專利名稱：一種菜用大豆dna指紋圖譜及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及一種植物DNA指紋圖譜及其構(gòu)建方法和用于植物品種鑒定的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
菜用大豆是近年發(fā)展起來的深受國際市場歡迎的重要特色蔬菜之一，尤其是我國南方居民喜食的傳統(tǒng)特色蔬菜，年栽培面積達(dá)500萬畝以上，并有不斷擴(kuò)大的趨勢。
菜用大豆新品種的選育一直是日本和我國臺(tái)灣省大豆育種家的主攻目標(biāo)。我國臺(tái)灣省育種家自上個(gè)世紀(jì)50年代就開始菜用大豆的育種研究，先后推出了臺(tái)290、臺(tái)292、臺(tái)75-1、9308、KVS844和KVS862等多個(gè)優(yōu)良品種，其中臺(tái)292和臺(tái)75-1以其大莢、大粒、灰白毛和優(yōu)良的口感品質(zhì)等特征成為我國南方地區(qū)出口生產(chǎn)上的主打品種。
中國菜用大豆的育種始于20世紀(jì)80年代后期，相繼育成的品種有蕭墾8901、泉豆8473、安豆三號(hào)、淮哈豆1號(hào)、華春18號(hào)和地神21號(hào)等，但這些品種均系粒用品種的系選或有性雜交而成，鮮豆粒吃口硬，風(fēng)味差，不適合速凍加工，且成熟期偏晚。近幾年，上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院相繼育成推出了青酥系列早熟、優(yōu)質(zhì)菜用大豆新品種，填補(bǔ)了我國南方春播型菜用大豆品種的市場空白，栽培面積迅速擴(kuò)大。
由于菜用大豆屬嚴(yán)格自花授粉作物，留種較為容易，育成新品種一投放于市場，就很快被不法種子商們冠以新的名稱，紛紛自行擴(kuò)繁推廣，致使種子市場菜用大豆的品種極為混亂，既損壞了品種育成單位和種子經(jīng)營單位的利益，也不利于國家有關(guān)菜用大豆品種推廣中種子質(zhì)量的控制，以及菜用大豆雜交育種中親本的選擇與可持續(xù)利用。
生物指紋圖譜是能夠鑒別生物個(gè)體之間差異的電泳圖譜。這種電泳圖譜多態(tài)性豐富，且具有高度的個(gè)體特異性和環(huán)境穩(wěn)定性，就像人的指紋一樣，因而被稱為“指紋圖譜”。指紋圖譜技術(shù)極其適合于品種的鑒定和登記。
作物品種指紋圖譜目前主要有兩種類型一類是較早研究開發(fā)的蛋白質(zhì)電泳指紋圖譜，另一類是90年代之后發(fā)展起來的DNA分子標(biāo)記指紋圖譜，即“DNA指紋圖譜”，該詞可以泛指一切具有某一種質(zhì)特異性的譜帶，借助DNA指紋圖譜，可以區(qū)分不同的品種，是鑒定品種、品系的有力工具。
目前廣泛應(yīng)用于DNA指紋圖譜繪制的分子標(biāo)記主要包括以下5種RFLP技術(shù)即限制性內(nèi)切酶片斷長度多態(tài)性(RFLP)，是近年發(fā)展起來的以生物基因組DNA序列變異為基礎(chǔ)，研究不同基因組差異的一項(xiàng)新技術(shù)。RFLP技術(shù)不受顯隱型關(guān)系、環(huán)境條件和發(fā)育階段的影響；在數(shù)量上不受限制，檢測方便；具有穩(wěn)定遺傳和特異性；而且用于檢測RFLP的克隆探針可隨意選擇，可以是核糖體DNA、葉綠體DNA或總DNA，這樣就可以產(chǎn)生大量的多態(tài)性，為研究植物的類群，特別是屬間、種間甚至品種間的親緣關(guān)系、系統(tǒng)發(fā)育與演化提供有力的依據(jù)。但因RFLP技術(shù)復(fù)雜，研究所需DNA量大，所研究對(duì)象需要有一定的遺傳背景，目前已逐漸被其它分子標(biāo)記技術(shù)所代替。
