專利名稱：農(nóng)桿菌介導(dǎo)的杜仲轉(zhuǎn)基因方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明所屬的技術(shù)領(lǐng)域為生物技術(shù)領(lǐng)域，進一步，本發(fā)明涉及一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的杜仲轉(zhuǎn)基因方法。
背景技術(shù)：
杜仲Eucommia ulmoides Oliv.單種屬，單屬科，為我國特有樹種，是杜仲科Eucommiaceae杜仲屬僅存的孑遺植物，現(xiàn)已作為稀有植物被列入《中國植物紅皮書——稀有瀕危植物》第一卷。杜仲既是常用貴重中藥之一，也是溫帶最有開發(fā)利用前景的膠源植物。嚴(yán)瑞芳等通過硫化杜仲膠技術(shù)，極大的拓寬了杜仲膠的應(yīng)用范圍。杜仲膠合成過程中的幾個關(guān)鍵酶已被克隆，杜仲藥用成分分離及相關(guān)基因克隆等方面的研究已成為的熱點。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將外源功能基因遺傳轉(zhuǎn)化杜仲，從而進一步研究杜仲橡膠及其藥用成分的生物合成機理，以及改良杜仲品質(zhì)意義重大。
杜仲是組織培養(yǎng)較為困難的一種木本植物。目前有關(guān)其再生體系的研究較少，且多為體細(xì)胞胚發(fā)生途徑，直接器官發(fā)生的正式報道國內(nèi)未見。由于組織培養(yǎng)較為困難，迄今尚未見到有關(guān)杜仲遺傳轉(zhuǎn)化方面的報道。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述領(lǐng)域中的空白，本發(fā)明提供一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的杜仲轉(zhuǎn)基因方法，為通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)深入研究并發(fā)掘杜仲的藥用、膠用價值奠定了基礎(chǔ)。
一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的杜仲轉(zhuǎn)基因方法，包括下列步驟a、將杜仲種子接種到MS培養(yǎng)基中，待種胚突破種皮0.4-0.7cm左右時，將胚剝出，接種到附加1.0-2.0mg/L赤霉素的MS培養(yǎng)基中；b、將農(nóng)桿菌單菌落加入YEP液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，直到OD值達(dá)到0.4～0.7，離心收集菌體，用1/2MS重懸培養(yǎng)基重懸制得農(nóng)桿菌菌液；c、將種胚胚軸切成0.4-0.7cm左右的外植體，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基于黑暗中培養(yǎng)后，投入步驟b農(nóng)桿菌菌液中，使外植體與農(nóng)桿菌充分接觸，取出外植體，轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)基上培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基1中誘導(dǎo)不定芽的再生，再在篩選培養(yǎng)基2中進行壯苗，最后將材料接種到生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根。
所述的共培養(yǎng)基中含有50mg/L乙酰丁香酮及20g/L蔗糖，1/2MS重懸培養(yǎng)基中含有20g/L蔗糖。
所述篩選培養(yǎng)基1中含有0.8mg/L 6-芐氨基嘌呤、0.1mg/L萘乙酸、50mg/L卡那霉素、100mg/L Timentine及30g/L蔗糖，篩選培養(yǎng)基2中含有1.0mg/L 6-芐氨基嘌呤、0.1mg/L萘乙酸、50mg/L卡那霉素、100mg/L Timentine及30g/L蔗糖。
所述生根培養(yǎng)基中含有1.5mg/L吲哚丁酸、1g/L活性炭、50mg/L卡那霉素、100mg/LTimentine及20g/L蔗糖。
所述杜仲種子經(jīng)4℃冷處理至少3天。
所述農(nóng)桿菌菌液OD值為0.3-0.4。
所述步驟c種胚為20天齡。
所述外植體在誘導(dǎo)培養(yǎng)基和共培養(yǎng)基上的培養(yǎng)時間均為48-72小時。
所述外植體在投入農(nóng)桿菌菌液之前，劃出橫向或/縱向深至表皮的傷口。
植物組織培養(yǎng)各個階段，除共培養(yǎng)及預(yù)培養(yǎng)階段不需要光照外，培養(yǎng)條件為光照強度為2000lx，每日光照16小時，培養(yǎng)溫度(26±2)℃。
