專利名稱：一種使用氧化硅－磁鐵礦納米復(fù)合物分離質(zhì)體dna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分離質(zhì)體DNA的方法，更特別的涉及一種使用氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物從細菌培養(yǎng)物中分離超純質(zhì)體DNA的方法。
背景技術(shù)：
特定細胞或分子的純化為生命科學(xué)研究的根本，不過某些分離方法可能具有物理和化學(xué)危害性。在現(xiàn)有技術(shù)中，磁性分離法提供了一種溫和的抉擇，目標物是經(jīng)捕捉在涂覆著目標物專一性表面的磁性粒子上，且使用磁場將目標物從樣品分離出。對于快速細菌質(zhì)體DNA分離，使所分離出的DNA不含蛋白質(zhì)、RNA、鹽類和酵素抑制劑的方法的需求已經(jīng)隨著對于需要高度純化的基因模板的分子實驗程序的泛濫而大幅增加。最盛行的質(zhì)體分離方法都是相當耗時間且需要用到吸附劑、毒性物質(zhì)、核酸酶和/或過濾介質(zhì)來使質(zhì)體從蛋白質(zhì)、基因組DNA分離出來。DNA的磁性分離法有快速的處理時間、較少的化學(xué)品需求、容易使用磁鐵分離且容易自動化的優(yōu)點。陰離子交換層析術(shù)吸著劑的低容量是質(zhì)體DNA純化中的另一項相關(guān)問題。因此，具有更高結(jié)合容量的新機體的設(shè)計與發(fā)展為質(zhì)體處理領(lǐng)域中的最重要發(fā)展之一。
在最近數(shù)年內(nèi)，隨著納米結(jié)構(gòu)材料和納米技術(shù)在生物技術(shù)與醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的快速發(fā)展，納米尺寸的磁性粒子已受到逐增的注意。由于強磁性和低毒性，納米尺寸的磁性粒子在生物技術(shù)與醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用已經(jīng)受到明顯的注意。小于約30納米的磁性粒子具有超順磁性(superparamagnetism)。嚴格說來，這些粒子不具磁性而是具有超順磁性，是指的是其只有在磁場中才具磁性。這種性質(zhì)使這些粒子可以再分散而不會有磁性聚集物的形成。因此這些粒子可以再使用或回收。這種特性可防止結(jié)塊且促成粒子的容易分散。微生物細胞溶裂物為相當粘稠者且可能在管柱分離操作中呈現(xiàn)問題。使用磁性粒子在生物分離應(yīng)用中的另一項優(yōu)點為其對于各種量的起始樣品的用處。對于大部份商業(yè)上可以取得的DNA純化系統(tǒng)，起始物的量都受到在塑料管柱或離心吊籃中固定的純化用基質(zhì)的含量所限制。再者，以磁性為基底的程序有適合于自動化系統(tǒng)的額外優(yōu)點，可減少人力和時間，同時提供更為可復(fù)制性的結(jié)果且可用于大規(guī)模分析。
本發(fā)明人報導(dǎo)過聚乙烯亞胺(PEI)-改質(zhì)磁性Fe3O4納米珠粒作為從細菌細胞溶裂物純化質(zhì)體DNA的介質(zhì)的用途。偶合到PEI化合物的氧化鐵可導(dǎo)入有益于恢復(fù)分散的正離子電荷且有助于與DNA的離子性交互作用。PEI-改質(zhì)磁性納米珠?？捎么膨?qū)動的分離予以回收且可經(jīng)由使用有最優(yōu)離子強度(1.25M)和pH(9.0)的溶析緩沖液予以再生。聚合酶鏈型反應(yīng)(PCR)以其高專一性、敏感度和快速的轉(zhuǎn)變時間而廣泛地受到使用。不過，抑制性因子可能與目標核酸共同萃取出因而阻礙PCR的效能。因此，大量注意力已經(jīng)集中于快速且有效的DNA離析方法。磁性粒子也因而適合用于無抑制劑的細胞或DNA的分離。不過，至今為止，氧化硅尚未被利用來開發(fā)類似的用于良好品質(zhì)質(zhì)體DNA的制備。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種使用100％水性溶液，因而消除因為溶劑、鹽濃度所致PCR失敗的任何可能性，并可減少沉淀的操作的氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物分離質(zhì)體DNA的方法。
本發(fā)明的目的之二是提供一種使用氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物從細菌培養(yǎng)物中分離超純質(zhì)體DNA的方法。
本發(fā)明的這些以及其他目的將通過下列詳細描述和說明來進一步體現(xiàn)和闡述。
本發(fā)明的使用氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物分離質(zhì)體DNA的方法，包括如下步驟A、使用Fe2+和Fe3+鹽和氫氧化銨在氮氣環(huán)境下以化學(xué)沉淀法制備超順磁性氧化鐵納米粒子；B、將四乙氧基硅烷(TEOS)用酸水解產(chǎn)生的氧化硅涂覆在A步驟得到的磁性氧化鐵納米粒子上來制備氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物載體；C、將含質(zhì)體DNA的樣品與上述步驟B所得的氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物載體接觸使其在高鹽條件下吸附到該載體上；D、使用溶析緩沖液將該質(zhì)體DNA從該氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物載體脫吸附，并且使用永久磁體回收該氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物載體，留下的澄清液回收該質(zhì)體DNA。
