專利名稱：多肽與編碼這些多肽的核酸和它們用于預防、診斷或治療肝臟失調(diào)和上皮癌的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多肽與編碼這些多肽的核酸和它們用于預防、診斷和/或治療肝臟失調(diào)和致瘤性失調(diào)，特別是肝臟和其他上皮組織的癌、良性肝臟腫瘤如腺瘤和其他增生性肝臟失調(diào)如病灶性結(jié)節(jié)性增生癥(FNH)和肝硬變的用途。本發(fā)明還涉及診斷和治療這些失調(diào)的方法。
背景技術(shù)：
癌的發(fā)展的一般特征是遺傳突變，該突變改變重要的細胞途徑包括，例如，增殖、凋亡(細胞死亡)、對脅迫的應答和上皮/基質(zhì)相互作用的活性。日益認識到在癌中去調(diào)節(jié)的核酸的鑒定可以提供對腫瘤轉(zhuǎn)化機理的重要的新的認識。前癌階段(如肝癌中巨大再生性瘤狀體和“大”和“小”細胞改變)中去調(diào)節(jié)核酸的鑒定可提供對惡性轉(zhuǎn)化中早期事件的理解。類似地，以組織增殖和重塑為特征的失調(diào)(如肝臟中FNH和肝硬變)中去調(diào)節(jié)基因表達的鑒定可以區(qū)分參與增殖和惡性轉(zhuǎn)化的核酸。這些去調(diào)節(jié)的核酸和被編碼的基因產(chǎn)物一起具有作為癌的新診斷標記的潛力。此外，這些去調(diào)節(jié)核酸的產(chǎn)物本身是人類患者中這些失調(diào)的預防和/或治療中治療性干預靶標。
肝臟在蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖類、核酸和維生素代謝中起重要作用。有許多影響肝臟而不能被有效診斷、預防或治療的失調(diào)，如肝細胞癌(HCC)。HCC的檢查尤其好地適于癌中去調(diào)節(jié)的基因表達的鑒定。這是因為HCC的組織樣品可以從手術(shù)切除的腫瘤得到并且該腫瘤是幾乎沒有基質(zhì)組織的被良好局限的實體結(jié)構(gòu)。此外，如上面指出的，可能比較分析良性和惡性腫瘤以及肝硬變-一種非瘤性狀態(tài)。如果本領(lǐng)域中與肝臟失調(diào)相關(guān)的差別表達基因鑒定的局限性可以被克服，那么該比較方法可以使得能夠鑒定與成熟器官中細胞增殖和組織重塑過程(例如，肝硬變)特別相關(guān)的去調(diào)節(jié)的核酸以及鑒定和分辨與增生(如FNH)和良性和惡性瘤(例如，腺瘤和HCC)相關(guān)的基因表達改變。在HCC中對于新的和更好的診斷和治療能力有迫切的需求。肝癌中去調(diào)節(jié)的基因可以與胃腸道的其他癌高度相關(guān)并且實際上與其他瘤(上皮起源的癌)相關(guān)，因為這些組織具有共同的胚胎學起源。
在全球基礎上，肝細胞癌(HCC)屬于最常見的惡性腫瘤，導致每年約1百萬例死亡(Ishak等人，1999.腫瘤病理學圖表冊(Atlas ofTumor Pathology).31卷.Armed Forces Institute of Pathology，華盛頓，DC)。
瘤性肝臟失調(diào)如HCC和許多其他腫瘤的明確診斷依賴于活檢標本的組織病理學評估。一般不采取侵入性手術(shù)方法直到癥狀出現(xiàn)并且那時該疾病通常處于晚期，從而限制了治療性干預選擇。從而，需要改進診斷學和診斷方法。此外，早診斷是關(guān)鍵的但是受到晚發(fā)作或者甚至缺乏特定臨床癥狀的妨礙。診斷時，大多數(shù)HCC腫瘤不再順從手術(shù)切除(除了被包裹的腫瘤或者羽層狀變體)(Chen和Jeng，1997，J.Gastroenterol.Hepatol.12329-34)；而且，它們對細胞抑制療法具有高度抗性(Kawata等人，2001 Br.J.Cancer 84886-91)?？傊?，診斷后一年內(nèi)通常發(fā)生死亡。從而，在該領(lǐng)域中高度希望HCC的早檢測標記、預防指示劑，和有效預防和/或治療方案。
相反，不像結(jié)直腸癌中充分研究的狀況，肝臟腺瘤不可能代表HCC的前體病變。類似地，雖然肝硬變和肝炎病毒感染是HCC的明顯危險因素，但是這些病癥不是發(fā)生HCC的前提。某些肝病變?nèi)缇薮笤偕孕〗Y(jié)節(jié)性增生可能代表HCC前期階段，但是這還沒有被證實(Shortell和Schwartz，1991，Surg Gynecol Obstet.173426-31；Anthony，P.in MacSween等人，編者Pathology of the Liver.2001，ChurchillLivingstone，Edinburgh)。盡管通過肝臟切除術(shù)和肝臟活檢的組織病理學研究可以診斷這些失調(diào)，但是沒有有效方法可以更早或者非侵入性檢測這些狀態(tài)。再一次迫切需要這些瘤的診斷和預后標記和這些失調(diào)的非侵入性檢測。
在過去的十年中，一些技術(shù)已經(jīng)使得可能同時監(jiān)視細胞內(nèi)許多轉(zhuǎn)錄物的表達水平(見，例如，Schena等人，1995，Science 270467-470；Lockhart等人，1996，Nature Biotechnology 141675-1680；Blanchard等人，1996，Nature Biotechnology 14，1649；1996，US 5.569.588)。轉(zhuǎn)錄物陣列技術(shù)已經(jīng)被用于鑒定在各種失調(diào)狀態(tài)中被上調(diào)或下調(diào)的基因。一些最近的研究已經(jīng)利用該技術(shù)檢查HCC中基因表達的變化。這些研究已經(jīng)不同地揭示了相對于對照HCC細胞系和HCC組織中編碼肝臟特定蛋白質(zhì)的基因的去調(diào)節(jié)(例如，過表達和表達不足)。此外，研究揭示了細胞周期控制、脅迫應答、凋亡、脂質(zhì)代謝、細胞-細胞-相互作用、DNA修復和細胞因子和生長因子產(chǎn)生所必需的基因(Graveel等人，2001，Oncogene 202704-12；Kawai等人，2001，Hepatology33676-91；Lau等人，2000，Oncol.Res.1259-69；Nagai等人，1998，Cancer 82454-61；Okabe等人，2001，Cancer Res 612129-37；Salwcci等人，1999，Oncogene 18181-187；Shirota等人，2001，Hepatology 33832-40；Tackels-Horne等人，2001，Cancer 92395-405；Wu等人，2001，Oncogene 202674-3682；Xu等人，2001，Cancer Res.613176-81)。然而，在這些研究中報導的基因表達模式中沒有一致性，這可能是由于實驗設計中的不同和/或由于HCC組織本身的異質(zhì)性。而且，這些HCC的病原學是一個重要的因素慢性乙肝和丙肝病毒感染是HCC的主要原因但是也認識到酒精和慢性肝代謝失調(diào)導致HCC并且造成來自這些不同病原學的腫瘤發(fā)展的機理可能不同。合起來看，直到現(xiàn)在還沒有開發(fā)出滿意的診斷學和診斷方法以便能夠干預肝臟失調(diào)。
同樣的情況應用于肝臟失調(diào)和上皮癌的療法。例如，對于HCC，除了切除和移植，沒有有效的治療選擇，但是切除和移植方法僅僅可應用于HCC的早期，受到得到供體肝臟的限制，并且與患者的嚴重風險相關(guān)。此外，這些方法極端昂貴。這些癌對化療應答極弱，最可能是由于解毒和輸出有害化合物的正常肝功能。一些其他治療選擇，如化療栓塞(chemoembolization)、冷凍療法和乙醇注射仍然處于實驗階段并且還沒有確立這些方法的功效。手術(shù)干預仍然是最好的治療選擇但是不可能精確限定腫瘤的程度。因此，該侵入性方法從治療觀點看不是最佳的。此外，特定肝臟功能異常的早期診斷學的缺乏最常導致疾病的進一步發(fā)展，其進一步混淆治療選擇并顯著地增加這些疾病的患者死亡率(Jansen P.L.，1999，Neth.J.Med.55287-292)。從而，直到現(xiàn)在還沒有開發(fā)出令人滿意的療法以便能夠干預肝臟失調(diào)，和其他上皮癌。此外，在本領(lǐng)域狀態(tài)中，通過差別基因表達揭示的肝臟失調(diào)的不同亞型如HCC前體病變、良性肝臟瘤，和代謝性肝臟疾病如酒精肝臟疾病和肝硬變的識別還沒有被公開。在表1中提供了本發(fā)明中評定的一些失調(diào)的關(guān)鍵疾病特征的概要。
表1疾病特征

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及多肽與編碼這些多肽的核酸和它們用于預防、診斷和/或治療肝臟失調(diào)，特別是肝細胞癌(HCC)，和上皮癌、前癌性肝臟病變、良性瘤如腺瘤，和其他增生性肝臟失調(diào)如病灶性結(jié)節(jié)性增生癥(FNH)和肝硬變的用途，這些預防、診斷和/或治療克服了本領(lǐng)域中的局限性。本發(fā)明還涉及含有這些核酸的載體和細胞，還涉及針對所述多肽和核酸的抗體或抗體片段。
本發(fā)明還涉及診斷和治療這些失調(diào)的方法。多種失調(diào)的評定具有重疊但是明顯的形態(tài)學和臨床特征，該評定為鑒定和辨別根據(jù)本發(fā)明的這些失調(diào)和最后關(guān)于這些失調(diào)的新的治療策略提供了新的信息。
發(fā)明詳述本發(fā)明中使用的一種獨特方法利用了不同的、病理學家證實的肝癌病理，其用于產(chǎn)生與非-癌性人肝臟庫相比富含在HCC中被特異上調(diào)或下調(diào)的基因的疾病特異的cDNA文庫。該文庫在基因組范圍內(nèi)代表HCC中去調(diào)節(jié)的基因表達并因此包括所有潛在的HCC去調(diào)節(jié)基因。用來自許多額外的不同的、病理學家證實的肝癌樣品(HCCs)和非惡性肝病變的被標記表達的核酸與這些文庫克隆反復雜交指出在HCC中被高度去調(diào)節(jié)的核酸。令人驚奇的發(fā)現(xiàn)是該方法提供了以前沒有被鑒定的去調(diào)節(jié)核酸以及以前不與HCC相關(guān)的許多去調(diào)節(jié)的核酸，這些核酸上升的表達也可以與其他癌相關(guān)。這些HCC去調(diào)節(jié)的基因和蛋白質(zhì)是本發(fā)明的主題。
篩選和檢定策略由于參數(shù)的精細且限定的選擇而自身具有創(chuàng)造性。根據(jù)本發(fā)明的差別表達的基因的鑒定依賴于組織病理學上可區(qū)分的肝臟疾病組織，其用于人肝臟疾病中基因表達變化的比較。也通過診斷確定用于實驗的非-患病的參比肝臟樣品。
通過肝臟失調(diào)、肝癌和/或上皮癌的一種診斷方法解決了本發(fā)明的目的，其中選自根據(jù)SEQ ID 1到SEQ ID 9和/或SEQ ID 47(表2)的序列的多肽、其功能變體、編碼前述多肽之一的核酸、前述核酸之一的變體、針對前述多肽或其變體之一的抗體或抗體片段的至少一種化合物在患者的樣品中被鑒定并且與參比文庫或參比樣品的至少一種化合物相比較。
還通過治療患有肝臟失調(diào)或上皮癌的患者的一種方法解決了本發(fā)明的目標，其中選自根據(jù)SEQ ID 1到SEQ ID 9和/或SEQ ID 47的多肽、前述多肽之一的功能變體、編碼前述多肽之一的核酸，或者其功能變體、前述核酸之一的變體、為前述核酸之一的非功能突變變體的核酸、具有與前述核酸之一互補的序列的核酸、含有前述核酸之一的載體、含有前述核酸之一的細胞、含有前述載體的細胞、針對前述多肽或其功能變體之一的抗體或者前述抗體片段、含有編碼前述抗體之一的核酸的載體、含有編碼前述抗體片段之一的核酸的載體、含有含有編碼前述抗體之一的核酸的載體的細胞和含有含有編碼前述抗體片段之一的核酸的載體的細胞中的至少一種組分被以治療有效量施用于需要這種治療的患者。
本發(fā)明的另一方面提供了藥物組合物，其含有選自根據(jù)本發(fā)明的多肽、其功能變體、編碼該多肽的核酸、前述核酸之一的變體、為前述核酸之一的非功能突變變體的核酸、具有與前述核酸之一互補的序列的核酸、含有前述核酸之一的載體、含有前述核酸之一的細胞、含有前述載體的細胞、針對前述多肽之一的抗體、針對前述多肽之一的功能變體的抗體、前述抗體之一的片段、含有編碼前述抗體之一的核酸的載體、含有編碼前述抗體片段之一的核酸的載體、含有含有編碼前述抗體之一的核酸的載體的細胞和含有含有編碼前述抗體片段之一的核酸的載體的細胞中的至少一種組分，該組合物被以治療有效量施用于需要這種治療的患者。
根據(jù)本發(fā)明的多肽的記錄號和它們的cDNAs在表2中顯示。
表2來自GenBank數(shù)據(jù)庫的核酸和多肽與它們各自的SEQ ID號和記錄號。

通過RT-PCR分析已經(jīng)表明根據(jù)本發(fā)明的這些核酸和多肽的一個子集在上皮起源的其他癌中并優(yōu)選不在相應的正常人組織中被特異表達或去調(diào)節(jié)。這些核酸優(yōu)選包括SEQ ID NO11到16和19(在表6和圖3中提供)。肝癌中的去調(diào)節(jié)核酸優(yōu)選與胃腸道的其他癌高度相關(guān)，因為這些組織具有共同的胚胎學起源。因此，這些核酸和所編碼的多肽可以優(yōu)選被類似地用于診斷的診斷學方法、藥物組合物和預防和/或治療這些上皮癌的方法。