實驗中生根培養(yǎng)基及1/2MS重懸培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基，其余培養(yǎng)基均為MS常規(guī)培養(yǎng)基。
杜仲種胚含有較多的未分化及分化程度較淺的分生細(xì)胞，具有很強的再生活性，在合適的生長素及細(xì)胞分裂素濃度下，其傷口處皮層可分化形成芽原始體并高頻直接再生不定芽。本實驗選取杜仲種胚為外植體，通過分生細(xì)胞器官直接發(fā)生途徑進行不定芽誘導(dǎo)，誘導(dǎo)情況見“圖2”，具有誘導(dǎo)率高，穩(wěn)定性高，變異低，利于進行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化的優(yōu)點。采用本方法胚軸遺傳轉(zhuǎn)化率為2.8％左右。
由于缺少高效的杜仲組織培養(yǎng)再生體系，尚未見到有關(guān)杜仲遺傳轉(zhuǎn)化方面的報道。本研究采用杜仲胚軸為外植體，直接誘導(dǎo)不定芽發(fā)生，完善了杜仲不定芽誘導(dǎo)再生體系。在上述研究的基礎(chǔ)上，篩選出較合理的遺傳轉(zhuǎn)化方案，建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的杜仲遺傳轉(zhuǎn)化體系，為通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，深入研究并發(fā)掘杜仲的藥用、膠用價值奠定了基礎(chǔ)。


圖1.篩選25d杜仲胚軸不定芽誘導(dǎo)情況(整皿)其中，a為轉(zhuǎn)基因材料(整皿)，b為非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?整皿)。
圖2.通過分生細(xì)胞器官直接發(fā)生途徑對杜仲胚軸進行不定芽誘導(dǎo)情況“a圖”為篩選25d杜仲胚軸不定芽(此圖為“圖1，a”中單個外植體的放大圖)，“b圖”為篩選45d杜仲胚軸不定芽。
圖3.杜仲轉(zhuǎn)基因材料的壯芽，及獲得的生根試管苗圖4.轉(zhuǎn)基因植株的GUS染色檢測結(jié)果其中，a為轉(zhuǎn)基因植株葉片染色情況，b為非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓耆~片染色情況。
圖5.轉(zhuǎn)基因杜仲PCR檢測結(jié)果其中，第1道為Marker(λDNA經(jīng)BamH I，HindIII雙酶切得到)，第2道為非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?，?道為陽性質(zhì)粒，第4、5、6道為杜仲轉(zhuǎn)基因材料。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的詳細(xì)說明。
培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件共培養(yǎng)基中含有50mg/L乙酰丁香酮，及20g/L蔗糖，1/2MS重懸培養(yǎng)基中含有20g/L蔗糖，篩選培養(yǎng)基1中含有0.8mg/L 6-芐氨基嘌呤、0.1mg/L萘乙酸、50mg/L卡那霉素、100mg/L Tinmentine及30g/L蔗糖，篩選培養(yǎng)基2中含有1.0mg/L6-芐氨基嘌呤、0.1mg/L萘乙酸、50mg/L卡那霉素、100mg/L Tinmentine及30g/L蔗糖，生根培養(yǎng)基中含有1.5mg/L吲哚丁酸、1g/L活性炭、50mg/L卡那霉素、100mg/L Tinmentine及20g/L蔗糖，實驗中生根培養(yǎng)基及1/2MS重懸培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基，其余培養(yǎng)基均為MS常規(guī)培養(yǎng)基。植物組織培養(yǎng)各個階段，除共培養(yǎng)及預(yù)培養(yǎng)階段不需要光照外，培養(yǎng)條件為光照強度為2000lx，每日光照16小時，培養(yǎng)溫度(26±2)℃。其中1L MS培養(yǎng)基中包含硝酸鉀(KNO3)1900毫克，硝酸銨(NH4NO3)1650毫克，氯化鈣(CaCl2·2H2O)440毫克，硫酸鎂(MgSO4·7H2O)370毫克，磷酸二氫鉀(KH2PO4)170毫克，硫酸錳(MnSO4·4H2O)22.3毫克，硫酸鋅(ZnSO4·7H2O)8.6毫克，硼酸(H2BO3)6.2毫克，碘化鉀(KI)0.83毫克，鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O)0.25毫克，乙二胺四乙酸二鈉(Na2-EDTA·2H2O)37.25毫克，硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)27.8毫克，硫酸銅(CuSO4·5H2O)0.025毫克，氯化鉆(COCl2·6H2O)0.025毫克，肌醇100毫克，煙酸0.5毫克，鹽酸硫胺素(維B1)0.1毫克，鹽酸吡哆素(維B6)0.5毫克，甘氨酸2毫克，PH值5.80。1LYEP培養(yǎng)集中包含5.0g蛋白胨，5.0g酵母提取物，2.5gNaCl，PH值7.20。