RAPD技術(shù)即隨機(jī)擴(kuò)增DNA多態(tài)性(RAPD)，是J.Williams和J.Welsh兩個(gè)研究小組在1990年發(fā)展起來的一種新型遺傳標(biāo)記，它是以人工合成的隨機(jī)引物對(duì)基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增而產(chǎn)生能顯示多態(tài)性的DNA指紋圖譜，RAPD技術(shù)是一種基于序列的多態(tài)性，其可以在沒有任何分子生物學(xué)研究基礎(chǔ)的情況下對(duì)某一物種進(jìn)行指紋圖譜的構(gòu)建、遺傳多樣性的研究，相對(duì)于RFLP技術(shù)來說比較經(jīng)濟(jì)簡便，DNA用量也少(ng級(jí))；而且避免了使用放射性同位素，近年來在品種資源研究方面得到了廣泛的應(yīng)用。但目前RAPD技術(shù)尚存在以下兩個(gè)問題(1)重復(fù)性和穩(wěn)定性差，有許多因素會(huì)影響RAPD的擴(kuò)增結(jié)果，在進(jìn)行RAPD分析之前，要反復(fù)進(jìn)行RAPD分析條件的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。(2)過于靈敏，使遺傳分析變得復(fù)雜化，因?yàn)橛械腞APD標(biāo)記不依照預(yù)期的遺傳樣式。
小衛(wèi)星DNA(VNTR)技術(shù)1980～1984年，人類遺傳學(xué)家相繼在人體基因組中發(fā)現(xiàn)了一些串聯(lián)重復(fù)序列，這些序列由長度為11～60bp的核心序列串聯(lián)重復(fù)而成，后來稱之為小衛(wèi)星DNA。由于重復(fù)單位的數(shù)目不同和重復(fù)拷貝數(shù)的等位性不同，使其表現(xiàn)出高度多態(tài)性。不同生物、同一生物的不同品種，甚至同一品種的不同個(gè)體，其所含小衛(wèi)星各異，雜交產(chǎn)生的圖譜各不相同，譜帶遵循孟德爾遺傳方式遺傳，并具有體細(xì)胞穩(wěn)定性。這些特點(diǎn)使之成為較先進(jìn)的遺傳標(biāo)記系統(tǒng)，而廣泛應(yīng)用在許多作物的品種鑒定和遺傳多樣性研究中。
SSR(微衛(wèi)星)技術(shù)SSR是一類由幾個(gè)核苷酸(一般為15個(gè))為重復(fù)單位組成的長達(dá)幾十個(gè)核苷酸的串聯(lián)重復(fù)序列。植物體內(nèi)的二核苷酸(AT)n遠(yuǎn)比哺乳動(dòng)物豐富，植物基因組中平均每隔2Kb就有一個(gè)三核苷酸或四核苷酸重復(fù)，且每種類型的SSR在每種物種中出現(xiàn)的頻率不同。SSR多態(tài)性的信息量非常豐富，具有所有RFLP的遺傳學(xué)優(yōu)點(diǎn)，又比RAPD重復(fù)性能和可信度高，因而是目前遺傳標(biāo)記中的熱點(diǎn)。但由于SSR必須針對(duì)每個(gè)染色體座位的微衛(wèi)星，發(fā)現(xiàn)其兩端的單拷貝序列以設(shè)計(jì)引物，因而給SSR標(biāo)記的利用帶來了一定困難，然而一旦開發(fā)出某種生物的SSR標(biāo)記，就顯現(xiàn)出該標(biāo)記的利用價(jià)值。SSR目前已廣泛應(yīng)用于多種農(nóng)作物的鑒定和標(biāo)記中。
AFLP技術(shù)AFLP技術(shù)是1993年由荷蘭生物技術(shù)公司KEYGENE的Zabeau和Vos等人發(fā)明的，已申請了專利。AFLP技術(shù)是RFLP和PCR相結(jié)合的一種方法。與RAPD一樣，AFLP可以用于沒有任何分子生物學(xué)研究基礎(chǔ)的物種，其引物在不同物種間是通用的，被稱為一種“半隨機(jī)”的擴(kuò)增。一個(gè)0.5mg的DNA樣品，可作4000個(gè)AFLP反應(yīng)，獲得8萬個(gè)標(biāo)記，600萬條帶紋?？梢夾FLP的多態(tài)性非常高。利用放射性標(biāo)記或銀染方法在變性的聚丙烯酰胺凝膠上通?？梢詸z測到50～100個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物，而且重復(fù)性強(qiáng)，因而非常適合于品種指紋圖譜的繪制、遺傳連鎖圖的構(gòu)建及遺傳多樣性的研究等。