根據(jù)本發(fā)明的多肽和核酸的共同之處是與參比樣品相比它們在從患有根據(jù)本發(fā)明的失調(diào)的患者中分離的樣品中差別表達。根據(jù)本發(fā)明的多肽和核酸的調(diào)節(jié)是病理過程必需的并且從而與根據(jù)本發(fā)明的失調(diào)的診斷、預防和/或治療有直接或間接的關(guān)系。根據(jù)本發(fā)明的多肽和核酸不屬于直到現(xiàn)在所知道的靶標從而從本發(fā)明得到令人驚奇的并且全新的診斷和治療方法。
通常，組織中差別表達的基因的分析比細胞培養(yǎng)系統(tǒng)的分析較少可能導致人為假陽性克隆形式的誤差。除了現(xiàn)有的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)不能充分模擬組織中的病理學過程的復雜性這一事實外，培養(yǎng)環(huán)境中細胞行為的變化也導致核酸和多肽表達模式與實際的病理狀態(tài)可疑的聯(lián)系。通過利用正常的和患病人組織中的基因表達，這些問題可能較不顯著，但是多變量再次混淆了直接與疾病相關(guān)的差別基因表達的清楚鑒定。例如，差別表達的核酸可以來自個體間差異、代謝狀態(tài)和/或臨床治療范例。此外，使用cDNA微陣列的大規(guī)?；虮磉_研究不能指出基因表達中變化的細胞來源。此外，包括所有或多數(shù)基因的差別基因表達研究產(chǎn)生非常大量的數(shù)據(jù)，它們使關(guān)鍵疾病-相關(guān)的基因表達變化的鑒定變得混淆不清。因此，包括來自僅僅一般定義(例如，肝臟腫瘤的)的肝臟失調(diào)的組織的基因表達的大規(guī)模描繪(profiling)的方法不可能闡明與該疾病過程相關(guān)的關(guān)鍵基因，并且就是這些關(guān)鍵基因代表診斷學和治療干預的最好靶標。
由于這些困難，所以篩選的成功嚴重依賴于實驗參數(shù)的選擇。盡管所用的方法基于成熟的步驟，但是篩選和證實策略由于參數(shù)的精細和限定的選擇而本身已經(jīng)具有創(chuàng)造性。本發(fā)明中使用的一種獨特方法利用了不同的、病理學家證實的肝癌病理，其用于產(chǎn)生與非癌性人肝臟庫相比富含在HCC中被特異上調(diào)或下調(diào)的基因的疾病特異的cDNA文庫。用于實驗的非患病參比肝樣品也通過診斷確定并合并三個獨立的樣品以減少個體間變化導致的假陽性的檢測。在參比肝臟庫和患病肝臟(即，HCC)中通常以類似水平表達的核酸通過產(chǎn)生扣除抑制雜交(subtractive suppressive hybridization)(SSH)cDNA文庫(Diatchenko等人，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 936025-6030)而被除去。這些cDNA高度富含在HCC中被上調(diào)和下調(diào)的核酸但是不代表未差別表達的那些核酸。數(shù)千SSH克隆的每一種都通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增并被固定到定制的cDNA微陣列中的載玻片上。來自額外的病理學家證實的肝臟失調(diào)的RNA被轉(zhuǎn)化成熒光標記的cDNA，其用于與微陣列上合并的未患病肝臟RNA競爭性雜交。所得雜交強度的比例揭示了肝臟失調(diào)中被特異下調(diào)的核酸。除了提供高度富含差別表達的基因的候選cDNA庫之外，SSH文庫還在基因組范圍規(guī)模內(nèi)代表大多數(shù)(如果不是全部)差別表達的基因，這些基因的克隆比標準cDNA文庫中的要少得多。該特征因此集中于在疾病中被特異下調(diào)的核酸。本發(fā)明中產(chǎn)生的SSH文庫包括來自基本不在正常肝臟中表達并因此不在常規(guī)cDNA文庫中或者基因組規(guī)模的cDNA微陣列上提供的核酸的cDNA克隆。
通過序列特異的定量RT-PCR(Q-PCR)對RNA水平的獨立分析，證實與正常肝臟相比肝臟失調(diào)組織中根據(jù)本發(fā)明的序列的過表達(圖2)。在這些驗證實驗中，相應于根據(jù)本發(fā)明的序列的細胞RNA水平的PCR產(chǎn)物通過特定PCR產(chǎn)物的熒光檢測來監(jiān)視。通過TaqMan方法中的序列特異的水解探針寡核苷酸(引物)或者通過熒光雙鏈DNA結(jié)合染料如SYBR綠提供熒光信號。通過與“管家”基因包括甘油醛脫氫酶(GAPDH)和β-肌動蛋白的水平比較將相應于本發(fā)明序列的PCR產(chǎn)物的水平關(guān)于實驗變異性標準化，“管家”基因被認為在疾病或下面的實驗操作中是相對不變的。這些Q-PCR步驟也用于測量實驗條件中基因表達的水平例如當根據(jù)本發(fā)明的一種序列的水平在實驗上隨著小干擾RNA寡核苷酸降低的情況(圖6，表10)。用于TaqMan Q-PCR分析的參比基因引物是GAPDH-p1，SEQ ID 56；GAPDH-p2，SEQ ID 57；GAPDH-p3，SEQ ID 58；bActin-p1，SEQ ID 59；bActin-p2，SEQ ID 60；和bActin-p3，SEQ ID 61。用于SYBR綠分析的參比基因引物是bActin-p4，SEQ ID 62；和bActin-p5，SEQ ID 63。Q-PCR實驗中相對于這些管家基因的RNA水平的確定，根據(jù)Pffafl的方法(NucleicAcids Research(2001)5月1日，29(9)e45)進行。這些技術(shù)是本領(lǐng)域中技術(shù)人員熟知的。
此外，根據(jù)本發(fā)明的HCC去調(diào)基因的表達與靜止細胞的8小時和12小時血清刺激后肝細胞瘤細胞(Hep3B)的增殖有關(guān)(圖8)。該發(fā)現(xiàn)支持如下提議根據(jù)本發(fā)明的序列的過表達對于增殖性肝臟失調(diào)如肝癌在功能上是重要的。
與本領(lǐng)域狀態(tài)相比，這些多肽和核酸令人驚奇地允許肝臟失調(diào)和/或上皮癌的改良的、更敏感、更早、更快、和/或非侵入性的診斷。根據(jù)本發(fā)明的核酸和多肽可用于肝臟失調(diào)和上皮癌的診斷、預防和治療。
本發(fā)明涉及含有根據(jù)SEQ ID 2的序列的多肽，或者其功能變體。本發(fā)明還涉及編碼該多肽，或者其功能變體的核酸，尤其涉及根據(jù)SEQID 11的核酸和其變體。
在優(yōu)選的實施方案中，該多肽由根據(jù)SEQ ID 2的序列組成。在另一優(yōu)選的實施方案中，該核酸由根據(jù)SEQ ID 11的序列組成。
與本領(lǐng)域狀態(tài)相比，這些多肽和核酸令人驚奇地允許肝臟失調(diào)和/或上皮癌的改良的、更敏感、更早、更快、和/或非侵入性診斷。
在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明涉及根據(jù)SEQ ID 1到9和/或SEQ ID47的多肽、該多肽的功能變體、編碼前述多肽之一的核酸、編碼功能變體的核酸、前述核酸之一的變體、為前述核酸之一的非功能突變變體的核酸、具有與前述核酸之一互補的序列的核酸、含有前述核酸之一的載體、含有前述核酸之一的細胞、含有前述載體的細胞、針對前述多肽之一的抗體、針對前述多肽之一的功能變體的抗體、前述抗體之一的片段、含有編碼前述抗體之一的核酸的載體、含有編碼前述抗體片段之一的核酸的載體、含有含有編碼前述抗體之一的核酸的載體的細胞、和/或含有含有編碼前述抗體片段之一的核酸的載體的細胞的至少一種用于根據(jù)本發(fā)明的失調(diào)的診斷、預防和/或治療。本發(fā)明的其他實施方案在下面詳述。
當與肝臟失調(diào)，和/或上皮癌的療法的本領(lǐng)域狀況相比時，這些組分的使用令人驚奇地提供了對根據(jù)本發(fā)明的失調(diào)的改良的、持續(xù)的和/或更有效的診斷、預防和/或治療。
術(shù)語“多肽”指根據(jù)本發(fā)明的多肽的全長。在優(yōu)選的實施方案中，術(shù)語“多肽”還包括分離的多肽和通過重組方法制備的多肽，例如，通過從樣品分離和純化，通過篩選文庫和通過常規(guī)方法進行蛋白質(zhì)合成，所有這些方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。優(yōu)選地，可以合成全長多肽或其部分，例如，通過常規(guī)合成如Merrifield技術(shù)合成。在另一優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的多肽的部分可用于得到抗血清或特異單克隆抗體，它們可用于篩選合適的基因文庫，所制備的基因文庫用于表達編碼的蛋白質(zhì)序列以鑒定根據(jù)本發(fā)明的多肽的其他功能變體。
術(shù)語“根據(jù)本發(fā)明的多肽”指根據(jù)SEQ ID 1到SEQ ID 9和/或SEQID 47的多肽(表2)。
術(shù)語多肽的“功能變體”在本發(fā)明的意義內(nèi)指與具有根據(jù)SEQ ID 1到SEQ ID 9和/或SEQ ID 47之一的氨基酸序列的多肽具有約70％、優(yōu)選約80％，尤其約90％，特別約95％，最優(yōu)選98％的序列同源性，尤其是序列同一性的多肽。這些功能變體為，例如，與根據(jù)本發(fā)明的多肽同源的多肽，它們來自非人生物，優(yōu)選來自非人哺乳動物如，例如，小鼠、大鼠、猴子和豬。功能變體的其他實例為不同個體中、生物的不同器官中或者不同發(fā)育階段中不同等位基因編碼的多肽。功能變體，例如，還包括被從非肝臟組織，例如，胚胎組織，分離的核酸編碼，但是在與肝臟失調(diào)相關(guān)的細胞中表達后具有指定的功能的多肽。功能變體優(yōu)選還包括天然發(fā)生的或合成的突變，尤其是定量地改變這些序列編碼的肽的活性的突變。此外，這些變體可以優(yōu)選來自編碼基因的差別剪接。
“功能變體”指與根據(jù)本發(fā)明的相應多肽具有基本相同的生物學功能的多肽。這種生物學功能可以在功能測定法中測定。
為了檢驗候選多肽是否是根據(jù)本發(fā)明的多肽的功能變體，候選多肽可以在本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的功能測定法中分析，該測定法適于測定根據(jù)本發(fā)明的相應多肽的生物學功能。這種功能測定法包括例如細胞培養(yǎng)系統(tǒng)；其中基因被缺失(“敲除)的小鼠或?qū)τ诰幋a候選多肽的基因是轉(zhuǎn)基因的小鼠；酶測定法等。如果候選多肽展示或者直接干擾與根據(jù)本發(fā)明的相應多肽基本相同的生物學功能，那么該候選多肽是相應多肽的功能變體，條件是該候選多肽滿足上面提到的％序列同一性水平的要求。
此外，術(shù)語“功能變體”包括相對于參比樣品或者參比文庫，在患有肝臟失調(diào)，或者其他上皮癌的患者中優(yōu)選差別表達的多肽，包括從突變基因或者從差別剪接的基因表達的多肽，條件是候選功能變異多肽在％序列同一性水平上滿足功能變體的標準。這種表達分析可以通過本領(lǐng)域中技術(shù)人員公知的方法實施。
多肽的“功能變體”還可以是根據(jù)本發(fā)明的多肽的部分，其長度至少為約7到約1000個氨基酸，優(yōu)選至少10個氨基酸，更優(yōu)選至少20個，最優(yōu)選至少50個，例如至少100個，例如至少200個，例如至少300個，例如至少400個，例如至少500個，例如至少600個氨基酸，條件是它們具有與根據(jù)本發(fā)明的相應多肽基本相同的生物學功能。還包括根據(jù)本發(fā)明的多肽的缺失，缺失的范圍為約1-30，優(yōu)選約1-15，尤其約1-5個氨基酸，條件是它們具有與根據(jù)本發(fā)明的相應多肽基本相同的生物學功能。例如，可以缺少第一個氨基酸甲硫氨酸而不顯著改變該多肽的功能。而且，在變體中可以存在翻譯后修飾，例如，脂質(zhì)錨定或者膦?；拇嬖诨蛉笔?。
“序列同一性”指兩條序列的同一性程度(％同一性)，對于多肽其可以通過例如BLASTP 2.0.1確定，對于核酸可以通過例如BLASTN2.014確定，其中Filter設為關(guān)并且BLOSUM為62(Altschul等人，1997，Nucleic Acids Res.，253389-3402)。
“序列同源性”指通過例如BLASTP 2.0.1確定的兩條多肽序列的相似性(％陽性)，BLASTP 2.0.1中Filter設為關(guān)并且BLOSUM為62(Altschul等人，1997，Nucleic Acids Res.，253389-3402)。
術(shù)語“肝臟失調(diào)”表示并包括優(yōu)選影響肝臟的解剖學、生理學、代謝的和/或遺傳活動，優(yōu)選影響新肝臟細胞的產(chǎn)生，和/或肝臟的再生的所有類型的失調(diào)，這些失調(diào)作為整體或者其部分優(yōu)選短暫地、暫時地、長期地或永久地處于病理途徑中。優(yōu)選還包括遺傳的肝臟失調(diào)和癌性肝臟失調(diào)。肝臟失調(diào)被進一步理解為優(yōu)選包括損傷、中毒、尤其是酒精、藥物或食物中毒、輻射、感染、膽汁郁積、免疫反應，和遺傳的代謝肝臟疾病導致的肝臟失調(diào)。肝臟失調(diào)的優(yōu)選實例包括肝硬變、酒精肝疾病、慢性肝炎、成爾遜病和血色素沉著。優(yōu)選還包括自身免疫失調(diào)，其中自身免疫應答針對至少一種根據(jù)本發(fā)明的多肽。在本發(fā)明的意思內(nèi)，術(shù)語“肝臟失調(diào)”優(yōu)選還包括肝癌，例如，肝細胞癌(HCC)、良性肝腫瘤如腺瘤和/或FNH。HCC優(yōu)選還包括所提到的失調(diào)的亞型，包括以細胞內(nèi)蛋白質(zhì)內(nèi)含體為特征的肝癌、以肝細胞脂肪變性為特征的HCC和纖維層的HCC。例如，癌前病變優(yōu)選還包括如以肝細胞增大(“大細胞”改變)為特征的病變，和以肝細胞減小(“小細胞”改變)以及巨大再生(增生的)的小結(jié)為特征的病變(Anthony，P.in MacSween等人，編輯Pathology of the Liver.2001，ChurchillLivingstone，Edinburgh)。