在本發(fā)明的使用氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物分離質(zhì)體DNA的方法中，在A步驟中，包括如下步驟(1)、將去離子水再次去離子，然后通入氮氣1小時以去除水中氧氣；(2)、將含F(xiàn)e2+和Fe3+離子的化合物在激烈攪拌之下溶解在(1)步驟得到的水中，得到FeCl36H2O(例如1.28M)和FeCl24H2O(例如0.64M)；(3)、將步驟(2)得到的含鐵溶液加入堿(較好的是NaOH)和脂肪酸(較好的是月桂酸)激烈攪拌，使用超聲波槽使磁鐵礦粒子稍微分散，然后依序使用丙酮、乙醇和去離子水清洗以去除殘留表面活性劑和未反應(yīng)的藥劑；(4)、得到的磁鐵礦懸浮液可以用于下一步驟中或者予以干燥得到粉末形式的產(chǎn)品。
在本發(fā)明的使用氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物分離質(zhì)體DNA的方法中，在B步驟中，將步驟(A)得到的磁鐵礦懸浮液在圓底燒瓶內(nèi)以超聲波分散，在激烈機械攪拌之下，加入HCl，反應(yīng)1小時之后，在反應(yīng)混合物中依序加入去離子水、氫氧化銨和四乙氧基硅烷，在70-85℃連續(xù)攪拌之下進行水解5-8小時，用永久磁鐵進行分離，所得產(chǎn)物用去離子水徹底洗滌三次，將氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物以10毫克/毫升濃度貯存于去離子水中。
較好的是，在本發(fā)明的使用氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物分離質(zhì)體DNA的方法中，在B步驟中，將步驟(A)得到的70毫升磁鐵礦懸浮液在圓底燒瓶內(nèi)以超聲波分散，在激烈機械攪拌之下，加入1毫升6N的HCl，反應(yīng)1小時之后，在反應(yīng)混合物中依序加9.9毫升的去離子水、34毫升的氫氧化銨和98％體積濃度的10.1毫升四乙氧基硅烷，在70-85℃以300-500轉(zhuǎn)/分鐘連續(xù)攪拌之下進行水解6.5-7.5小時，用永久磁鐵進行分離，所得產(chǎn)物用去離子水徹底洗滌三次，將氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物以10毫克/毫升濃度貯存于去離子水中。
在本發(fā)明的使用氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物分離質(zhì)體DNA的方法中，在C步驟中，將含質(zhì)體DNA的樣品與氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物在結(jié)合緩沖液中于室溫下混合1-3分鐘，然后使用具有約2000G表面磁化強度的永久磁鐵將粒子固定并且去除上澄液。所述的結(jié)合緩沖液由0.1-4M的NaCl和0.05M的Tris-HCl組成，溶液的PH為7.0-9.0。
較好的是，在本發(fā)明的使用氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物分離質(zhì)體DNA的方法中，在C步驟中，將含質(zhì)體DNA的樣品放入1.5毫升的無DNase/RNase微型離心管之中，并且加入1％(w/v)氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物和100微升結(jié)合緩沖液，組成懸浮液，在室溫下溫和混合該懸浮液2分鐘，然后使用具有約2000G表面磁化強度的永久磁鐵將粒子固定并且去除上澄液。所述的結(jié)合緩沖液由2M的NaCl和0.05M的Tris-HCl組成，溶液的PH為8.0。
在本發(fā)明的使用氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物分離質(zhì)體DNA的方法中，在D步驟中，使用300-400微升洗滌緩沖液將粒子洗滌，并且再用磁鐵固定之后，添加100微升水將質(zhì)體DNA脫吸附，最后，將粒子固定且回收上澄液即完成該質(zhì)體DNA的分離。所述的洗滌緩沖液由0.1-0.5M的NaCl和0.05M的Tris-HCl組成，其PH值為8。較好的是，將上澄液轉(zhuǎn)移到新的無DNase/RNase微型離心管之內(nèi)，溶液中的核酸濃度從260納米的吸光度計算出。
在本發(fā)明的使用氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物分離質(zhì)體DNA的方法中，所述的含DNA的生物樣品為微生物包括細菌、真菌、病毒和寄生蟲與類似者，動物和植物的細胞、體液、組織萃取物和類似者，以及病毒、載體、質(zhì)體、黏質(zhì)體和含DNA的其它生物樣品?；蛘邽槭褂镁酆厦告溞头磻?yīng)從pEGFP-N1擴增一完整的綠色螢光蛋白質(zhì)基因(EGFP)，然后使用所得質(zhì)體轉(zhuǎn)形大腸桿菌，再將轉(zhuǎn)形大腸桿菌培養(yǎng)之后，將回收所得細菌用堿包括氫氧化鈉予以溶裂而得的含有質(zhì)體DNA的細菌細胞溶裂物。