1、杜仲胚軸抗生素敏感性實驗本實驗中用于杜仲遺傳轉(zhuǎn)化的構(gòu)建中含有卡那霉素抗性基因，因此采用卡那霉素對轉(zhuǎn)基因植株進行篩選，另外本實驗采用Tinmentine作為杜仲材料在組培過程當(dāng)中的農(nóng)桿菌抑制劑。在杜仲誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，分別附加0mg/L卡那霉素，0mg/L卡那霉素、100mg/LTinmentine，25mg/L卡那霉素，50mg/L卡那霉素和100mg/L卡那霉素。將0.5cm左右的胚軸切段，接種到上述培養(yǎng)基中，25d后統(tǒng)計材料的分化及存活情況。結(jié)果表明，100mg/L的Tinmentine對杜仲胚軸及子葉的分化影響不大，故在篩選時我們采用100mg/L的Tinmentine抑菌。杜仲胚軸對轉(zhuǎn)基因材料比較敏感，當(dāng)卡那霉素濃度為25mg/L時，外植體死亡率為45.3％，個別材料出現(xiàn)芽苗分化，但產(chǎn)生的芽嚴(yán)重玻璃化，不能正常生長；當(dāng)卡那霉素濃度為50mg/L時，外植體黃化、玻璃化嚴(yán)重，死亡率65.6％，沒有不定芽的分化；當(dāng)卡那霉素濃度達(dá)到100mg/L時，絕大多數(shù)外植體死亡率。我們選擇的篩選壓為卡那霉素50mg/L，并附加100mg/L Tinmentine抑制農(nóng)桿菌的生長。
2、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的外源基因遺傳轉(zhuǎn)化杜仲胚軸2.1材料及培養(yǎng)條件取杜仲種子(采自貴州大學(xué)花溪南校區(qū)校園)，剝?nèi)ネ馄?，置?℃冰箱冷處理至少3天中待用。光照強度為2000lx，每日光照16h，培養(yǎng)溫度(26±2)℃。
2.2材料消毒方法取4℃保存的種子，用自來水沖洗30min，在超凈工作臺中，用無菌水浸泡15min，再用75％酒精消毒60s后轉(zhuǎn)入0.1％升汞水中浸泡30min，無菌水漂洗5次，浸泡過夜。將消毒后的種子接種到MS培養(yǎng)基中。
2.3接種待種胚突破種皮0.5cm左右時，取長勢較好的材料將胚剝出，用常規(guī)無菌操作方法，接種到附加1.0-2.0mg/L赤霉素的MS培養(yǎng)基中，使其快速伸長。3周左右種胚可伸長至3cm左右(由于去除了種皮的束縛，材料的生長較為一致)2.4農(nóng)桿菌的準(zhǔn)備用接種針蘸取-80℃凍存的含有pBin19重組質(zhì)粒(重組質(zhì)粒中含有β-葡萄糖苷酸酶基因和重組酶基因flp)的農(nóng)桿菌，在YEP固體培養(yǎng)基上劃平板，28℃恒溫培養(yǎng)24h左右，直到長出合適大小的菌斑。用牙簽挑取農(nóng)桿菌單菌落加入到5mlYEP液體培養(yǎng)基中，200rpm 28℃震蕩培養(yǎng)24h，于5ml菌液中取500ul加入50ml YEP液體培養(yǎng)基中，200rpm28℃震蕩培養(yǎng)，直到OD值達(dá)到0.4～0.7。將菌液轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，6000rpm，4℃離心10min，收集菌體。用1/2MS重懸培養(yǎng)基重懸離心收集的農(nóng)桿菌，調(diào)節(jié)菌液OD值在0.3～0.4之間。