術(shù)語“上皮癌”在本發(fā)明意思內(nèi)包括除了肝臟之外的任何器官，優(yōu)選肺、胃、腎、結(jié)腸、前列腺、皮膚和乳腺的腺癌，并且指這些器官的失調(diào)，在這些器官中組織的上皮細胞組分被轉(zhuǎn)化，導致根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的標準診斷方法鑒定的惡性腫瘤。
在本發(fā)明的意思內(nèi)，術(shù)語“根據(jù)本發(fā)明的失調(diào)”包括如上定義的上皮癌和肝臟失調(diào)。
對于多肽，術(shù)語“多肽的差別表達”指與參比樣品或者參比文庫中多肽的表達相比，來自患者的分離樣品中多肽的表達的相對水平。該表達可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法確定。這些方法的實例包括用對多肽特異的抗體對該多肽進行的免疫組織化學或免疫印跡或ELISA檢測。優(yōu)選還包括通過遺傳操作以標記多肽并在模型體系中檢測進行該多肽的檢測，如通過在用于在模型系統(tǒng)中表達的轉(zhuǎn)基因中標記多肽。
術(shù)語“樣品”指生物材料，其包括肝臟組織或肝細胞，優(yōu)選來自受到惡性轉(zhuǎn)化的另一器官的組織或者來自該器官的細胞、血液、血清、血漿、腹水、胸膜積液、腦脊液、唾液、尿、精液或糞便。
通過包括侵入性或非侵入性方法的方法可以從患者或者另一受試者分離樣品。侵入性方法是技術(shù)人員公知的并且包括例如通過穿刺分離樣品、從打開的身體或者通過內(nèi)窺鏡儀器手術(shù)去除樣品。最小的侵入性和非侵入性方法也是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的并且包括例如，收集體液如血液、血清、血漿、腹水、腦膜液和腦脊液、唾液、尿、精液和糞便。非侵入性方法優(yōu)選不需要穿刺或者通過不同于天然存在的身體開口如口、耳、鼻、直腸、尿道和創(chuàng)口的開口打開患者或者受試者身體。
術(shù)語“最小侵入性”方法指為了得到患者樣品材料本領(lǐng)域中特別是技術(shù)人員公知的方法，該方法不需要麻醉，可以在醫(yī)務室或者診所中常規(guī)地完成并且或者不疼痛或者僅僅微痛。最小侵入性方法的最常見實例是靜脈穿刺(venupuncture)。
術(shù)語“參比樣品”指用以評價從患者中分離的給定樣品中根據(jù)本發(fā)明的核酸和/或多肽的差別表達作為適宜對照的樣品；這種適宜參比樣品的選擇是本領(lǐng)域中技術(shù)人員公知的。參比樣品的實例包括從相同患者或者另一受試者的非患病器官或組織或細胞分離的樣品，其中非患病器官或組織或細胞選自肝臟組織或肝臟細胞、血液，或者上面描述的樣品。為了與從肝臟失調(diào)患者分離的樣品中的表達比較，參比樣品還可以包括從不同患者的非患病器官或者組織或者細胞分離的樣品，其中肝臟失調(diào)的組織或細胞選自上面列出的樣品組。此外，參比可以包括來自健康供體，優(yōu)選與患者的年齡和性別匹配的健康供體的樣品。
術(shù)語“參比文庫”指展示所表達基因的克隆的文庫，該文庫優(yōu)選從非患病肝組織或細胞制備。參比還可以來自非患病肝臟組織或細胞的mRNA并且可以包括含有關(guān)于核酸的非患病組織表達數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫。為了比較從具有失調(diào)的肝臟患者分離的樣品中根據(jù)本發(fā)明的核酸或多肽的表達，參比文庫可以含有從肝臟失調(diào)的患病肝臟組織或者細胞制備的表達文庫和含有關(guān)于核酸的肝臟失調(diào)的特異表達數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫。
術(shù)語“患者”在本發(fā)明意思內(nèi)包括死亡的或活的動物，優(yōu)選哺乳動物，和人?；颊呋蛘呋加懈闻K失調(diào)，和/或其他上皮癌，或者受肝臟失調(diào)和/或其他上皮癌的分析、預防措施、治療和/或診斷的影響。
術(shù)語“受試者”在本發(fā)明范圍內(nèi)包括，死亡的或活的動物，優(yōu)選哺乳動物，和人，它們不患有肝臟失調(diào)和/或其他上皮癌并從而代表用于確定患者中根據(jù)本發(fā)明的核酸和/或多肽的差別表達的優(yōu)選的合適對照。
術(shù)語“有效治療”在本發(fā)明意思內(nèi)指優(yōu)選治愈患者的至少一種根據(jù)本發(fā)明的失調(diào)和/或關(guān)于與該失調(diào)相關(guān)的至少一種癥狀，優(yōu)選3種癥狀、更優(yōu)選5種癥狀、最優(yōu)選與該失調(diào)相關(guān)的10種癥狀；優(yōu)選基于短暫的、短期的(數(shù)小時到數(shù)天)、長期的(數(shù)周、數(shù)月或數(shù)年)或者永久的基礎，改善患者的病理狀況的治療，其中病理狀況的改善情況可以優(yōu)選為不變的、漸增的、漸減的、不斷改變的或者擺動的，只要總效果與對照患者相比是顯著改善的。治療效能和毒性，例如，ED50和LD50可以通過細胞培養(yǎng)或?qū)嶒瀯游镏袠藴实乃幚韺W方法確定。治療和毒性效果之間的劑量比為治療指數(shù)并且可通過比例LD50/ED50表達。優(yōu)選顯示出大治療指數(shù)的藥物組合物。必須根據(jù)所治療的單個患者的年齡、體重和狀況，以及施用途徑、劑量形式和方案、所希望的結(jié)果調(diào)整劑量，并且精確的劑量當然應該由執(zhí)業(yè)醫(yī)師決定。
實際的劑量依賴于所治療的失調(diào)的性質(zhì)和嚴重性，在醫(yī)生的判斷力之內(nèi)，并且隨著為產(chǎn)生所希望的治療效果本發(fā)明的特定環(huán)境中劑量的滴度而變。然而，現(xiàn)今預期每劑含有約0.1到500mg，優(yōu)選約1到100mg，最優(yōu)選約1到10mg活性成分的藥物組合物適于治療性治療。
活性成分可以每天以一個或幾個劑量施用。滿意的結(jié)果可以，在一些情況中，在靜脈內(nèi)(i.v)0.1μg/kg和經(jīng)口地(p.o.)1μg的低劑量下得到。優(yōu)選的范圍為0.1μg/kg/天到約10mg/kg/天i.v.和1μg/kg/天到約100mg/kg/天p.o.。
本發(fā)明的另一方面涉及含有根據(jù)SEQ ID 1到9和/或SEQ ID 47的多肽的融合蛋白質(zhì)，或者其功能變體。
“融合蛋白質(zhì)”指多肽，其含有至少一種根據(jù)SEQ ID 1到9和/或SEQ ID 47的多肽、其功能變體或部分和選自通過本領(lǐng)域中技術(shù)人員公知的共價或非共價結(jié)合如，例如，氫鍵結(jié)合到根據(jù)本發(fā)明的多肽的多肽、肽和/或肽類似物的至少一種組分A。融合蛋白質(zhì)的組分A的優(yōu)選實例為多肽、肽和/或肽類似物，其使該融合蛋白質(zhì)更易檢測；這些實例為，例如，“綠色熒光蛋白質(zhì)”，或者其變體。還包括方便了重組蛋白質(zhì)的純化的融合蛋白質(zhì)如“his-標簽”，或者增加蛋白質(zhì)的免疫原性的融合。
根據(jù)本發(fā)明的融合蛋白質(zhì)可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法產(chǎn)生。根據(jù)本發(fā)明的融合蛋白質(zhì)可用于肝臟失調(diào)和/或上皮癌的診斷、預防和/或治療。
與本領(lǐng)域的狀況相比，這些融合蛋白質(zhì)令人驚奇地允許肝臟失調(diào)和/或上皮癌的改良的、更敏感、更早、更快、和/或非侵入性的診斷和/或改良的、持續(xù)的和/或更有效的治療。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選核酸具有根據(jù)SEQ ID 10到SEQ ID No.19之一的序列，或者其變體。本發(fā)明尤其涉及已經(jīng)分離的根據(jù)本發(fā)明的核酸。
與本領(lǐng)域狀況相比，這些核酸和多肽令人驚奇地允許肝臟失調(diào)和/或上皮癌的改良的、更敏感、更早、更快、和/或非侵入性的診斷和/或改良的、持續(xù)的和/或更有效的治療。
術(shù)語“根據(jù)本發(fā)明的核酸”指相應于SEQ ID 10到SEQ ID 19的核酸和/或其變體。
術(shù)語“編碼核酸”涉及編碼根據(jù)本發(fā)明的可分離的生物活性多肽或者其前體的DNA序列。該多肽可被全長序列或者該編碼序列的部分所編碼，只要生物功能，如例如受體-活性，被基本上保留(參考功能變體的定義)。
公知上述核酸的序列中可以存在小的改變，例如，由于遺傳密碼的簡并性，或者未翻譯的序列可以粘附到核酸的5’和/或3’末端而不顯著影響所編碼多肽的活性。本發(fā)明因此還包括上述核酸的所謂天然發(fā)生的和人工產(chǎn)生的“變體”。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明使用的核酸為DNA或RNA，優(yōu)選DNA，尤其是雙鏈DNA。根據(jù)本發(fā)明的核酸尤其可以是RNA分子，優(yōu)選單鏈或雙鏈RNA分子。核酸的序列可以還含有至少一個內(nèi)含子和/或一個polyA序列。
根據(jù)本發(fā)明的核酸可以通過技術(shù)人員公知的方法產(chǎn)生并且也已經(jīng)在下面詳述。
在本發(fā)明的意思內(nèi)“變體“指與DNA序列互補的所有DNA序列，其在嚴格條件下與參比序列雜交并且具有相應于根據(jù)本發(fā)明的多肽的類似活性。根據(jù)本發(fā)明的核酸也可以以它們的反義序列的形式使用。
核酸的“變體”也可以與來自其他物種的核酸同源，序列同一性優(yōu)選為80％，尤其是90％，最優(yōu)選95％。
核酸的“變體”也可以是根據(jù)本發(fā)明的核酸的部分，其長為至少約8個核苷酸，優(yōu)選至少約16個核苷酸，尤其至少約21個核苷酸，更優(yōu)選至少約30個核苷酸，甚至更優(yōu)選至少約40個核苷酸，最優(yōu)選至少約50個核苷酸，只要這些部分具有與根據(jù)本發(fā)明的相應多肽類似的活性。這些活性可以使用上面描述的功能測定法測定。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，核酸含有具有與根據(jù)本發(fā)明的核酸互補的序列的核酸，或者其變體。該核酸優(yōu)選含有根據(jù)本發(fā)明的核酸的非功能突變變體，或者其變體。
本發(fā)明尤其涉及具有互補序列的核酸，其中該核酸是反義分子或者RNA干擾分子。
術(shù)語“核酸的非功能突變變體”指從根據(jù)本發(fā)明的核酸得到的核酸或者其變體，該核酸已經(jīng)被突變從而該核酸的非功能突變變體編碼的多肽顯示出與未突變的多肽相比顯著降低或被消除的生物學活性。非功能突變的變體核酸編碼的多肽的這種活性可以通過如上述用于評價功能變體的功能測定法確定。從根據(jù)本發(fā)明的核酸得到的這種非功能突變的變體的構(gòu)建和篩選是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。這種根據(jù)本發(fā)明的“核酸的非功能突變變體”可以在患者中表達并且將優(yōu)選通過與用以被核糖體翻譯成多肽的天然mRNA分子競爭而消除或減小目標核酸的表達水平。
“嚴格雜交條件”指那些條件，其中雜交在60℃2.5×SSC緩沖液中發(fā)生并且在37℃低鹽濃度緩沖液中許多洗滌步驟后保持穩(wěn)定。
術(shù)語“核酸的差別表達”指與參比樣品或參比文庫中核酸的表達相比，從患者分離的核酸的相對表達水平。參比樣品和參比文庫的定義已經(jīng)在上面詳述。該表達可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法確定。這些方法的實例包括RNA印跡(northern)分析、核酸酶保護、原位雜交、反轉(zhuǎn)錄酶PCR(RT-PCR；包括定量動態(tài)RT-PCR)。這些方法還包括cDNA和寡核苷酸微陣列。