在本發(fā)明中，可以將一編碼綠色螢光性蛋白質(zhì)與T7激活基因的質(zhì)體，pRSETB-EGFP，在大腸桿菌DE3菌株(E.coli DE3strain)內(nèi)擴增，利用其溶裂物作為起始樣品分離該質(zhì)體。經(jīng)證實從細菌溶裂物的制備起始直到回收純化質(zhì)體為止可在8分鐘以內(nèi)完成。與市售以氧化硅為基礎(chǔ)的方法及其它方法比較，本發(fā)明使用氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物分離質(zhì)體DNA的方法具有節(jié)省時間，整體較高的產(chǎn)率，較低的污染與較佳的聚合酶鏈型反應(yīng)(PCR)擴增結(jié)果。
四

圖1是本發(fā)明氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物的透射電子顯微照片。
圖2是本發(fā)明氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物的磁化強度相對于磁場的關(guān)系圖。
圖3為本發(fā)明氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物懸浮液在不同的鹽濃度和pH的δ電位。
圖4為鹽濃度對于從本發(fā)明氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物溶析出質(zhì)體DNA的影響。
圖5為pH對于質(zhì)體DNA在本發(fā)明氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物上的結(jié)合的影響。
圖6為本發(fā)明氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物在3毫升細菌培養(yǎng)物中的添加量對于從該氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物溶析出質(zhì)體DNA的影響。
圖7為在吸附于本發(fā)明氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物上之后，于結(jié)合后的上澄液，洗滌溶液與溶析溶液之內(nèi)所含質(zhì)體DNA之瓊脂糖電泳分離圖。
圖8為使用UV盒偵測在轉(zhuǎn)形大腸桿菌細胞中的EGFP表現(xiàn)。
圖9為使用限制核酸內(nèi)切酶將純化出的質(zhì)體DNA消化后，進行瓊脂糖電泳分離脂結(jié)果。
圖10為純化出的質(zhì)體DNA的PCR擴增敏感性。
在圖4中，其中流道M分子量標志物；1[NaCl]＝OM；2[NaCl]＝0.25M；3[NaCl]＝0.5M。
在圖5中，其中流道M分子量標志物；1pH＝7.0；2pH＝8.0；3pH＝9.0。
在圖6中，其中流道M分子量標志物；1700微克；2800微克；3900微克；41000微克。
在圖7中，其中流道M分子量標志物；1吸附后的上澄液；2洗滌溶液；3溶析溶液；4從Qiagen Spin管柱出來的溶析溶液。
在圖9中，其中流道M分子量標志物；1沒有限制核酸內(nèi)切酶消化的純化出的質(zhì)體DNA；2有用限制核酸內(nèi)切酶消化(EcoRI)的純化出的質(zhì)體DNA；3使用兩種限制核酸內(nèi)切酶消化(BamHI和EcoRI)的純化出的質(zhì)體DNA。
在圖10中，其中流道M分子量標志物；1對照物；2從Qiagen Spin管柱分離出來的樣品；3從本發(fā)明氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物分離出的樣品；4從經(jīng)PEI-改質(zhì)的磁性納米珠粒分離出來但沒有沉淀所得樣品；5從經(jīng)PEI-改質(zhì)的磁性納米珠粒分離出來且沉淀所得樣品。
在本發(fā)明中使用的所有原材料和一些方法等均是常規(guī)使用的，可以從市場購得。在本發(fā)明中，如非特指，所有的量、百分比均為重量單位。
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進行具體的描述。由技術(shù)常識可知，本發(fā)明可以通過其他的不脫離其精神實質(zhì)或必要特征的實施方案來實現(xiàn)。因此，下列實施方案，就各方面而言，都只是舉例說明，并不是僅有的。所有在本發(fā)明范圍內(nèi)或等同本發(fā)明的范圍內(nèi)的改變均被本發(fā)明包含。
五具體實施例方式
實施例1材料
氯化鐵六水合物是購自J.T.Baker(Phillipsburg，NJ，USA)。氯化亞鐵四水合物是購自Fluka(Buchs，Switzerland)。PEI、四乙氧基硅烷和月桂酸都是由Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO，USA)所供應(yīng)。瓊脂糖L(低電內(nèi)滲透壓)是得自Amersham Biosciences(Uppsala，Sweden)。超螺旋階梯狀DNA電泳條帶是得自Invitrogen Co.(Carlsbad，CA，USA)。DNA分離和分析中所用到的藥劑都是分子生物學(xué)品級者。核糖核酸酶A是得自Sigma。所用到的所有其它化學(xué)品和溶劑都是分析級且不再純化即使用。于整個實驗中所用的水都是由NihonMillipore Ltd.(Tokyo，Japan)的Milli-Q Ultra-Pure-WaterPurification System所制造。所有溶液都是新鮮制備。