多數(shù)作物上的研究結(jié)果都表明其產(chǎn)生的多態(tài)性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了RFLP、RAPD等，目前被認(rèn)為是DNA指紋圖譜技術(shù)中多態(tài)性最為豐富的一項(xiàng)技術(shù)。實(shí)際上，AFLP最適的應(yīng)用范圍，也是Zabeau和Vos申請的專利的關(guān)鍵，就是利用AFLP技術(shù)鑒定品種的指紋，檢測品種的質(zhì)量和純度。由于AFLP已申請專利，因而它在生產(chǎn)及商業(yè)上的應(yīng)用受到限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種菜用大豆DNA指紋圖譜及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，以解決現(xiàn)有技術(shù)的缺陷。
本發(fā)明首先提供了一種菜用大豆DNA指紋圖譜，首先本發(fā)明選用如表1所示的28個(gè)菜用大豆品種/系為供試材料，選材以生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用的早、中熟優(yōu)質(zhì)菜用大豆品種為主，包括一些高代自交系和育種材料，具有較好的代表性。
表1 28個(gè)菜用大豆品種/系的來源和特性


根據(jù)上述28個(gè)品種所建立的指紋圖譜用數(shù)字表示為0100010011010，0111110100100，0111111101111，0110111111111，0110101101000，0001111111110，0111111110111，0110111111100，1111111111110，0111011110111，0111110111111，0111111111101，0111101111100，0101111111111，0011111101111，0011110111111，0111111110111，0011111101100，0110010111000，0100010111010，1111111111111，1101101111011，1011111111111，0111111110000，1110111111111，1111010110111，1111010111111，1111111110111。
其中，“1”代表圖譜中某個(gè)位置上有擴(kuò)增條帶存在，而“0”代表圖譜中某個(gè)位置上沒有擴(kuò)增條帶存在。
而數(shù)字表示的指紋圖譜用附圖的形式表示，即為附圖1，其中附圖中的“-”相對(duì)應(yīng)的是數(shù)字中的“1”，而數(shù)字中的“0”在附圖中則為空白。
本發(fā)明還提供了上述菜用大豆指紋圖譜的構(gòu)建方法，該方法包括如下步驟菜用大豆DNA的提取；PCR擴(kuò)增引物的篩選，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測，條帶分子量大小的測定及菜用大豆DNA指紋圖譜的構(gòu)建。
具體步驟為①、DNA的提取剪取每個(gè)菜用大豆品種的幼嫩葉片(2～5g)，提取其總DNA；
②、PCR擴(kuò)增應(yīng)用表2中的13對(duì)引物，使用PCR熱循環(huán)儀分別對(duì)所研究的菜用大豆品種的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增。在PCR熱循環(huán)儀上循環(huán)30個(gè)周期，對(duì)模板進(jìn)行擴(kuò)增；③、PCR產(chǎn)物的鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行8％丙烯酰胺垂直凝膠電泳，銀染后用Bio-Rad凝膠掃描系統(tǒng)掃描照相；④、數(shù)據(jù)分析按照照片上各材料在各引物上的擴(kuò)增情況作記錄，有帶的記為1，無帶的記為0；按照井正列(Nei)的方法計(jì)算菜用大豆品種間的相似系數(shù)(Gs)，再按照平均距離法(UPGMA法)進(jìn)行聚類分析；⑤、DNA指紋圖譜的構(gòu)建按照照片上各材料在各引物上的擴(kuò)增情況，挑取具有代表性(穩(wěn)定性和重復(fù)性良好)的SSR多態(tài)性帶，繪制菜用大豆品種/系的DNA指紋圖譜。