在優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的核酸為Obcl1 cDNA(SEQ ID10)，其通過鑒定來自非豐余的和人EST GenBank序列數(shù)據(jù)庫的重疊序列裝配。相應于裝配序列SEQ ID的RNA的HCC中表達通過實驗證實。相對于被鑒定為SSH cDNA克隆的非患病肝臟，HCC中被上調(diào)的最初序列相應于GenBank序列AL050205。該序列的5’末端與AF131755重疊；該序列以XM113703、AK055521和AY004310的5’不斷延伸。后三個序列包括編碼OBcl1.pr的可讀框(SEQ ID 1)。為支持該mRNA構(gòu)建體，所有重疊的cDNA序列可以定位于相同的染色體。此外，使用來自該克隆的SSH序列作為雜交探針通過HCC但不是正常肝臟RNA的RNA印跡分析鑒定了約6kb的mRNA(圖4)。相應于該克隆的序列的表達以前還沒有在肝臟或HCC中報導。
在優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的多肽為OBcl1.pr多肽(SEQID 1)，其從相對于未患病肝臟在HCC中被鑒定上調(diào)平均2.9倍的mRNA令人驚奇地鑒定出來(OBcl1，SEQ ID 10)(見表3A/3B)。用反轉(zhuǎn)錄PCR分析鑒定編碼該多肽并與該mRNA重疊的cDNA序列并且這些核酸在HCC中類似地升高。關(guān)于該多肽序列在HCC中上升的水平以前未被識別。從OBcl1.pr多肽的序列，以用BLAST序列分析工具可以得到的保守結(jié)構(gòu)域預測CDD算法可以鑒定兩個保守序列結(jié)構(gòu)域(Altschul等人，1997，Nucleic Acids Res.，253389-3402)；狼瘡La多肽型RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(SEQ ID 1，氨基酸47到125)，和功能未知的GTPase酶結(jié)構(gòu)域(SEQ ID 1，氨基酸90到203)。OBcl1.pr序列在GenBank序列數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)被指定為細胞骨髓增殖性白血病受體(c-Mp1)結(jié)合多肽。雖然是骨髓增殖性白血病病毒受體(也稱作血小板生成素受體)的潛在調(diào)節(jié)劑，但是該多肽的功能角色還沒有被在任何系統(tǒng)中描述。類似地，該多肽的表達模式還沒有被公開。在受到表達描繪的21個肝臟腫瘤中的11個腫瘤(52％)中編碼該多肽的mRNA相對于未患病肝臟上升2倍以上。在被描繪的4個病灶性結(jié)節(jié)性增生癥(FNHs)的四個(100％)中編碼該多肽的mRNA類似地上升至少2倍(表3A/3B)。對于根據(jù)本發(fā)明的該核酸和其他核酸，該表達的值包括來自置于cDNA微陣列表達描繪實驗的所有21個HCC樣品的表達值比例數(shù)據(jù)，包括不上升2倍或更高的來自樣品的值。
該mRNA的表達對于肝臟失調(diào)顯著特異，因為在所分析的其他癌或者未患病組織包括肝臟、腎、胃、肺、皮膚和其他組織中都沒有檢測到表達(見表6)。Obcl1mRNA的表達水平的獨立的RT-PCR分析用基因特異的寡核苷酸引物包括SEQ ID 22和SEQ ID 23來確定。因此，令人驚奇地發(fā)現(xiàn)分別在OBcl1.pr多肽(SEQ ID 1)和編碼該多肽的核酸(SEQ ID 10)與根據(jù)本發(fā)明的失調(diào)之間有強而且特異的相關(guān)性。因此，該多肽和編碼核酸可用于診斷根據(jù)本發(fā)明的失調(diào)，例如用于診斷增生性(包括癌性)肝臟疾病和肝硬變之間的區(qū)別。
此外，該HCC-去調(diào)節(jié)的基因的表達與肝癌細胞的增殖相關(guān)，表現(xiàn)出用8小時和12小時血清刺激靜置細胞時，Hep3B細胞系中Obcl1mRNA分別增加3.4倍和6.3倍(見圖8)。
這些結(jié)果證明OBcl1.pr多肽(SEQ ID 1)和編碼該多肽的核酸(SEQ ID 10)可用于防止和治療根據(jù)本發(fā)明的失調(diào)，尤其用于治療增生性(包括瘤性)肝臟疾病。對于治療，優(yōu)選實施該治療從而OBcl1.pr多肽或者編碼該多肽的核酸的表達被減小和/或抑制，例如，通過施用與編碼OBcl1.pr多肽的核酸特異相互作用的反義寡核苷酸或RNA干擾分子實現(xiàn)治療。備選地，實施治療從而OBcl1.pr多肽的活性被減小和/或抑制，例如，通過將封閉OBcl1.pr多肽活性的針對OBcl1.pr多肽的抗體或者其抗體片段施用于需要這種治療的患者實現(xiàn)該治療。與本領(lǐng)域的狀況相比，該OBcl1.pr多肽和/或Obcl1核酸令人驚奇地允許肝臟失調(diào)和/或上皮癌的改良的、更敏感、更早、更快、和/或非侵入性的診斷和/或改良的、持續(xù)的和/或更有效的治療。
在另一實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的核酸是OBcl5核酸(SEQ ID11)，其是編碼OBcl5.pr多肽(SEQ ID 2)的編碼序列。
完整序列從許多GenBank表達序列標簽(EST)數(shù)據(jù)庫序列和GenBank基因組數(shù)據(jù)庫序列建立，并且驗證每個片段在HCC中的過表達。例如，相對于未患病肝臟參比物，cDNA微陣列上該核酸的序列平均上升24.7倍(表3A/3B)。
相應于該克隆的部分序列的表達已經(jīng)在一些組織和一些腫瘤(包括胎兒肝臟、結(jié)腸腺癌和局限于肝臟中的腫瘤轉(zhuǎn)移)中報導，但是根據(jù)本發(fā)明的完整序列以前還沒有描述。因此OBcl5的上升的表達對于肝臟失調(diào)十分特異。OBcl5核酸或者推導的多肽的編碼序列在根據(jù)本發(fā)明的失調(diào)，優(yōu)選HCC中的上升的水平還沒有被認識到。
檢索公共結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(如PubMed和SOURCE)得到關(guān)于該序列和根據(jù)本發(fā)明的所有序列的信息。期刊文章還沒有公開根據(jù)本發(fā)明的大多數(shù)序列。來自自動測序的cDNA文庫的cDNA克隆的相對豐度因此提供了關(guān)于根據(jù)本發(fā)明的該序列和其他序列此處所引用的證據(jù)。通過數(shù)據(jù)庫如“SOURCE”(由斯坦福大學的遺傳學系提供)可以得到該信息，該數(shù)據(jù)庫包括來自(curate from)UniGene、Swiss-Prot、GeneMap99、RHdb、dbEST、GeneCards和Locus-Link數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)。
在另一優(yōu)選的實施方案中根據(jù)本發(fā)明的多肽是OBcl5.pr多肽(SEQID 2)，其代表來自該去調(diào)節(jié)的mRNA序列的最大的可讀框。該多肽序列不含有與特征多肽或者公知的結(jié)構(gòu)基序同源的已識別序列。還沒有描述該多肽的表達模式。潛在編碼該多肽的RNA的表達與非-患病肝臟相比在100％的HCC病例中上升2倍以上，并且在所描繪的21個病例的17個病例中(81％)大于8倍。相對于非-患病肝臟，編碼mRNA的上升的表達在肝臟腺瘤、FNH和肝硬變肝臟中也是明顯的，但是轉(zhuǎn)錄在肝硬變中上調(diào)的顯著性稍小。編碼該多肽的mRNA在非-患病人肺、腦(皮質(zhì))、結(jié)腸、睪丸組織中可以檢測到但是在多數(shù)其他評價的癌中檢測不到(表6)。Obcl5RNA表達水平的獨立RT-PCR分析用包括SEQID 24和SEQ ID 25的基因特異的寡核苷酸引物確定。OBcl5cDNA的高表達特異性通過與正常組織中表達模式相比HCC、FNH和如圖2闡明的其他類型的癌中的定量評定(Q-PCR)證實。TaqMan方法證實了與非癌性肝臟相比HCC和FNH中OBcl5RNA(SEQ ID 11)的大量表達(圖2)，TaqMan方法利用了GAPDH和β-肌動蛋白的平行檢查。相對于這些管家基因，Q-PCR揭示與正常肝相比，肝癌和FNH中OBcl5RNA水平上升并且其他組織和其他癌中OBcl5RNA水平比正常肝臟低的多。對于TaqMan分析，用包括SEQ ID 66、SEQ ID 67和SEQ ID 68(“水解”探針)的基因特異性寡核苷酸引物確定了OBcl5表達。
此外，原位雜交分析使用通過與OBcl5RNA特異雜交的放射性同位素標記的OBcl5RNA反義探針清楚地指出與正常肝組織切片中邊緣信號相對比HCC中OBcl5RNA的位置(圖5)。
因此該多肽和/或編碼RNA的過表達，可用于診斷肝臟失調(diào)。這些結(jié)果清楚地闡明OBcl5.pr多肽和編碼該多肽的核酸(SEQ ID 11)和其功能變體可用于診斷、預防和治療根據(jù)本發(fā)明的失調(diào)，尤其是HCC、肝腺瘤、FNH和肝硬變。
關(guān)于治療，優(yōu)選實施治療使得OBcl5.pr多肽和/或其功能變體；或者編碼該多肽的核酸和/或其功能變體的表達被減弱和/或抑制，例如，通過施用反義寡核苷酸或小干擾RNA分子實現(xiàn)治療，這些分子與潛在編碼OBcl5.pr多肽和/或其功能變體的SEQ ID 11中定義的核酸特異相互作用。
備選地可以實施治療使得OBcl5.pr多肽和/或其功能變體的活性被減小和/或抑制，例如，通過將可以封閉OBcl5.pr多肽和/或其功能變體的活性的針對OBcl5.pr多肽和/或其功能變體的抗體，或者抗體片段施用于需要這種治療的患者實現(xiàn)治療。與本領(lǐng)域的狀況相比，OBcl5.pr多肽和/或其功能變體；和/或OBcl5核酸令人驚奇地允許肝臟失調(diào)和/或上皮癌的改良的、更敏感、更早、更快、和/或非侵入性的診斷和/或改良的、持續(xù)的和/或更有效的治療。
詳細的序列分析揭示OBcl5mRNA與其他真核生物的非編碼RNA之間的序列相似性。此外，旨在檢測該RNA的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的使用不同方法學的多種嘗試還沒有揭示這種產(chǎn)物。因此，該RNA可能不被翻譯成多肽但是可能自身具有功能(例如，調(diào)節(jié)的)性質(zhì)。非編碼調(diào)節(jié)性RNA的疾病相關(guān)性現(xiàn)在正變得明顯，如例如通過與真核生物果蠅中細胞增殖相關(guān)的非編碼RNA“bantam”(Brennecke J，Hipfner DR，StarkA，Russell RB，Cohen SM.Cell(2003)4月4；113(1)25-36)，和與轉(zhuǎn)錄因子HES-1相互作用而阻礙神經(jīng)元分化的微RNA-23和通過微小RNA-23的角色所證明的(Kawasaki，H.和Tiara，K.Nature(2003)423838-842)。
用小干擾RNA(siRNA)寡核苷酸降低正增殖的人肝癌細胞中OBcl5RNA的水平(擊倒)，這證明了OBcl5RNA升高的表達在肝臟失調(diào)，特別是肝癌中的功能上的重要角色。在該實驗中，當OBcl5RNA的水平降低時，編碼腫瘤抑制基因成視網(wǎng)膜細胞瘤蛋白1(RB1)的mRNA的水平被上調(diào)若干倍，OBcl5RNA的水平使用如上述的TaqMan Q-PCR確定。RB1mRNA的水平使用SYBR綠定量PCR分析用引物RB1-p1(SEQ ID64)和RB1-p2(SEQ ID 65)確定。通過RB1的負調(diào)節(jié)，HCC中OBcl5RNA的上升的表達可因此促進腫瘤細胞生長(圖6)。
在另一優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的核酸是Gene Bank序列NM025160代表的IK2核酸(SEQ ID 12)，序列NM025160包括編碼IK2.pr多肽(SEQ ID 3)的開放讀框。IK2.pr多肽是本發(fā)明的另一實施方案。已經(jīng)報導在來自包括肝臟的一些組織的cDNA文庫和腺瘤中相應于該克隆的EST序列，但是該序列以前還沒有被包含在HCC中。該多肽的表達還沒有在任何細胞或組織中描述。該多肽序列沒有公知的功能，盡管該序列在演變中相當保守(預測的多肽在一些哺乳動物、果蠅(Drosophila)和植物(擬南芥)中發(fā)現(xiàn))。CDD算法預測了在根據(jù)本發(fā)明的多肽序列中WD40型多肽-多肽相互作用域。在來自HCC患者的肝臟樣品中，編碼該多肽的mRNA的表達相對于非患病肝臟令人驚奇地在描繪的21例的15例(71％)中上升了平均4.67倍。相對于非-患病肝臟編碼mRNA的上升表達在肝硬變肝臟中也是明顯的(表3A/3B)。相對于非患病肝臟，在FNH中觀察到編碼該肽的mRNA的最高差別表達水平；在所描述的4例的4例中上調(diào)8倍。編碼該多肽的mRNA還在其他人類癌中表達，這些癌包括乳腺、肺和腎的癌，并且在所檢查的17種非患病人組織的2種(乳腺和腎)中也有表達。用包括SEQ ID 26和SEQ ID 27的基因特異性寡核苷酸引物進行了IK2mRNA表達水平的獨立RT-PCR分析。
這些結(jié)果表明該多肽和/或編碼mRNA的過表達可用于根據(jù)本發(fā)明的失調(diào)的診斷、預防和治療，尤其用于HCC、FNH、肝硬變和上皮來源的癌的診斷。關(guān)于治療，優(yōu)選實施治療使得IK2.pr多肽或者編碼該多肽的核酸的表達被減弱和/或抑制，例如，通過施用反義寡核苷酸或RNA干擾分子實現(xiàn)治療，這些分子與編碼IK2.pr多肽的核酸特異相互作用。備選地可以實施治療使得IK2.pr多肽的活性被減小和/或抑制，例如，通過將封閉IK2.pr多肽活性的針對IK2.pr多肽的抗體或者其抗體片段施用于需要這種治療的患者實現(xiàn)治療。與本領(lǐng)域的狀況相比，IK2.pr多肽和/或IK2核酸令人驚奇地允許肝臟失調(diào)和/或上皮癌的改良的、更敏感、更早、更快、和/或非侵入性的診斷和/或改良的、持續(xù)的和/或更有效的治療。