方法1、質(zhì)體構(gòu)成將完整經(jīng)增強的綠色螢光性蛋白質(zhì)基因(EGFP)使用聚合酶鏈型反應(yīng)從pEGFP-N1(BD Bioscience，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ，USA)予以擴增。將經(jīng)過處理而在5’端分別含有BamHI和EcoRI切割部位的上游引子和下游引子(5’-cgggatccACCGGTCGCCAC-3’和5’-cggaattcGCGGCCGCTTTACTTGTACAGC-3’)分別安置于EGFP基因的起始密碼子和停止密碼子之處。PCR是使用MinicyclerTM(MJ Research)在100微升體積內(nèi)實施。每一反應(yīng)包含50mM KCl，10mM Tris-HCl pH8.3，1.5mM MgCl2，0.001％(w/v)明膠，5.0微微莫耳的每一種引子，各200μM的每一種脫氧核糖核苷三磷酸鹽(dNTP)，2.5U Ex Tag(Takara)以及0.1微克的pEGFP-N1。循環(huán)條件為20循環(huán)的95℃下1分鐘，60℃一分鐘和72℃一分鐘。
使用BamHI和EcoRI將擴增的PCR片段線型化，然后使用GFXTMPCR DNA and Gel Band Purification Kit(AmershamBioscience)采用制造商的實驗程序從1％瓊脂糖予以純化。將限制酶切過的PCR片段使用BamHI/EcoRI-消化過的pRSETB(Invitrogen Life Technologies Ltd.)在T7激活基因的驅(qū)動下與(His)6框構(gòu)內(nèi)(in frame)連接而得pRSET-EGFP。
2、細菌轉(zhuǎn)形將含有在IPTG-誘導(dǎo)Lac激活基因控制下的T7 RNA聚合酶之BL21(DE3)大腸桿菌(Invitrogen Life Technologies Ltd.)置于冰上解凍，然后將1毫微克的pRSET-EGFP與大腸桿菌混合。在冰上溫置30分鐘之后，在37℃下培養(yǎng)大腸桿菌30秒鐘，然后保持在冰上2分鐘。于熱震蕩之后于LB液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)大腸桿菌1小時以供回收。然后將100微升的大腸桿菌懸浮液展布在含有60微克/毫升氨芐青霉素的LB瓊脂上且在37℃下培養(yǎng)整個晚上以形成菌落。
3、細菌溶裂物的制備細菌是使用Birnboim和Doly所述堿法的修改法予以溶裂。將可表現(xiàn)質(zhì)體pRSET-EGFP的大腸桿菌DE3細胞在含有100微克/毫升氨芐青霉素的Luira-Bertani液體培養(yǎng)基終生長到后對數(shù)期。從3毫升的細胞培養(yǎng)物在3000rpm離心3分鐘而收獲細菌細胞。將沉丸再懸浮于含有0.01M EDTA和100微克/毫升核糖核酸酶X(250微升)的0.05M Tris-HCl緩沖液，pH8.0之中。經(jīng)由將再懸浮的細胞沉丸于含有1％(W/V)十二烷基硫酸鈉的0.2M NaOH(250微升)溫和地混合以實施細胞溶裂。經(jīng)由添加6M胍-鹽酸鹽，pH5.5(350微升)沉淀出基因組DNA和其它雜質(zhì)。將該混合物10000xg離2分鐘以沉著沉淀出的蛋白質(zhì)、細胞碎屑和變性的染色體DNA。
4、磁鐵礦和氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物的制備磁性納米粒子Fe3O4是經(jīng)由將Fe2+和Fe3+離子在氨溶液中于水熱條件下處理以化學(xué)沉淀法制備。于使用之前將Milli-Q水再去離子且經(jīng)由通入氮氣氣體1小時除氧。將含F(xiàn)e2+和Fe3+離子的化學(xué)品于激烈攪拌之下溶解在Milli-Q水中以制備1.28MFeCl36H2O和0.64MFeCl24H2O儲液作為鐵源。以相同的方式制備1.0M NaOH作為堿源。另外，制備1.5M月桂酸，pH＝10用以涂覆。將使用超聲波槽使磁鐵礦粒子稍微分散。然后依序使用丙酮、乙醇和去離子水予以清洗以移除殘留界面活性劑和未反應(yīng)的藥劑。典型地，是將70毫升上面所制備的磁鐵礦懸浮液(0.7克Fe3O4)在一圓底燒瓶內(nèi)以超聲波分散。于激烈機械攪拌之下，加入1毫升的HCl(6N)。于1小時之后，在反應(yīng)混合物中依序加入9.9毫升的水，34毫升的氫氧化銨(28重量％的NH3)，以及10.1毫升的四乙氧基硅烷(TEOS；98％(v/v))/22.4毫升甲醇。于80℃連續(xù)攪拌(350rpm)之下進行TEOS的水解7小時。將藉助永久磁鐵的磁性分離所得產(chǎn)物使用去離子水徹底洗滌三次。將氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物以10毫克/毫升濃度貯存于去離子水中。
5、磁性粒子的鑒定使用Philips(Eindhoven，The Netherlands)的Tecnai G2F20 FEG-TEM在200kV以透射電子顯微術(shù)(TEM)觀察磁性納米粒子的尺寸和形態(tài)學(xué)。使用超導(dǎo)性量子干涉裝置(SQUID)Quantum Design(San Diego，CA，USA)MPMS7磁強計進行磁測量。使用Malvern(Worcs，UK)Brook haven Zetasizer 3000分析儀測量氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物在不同pH和鹽濃度的δ電位。
