細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)微環(huán)境的改變,和不同的病毒感染復(fù)制、致病、治療免疫應(yīng)答細(xì)胞活性與細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)微環(huán)境/CD4+細(xì)胞動(dòng)力學(xué)機(jī)制的,綜合科學(xué)研究實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。可以被應(yīng)用于綜合模擬揭示上述HIV感染是首先通過(guò)表達(dá)的gp120與CD4+T淋巴細(xì)胞受體特異結(jié)合,觸發(fā)免疫耐受機(jī)制的,相關(guān)綜合分子生物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)機(jī)制。
gp160疫苗通常需用較高劑量接種4次以上才能使少數(shù)受試者產(chǎn)生較低滴度的同源中和抗體。Vaxgene公司的gp120疫苗在北美和泰國(guó)進(jìn)行大規(guī)模的III臨床試驗(yàn)。2003年2月23日,Vaxgene公司公布了北美地區(qū)的試驗(yàn)結(jié)果,其中接種疫苗人群HIV感染率為5.7%,未接種疫苗人群HIV感染率為5.8%。結(jié)果表明該疫苗不能有效預(yù)防HIV感染。眾多不可被一一綜述與各種gp160、gp120疫苗實(shí)驗(yàn)失敗相關(guān)的HIV科學(xué)研究發(fā)現(xiàn),可以為證實(shí),HIV感染是首先通過(guò)表達(dá)的gp120與CD4+T淋巴細(xì)胞受體特異結(jié)合,觸發(fā)免疫耐受機(jī)制,提供相關(guān)綜合科學(xué)研究實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
可以利用HIV科學(xué)研究現(xiàn)有的猴免疫缺陷病毒SIV恒河猴動(dòng)物模型,nef基因缺失的SIV-mac239Δnef減毒株疫苗、SIV膜蛋白疫苗,實(shí)施與SIV膜蛋白觸發(fā)免疫耐受機(jī)制相關(guān)的器官移植實(shí)驗(yàn),將能夠?yàn)樽C實(shí)HIV感染是首先通過(guò)表達(dá)的gp120與CD4+T淋巴細(xì)胞受體特異結(jié)合,觸發(fā)免疫耐受機(jī)制,提供可令人信服的,足夠充分的科學(xué)研究實(shí)驗(yàn)依據(jù)。并且可以把表達(dá)膜蛋白gp120的HIV減活疫苗應(yīng)用于器官移植實(shí)驗(yàn),在器官移植科學(xué)研究方面取得重大科學(xué)研究突破。但是它將會(huì)不幸的證實(shí)HIV科學(xué)研究在沒(méi)有充分揭示HIV感染是首先通過(guò)表達(dá)的gp120與CD4+T淋巴細(xì)胞受體特異結(jié)合,觸發(fā)免疫耐受機(jī)制,尋找到能夠解決它的問(wèn)題方法前,現(xiàn)有的疫苗科學(xué)研究思維、科學(xué)研究方法,將不能研制出可能會(huì)有效預(yù)防HIV感染的HIV疫苗。它極有可能是HIV科學(xué)研究在應(yīng)用HIV疫苗預(yù)防艾滋病科學(xué)研究方面,所難以逾越的科學(xué)障礙!因此,HIV科學(xué)研究需要設(shè)計(jì)、研制a抗HIV-I藥致變異系數(shù)<1,抗HIV-I藥抑制病毒變異發(fā)生率,減少機(jī)體存在的HIV-I基因變異缺陷病毒長(zhǎng)期慢性感染細(xì)胞、靜止?jié)摲腥炯?xì)胞-儲(chǔ)庫(kù)的,新的抗HIV-I藥或抗HIV-I藥聯(lián)合。爭(zhēng)取在HIV感染急性期,HIV感染者的免疫系統(tǒng)所受到的損傷還沒(méi)有超過(guò)閾值,免疫功能還可以被重建、有可能效治根治HIV感染者的窗口期,盡早對(duì)HIV感染者實(shí)施a抗HIV-I藥致變異系數(shù)<1,抗HIV-I藥抑制病毒變異發(fā)生率,減少機(jī)體存在的HIV-I基因變異缺陷病毒長(zhǎng)期慢性感染細(xì)胞、靜止?jié)摲腥炯?xì)胞-儲(chǔ)庫(kù)的,新的抗HIV-I藥或抗HIV-I藥聯(lián)合早期抗HIV感染治療。是未來(lái)人類有可能通過(guò)盡早對(duì)HIV感染者實(shí)施早期抗HIV感染治療,實(shí)現(xiàn)抗HIV治療達(dá)到徹底清除患者機(jī)體病毒的目的,治愈HIV感染者的,唯一希望,最基本的保障。