在另一優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的核酸是代表HCC去調(diào)節(jié)的cDNA克隆的序列的IK5核酸(SEQ ID 13)。已經(jīng)報導在一些組織(包括肝臟)和一些腫瘤(包括垂體和前列腺)中相應于該克隆的序列的表達，但是該序列以前還沒有描述在HCC中被上調(diào)。在優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的多肽是IK5.pr多肽(SEQ ID 4)，其被IK5cDNA(SEQ ID 13)編碼。從GenBank數(shù)據(jù)庫(記錄號NM006407)推論出該多肽序列為JWA-一種維生素A應答多肽。盡管從用維生素A刺激培養(yǎng)的細胞描述了編碼該假定的多肽的基因，但是還沒有描述該多肽在任何細胞或組織中存在并且功能是未知的。在GenBank數(shù)據(jù)庫中JWA被進一步描述為細胞骨架相關(guān)的多肽。該多肽還和與EAAC1谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白相互作用并降低其活性的嚙齒動物多肽具有同源性。該序列的保守結(jié)構(gòu)域檢索指出可能存在異戊二烯基化的rab接納體1結(jié)構(gòu)域(PRA1)，其可能調(diào)節(jié)與G蛋白信號分子的相互作用。在100％的所描繪的HCC病例中編碼該多肽的mRNA的表達相對于未-患病肝臟平均升高9.14倍。類似地，在腺瘤和FNH中編碼mRNA的上升的表達也是明顯的。編碼mRNA的表達在肝硬變肝臟中也差異表達但是比在其他肝臟失調(diào)中的程度低。編碼該多肽的mRNA在人的肺、腎和結(jié)腸癌中表達但是在所檢查的17例未患病人組織中僅1例中有表達。用包括SEQID 28和SEQ ID 29的基因特異性寡核苷酸引物確定了IK5mRNA的表達的獨立RT-PCR分析。該多肽和/或編碼mRNA的過表達可能標志特異的上皮來源的癌，包括肝癌。這些結(jié)果表明IK5cDNA序列的差異的上調(diào)表達對于根據(jù)本發(fā)明的失調(diào)是高度特異的。
此外，該HCC-去調(diào)節(jié)的基因的表達與肝癌細胞的增殖相關(guān)，當靜止細胞的8小時和12小時血清刺激時顯示出Hep3B細胞系中IK5mRNA分別增加10.9倍和4.3倍。
因此，IK5.pr多肽和/或編碼核酸可用于根據(jù)本發(fā)明的失調(diào)的診斷、預防和治療，尤其用以HCC、腺癌、FNH、肝硬變和上皮來源的癌的診斷。關(guān)于治療，優(yōu)選實施治療使得IK5.pr多肽或者編碼該多肽的核酸的表達被減弱和/或抑制，例如，通過施用反義寡核苷酸或RNA干擾分子實現(xiàn)治療，這些分子與編碼IK5.pr多肽的核酸特異相互作用。備選地可以實施治療使得IK5.pr多肽的活性被減小和/或抑制，例如，通過將可以封閉IK5.pr多肽活性的針對IK5.pr多肽的抗體或者其抗體片段施用于需要這種治療的患者實現(xiàn)治療。與本領(lǐng)域的狀況相比，該IK5.pr多肽和/或IK5核酸令人驚奇地允許肝臟失調(diào)和/或上皮癌的改良的、更敏感、更早、更快、和/或非侵入性的診斷和/或改良的、持續(xù)的和/或更有效的治療。
在另一優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的核酸是DAP3核酸(SEQ ID14)，其以前被公開(記錄號X83544)編碼DAP3.pr多肽(SEQ ID 5)。本發(fā)明還涉及死亡相關(guān)的多肽3(DAP3，SEQ ID 5)，其在培養(yǎng)的細胞中過表達時促進凋亡細胞死亡(Kissil等人，1995，J.Biol.Chem.，27027932-6)。
該多肽促進線粒體28S核糖體復合物。同樣，該多肽可能在許多(如果不是全部)組織和細胞中普遍表達，盡管顯然以較低水平表達。沒有描述內(nèi)源DAP3的特定功能(Cadvar Koc等人，2001，F(xiàn)EBS Lett.，492166-170)。在肝臟的結(jié)腸腺癌轉(zhuǎn)移中描述了DAP3 mRNA的下調(diào)(PCT/US01/30589)，但是還沒有認識到根據(jù)本發(fā)明的失調(diào)，優(yōu)選HCC中DAP3核酸或DAP3多肽的上升的水平。
純化的基因組DNA的定量RT-PCR(Q-PCR)擴增分析表明在10例HCC的8例中DAP3基因在肝癌中以約4-6拷貝擴增，在13個非-癌性肝臟樣品(包括接近和遠離腫瘤的肝硬變組織)中都沒有擴增。這些分析用TaqMan方法進行以精確定量DAP3基因組DNA的相對量，使用引物DAP3-p5(SEQ ID 71)、DAP3-p6(SEQ ID 72)和水解探針DAP3p-7(SEQ ID 73)。實際上，DAP3基因位于染色體1q上，通常發(fā)現(xiàn)該區(qū)域在HCC中擴增(Buendia MA.，Med Pediatr Oncol.(2002)11月；39(5)530-5.)。該發(fā)現(xiàn)表明表現(xiàn)為基因擴增的正選擇壓力可能驅(qū)動HCC中DAP3RNA的過表達，證明DAP3在HCC中的功能上重要的角色。
在所描繪的21例HCC的18例(86％)中編碼該多肽的mRNA的表達相對于未患病肝臟平均升高5.5倍。編碼mRNA的上升的表達在其他肝臟失調(diào)中也是明顯的但是比HCC中的程度低。用包括SEQ ID 30和SEQ ID 31的基因特異的寡核苷酸引物確定了DAP3mRNA的表達水平的獨立RT-PCR分析。通過Q-PCR分析，以SYBR綠技術(shù)，使用β-肌動蛋白作為參比基因，進一步證實了與正常肝臟相比HCC中上升的DAP3mRNA。在從所檢查的5例HCC的每一種分離的RNA中，DAP3mRNA與β-肌動蛋白mRNA水平的比例與從2個正常肝臟樣品分離的RNA中這些比例相比升高了(DAP 3mRNA與β-肌動蛋白mRNA的平均HCC比例＝12.8，DAP3mRNA與β-肌動蛋白mRNA的平均正常肝臟比例＝1.03)。使用SYBR綠分析以包括SEQ ID 69和SEQ ID 70的基因特異的寡核苷酸引物確定了DAP3mRNA的Q-PCR分析。
DAP3蛋白質(zhì)的表達在HCC中被顯著特異上調(diào)，因為在所分析的其他癌中和包括肝臟、腎、胃、肺、皮膚和其他組織的未患病組織中表達非常低或者沒有檢測到。與正常肝臟和其他正常和患病組織相比HCC中DAP3蛋白質(zhì)表達水平的特異增加進一步證明了DAP3在HCC中的功能相關(guān)性(見表6和圖7)。用小干涉RNA分子(siRNA；SEQ ID 54和SEQ ID 55)實驗減少肝癌細胞中DAP3mRNA導致肝癌細胞中顯著的形態(tài)變化和明顯的生物化學改變從而細胞變大并且用標準方法提取RNA和蛋白質(zhì)對于處理的細胞是不可能的。這些發(fā)現(xiàn)進一步支持了HCC中增加的DAP3的功能重要性。
這些結(jié)果表明DAP3 cDNA序列和DAP3.pr多肽的強烈的上調(diào)表達對于根據(jù)本發(fā)明的失調(diào)，特別是HCC是高度特異的。因此，DAP3多肽和/或編碼核酸可用于根據(jù)本發(fā)明的失調(diào)的診斷、預防和治療，尤其用于HCC的診斷。關(guān)于治療，優(yōu)選實施治療使得DAP3多肽或者編碼該多肽的核酸的表達被減弱和/或抑制，例如，通過施用反義寡核苷酸或RNA干擾分子實現(xiàn)治療，這些分子與編碼DAP3多肽的核酸特異相互作用。備選地可以實施治療使得DAP3多肽的活性被減小和/或抑制，例如，通過將封閉DAP3多肽活性的針對DAP3多肽的抗體或者其抗體片段施用于需要這種治療的患者實現(xiàn)治療。與本領(lǐng)域的狀況相比，DAP3多肽和/或DAP3核酸令人驚奇地允許肝臟失調(diào)和/或上皮癌的改良的、更敏感、更早、更快、和/或非侵入性的診斷和/或改良的、持續(xù)的和/或更有效的治療。
在另一優(yōu)選的實施方案中本發(fā)明涉及HCC上調(diào)的LOC5.pr假定多肽(SEQ ID 6)和編碼該多肽的核酸LOC5(SEQ ID 15)。已經(jīng)從包括肝臟的一些人組織的cDNA文庫中鑒定了相應于該mRNA的cDNA(信息來自如上述的SOURCE數(shù)據(jù)庫)，但是以前沒有報導該序列在根據(jù)本發(fā)明的失調(diào)，尤其是HCC中被上調(diào)。在71％的所描繪的HCC病例中該mRNA的表達相對于未患病肝臟上升5倍(表3B)。類似的分析揭示在置于該cDNA微陣列表達描繪步驟的FNH和大多數(shù)肝硬變肝臟中該mRNA的上升的表達。該mRNA在其他胃腸道癌中表達但是僅在所檢查的17例未患病人組織的腦和骨髓中表達。用包括SEQ ID 32和SEQ ID 33的基因特異的寡核苷酸引物確定LOC5mRNA的表達水平的獨立RT-PCR分析。LOC5.pr(SEQ ID 6)是一種預測的30kDa多肽(GenBank數(shù)據(jù)庫中記錄號NP_60917.1)。還沒有描述任何細胞或組織中存在該多肽。還沒有描述該預測的多肽的功能，CDD結(jié)構(gòu)域算法檢索也沒有揭示保守結(jié)構(gòu)域。這些結(jié)果表明LOC5cDNA序列的強烈的上調(diào)表達對于本發(fā)明的失調(diào)，特別是在HCC、FNH和大多數(shù)肝硬變肝臟中是高度特異的。此外，該HCC-去調(diào)節(jié)基因的表達與肝癌細胞的增殖相關(guān)，當對靜止細胞用血清刺激8小時和12小時時Hep3B細胞系中LOC5mRNA分別增加3.7倍和8.8倍(見圖8)。
因此，LOC5.pr多肽和/或其功能變體和/或編碼核酸和/或其變體可用于根據(jù)本發(fā)明的失調(diào)的診斷、預防和治療，尤其用于HCC、FNH和大多數(shù)肝硬變肝臟中的診斷。關(guān)于治療，優(yōu)選實施治療使得LOC5.pr多肽或者編碼該多肽的核酸的表達被減弱和/或抑制，例如，通過施用反義寡核苷酸或RNA干擾分子實現(xiàn)治療，這些分子與編碼LOC5.pr多肽的核酸特異相互作用。備選地可以實施治療使得LOC5.pr多肽的活性被減小和/或抑制，例如，通過將封閉LOC5.pr多肽活性的針對LOC5.pr多肽的抗體或者其抗體片段施用于需要這種治療的患者實現(xiàn)治療。與本領(lǐng)域的狀況相比，LOC5.pr多肽和/或LOC5核酸令人驚奇地允許肝臟失調(diào)和/或上皮癌的改良的、更敏感、更早、更快、和/或非侵入性的診斷和/或改良的、持續(xù)的和/或更有效的治療。
在另一優(yōu)選的實施方案中本發(fā)明涉及編碼根據(jù)本發(fā)明的SEC14L2.pr多肽(SEQ ID 7)的SEC14L2核酸cDNA(SEQ ID 16)。SEC14L2mRNA的表達已經(jīng)在許多組織中描述，但是該mRNA或者所編碼的多肽的上升以前還沒有在根據(jù)本發(fā)明的失調(diào)，尤其是肝臟失調(diào)或癌中報導。SEC14L2.pr(SEQ ID 7)是酵母sec多肽14的人同系物。盡管該多肽與酵母分泌途徑有關(guān)，但是該多肽或者其同系物的確切功能還沒有在任何物種中報導。還提議該人序列結(jié)合生育酚并且預測該多肽參與鯊烯轉(zhuǎn)移、膽固醇生物合成或者更一般地細胞內(nèi)運輸(Zimmer等人，2000，J.Biol.Chem.27525672-25680)。還沒有報導人細胞或組織中該多肽序列的表達。該多肽序列包括可能的G-多肽結(jié)合和磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)域和共有CRAL_TRIO結(jié)構(gòu)域。CRAL_TRIO結(jié)構(gòu)域通過順式-視黃醛CRAL基序參與維生素結(jié)合。在71％的HCC樣品、所有描繪的FNH疾病樣品、但是不在腺癌中、在僅一半肝硬變樣品中編碼該多肽的mRNA相對于未患病肝臟平均上升5.14倍或更高(表3A/3B)。在腎和結(jié)腸癌和正常胰腺中但是未在所檢查的其他正常組織中檢測到編碼該多肽的mRNA的表達(表6)。用包括SEQ ID 34和SEQ ID 35的特異寡核苷酸引物確定了SEC14L2mRNA的表達水平的獨立RT-PCR分析。此外，該HCC-去調(diào)節(jié)的基因的表達與肝癌細胞的增殖相關(guān)，表現(xiàn)出靜止細胞的8小時和12小時血清刺激時Hep3B細胞系中SEC14L2mRNA的分別為10.6倍和1.9倍的增加(見圖8)。