6、以氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物純化質(zhì)體DNA將透明堿溶裂物的上澄液置于一1.5毫升的無DNase/RNase微型離心管之內(nèi)且加入1％(w/v)氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物在結(jié)合緩沖液(100微升，2M NaCl，0.05M Tris-HCl緩沖液，pH8)中的懸浮液。在室溫下溫和混合該懸浮液2分鐘。然后使用一具有約2000G表面磁化強度的永久磁鐵將該等粒子固定且移除上澄液。將這些珠粒再懸浮于洗滌緩沖液(350微升，1.5M NaCl，0.05M Tris-HCl緩沖液，pH8)予以洗滌。在將這些珠粒固定之后，丟棄上澄液且經(jīng)由添加溶析緩沖液(100微升，水)將質(zhì)體DNA脫吸附。最后，將粒子固定且將上澄液轉(zhuǎn)移到一新的無DNase/RNase微型離心管之內(nèi)。溶液中的核酸濃度可以從260納米的吸光度輕易地計算出。
7、瓊脂糖凝膠電泳在一Bio-Rad(Hercules，CA，USA)水平式凝膠電泳單元與使用1kb分子量標準品(Amersham Biosciences)在含有0.5微克/毫升溴化乙錠的0.8％瓊脂糖凝膠上進行電泳分離。所用的操作緩沖液為TAE(40mM Tris，20mM乙酸，1mM EDTA，pH8.0)。該電泳是在100V進行40分鐘。
8、結(jié)合緩沖液的鹽濃度和pH對于質(zhì)體DNA吸附的影響結(jié)合緩沖液的鹽濃度和pH對于質(zhì)體DNA在氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物上的吸附的影響是分別在0.1-4M的NaCl濃度范圍和7.0-9.0范圍內(nèi)的pH評定的。
9、溶析緩沖液的鹽濃度對于質(zhì)體DNA脫吸附的影響溶析緩沖液的鹽濃度對于質(zhì)體DNA從氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物上的脫吸附的影響是在0.1-0.5M的NaCl濃度范圍內(nèi)評定的。
10、最優(yōu)氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物用量知測定為了測定氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物的最優(yōu)用量，將其加到3毫升細菌培養(yǎng)物之內(nèi)。使用于在700至1000微克范圍內(nèi)的數(shù)種量的氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物進行研究。離析質(zhì)體DNA的產(chǎn)率是使用UV光譜光度測定法在260納米，或較佳者，經(jīng)由比較在溴化乙錠染色的瓊脂糖凝膠上脂DNA分離帶所具強度而測定。將所有離析質(zhì)體DNA樣品的260/280納米吸光度比例計算成為純度的量度。
11、限制核酸內(nèi)切酶消化將20微升體積的溶析DNA溶液與制造商的反應(yīng)緩沖液(3微升)，和無菌水(6微升)混合，且與限制核酸內(nèi)切酶(BamHI和EcoRI，1微升，10單位)在37℃下溫置18小時。將消化混合物直接用瓊脂糖凝膠電泳分析。
12、PCR擴增
PCR是使用確定的可目標導(dǎo)引基因輿圖脂插入組件IS900的引子(5’-cgggatccACCGGTCGCCAC-3’和5’-cggaattcGCGGCCGCTTTACTTGTACAGC-3’)實施的。擴增產(chǎn)物的大小為800bp。將10微升的萃取DNA使用MinicyclerTM(MJResearch)加到含有PCR緩沖液的調(diào)合液之中。每一反應(yīng)包含50mM KCl，10mM Tris-HCl pH8.3，1.5mM MgCl2，0.001％(w/v)明膠，5.0微微莫耳的每一種引子，各200μM的每一種脫氧核糖核苷三磷酸鹽(dNTP)，2.5U Ex Tag(Takara)以及0.1微克的pEGFP-N1。循環(huán)條件為20循環(huán)的95℃下1分鐘，60℃一分鐘和72℃一分鐘。將擴增的PCR片段在含有0.5％EtBr的1％瓊脂糖凝膠中進行電泳偵測且以UV照射目視檢驗。
實施例21、磁性粒子的鑒定磁性納米粒子的尺寸和形態(tài)學(xué)是以TEM予以鑒定。圖1顯示出磁性粒子的典型TEM顯微照片。磁性粒子的超順磁性質(zhì)是以SQUID測量的磁化強度曲線予以證實。圖2顯示出在298K的磁化強度對施加磁場的典型標繪圖(M-H回線)。所得Fe3O4磁性粒子的飽和磁化強度為64emu/克Fe3O4。這些磁性粒子的大飽和磁化強度使其對磁場非常敏感，因而使固體相和液體相得以容易地分離。非常微弱的磁滯揭露出所得磁性納米粒子都是近乎超順磁性者。
2、離子強度的影響所用的結(jié)合緩沖液和溶析緩沖液所具鹽濃度和pH可決定DNA是結(jié)合到磁性珠?；驈拇判灾榱Ｈ芪龀?。透過結(jié)合緩沖液和溶析緩沖液的謹慎選擇可達到解決。DNA-納米珠粒交互作用可以透過由離子強度所提供的靜電篩選，以及透過DNA的靜電荷予以調(diào)制，如由溶液的δ電位予以決定者。圖3顯示出氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物懸浮液在不同的鹽濃度和pH所測量到的δ電位。在5.0-9.5的pH范圍內(nèi)隨著鹽濃度從0增加到2.0M，本發(fā)明氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物粒子的δ電位數(shù)據(jù)會從負值(-43mV)急劇地增加到正值(16mV)。眾所周知，DNA因為在核酸骨架上含有磷酸根而為一種聚陰離子性分子，且可以方便地捕捉到用荷正電官能基所衍化的珠粒之上。因此，DNA在氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物上的結(jié)合需要高鹽濃度的存在。在從0至4M的NaCl濃度所進行的試驗中發(fā)現(xiàn)大于或等于2M的鹽濃度可促成最大的結(jié)合。為了測定出離子強度對質(zhì)體DNA從氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物脫吸附的影響，乃在從0至0.5M范圍內(nèi)的數(shù)個NaCl濃度研究溶析緩沖液。其結(jié)果顯示于圖4中，可以看出，增加鹽濃度顯然地會導(dǎo)致脫吸附效用性的減低。沒有NaCl之下，所吸附的質(zhì)體之溶析會明顯地增加。這些結(jié)果與在δ電位上所報告者一致，如圖3中所示。隨著在pH 8下NaCl濃度值從0增加到0.5M，磁性粒子的δ電位值從-40mV急劇地增加到-8mV。由此結(jié)果之故，乃使用水來進行所有的后續(xù)實驗。