發(fā)明者知道有一種藥,曾在多種不同的體外系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)中都顯示a抗HIV-I藥致變異系數(shù)<1;還沒(méi)有做過(guò)繼續(xù)深入的相關(guān)實(shí)驗(yàn)。如果能夠通過(guò)1.4體外系統(tǒng),證實(shí)它具有a抗HIV-I藥致變異系數(shù)<1,抗HIV-I藥抑制病毒變異發(fā)生率,減少機(jī)體存在的HIV-I基因變異缺陷病毒長(zhǎng)期慢性感染細(xì)胞、靜止?jié)摲腥炯?xì)胞-儲(chǔ)庫(kù)等作用。再進(jìn)一步利用SIV、HIV-II恒河猴動(dòng)物模型,證實(shí)它在SIV、HIV-H感染猴的免疫系統(tǒng)所受到的損傷還沒(méi)有超過(guò)閾值,免疫功能還可以被恢復(fù)重建時(shí),可以通過(guò)實(shí)施它早期抗SIV、HIV-II治療,達(dá)到徹底清除SIV、HIV-II感染猴機(jī)體病毒的目的,治愈SIV、HIV-II感染猴。它將是一種有希望被應(yīng)用于在HIV感染急性期,早期治愈HIV-I感染者的抗HIV-I藥。
發(fā)明者尋求實(shí)施研制相關(guān)抗HIV-I藥的,合作者與資助者。
權(quán)利要求
1.一種HIV-1感染CD4+細(xì)胞體外細(xì)胞培養(yǎng)模型與方法,其特征在于應(yīng)用加血清(1)培養(yǎng)液(2)、感染培養(yǎng)CD4+細(xì)胞的HIV-I病毒(3)實(shí)施CD4+細(xì)胞(4)體外細(xì)胞培養(yǎng)(5),對(duì)最終培養(yǎng)沒(méi)有被HIV-I感染致死的活細(xì)胞實(shí)施HIV-I感染檢測(cè)(6),對(duì)HIV-I感染檢測(cè)陽(yáng)性的活細(xì)胞計(jì)數(shù)(7)。
2.一種HIV-1感染CD4+細(xì)胞體外細(xì)胞培養(yǎng)模型與方法,其特征在于應(yīng)用加血清(1)培養(yǎng)液(2)、感染培養(yǎng)CD4+細(xì)胞的HIV-I病毒(3)、抗HIV-I藥(8)實(shí)施CD4+細(xì)胞(4)體外細(xì)胞培養(yǎng)(5),對(duì)最終培養(yǎng)沒(méi)有被HIV-I感染致死的活細(xì)胞實(shí)施HIV-I感染檢測(cè)(6),對(duì)HIV-I感染檢測(cè)陽(yáng)性的活細(xì)胞計(jì)數(shù)(7)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1、2中所述的HIV-1感染CD4+細(xì)胞體外細(xì)胞培養(yǎng)模型與方法,其特征在于體外細(xì)胞培養(yǎng)(5)是傳代補(bǔ)充CD4+細(xì)胞(4)的體外傳代細(xì)胞培養(yǎng)(9)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中所述的HIV-1感染CD4+細(xì)胞體外細(xì)胞培養(yǎng)模型與方法,其特征在于血清(1)是胎牛血清(10)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至3中所述的HIV-1感染CD4+細(xì)胞體外細(xì)胞培養(yǎng)模型與方法,其特征在于血清(1)是未感染HIV-I者的人血清(11)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至3中所述的HIV-1感染CD4+細(xì)胞體外細(xì)胞培養(yǎng)模型與方法,其特征在于血清(1)是感染HIV-I者的人血清(12)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至7中所述的HIV-1感染CD4+細(xì)胞體外細(xì)胞培養(yǎng)模型與方法,其特征在于CD4+細(xì)胞(4)是感染HIV-I者的人PBMC細(xì)胞(13)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中所述的HIV-1感染CD4+細(xì)胞體外細(xì)胞培養(yǎng)模型與方法,其特征在于CD4+細(xì)胞(4)是未感染HIV-I者的人PBMC細(xì)胞(14)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至7中所述的HIV-1感染CD4+細(xì)胞體外細(xì)胞培養(yǎng)模型與方法,其特征在于CD4+細(xì)胞(4)是傳代人CD4+細(xì)胞系(15)。
10.根據(jù)權(quán)利要求2至10中所述的HIV-1感染CD4+細(xì)胞體外細(xì)胞培養(yǎng)模型與方法,其特征在于抗HIV-I藥(8)是有核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(16)的抗HIV-I藥。
全文摘要
本發(fā)明名稱為HIV-1感染CD文檔編號(hào)C12Q1/04GK1944637SQ200610140799
公開(kāi)日2007年4月11日 申請(qǐng)日期2006年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月12日
發(fā)明者葉新新 申請(qǐng)人:葉新新