這些結(jié)果表明SEC14L2 cDNA序列的強烈上調(diào)的表達對于根據(jù)本發(fā)明的失調(diào)，特別是HCC和FNH是高度特異的。因此，SEC14L2.pr多肽和/或編碼核酸可用于根據(jù)本發(fā)明的失調(diào)的診斷、預防和治療，尤其用于HCC、FNH和還優(yōu)選肝硬變中的診斷。關(guān)于治療，優(yōu)選實施治療使得SEC14L2.pr多肽或者編碼該多肽的核酸的表達被減弱和/或抑制，例如，通過施用反義寡核苷酸或RNA干擾分子實現(xiàn)治療，這些分子與編碼SEC14L2.pr多肽的核酸特異相互作用。備選地可以實施治療使得SEC14L2.pr多肽的活性被減小和/或抑制，例如，通過將封閉SEC14L2.pr多肽活性的針對SEC14L2.pr多肽的抗體或者其抗體片段施用于需要這種治療的患者實現(xiàn)治療。與本領(lǐng)域的狀況相比，SEC14L2.pr多肽和/或SEC14L2核酸令人驚奇地允許肝臟失調(diào)和/或上皮癌的改良的、更敏感、更早、更快、和/或非侵入性的診斷和/或改良的、持續(xù)的和/或更有效的治療。
在另一優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及編碼SSP29.pr或APRIL多肽的核酸(SEQ ID 17)，其已經(jīng)在許多組織和腫瘤中描述。以前還沒有報導編碼該假定的腫瘤壞死家族成員的基因在根據(jù)本發(fā)明的失調(diào)，尤其是HCC中以升高的水平表達。此外，本發(fā)明涉及可銀染的29kDa多肽(SSP29.pr；SEQ ID 8)，其被根據(jù)本發(fā)明的核酸(SEQ ID 17)編碼。該多肽已經(jīng)被鑒定為富亮氨酸的分泌多肽，可能屬于TNF細胞因子家族。其還被稱為APRIL(富含亮氨酸的酸性多肽)并且在N-末端附近含有富亮氨酸重復(LRRs)，其可能參與抗原-介導的細胞應答(Zhu等人，1997，Biochem.Mol.Biol.Int.42927-935；Mencinger等人，1998，Biochim.Biophys.Acta 1395176-180)。還沒有報導人細胞或組織中有SSP29.pr多肽的表達。在描繪的21例HCC的17例中編碼該多肽的mRNA相對于未患病肝臟平均上升3.77倍。令人驚奇地，在銅中毒導致的肝硬變中編碼該多肽的mRNA水平比未患病肝臟庫中高30倍(表3A/3B)。相對于未患病肝臟在描繪的其他肝臟失調(diào)中mRNA水平或多或少地上升了并且否則在受到表達描繪的正常和患病組織中僅僅偶爾檢測到該mRNA。用包括SEQ ID 36和SEQ ID 37的基因特異的寡核苷酸引物確定了SSP29mRNA表達的獨立RT-PCR分析。此外，該HCC-去調(diào)節(jié)的基因的表達與肝癌細胞的增殖有關(guān)，顯示出當靜止細胞的8小時和12小時血清刺激時在HeP3B細胞系中SSP29增加分別為2.4倍和4.3倍(見圖8)。這些結(jié)果表明SSP29cDNA的強烈上調(diào)的表達對于根據(jù)本發(fā)明的失調(diào)，特別是HCC中和某些類型的肝硬變疾病中是高度特異的。
因此，SSP29.pr多肽和/或編碼核酸可用于根據(jù)本發(fā)明的失調(diào)的診斷、預防和治療，尤其用于HCC、FNH和還優(yōu)選肝硬變中的診斷。關(guān)于治療，優(yōu)選實施治療使得SSP29.pr多肽或者編碼該多肽的核酸的表達被減弱和/或抑制，例如，通過施用反義寡核苷酸或RNA干擾分子實現(xiàn)治療，這些分子與編碼SSP29.pr多肽的核酸特異相互作用。備選地可以實施治療使得SSP29.pr多肽的活性被減小和/或抑制，例如，通過將封閉SSP29.pr多肽活性的針對SSP29.pr多肽的抗體或者其抗體片段施用于需要這種治療的患者實現(xiàn)治療。與本領(lǐng)域的狀況相比，SSP29.pr多肽和/或SSP29核酸令人驚奇地允許肝臟失調(diào)和/或上皮癌的改良的、更敏感、更早、更快、和/或非侵入性的診斷和/或改良的、持續(xù)的和/或更有效的治療。
在另一優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及HS 16核酸(SEQ ID 18)，相應于HS16mRNA的cDNA克隆已經(jīng)在包括結(jié)腸的腺癌的一些組織中鑒定，但是該mRNA和編碼的多肽(HS16.pr，SEQ ID 9)以前都沒有與根據(jù)本發(fā)明的失調(diào)，尤其是肝臟失調(diào)或HCC相關(guān)。本發(fā)明還涉及編碼HS16的多肽，其是16.7kDa的預測的多肽(SEQ ID 9；GenBank中記錄號NP_057223)。還沒有描述任何細胞或組織中存在該多肽并且其功能還沒被鑒定，用CDD算法也沒有鑒定其功能結(jié)構(gòu)域。編碼該多肽的mRNA在檢查的8例HCC中升高至少2.8倍或更高，在所檢查的額外4個HCC樣品中升高近2倍，所有都相對于未患病的肝臟(表3A/3B)。用包括SEQ ID 38和SEQ ID 39的基因特異的寡核苷酸引物確定了HS16mRNA表達的獨立RT-PCR分析。這些結(jié)果表明HS16cDNA的強烈上調(diào)的表達對于根據(jù)本發(fā)明的失調(diào)，特別是HCC中是高度特異的。
因此，HS16.pr多肽和/或編碼核酸可用于根據(jù)本發(fā)明的失調(diào)的診斷、預防和治療，尤其用于HCC的診斷。關(guān)于治療，優(yōu)選實施治療使得HS16.pr多肽或者編碼該多肽的核酸的表達被減弱和/或抑制，例如，通過施用反義寡核苷酸或RNA干擾分子實現(xiàn)治療，這些分子與編碼HS16.pr多肽的核酸特異相互作用。備選地可以實施治療使得HS16.pr多肽的活性被減小和/或抑制，例如，通過將封閉HS16.pr多肽活性的針對HS16.pr多肽的抗體或者其抗體片段施用于需要這種治療的患者實現(xiàn)治療。與本領(lǐng)域的狀況相比，HS16.pr多肽和/或HS16核酸令人驚奇地允許肝臟失調(diào)和/或上皮癌的改良的、更敏感、更早、更快、和/或非侵入性的診斷和/或改良的、持續(xù)的和/或更有效的治療。
在一個優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的核酸是IK3cDNA(SEQ ID19)，其通過從非豐余的GenBank序列數(shù)據(jù)庫中鑒定重疊序列而得到。用cDNA微陣列分析相對于未患病肝臟在HCG中上調(diào)的最初序列相應于GenBank數(shù)據(jù)庫中胎兒腦cDNA(AL049338)。該序列與一種編碼酪氨酸磷酸酶D型受體(PTPRD)的小鼠cDNA XM 131462(SEQ ID.No.47)重疊。盡管該小鼠PTPRD與人PTPRD轉(zhuǎn)錄單位高度同源，但是在該人PTPRD轉(zhuǎn)錄單位序列中沒有發(fā)現(xiàn)與該肝癌去調(diào)節(jié)的RNA同源的區(qū)。因此，可能該HCC-調(diào)節(jié)的序列編碼還沒有描述的人PTPRD。備選地，所提供的數(shù)據(jù)庫序列可能含有錯誤，其是缺乏開放讀框的原因。另一備選原因是所編碼的多肽可能來自該序列中小開放讀框之一。甚至，該RNA可能不被翻譯成多肽但是可能自身具有功能(例如，調(diào)節(jié)的)性質(zhì)。
令人驚奇地，來自該mRNA的序列在HCC中比在正常人肝臟中以更高水平表現(xiàn)。另外，該RNA在正常的腦、骨骼肌、前列腺和肝臟中僅以低水平表達。在描繪的21個HCC樣品中的12個樣品(57％)中該mRNA相對于未患病肝臟平均上升3.81倍或更高。在所檢查的4例FNH的3例中，相對于未患病肝臟，腺癌中和所檢查的6個肝硬變樣品中的5個中IK3也上升了2倍或更高(表3A/3B)。用包括SEQ ID 40和SEQ ID 41的基因特異的寡核苷酸引物確定了IK3mRNA表達的獨立RT-PCR分析。這些結(jié)果表明IK3cDNA的強烈上調(diào)的表達對于根據(jù)本發(fā)明的失調(diào)，特別是HCC、FNH、腺癌和肝硬變中是高度特異的。
因此，IK3多肽和/或其功能變體，和/或編碼核酸和/或其變體可用于根據(jù)本發(fā)明的失調(diào)的診斷、預防和治療，尤其用于HCC、FNH、腺癌和肝硬變的診斷。關(guān)于治療，優(yōu)選實施治療使得IK3編碼的多肽或者IK3核酸的表達被減弱和/或抑制，例如，通過施用反義寡核苷酸或RNA干擾分子實現(xiàn)治療，這些分子與編碼IK3核酸特異相互作用。備選地可以實施治療使得IK3多肽的活性被減小和/或抑制，例如，通過將封閉IK3多肽活性的針對IK3多肽的抗體或者其抗體片段施用于需要這種治療的患者實現(xiàn)治療。與本領(lǐng)域的狀況相比，該IK3核酸令人驚奇地允許肝臟失調(diào)和/或上皮癌的改良的、更敏感、更早、更快、和/或非侵入性的診斷和/或改良的、持續(xù)的和/或更有效的治療。
評價了相對于未患病肝臟參比樣品來自包括HCC的人肝臟失調(diào)的組織中根據(jù)本發(fā)明的序列的cDNA表達水平，這些cDNA表達水平在代表兩組獨立的實驗的表3A/3B中顯示。表3B中的值代表表達水平的log2比例而表3A是從對定制的cDNA微陣列的競爭性雜交得到的患病和未患病樣品之間的未轉(zhuǎn)化的數(shù)據(jù)。HCC＝肝細胞癌樣品；HCC(IHB)＝含有HCC樣品的intrahyaline體；FNH＝病灶結(jié)節(jié)性增生樣品；Cirrh＝肝硬變樣品。提供了每組(HCC、FNH和Cirrh)每個序列(SEQ ID 10到19)值的平均值、中位數(shù)(值的第50個百分位數(shù))和標準誤。
表3AcDNA微陣列表達水平比(未轉(zhuǎn)化的值)





表3BcDNA微陣列核酸表達水平比(log2值)





在表4中顯示了cDNA微陣列核酸表達值的概述。應用Mann-Whitney-U檢驗統(tǒng)計地評估RNA表達水平該檢驗等于成對旗標＝“假”的Wilcoxon Rank Sum雙邊檢驗(Hollander & Wolfe，1973，非參數(shù)統(tǒng)計學推論(Nonparametric statistical inference)紐約JohnWiley & Sons，27-33頁，68-75；Bauer，D.F.，1972，J.Amer.Statistical Assoc.67687-690)。表達值通常不符合正態(tài)分布從而將值平均可能是誤導的。然而，中位值的分析闡明了大多數(shù)情況下實驗和參比值之間的顯著差異，在大數(shù)據(jù)組中尤其如此。Expt.中位值＝實驗(患病)組織的中位值；Expt.iqr＝實驗值四分位間范圍(中位值的+/-25百分位數(shù))；Contr.中位值＝對照(未患病)組織樣品的中位值；Contr.iqr＝對照值四分位間范圍(中位值的+/-25百分位數(shù))；p值＝對實驗值和對照值顯著不同這一可能性的統(tǒng)計學評價得到的值。
表4cDNA微陣列核酸(SEQ ID 10到19)表達值概述


在表5中顯示了非癌性肝臟疾病和肝癌中核酸表達值的比較。對于根據(jù)本發(fā)明的每一種核酸，為FNH、Cirrh.和HCC樣品之間比較的中位實驗表達值提供了P值。對于每種核酸和比較，小于或等于0.05的P值表明患病組之間表達值的顯著差異。用Wilcoxon rank sum檢驗評估重要性。在患病組之間表達中的統(tǒng)計學顯著性差異是明顯的。例如，在所有三個比較中IK2的表達值是顯著差異的(P值小于0.05)。FNH樣品組是小的并且顯示出值的大分布。這可能是由于與該組的比較中較少的顯著差異的原因。
表5AHCC對Cirrh、HCC對FNH、Cirrh對FNH中核酸(SEQ ID 10到19)的表達特異性。

表5B中的Mann-Whitney U指出當值以升序排列時第一組(HCC)中的值超過第二組(分別為FHN和Cirrh)的次數(shù)。Wilcoxon W是Mann-Whitney Wilcoxon Rank Sum檢驗中兩組的較大者的等級的總和。Asymptotic顯著性(Asymp.Sig.)(雙尾)提供了雙側(cè)檢驗的P值。該統(tǒng)計分析用于確定OBcl5(HCC對FNH、HCC對Cirrh)的表達模式的總趨勢，其通過表7中提供的定量RT-PCR(Q-PCR)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學驗證并在圖2中顯示。
圖5BHCC對FNH和HCC對Cirrh中OBcl5的表達特異性HCC對FNH

HCC對Cirrh

用對在所列的每種組織中每種去調(diào)節(jié)的核酸特異的引物實施了反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈式反應(RT-PCR)以確定是否該序列存在于從每種組織制備的RNA中。所用的所有組織在用于RNA(和cDNA)制備前通過診斷證實。在表6中符號“+”表示基因在組織中表達，“-”表示來自該RNA樣品的cDNA中沒有檢測到該基因；空格表示沒有對該基因和組織組合進行分析。提供了患者的年齡和性別。其他的樣品信息包括腫瘤分期值(T＝腫瘤大小)，以及腫瘤分級得分(G＝腫瘤細胞分化)；大的數(shù)字分別指出更大的和分化較差的腫瘤。組織cDNA的陽性對照是來自甘油醛磷酸脫氫酶mRNA(GAPDH)的擴增。
表6人未患病組織和患病組織中核酸表達的RT-PCR分析