3、pH的影響在圖5中顯示出在7.0-9.0范圍內(nèi)的數(shù)個pH進行值體DNA吸附對于溶析緩沖液的pH的相關(guān)性。如所預(yù)料的，pH對于質(zhì)體在氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物上的吸附?jīng)]有明顯影響。這些結(jié)果也與在δ電位上所報告者一致。在沒有NaCl之下，隨著pH從7.0增加到9.0，磁性粒子的δ電位值從-36mV稍微增加到-43mV。由此結(jié)果之故，因此使用pH8.0的溶析緩沖液來進行所有的后續(xù)實驗。
4、氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物的最優(yōu)用量的測定為了測定出氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物的最優(yōu)用量，將其加到3毫升的細菌培養(yǎng)物中。于700至1000微克范圍內(nèi)研究氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物的數(shù)個用量。如圖6和表1中所顯示者，隨著氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物的量從700微克增加到1000微克，從260納米的UV光譜光度測定法所判斷者，溶析出的質(zhì)體DNA的量從19.9微克明顯地增加到43.1微克。此可歸因于吸附之后上澄液中的質(zhì)體DNA之量會從700至1000微克實質(zhì)地減低的事實(沒有顯示出數(shù)據(jù))。另外，也從QIAGEN(Valencia，CA，USA)Spin管柱套組根據(jù)制造商的指示純化質(zhì)體DNA。于此情況中，使用QIAGEN Spin管柱套組從3毫升的細菌培養(yǎng)物溶析出的最大質(zhì)體DNA為約21.3微克。所以，本發(fā)明氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物的純化容量明顯地大于使用市售的以氧化硅為基底的樹脂所可能達到者。對四種不同的樣品，即吸附、洗滌、和脫吸附后的各上澄液，以及從QIAGENSpin管柱所得溶析溶液中的質(zhì)體DNA進行凝膠電泳實驗。為了進行RNA污染的比較，在瓊脂糖電泳中的所有裝載溶液都經(jīng)由添加室溫液丙醇予以沉淀。混合后立即12,000rpm離心5分鐘。使用70％乙醇洗該沉丸且以12,000rpm離心5分鐘。如所知者，質(zhì)體DNA和RNA兩者都是聚陰離子分子，且是透過核酸骨架上的荷負電磷酸殘基與磁性吸附劑上的荷正電官能基交互作用。對于核酸而言，整體電荷為其大小的函數(shù)。被RNase降解的小RNA雜質(zhì)因而預(yù)料會具有低整體電荷。經(jīng)由在溶析緩沖液中使用適當?shù)柠}濃度(2M NaCl)，可以降低溶析出的質(zhì)體DNA中之RNA雜質(zhì)含量，如第七圖中所顯示者。此對于質(zhì)體DNA純化中所使用的良好吸附劑而言是非常重要的。
表1.從本發(fā)明氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物溶析出質(zhì)體DNA與用市售Qiagen Spin管柱套組溶析出質(zhì)體DNA在產(chǎn)率和品質(zhì)上的比較表1

5、純化質(zhì)體DNA的表現(xiàn)所純化出的質(zhì)體DNA可以立即用于下游應(yīng)用之中例如轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)形、限制消化、連接(ligation)、定序(sequencing)與PCR。于一具體實例中，也對所純化出的質(zhì)體DNA檢驗其經(jīng)電轉(zhuǎn)形到細菌細胞內(nèi)的生物學(xué)活性。如圖8中所顯示的，以UV盒偵測其在轉(zhuǎn)形過的大腸桿菌細胞內(nèi)的EGFP表現(xiàn)顯示出在從氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物純化出之后仍然保留DNA片段的生物學(xué)活性。EGFP表現(xiàn)是以螢光顯微術(shù)在轉(zhuǎn)形的大腸桿菌細胞內(nèi)偵測，顯示出在從氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物純化出之后，DNA片段仍然保留的其生物學(xué)活性。于第九圖中，使用兩種限制核酸內(nèi)切酶(BamHI和EcoRI)將純化出的質(zhì)體DNA消化后，進行瓊脂糖電泳分離脂的結(jié)果，導(dǎo)致兩個筆為消化的純化出的質(zhì)體DNA跑得更快的較小簇團(約0.8kb和2.9kb)。經(jīng)純化的質(zhì)體DNA可以使用限制核酸酶予以切斷，此即證實該質(zhì)體DNA的純度。