2.5植物材料的農(nóng)桿菌侵染取20d齡種胚，將胚軸切成0.5cm左右的切段，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中黑暗中培養(yǎng)48-72d，在預(yù)培養(yǎng)的外植體上劃出幾條橫向、縱向傷口(深度至表皮)以擴大受傷面積，投入預(yù)先準(zhǔn)備好的農(nóng)桿菌菌液中，不斷搖動，使外植體與農(nóng)桿菌充分接觸，6～8min后，取出外植體，置于干燥無菌濾紙上吸去多余的菌液，轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)基上，培養(yǎng)48h-72h。立刻轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基1中誘導(dǎo)不定芽的再生。轉(zhuǎn)基因植物與對照的篩選，及不定芽直接誘導(dǎo)情況分別見圖1和圖2。在含有50mg/L卡那霉素的篩選培養(yǎng)基中，由于導(dǎo)入了卡那霉素抗性基因，因此轉(zhuǎn)基因材料能夠分解培養(yǎng)基中的卡那霉素，故能夠存活；而非轉(zhuǎn)基因?qū)φ詹牧纤劳觥?br> 2.6分化及壯苗材料轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基1后4-5周可見小芽萌發(fā)(接種25天后轉(zhuǎn)基因材料、及非轉(zhuǎn)基因?qū)φ詹牧吓咻S的不定芽誘導(dǎo)情況見圖1)，誘導(dǎo)出的不定芽在篩選培養(yǎng)基2中進繼代2次，約4-5周，小苗可長至3-4公分高。(見圖2，b)2.7完整植株的獲得將小苗轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根。2周后材料下端長出白色小根，繼續(xù)培養(yǎng)即獲得杜仲轉(zhuǎn)基因植株試管苗。(見圖3)3、轉(zhuǎn)基因植株的GUS及PCR檢測(1)GUS基因的活性檢測本實驗中用于杜仲遺傳轉(zhuǎn)化的構(gòu)建中含有β-葡萄糖苷酸酶基因，可進行GUS染色。取待檢測材料的葉片清洗后抽真空，于5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖苷酸染色液(X-Gluc 0.5mg/mL，100mmol/L磷酸緩沖液ph＝7.0，0.1％Triton X100，1mmol/L鐵氰化鉀，1mmol/L亞鐵氰化鉀)中于37℃下保溫過夜，然后分別用10％，25％，50％，75％，95％的乙醇脫色，每種濃度的乙醇分別脫色5min，最后組織繼續(xù)放在95％的乙醇溶液中浸泡，直到綠色退去。
檢測結(jié)果見“圖4”。經(jīng)過GUS染色，轉(zhuǎn)基植株的葉片因呈藍(lán)色，而對照植株的葉片沒有著色，呈白色。
(2)轉(zhuǎn)基因杜仲植株的PCR檢測本實驗中用于杜仲遺傳轉(zhuǎn)化的構(gòu)建中含有flp基因，因此采用flp引物對轉(zhuǎn)基因植株進行PCR檢測。CTAB法提取杜仲基因組DNA，以基因組DNA為模版利用flp引物進行PCR擴增，待擴增片段長度為1270bp。
(25ul)PCR擴增體系2.5ul 10X PCR buffer，1.0ul 25mmol MgCL2，0.5ul 10mmol dNTP，1.0ulDNA模版，各1.0ul 20mmol flp引物，0.5ul 5u/ul tag酶)，反應(yīng)條件為94℃7min，(94℃30s，63℃1min，72℃1min)35cycle，72℃7min。
flp引物序列flp-Ks-F，5’ggg gta ccc aag tcg acc aat gcc aca att tgg tat att atg 3’flp-x-R，5’ccg atc gag tta tat gcg tct att tat gta gg 3’檢測結(jié)果見“圖5”。第4、5、6道的杜仲轉(zhuǎn)基因材料擴增出了1270bp的帶，結(jié)果與陽性質(zhì)粒一致，而非轉(zhuǎn)基因?qū)φ詹牧蠜]有擴增出帶。
權(quán)利要求
1.一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的杜仲轉(zhuǎn)基因方法，包括下列步驟a、將杜仲種子接種到MS培養(yǎng)基中，待種胚突破種皮0.4-0.7cm左右時，將胚剝出，接種到附加1.0-2.0mg/L赤霉素的MS培養(yǎng)基中；b、將農(nóng)桿菌單菌落，用牙簽挑取，加入到Y(jié)EP液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)震蕩培養(yǎng)，直到OD值達(dá)到0.4～0.7，離心收集菌體，用1/2MS重懸培養(yǎng)基重懸制得農(nóng)桿菌菌液；c、將種胚胚軸切成0.4-0.7cm左右的外植體，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基于黑暗中預(yù)培養(yǎng)后，投入步驟b農(nóng)桿菌菌液中，使外植體與農(nóng)桿菌充分接觸，取出外植體，轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)基上培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基1中誘導(dǎo)不定芽的再生，再在篩選培養(yǎng)基2中進行壯苗，最后將材料接種到生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的杜仲轉(zhuǎn)基因方法，所述的共培養(yǎng)基中含有50mg/L乙酰丁香酮及20g/L蔗糖，1/2MS重懸培養(yǎng)基中含有20g/L蔗糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的杜仲轉(zhuǎn)基因方法，所述篩選培養(yǎng)基1中含有0.8mg/L 