在本發(fā)明的另一優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的核酸可用于構(gòu)建反義寡核苷酸(Zheng和Kemeny，1995，Clin.Exp.Immunol.100380-2；Nellen和Lichtenstein，1993，Trends Biochem.Sci.18419-23；Stein，1992，Leukemia 6967-74)和/或核酶(Amarzguioui，等人1998，Cell.Mol.Life Sci.541175-202；Vaish等人，1998，Nucleic Acids Res.265237-42；Persidis，1997，Nat.Biotechnol.15921-2；Couture和Stinchcomb，1996，Trends Genet.12510-5)和/或小干涉雙鏈RNA(Elbashir等人，2001，Nature 411494-98；Brummelkamp等人，2002，Science 296550-553)。在進一步優(yōu)選的實施方案中，通過使用RNA干擾分子(寡核苷酸)可以降低根據(jù)本發(fā)明的核酸的穩(wěn)定性和/或抑制根據(jù)本發(fā)明的核酸的翻譯。從而，例如，細胞中相應基因的表達可以體內(nèi)和體外都降低。因此寡核苷酸可適于作為治療劑。該策略也適于例如，肝臟細胞，尤其如果反義寡核苷酸與脂質(zhì)體復合的話。優(yōu)選單鏈DNA或RNA用作探針或“反義”寡核苷酸。小干涉RNA(siRNA)雙鏈寡核苷酸也適于用作治療劑。使用該方法，包括與所要治療靶定的序列互補的序列的短序列或者15到22個核苷酸的序列暴露于疾病組織并用于顯著降低或者“擊倒”治療靶標RNA序列的表達水平。其他疾病中的siRNA治療方法最近也有報導并且也可應用于肝臟失調(diào)，肝癌和其他上皮癌(Filleur S，Courtin A，Ait-SiAli S，Guglielmi J，Merle C，Harel-Bellan A，Clezardin P，Cabon F.Cancer Res.2003，7月15日；63(14)39-22.)。
在優(yōu)選的實施方案中，通過篩選文庫或者從來自患者或者受試者的樣品分離，用重組方法制備了根據(jù)本發(fā)明的核酸。在本發(fā)明的另一優(yōu)選的實施方案中，合成制備了根據(jù)本發(fā)明的核酸。從而，例如借助于SEQ ID 10到SEQ ID 19中描述的DNA序列和/或借助于SEQ ID 1到SEQ ID 9和/或SEQ ID 47中描述的蛋白質(zhì)序列參考遺傳密碼，例如根據(jù)磷酸三酯方法(see，for example，Uhlmann and Pey-man，1990，Chemical Reviews 90543-584)可以化學合成根據(jù)本發(fā)明的核酸。
在另一優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的核酸或者為該核酸的非功能突變變體的核酸或者具有與前述核酸之一互補的序列的核酸，該核酸通過粘附化學部分而被修飾，該修飾用以穩(wěn)定該核酸以抵抗降解，從而細胞中長期保持高濃度的該核酸(Beigelman等人，1995，Nucleic Acids Res.233989-94；Dudycz，1995，WO 95/11910；Macadam等人，1998，WO 98/37240；Reese等人，1997，WO 97/29116)。典型地，可以通過導入一個或多個核苷酸間(imternucleotide)磷基團或者通過導入一個或多個核苷酸間非磷基團得到這種穩(wěn)定。
優(yōu)選的適宜的被修飾的核苷酸間在Uhlmann和Peymann(1990Chem.Rev.90，544；還見Beigelman等人，1995Nucleic Acids Res.233989-94；Dudycz，1995，WO 95/11910；Macadam等人，1998，WO98/37240；Reese等人，1997，WO97/29116)中概述。
在另一實施方案中，本發(fā)明涉及含有根據(jù)本發(fā)明的核酸的載體和/或其變體，或者為該核酸的非功能突變變體的核酸，或者具有與一種前述核酸互補序列的核酸。載體優(yōu)選為可應用于基因治療中的敲除基因構(gòu)建體、質(zhì)粒、穿梭載體、噬菌粒、粘粒、病毒載體、表達載體和/或可應用于基因治療中的載體。這種構(gòu)建體的制備是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。
本發(fā)明意義內(nèi)的“表達載體”優(yōu)選包含用于在真核生物中表達的至少一個啟動子或增強子，即至少一個含有一種翻譯啟動信號的調(diào)節(jié)元件、至少一種根據(jù)本發(fā)明的核酸或為該核酸的非功能突變變體的核酸、或者具有與一種前述核酸互補序列的核酸、一種翻譯終止信號、轉(zhuǎn)錄終止信號、和聚腺苷酸化信號。
對于有關(guān)基因的表達，通常優(yōu)選雙鏈DNA，尤其優(yōu)選編碼多肽的DNA區(qū)域。對于真核生物的情況，該區(qū)域以位于Kozak序列(Kozak，1987，Nucleic.Acids Res.158125-48)中的第一個起始密碼子(ATG)開始直到下一個終止密碼子(TAG、TGA或TAA)，該終止密碼子位于與ATG相同的讀框中。對于原核生物的情況，該區(qū)域以SD序列后的第一個AUG(或者GUG)開始并以下一個終止密碼子(TAA、TAG或TGA)結(jié)束，該終止密碼子位于與ATG相同的讀框中。
HCC中差別表達的基因可以含有肝臟或肝癌基因特異調(diào)節(jié)序列。這些在組織特異性基因或疾病特異性基因中發(fā)現(xiàn)的未轉(zhuǎn)錄的序列可用于驅(qū)動所包括的治療和/或腫瘤細胞毒性基因的組織或疾病特異的表達。這些調(diào)節(jié)序列可用于根據(jù)本發(fā)明的核酸或者為該核酸的非功能突變變體的核酸，或者具有與前述核酸之一互補序列的核酸的肝癌特異的表達。這種調(diào)節(jié)序列的篩選和構(gòu)建是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。
適宜的表達載體可以是原核或真核表達載體。用于在大腸桿菌(E.coli)中表達的原核表達載體的實例為，例如載體pGEM或pUC衍生載體，真核表達載體的實例為，用于在釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中表達的載體例如，載體p426Met25或p426GAL1(Mumberg等人(1994)Nucl.Acids Res.，22，5767-5768)，用于在昆蟲細胞中表達的為，例如，如在EP-B1-0 127839或EP-B1-0 549721中公開的桿狀病毒載體，和用于在哺乳動物細胞中表達的為例如，載體Rc/CMV和Rc/RSV或SV40載體，它們通常都是可得到的。還包括用于在轉(zhuǎn)染后產(chǎn)生RNA干擾的特異載體，如pSUPER載體(Brummelkamp等人，2002，Science 296550-553)。
通常，表達載體還包括適于各自細胞的啟動子，如，例如，用于在大腸桿菌中表達的trp啟動子(見，例如，EP-B1-0 154 133)、用于在酵母中表達的MET25、GAL1或ADH2啟動子(Russel等人(1983)，J.Biol.Chem.258，2674-2682；Mumberg，同前)、用于在昆蟲細胞中表達的桿狀病毒多角體蛋白啟動子(見，例如，EP-B1-0 127 839)。對于哺乳動物細胞中的表達，例如，適宜的啟動子為允許真核細胞中組成性的、可調(diào)節(jié)的、組織特異的、細胞周期特異性的或代謝特異的表達的那些啟動子。根據(jù)本發(fā)明的調(diào)節(jié)元件為啟動子、激活子序列、增強子、沉默子和/或阻遏子序列。
使得在真核生物中組成性表達成為可能的適宜的調(diào)控元件的實例優(yōu)選為被RNA聚合酶III識別的啟動子或者病毒啟動子、CMV增強子、CMV啟動子、SV40啟動子或LTR啟動子，它們來自例如MMTV(小鼠乳腺腫瘤病毒Lee等人(1981)Nature214，228-232)和其他病毒啟動子和活化序列，它們來自例如，腺病毒或類腺病毒、HBV、HCV、HSV、HPV、EBV、HTLV或HIV。
使得真核生物中受調(diào)節(jié)的表達可能的調(diào)節(jié)元件的實例是四環(huán)素操作基因與相應阻遏基因的組合(Gossen等人，1994，Curr.Opin.Biotechnol.5516-20)。
翻譯起始信號、翻譯終止信號、轉(zhuǎn)錄終止信號、和聚腺苷酸化信號是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的并且可容易地從商業(yè)的實驗室供應商得到。
優(yōu)選地，肝臟失調(diào)和/或上皮癌相關(guān)基因的表達處于組織特異性啟動子的控制下，例如，處于肝臟特異性啟動子如白蛋白、α胎蛋白、載脂蛋白AI、α-1抗胰蛋白酶和補體C5和C8A基因的控制下(Schrem等人，2002，Pharmacol.Rev.54129-58；Pontoglio等人，2001，J.Expt.Med.1941683-1689)。與如此處描述的HCC中高度去調(diào)節(jié)的基因相關(guān)的調(diào)節(jié)序列也提供了在這些失調(diào)中特異基因表達的優(yōu)選方法。
使得在真核生物中組織特異性表達可能的調(diào)節(jié)元件的其他實例為來自編碼僅在某些細胞類型中表達的蛋白質(zhì)的那些基因的啟動子或增強子的啟動子序列或活化劑序列。
使得在真核生物中代謝性特異表達可能的調(diào)節(jié)元件的實例為受缺氧、氧化脅迫、葡萄糖缺乏、磷酸濃度或熱休克調(diào)節(jié)的啟動子。
使得在真核生物中細胞周期特異性表達可能的調(diào)節(jié)元件的實例為下面基因的啟動子cdc25A、cdc25B、cdc25C、細胞周期蛋白A、細胞周期蛋白E、cdc2、E2F-1到E2F-5、B-myb或DHFR(wicker J.和Müller R..1997，Trends Genet.133-6)。在下面情況尤其優(yōu)選使用細胞周期調(diào)節(jié)的啟動子根據(jù)本發(fā)明的多肽或核酸的表達將被限制于增殖細胞。
為了能夠?qū)肴缟鲜龅暮怂?，或者為該核酸的非功能突變變體的核酸并從而能夠通過轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化或者感染在真核或原核細胞中表達該多肽，該核酸可以作為質(zhì)粒，病毒或非病毒載體的部分存在。這里適宜的病毒載體尤其為桿狀病毒、牛痘病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒和皰疹病毒。這里適宜的非病毒載體尤其為病毒體、脂質(zhì)體、陽離子脂質(zhì)或聚賴氨酸偶聯(lián)的DNA或裸露的DNA。
適于根據(jù)本發(fā)明的用途的質(zhì)粒、穿梭載體、噬菌粒和粘粒也是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的并且通?？蓮纳虡I(yè)的實驗室供應商得到。
可應用于基因治療的載體的實例為病毒載體，例如腺病毒載體、反轉(zhuǎn)錄病毒載體或基于RNA病毒的復制子的載體(Lindemann等人，1997，Mol.Med.3466-76；Springer等人，1998，Mol.Cell.2549-58，Khromykh，2000，Curr.Opin.MolTher.2555-569)。真核表達載體適于以分離的形式用于基因治療，因為裸露的DNA當局部應用或者通過血液供應時可以例如，穿入活細胞中。
與本領(lǐng)域狀況相比，該融合構(gòu)建體令人驚奇地允許肝臟失調(diào)和/或其他上皮癌的改良的、更敏感、更早、更快、和/或非侵入性的診斷和/或改良的、持續(xù)的和/或更有效的治療。
在本發(fā)明的另一方面還涉及含有根據(jù)本發(fā)明的核酸和/或其變體的細胞。該細胞優(yōu)選用根據(jù)本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化。該細胞優(yōu)選含有核酸，其中該核酸是根據(jù)本發(fā)明的核酸或者其變體的非功能突變變體。具體地，該細胞含有含有核酸的載體，其中該核酸是根據(jù)本發(fā)明的核酸或者其變體的非功能突變變體。該細胞優(yōu)選含有編碼具有與根據(jù)本發(fā)明的核酸或者其變體互補的序列的核酸的核酸。此外，該細胞優(yōu)選含有含有編碼根據(jù)本發(fā)明的核酸的抗體或者該抗體的片段的核酸的載體。根據(jù)本發(fā)明的細胞可以例如是肝細胞，含有至少一種上面提到的核酸，或者用一種上面描述的載體轉(zhuǎn)化的細胞。細胞可以是原核或真核細胞、異體或自體細胞。原核細胞的實例為大腸桿菌，真核細胞的實例包括原代肝細胞、肝細胞細胞系如HepG2和Hep3B細胞、酵母細胞，例如釀酒酵母或昆蟲細胞。
與本領(lǐng)域狀況相比，根據(jù)本發(fā)明的細胞令人驚奇地允許肝臟失調(diào)和/或其他上皮癌的改良的、更敏感、更早、更快、和/或非侵入性的診斷和/或改良的、持續(xù)的和/或更有效的治療。