6、PCR擴增PCR檢定法已在最近成為原樣品中所含各種DNA的快速且敏感的偵測所不可缺少的方法。不過，細胞外和細胞內(nèi)抑制劑時常會干擾檢定。因此，磁性粒子適合用為細胞或DNA的無抑制劑分離。無論如何，這些粒子必須不會干擾PCR，PCR對于目標DNA偵測的敏感度可能會因為該等粒子的制備中所用的某些化合物的存在而受到負面地影響。因此，針對pRSET-EGFP的DNA分離方法進行評估，其中包括經(jīng)PEI改質(zhì)的磁性珠粒，氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物，和QIAGEN Spin管柱。從粒子溶析出的DNA直接用于PCR擴增中。其結(jié)果顯示在圖10中。在從PEI改質(zhì)的磁性珠粒分離出的DNA再PCR中觀察到抑制劑，而溶析后的沉淀可以減輕此問題。氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物和QIAGEN Spin管柱都證明可以更有效地移除抑制性因子。分離出的DNA的量與品質(zhì)都足以供PCR所用。通常，勞力為分離程序的最昂貴成分。使用氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物的分離為最有效且最具成本效益的CAN分離程序。
因此，本發(fā)明所提供的使用氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物分離質(zhì)體DNA的方法具有節(jié)省時間，整體較高的產(chǎn)率，較低的污染與較佳的聚合酶鏈型反應(yīng)(PCR)擴增結(jié)果等效益。所分離出的DNA的量與品質(zhì)都足以供下游應(yīng)用所用。
權(quán)利要求
1.一種使用氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物分離質(zhì)體DNA的方法，其特征在于包括如下步驟A、使用Fe2+和Fe3+鹽和氫氧化銨在氮氣環(huán)境下以化學(xué)沉淀法制備超順磁性氧化鐵納米粒子；B、將四乙氧基硅烷用酸水解產(chǎn)生的氧化硅涂覆在A步驟得到的磁性氧化鐵納米粒子上來制備氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物載體；C、將含質(zhì)體DNA的樣品與上述步驟B所得的氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物載體接觸使其在高鹽條件下吸附到該載體上；D、使用溶析緩沖液將該質(zhì)體DNA從該氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物載體脫吸附，并且使用永久磁體回收該氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物載體，留下的澄清液回收該質(zhì)體DNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的使用氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物分離質(zhì)體DNA的方法，其特征在于在A步驟中，包括如下步驟(1)、將去離子水再次去離子，然后通入氮氣1小時以去除水中氧氣；(2)、將含F(xiàn)e2+和Fe3+離子的化合物在激烈攪拌之下溶解在(1)步驟得到的水中，得到FeCl36H2O和FeCl24H2O；(3)、將步驟(2)得到的含鐵溶液加入堿和脂肪酸激烈攪拌，使用超聲波槽使磁鐵礦粒子稍微分散，然后依序使用丙酮、乙醇和去離子水清洗以去除殘留表面活性劑和未反應(yīng)的藥劑；(4)、得到的磁鐵礦懸浮液可以用于下一步驟中或者予以干燥得到粉末形式的產(chǎn)品。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的使用氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物分離質(zhì)體DNA的方法，其特征在于所述的堿為NaOH，所述的脂肪酸為月桂酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的使用氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物分離質(zhì)體DNA的方法，其特征在于在B步驟中，將步驟(A)得到的磁鐵礦懸浮液在圓底燒瓶內(nèi)以超聲波分散，在激烈機械攪拌之下，加入HCl，反應(yīng)1小時之后，在反應(yīng)混合物中依序加入去離子水、氫氧化銨和四乙氧基硅烷，在70-85℃連續(xù)攪拌之下進行水解5-8小時，用永久磁鐵進行分離，所得產(chǎn)物用去離子水徹底洗滌三次，將氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物以10毫克/毫升濃度貯存于去離子水中。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的使用氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物分離質(zhì)體DNA的方法，其特征在于在B步驟中，將步驟(A)得到的70毫升磁鐵礦懸浮液在圓底燒瓶內(nèi)以超聲波分散，在激烈機械攪拌之下，加入1毫升6N的HCl，反應(yīng)1小時之后，在反應(yīng)混合物中依序加入9.9毫升的去離子水、34毫升的氫氧化銨和98％體積濃度的10.1毫升四乙氧基硅烷，在70-85℃以300-500轉(zhuǎn)/分鐘連續(xù)攪拌之下進行水解6.5-7.5小時，用永久磁鐵進行分離，所得產(chǎn)物用去離子水徹底洗滌三次，將氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物以10毫克/毫升濃度貯存于去離子水中。