表2 13對(duì)引物的序列

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)勢和效果品種鑒定和種子純度分析在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上極其重要，而檢測方法的準(zhǔn)確性和可靠性對(duì)鑒定結(jié)果至關(guān)重要。上世紀(jì)80年代以前，田間形態(tài)觀察的方法在作物品種鑒定和種子純度分析上起過極其重要的作用，但隨著品種的豐富和育種親本利用的集中化，品種鑒定愈來愈困難，傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法已愈來愈不適應(yīng)品種鑒定和純度分析。DNA分子標(biāo)記方法的出現(xiàn)，使我們能夠用分子生物學(xué)方法進(jìn)行品種鑒定和純度分析。目前，利用DNA分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行品種鑒定和種子純度分析已在重要農(nóng)作物生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用。但該方法在菜用大豆種質(zhì)資源研究及菜用大豆種子生產(chǎn)上還未見到報(bào)道，至今，菜用大豆品種的鑒定與區(qū)分仍然采用最原始的田間形態(tài)觀察方法，這對(duì)菜用大豆新品種的選育及良種產(chǎn)業(yè)化發(fā)展極為不利?？紤]到RFLP分析的復(fù)雜性、AFLP已被發(fā)明人申請專利、以及小衛(wèi)星DNA(VNTR)與SSR(微衛(wèi)星)技術(shù)需要了解實(shí)驗(yàn)材料的遺傳背景等，本發(fā)明以SSR分析技術(shù)為基礎(chǔ)，針對(duì)菜用大豆的基因組特點(diǎn)，研究建立了一種菜用大豆品種/系DNA指紋圖譜及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，本發(fā)明具有以下優(yōu)勢(1)本發(fā)明填補(bǔ)了菜用大豆品種資源研究尤其DNA指紋圖譜研究的空白；(2)應(yīng)用本發(fā)明的指紋圖譜進(jìn)行菜用大豆品種堅(jiān)定比目前用在菜用大豆品種鑒定中所采用的田間形態(tài)觀察法更準(zhǔn)確、簡便，本專業(yè)領(lǐng)域的專業(yè)人員均能使用；(3)本發(fā)明的菜用大豆品種/系DNA指紋圖譜簡明、直觀，適于計(jì)算機(jī)管理。


圖1 28個(gè)菜用大豆品種/系的DNA指紋圖譜其中橫坐標(biāo)為28個(gè)菜用大豆品種/系的編號(hào)；縱坐標(biāo)為構(gòu)建該DNA指紋圖譜所用的13對(duì)引物的編號(hào)?！?”表示擴(kuò)出了特異帶，“ ”表示沒有擴(kuò)增出特異帶。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1構(gòu)建菜用大豆指紋圖譜1、DNA的提取采取各品種/系的新鮮葉片磨樣，利用CTAB法提取其DNA，所得的DNA原液利用EB法測其濃度，然后稀釋成10ng/ul左右DNA稀釋液。
2、PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)在型號(hào)為PTC-225的PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行。反應(yīng)體系為10ul，其中包含模板基因組DNA溶液4.5ul(10ng/ul)10xbuffer(100mmol/l tris-Hclph8.0 1.36ul500mmol/lkcl0.1％gelatin)dNTP(10mM) 0.24ulTaq酶(5u/ul) 0.1ulMg2+(25Mm) 0.8ul引物(1ppm) 3.0ul附PCR反應(yīng)程序(1)94度預(yù)變性3min(2)95度變性1min(3)55度退火110s(4)72度延伸60s