6-芐氨基嘌呤、0.1mg/L萘乙酸、50mg/L卡那霉素、100mg/L Tinmentine及30g/L蔗糖，篩選培養(yǎng)基2中含有1.0mg/L 6-芐氨基嘌呤、0.1mg/L萘乙酸、50mg/L卡那霉素、100mg/L Tinmentine及30g/L蔗糖。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的杜仲轉(zhuǎn)基因方法，所述生根培養(yǎng)基中含有1.5mg/L吲哚丁酸、1g/L活性炭、50mg/L卡那霉素、100mg/L Tinmentine及20g/L蔗糖。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的杜仲轉(zhuǎn)基因方法，所述杜仲種子經(jīng)4℃冷處理至少3天。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的杜仲轉(zhuǎn)基因方法，所述農(nóng)桿菌菌液OD值為0.3-0.4。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的杜仲轉(zhuǎn)基因方法，所述步驟c種胚為20天齡。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的杜仲轉(zhuǎn)基因方法，所述外植體在誘導(dǎo)培養(yǎng)基和共培養(yǎng)基上的培養(yǎng)時間均為48-72小時。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的杜仲轉(zhuǎn)基因方法，所述外植體在投入農(nóng)桿菌菌液之前，劃出橫向或/縱向深至表皮的傷口。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的杜仲轉(zhuǎn)基因方法，所述植物組織培養(yǎng)各個階段，除共培養(yǎng)及預(yù)培養(yǎng)階段不需要光照外，培養(yǎng)條件為光照強度為2000lx，每日光照16小時，培養(yǎng)溫度(26±2)℃。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的杜仲轉(zhuǎn)基因方法。一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的杜仲轉(zhuǎn)基因方法，包括下列步驟a.將杜仲種子接種到MS培養(yǎng)基中，然后將胚剝出，再接種到附加赤霉素的MS培養(yǎng)基中；b.用1/2MS重懸培養(yǎng)基重懸離心收集的農(nóng)桿菌菌體制得農(nóng)桿菌菌液；c.將種胚胚軸外植體，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基于黑暗中培養(yǎng)后，投入農(nóng)桿菌菌液中，使外植體與農(nóng)桿菌充分接觸，取出外植體，轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)基上培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基中誘導(dǎo)不定芽的再生，最后將材料接種到生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根。本發(fā)明建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的杜仲遺傳轉(zhuǎn)化體系，為通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)深入研究并發(fā)掘杜仲的藥用、膠用價值奠定了基礎(chǔ)。采用本方法胚軸遺傳轉(zhuǎn)化率為2.8％左右。
文檔編號C12N15/87GK1948480SQ20061011456
公開日2007年4月18日 申請日期2006年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月15日
發(fā)明者趙德剛, 李巖 申請人:貴州大學(xué)