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的使用氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物分離質(zhì)體DNA的方法，其特征在于在C步驟中，將含質(zhì)體DNA的樣品與氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物在結(jié)合緩沖液中于室溫下混合1-3分鐘，然后使用具有約2000G表面磁化強度的永久磁鐵將粒子固定并且去除上澄液。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的使用氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物分離質(zhì)體DNA的方法，其特征在于所述的結(jié)合緩沖液由0.1-4M的NaCl和0.05M的Tris-HCl組成，溶液的PH為7.0-9.0。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的使用氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物分離質(zhì)體DNA的方法，其特征在于在C步驟中，將含質(zhì)體DNA的樣品放入1.5毫升的無DNase/RNase微型離心管之中，并且加1％(w/v)氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物和100微升結(jié)合緩沖液，組成懸浮液，在室溫下溫和混合該懸浮液2分鐘，然后使用具有約2000G表面磁化強度的永久磁鐵將粒子固定并且去除上澄液。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的使用氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物分離質(zhì)體DNA的方法，其特征在于所述的結(jié)合緩沖液由2M的NaCl和0.05M的Tris-HCl組成，溶液的PH為8.0。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的使用氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物分離質(zhì)體DNA的方法，其特征在于在D步驟中，使用300-400微升洗滌緩沖液將粒子洗滌，并且再用磁鐵固定之后，添加100微升水將質(zhì)體DNA脫吸附，最后，將粒子固定且回收上澄液即完成該質(zhì)體DNA的分離。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的使用氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物分離質(zhì)體DNA的方法，其特征在于洗滌緩沖液由0.1-0.5M的NaCl和0.05M的Tris-HCl組成，其PH值為8。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的使用氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物分離質(zhì)體DNA的方法，其特征在于將上澄液轉(zhuǎn)移到新的無DNase/RNase微型離心管之內(nèi)，溶液中的核酸濃度從260納米的吸光度計算出。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-12之一所述的使用氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物分離質(zhì)體DNA的方法，其特征在于所述的含DNA的生物樣品為微生物包括細菌、真菌、病毒和寄生蟲與類似者，動物和植物的細胞、體液、組織萃取物和類似者，以及病毒、載體、質(zhì)體、黏質(zhì)體和含DNA的其它生物樣品。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-12之一所述的使用氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物分離質(zhì)體DNA的方法，其特征在于所述的含DNA的生物樣品為使用聚合酶鏈型反應(yīng)從pEGFP-N1擴增一完整的綠色螢光蛋白質(zhì)基因，然后使用所得質(zhì)體轉(zhuǎn)形大腸桿菌，再將轉(zhuǎn)形大腸桿菌培養(yǎng)之后，將回收所得細菌用堿包括氫氧化鈉予以溶裂而得的含有質(zhì)體DNA的細菌細胞溶裂物。
15.一種使用權(quán)利要求1-14所述的氧化硅-磁鐵礦納米復(fù)合物分離質(zhì)體DNA的方法所得的質(zhì)體DNA。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種使用氧化硅－磁鐵礦納米復(fù)合物分離質(zhì)體DNA的方法，包括Fe
文檔編號C12N15/10GK1908168SQ20061011162
公開日2007年2月7日 申請日期2006年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月18日
發(fā)明者江禎立, 宋錦珊 申請人:邱良瑛