(5)72度保溫8min(6)4度保溫其中從第二步到第五步要重復(fù)循環(huán)30次3、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入2ul Loading buffer(二甲苯氰緩沖液)，在8％聚丙烯酰胺膠(PAGE)上20W恒功率電泳1小時(shí)左右，然后銀染檢測。
具體步驟如下(1)玻璃板的組裝取干凈的玻璃板成對(duì)組裝并固定到北京六一廠產(chǎn)的型號(hào)為DYZ-30的電泳槽上，用0.1％的瓊脂糖封住下部狹縫。
(2)灌膠向裝有8％的聚丙烯酰胺溶液的三角瓶中加入適量的10％過硫酸銨和四甲基乙二胺原液，混勻，靜止2分鐘左右。沿灌膠口將膠輕輕灌入，若膠中有氣泡及時(shí)用細(xì)針將其挑出。插入梳子，等待膠液凝聚。
(3)點(diǎn)樣和電泳向電泳槽加入1XTBE電泳緩沖液，拔出梳子。在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入2ul loading buffer。點(diǎn)樣量視點(diǎn)樣孔的多少而定。
電泳采用恒定功率，10w/膠板。大約電泳50～70min即可。
(4)卸膠和銀染電泳完畢后，倒出電泳緩沖液，卸膠。將膠放入固定液，在搖床上搖動(dòng)固定至少15分鐘；固定完畢后，將固定液倒出，加入滲透液，滲透10min(滲透時(shí)間要嚴(yán)格保證)；然后用純水漂洗2～3次(30秒/次)，加入顯色液進(jìn)行顯色，以能清楚地看到條帶為準(zhǔn)，停止顯色，用清水清洗干凈。
4、條帶分子量大小的測定將已經(jīng)顯色清楚的凝膠利用Bio-Rad的Quantity One軟件進(jìn)行凝膠成像掃描保存圖像，并分析分子量大小(分子量大小以50bp ladder Marker為標(biāo)準(zhǔn))。
5、數(shù)據(jù)資料的分析統(tǒng)計(jì)13個(gè)能產(chǎn)生多態(tài)性的引物(引物序列見表2)在28個(gè)菜用大豆品種(系)的DNA樣品中擴(kuò)增的電泳帶總數(shù)與多態(tài)性帶的數(shù)目。在電泳圖譜同一個(gè)SSR位點(diǎn)上有電泳帶記錄為1，無電泳帶記錄為0。作0，1矩陣圖輸入計(jì)算機(jī)。根據(jù)井正利(Nei)的方法計(jì)算菜用大豆品種間的相似系數(shù)(GS)，從而得遺傳差異GD＝1-GS。利用GD按平均距離法(UPGMA法)計(jì)算遺傳分類。
6、DNA指紋圖譜的構(gòu)建按照上述照片上各材料各引物(13個(gè)SSR引物)擴(kuò)增情況，挑取具有代表性的(穩(wěn)定性和重復(fù)性良好的)SSR多態(tài)性帶，繪制28個(gè)菜用大豆品種(系)的DNA指紋圖譜。在該DNA指紋圖譜中，每個(gè)菜用大豆品種(系)均有其特異的DNA指紋，可以把這28個(gè)品種(系)彼此區(qū)分開(見圖1)。28個(gè)品種(系)的名稱、來源等見表1。
實(shí)施例2將本發(fā)明的菜用大豆DNA指紋圖譜用于某個(gè)菜用大豆品種的真實(shí)性檢測菜用大豆標(biāo)準(zhǔn)DNA指紋圖譜建立以后，要對(duì)某個(gè)品種(系)進(jìn)行鑒定時(shí)，用目前廣泛應(yīng)用的CTAB法提取DNA，用提取的DNA作為模板，用篩選出的13個(gè)引物對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并根據(jù)各引物(引物序列見表2)在該菜用大豆品種(系)的DNA樣品的電泳圖譜同一個(gè)SSR位點(diǎn)上擴(kuò)增出特異性條帶的有、無，繪制出該批待測種子的DNA指紋圖譜，與標(biāo)準(zhǔn)DNA指紋圖譜進(jìn)行對(duì)比，就可以知道它是用來構(gòu)建DNA指紋圖譜的28個(gè)菜用大豆品種(系)中的哪一個(gè)。
實(shí)施例3將本發(fā)明的菜用大豆DNA指紋圖譜用于某個(gè)菜用大豆品種的真實(shí)性檢測如供試材料中的“青酥二號(hào)”菜用大豆品種是目前生產(chǎn)上大規(guī)模推廣應(yīng)用的優(yōu)良品種，現(xiàn)有一批種子不能確定是否是真正的“青酥二號(hào)”種子，因此，按照本發(fā)明的方法建立這批種子的DNA指紋圖譜，然后對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行對(duì)比鑒定。
鑒定結(jié)果若它的DNA指紋與標(biāo)準(zhǔn)DNA指紋圖譜中“青酥二號(hào)”的指紋是一致的，這批種子就是真正的“青酥二號(hào)”。如果待測樣品的DNA指紋與標(biāo)準(zhǔn)DNA指紋圖譜中“青酥二號(hào)”的指紋不是一致的，那么這批種子就不是真正的“青酥二號(hào)”。
權(quán)利要求
1.一種菜用大豆DNA指紋圖譜，其特征在于該指紋圖譜用數(shù)字表示為0100010011010，0111110100100，0111111101111，0110111111111，0110101101000，0001111111110，0111111110111，0110111111100，1111111111110，0111011110111，0111110111111，0111111111101，0111101111100，0101111111111，0011111101111，0011110111111，0111111110111，0011111101100，0110010111000，0100010111010，1111111111111，1101101111011，1011111111111，0111111110000，1110111111111，1111010110111，1111010111111，1111111110111；其中，“1”代表圖譜中某個(gè)位置上有擴(kuò)增條帶存在，而“0”代表圖譜中某個(gè)位置上沒有擴(kuò)增條帶存在。
2.一種構(gòu)建權(quán)利要求1所述的指紋圖譜的方法，其特征在于該方法的具體步驟為①、DNA的提取剪取每個(gè)菜用大豆品種的幼嫩葉片，提取其總DNA；②、PCR擴(kuò)增應(yīng)用13對(duì)引物，對(duì)上述DNA進(jìn)行擴(kuò)增；③、PCR產(chǎn)物的鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行8％丙烯酰胺垂直凝膠電泳，銀染后用Bio-Rad凝膠掃描系統(tǒng)掃描照相；④、數(shù)據(jù)分析按照照片上各材料在各引物上的擴(kuò)增情況作記錄，有帶的記為1，無帶的記為0；按照井正列的方法計(jì)算菜用大豆品種間的相似系數(shù)，再按照平均距離法進(jìn)行聚類分析；⑤、DNA指紋圖譜的構(gòu)建按照照片上各材料在各引物上的擴(kuò)增情況，挑取具有穩(wěn)定性和重復(fù)性良好的SSR多態(tài)性帶，繪制菜用大豆品種的DNA指紋圖譜。
3.一種權(quán)利要求1所述的指紋圖譜，可應(yīng)用于菜用大豆品種/系的鑒定或純度分析。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種菜用大豆品種的DNA指紋圖譜及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。該指紋圖譜是以28個(gè)菜用大豆品種/系為供試材料，通過DNA的提取、PCR擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物的鑒定、數(shù)據(jù)分析，最終構(gòu)建DNA指紋圖譜。該指紋圖譜可用于菜用大豆品種/系和純度的鑒定。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1944649SQ200610117638
公開日2007年4月11日 申請日期2006年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月27日
發(fā)明者顧衛(wèi)紅, 麻浩, 王麗群, 馬坤, 宋榮浩, 高文瑞, 楊紅娟 申請人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院