在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案中，細胞為轉(zhuǎn)基因的胚胎非人干細胞，其含有如上述的至少一種根據(jù)本發(fā)明的核酸、至少一種載體、至少一種敲除基因構(gòu)建體和/或至少一種表達載體。
細胞和/或干細胞的轉(zhuǎn)化方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的并且包括，例如，電穿孔或微注射。
本發(fā)明的另一方面涉及轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物的提供，該哺乳動物含有化合物，所述化合物選自根據(jù)本發(fā)明的核酸和/或其變體、為該核酸的非功能突變變體的核酸、具有與上述核酸之一互補的序列的核酸、以載體、擊倒或敲除基因構(gòu)建體和表達載體形式存在的上述核酸之一。
轉(zhuǎn)基因動物通常顯示出核酸和/或多肽的組織特異性增加的表達并且可用于肝臟失調(diào)和/或上皮癌，如例如HCC的分析，以及用于這些失調(diào)的治療策略的開發(fā)和評價。轉(zhuǎn)基因動物還可以用于產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的多肽。該動物產(chǎn)生的多肽可以例如在動物的體液中富集。根據(jù)本發(fā)明的多肽可以例如從體液如奶中分離。
與本領(lǐng)域狀況相比，該轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物令人驚奇地允許肝臟失調(diào)和/或其他上皮癌的改良的、更敏感、更早、更快、和/或非侵入性分析和/或診斷。
制備轉(zhuǎn)基因動物，尤其是轉(zhuǎn)基因小鼠的方法同樣是本領(lǐng)域技術(shù)人員從DE 196 25 049和US 4.736.866、US 5.625.122、US 5.698.765、US 5.583.278和US 5.750.825公知的并包括可以例如，通過將根據(jù)本發(fā)明的表達載體直接注射到胚胎或精母細胞或通過將表達載體注射到受精卵的原核或者通過將表達載體轉(zhuǎn)染到胚胎干細胞或通過核轉(zhuǎn)移到適宜的受體細胞中產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物(Polites核Pinkert，DNA微注射核轉(zhuǎn)基因動物產(chǎn)生，15到68頁Pinkert，1994，轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)實驗室手冊(Transgenic animalt echnologya laboratoryhandbook)，Academic Press，倫敦，UK；Houdebine，1997，HarwoodAcademic Publishers，阿姆斯特丹，荷蘭；Doetschman，胚胎干細胞中的基因轉(zhuǎn)移，115到146頁，Pinkert，1994，如前；Wood，反轉(zhuǎn)錄病毒介導的基因轉(zhuǎn)移，147到176頁，Pinkert，1994，如前；Monastersky，基因轉(zhuǎn)移技術(shù)、備選技術(shù)和應用(Gene TransferTechnology；Alternative Techniques and Applications)，177到220頁，Pinkert，1994，如前)。
如果上述核酸被整合到所謂的“靶定載體”或“敲除”基因構(gòu)建體(Pinkert，1994，如前)，那么胚胎干細胞轉(zhuǎn)染和同源重組后可能，例如，產(chǎn)生敲除小鼠，其通常作為雜合小鼠，顯示出核酸的降低的表達，而純合小鼠不再表現(xiàn)出該核酸的表達。這樣產(chǎn)生的動物也可用于肝臟失調(diào)，如例如HCC，和/或上皮癌的分析。
敲除基因構(gòu)建體是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以從美國專利5.625.122、US 5.698.765、US 5.583.278和US 5.750.825公知的。
本發(fā)明的另一方面涉及抗體或其片段的提供，其中該抗體或抗體片段針對根據(jù)本發(fā)明的多肽、其功能變體或針對編碼該多肽，或者其變體的核酸。
與本領(lǐng)域狀況相比，這些抗體或其片段令人驚奇地允許肝臟失調(diào)和/或其他上皮癌的改良的、更敏感、更早、更快、和/或非侵入性的診斷和/或改良的、持續(xù)的和/或更有效的治療。
術(shù)語“抗體”或“抗體片段”根據(jù)本發(fā)明還被理解為通過遺傳工程制備和任選被修飾的抗體或其抗原結(jié)合部分，如，例如，嵌合抗體、人源化抗體、多功能抗體、雙特異性或寡特異性抗體、單鏈抗體、F(ab)或F(ab)2片段(見，例如，EP-B1-0 368 684、US 4.816.567、US 4.816.397、WO88/01649、WO93/06213、WO 98/24884)。根據(jù)本發(fā)明的抗體可以例如用于根據(jù)本發(fā)明的失調(diào)如肝臟失調(diào)，例如HCC，和/或上皮癌的預防和/或治療。
本發(fā)明還涉及例如用于根據(jù)本發(fā)明的失調(diào)的診斷和/或預防和/或治療的對根據(jù)本發(fā)明的核酸或者其變體編碼的多肽或其功能變體特異的抗體或抗體片段，優(yōu)選多克隆或單克隆抗體的產(chǎn)生方法。根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法，通過用根據(jù)本發(fā)明的核酸或它們的變體，或者用長度至少為6個氨基酸，優(yōu)選至少8個氨基酸，尤其至少12個氨基酸的根據(jù)本發(fā)明的多肽或其部分或者其功能變體，如合適在例如，弗氏佐劑和/或氫氧化鋁的存在下，免疫哺乳動物，例如，兔，來實施該方法(見，例如，Harlow和Lane，1998，使用抗體實驗室手冊(Using AntibodiesA Laboratory Manual)，冷泉港出版社，紐約，美國，第5章，53-135頁)。由于免疫學反應導致在動物中形成的多克隆抗體用根據(jù)公知方法容易地從血液分離并例如，通過柱層析純化?？梢愿鶕?jù)Winter和Milstein(Winter和Milstein，1991，Nature 349293-299)的公知方法制備單克隆抗體。
本發(fā)明還涉及針對上述多肽并與該多肽特異反應的抗體或抗體片段，其中上述多肽的部分或者自身是免疫原性的或者可以通過偶聯(lián)適宜的載體，如，例如，牛血清白蛋白或者鎖眼帽貝血藍蛋白以增加它們的免疫原性而獲得免疫原性。該抗體是多克隆的或者單克隆的；優(yōu)選其是單克隆抗體。
此外，本發(fā)明涉及從如例如，Knappik等人(2000，J.Molec.Biol.29657-86)或者Chadd和Chamow(2001 Curr.Opin.Biotechnol.12188-94)重組載體表達文庫產(chǎn)生和/或制備對根據(jù)本發(fā)明的多肽特異的抗體或抗體片段。
在本發(fā)明的另一實施方案中，提供了陣列，其中該陣列含有選自根據(jù)本發(fā)明的多肽、其功能變體、編碼該多肽的核酸、該核酸的非功能突變變體和針對該多肽的抗體或抗體片段的至少兩種化合物。備選地，該陣列含有至少一種根據(jù)本發(fā)明的組分與以前描述的與瘤性或代謝性肝臟失調(diào)或上皮癌相關(guān)的組分的組合。
在本發(fā)明的意義內(nèi)，術(shù)語“陣列”指固相或凝膠樣載體，其上粘附或結(jié)合以一維、二維或三維排列的至少兩種化合物。這種陣列是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的并且通常在顯微鏡載玻片，特別是有涂層載玻片如涂有聚陽離子、硝酸纖維素或生物素的載玻片，蓋片、和膜例如基于硝酸纖維素或尼龍的膜上產(chǎn)生。
上面提到的陣列包括根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合多肽或其功能變體或者編碼該多肽的核酸或其變體、根據(jù)本發(fā)明的融合蛋白或者針對根據(jù)本發(fā)明的多肽或其變體的抗體或抗體片段或者表達根據(jù)本發(fā)明的多肽或者其功能變體的細胞或者表達根據(jù)本發(fā)明的至少一種核酸或者其變體的至少兩種細胞。編碼這些或者其變體的核酸也可以是陣列的部分。這種陣列可用于肝臟失調(diào)，優(yōu)選HCC，和/或上皮癌的分析和/或診斷。
本發(fā)明還涉及產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的陣列的方法，其中根據(jù)本發(fā)明的至少兩種化合物結(jié)合到載體材料。
產(chǎn)生(例如，基于固相化學和光不穩(wěn)定的保護基團)這種陣列的方法是公知的(US 5.744.305)。這種陣列也可以與物質(zhì)或者物質(zhì)文庫接觸并試驗相互作用，例如結(jié)合或構(gòu)象的改變。
本發(fā)明還涉及制備固定在載體材料上的陣列的方法，該陣列用于根據(jù)本發(fā)明的失調(diào)如肝臟失調(diào)，優(yōu)選HCC的分析和/或診斷，其中如上述的至少兩種核酸、至少兩種多肽或至少兩種抗體或抗體片段，和/或至少兩種細胞，或者至少一種上述組分與其他與瘤性和代謝性肝臟失調(diào)或上皮癌相關(guān)的組分的組合，被用于制備。通過這種方法產(chǎn)生的陣列可用于根據(jù)本發(fā)明的失調(diào)的診斷。
本發(fā)明的另一方面涉及診斷試劑，其含有至少一種化合物、所述化合物選自根據(jù)本發(fā)明的多肽、或者其功能變體、編碼該多肽的核酸、優(yōu)選根據(jù)SEQ ID 10到19的核酸、或一種上面提到的核酸的變體、和根據(jù)本發(fā)明的抗體或抗體片段，與適宜的添加劑或助劑組合或在一起。
與本領(lǐng)域狀況相比，該診斷試劑令人驚奇地允許肝臟失調(diào)和/或其他上皮癌的改良的、更敏感、更早、更快、和/或非侵入性的診斷。
在本發(fā)明的意義內(nèi)，“適宜的添加劑”或“助劑”是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的并且包括，例如，基于生理鹽溶液、軟化水、明膠或甘油的蛋白質(zhì)穩(wěn)定試劑。備選地，根據(jù)本發(fā)明的核酸或多肽可以為了穩(wěn)定而被凍干。
在另一實施方案中，可以產(chǎn)生基于根據(jù)本發(fā)明的核酸序列的診斷試劑盒。這種試劑盒可被特別設計以檢測由于所描述的失調(diào)而導致循環(huán)系統(tǒng)細胞改變并從而可以在來自受試患者的血清中被檢測到。診斷試劑盒的其他實例包括酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)、放射免疫測定法(RIA)，和特定抗體與根據(jù)本發(fā)明的多肽的免疫反應的檢測，包括特定應答免疫細胞的檢測。
在優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的診斷試劑含有探針，優(yōu)選DNA探針。
例如，可能根據(jù)本發(fā)明制備基于聚合酶鏈式反應(PCR)的診斷試劑。在限定的條件下，優(yōu)選使用對根據(jù)本發(fā)明的核酸特異的引物作為DNA探針，對本發(fā)明的核苷酸序列特異的PCR將用于監(jiān)視為了診斷或治療目的從患者分離的樣品中根據(jù)本發(fā)明的特定核酸的存在，特別是量。這使得進一步可能通過適宜的探針，從適宜的基因或cDNA文庫，例如，從肝臟失調(diào)特異的或肝臟特異的基因庫分離得到所描述的核酸(見，例如J.Sambrook等人，1989，分子克隆實驗室手冊第二版，冷泉港實驗室，冷泉港，NY，第8章，8.1到8.81頁，第9章，9.47到9.58頁和第10章10.1到10.67頁)。
適宜的探針為，例如，長度為約50-1000個核苷酸，優(yōu)選約10到約100個核苷酸，優(yōu)選約100到約200個核苷酸，尤其約200-500個核苷酸的DNA或RNA片段，其序列可來自根據(jù)SEQ ID 1到SEQ ID 9和/或SEQ ID 47的多肽，和其功能變體，和編碼該多肽優(yōu)選根據(jù)SEQ ID10到SEQ ID 19的核酸，和其變體。
備選地，優(yōu)選可能通過衍生的核酸序列合成適于用作聚合酶鏈式反應的引物的寡核苷酸。使用該寡核苷酸，上述核酸或其部分可被擴增并從cDNA，例如，HCC-特異的cDNA分離。適宜的引物為，例如，長度為約10到100個核苷酸，優(yōu)選約15到50個核苷酸，尤其為17到30個核苷酸的DNA片段，其序列可以來自根據(jù)SEQ ID 1到SEQ ID 9和/或SEQ ID 47的多肽，這些多肽來自根據(jù)SEQ ID 10到SEQ ID 19的核酸。這些引物的設計和合成是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。該引物可以還含有限制位點，例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的適于將擴增的序列整合到載體的限制位點，或者其他銜接或突出端序列，例如具有標記分子如粘附熒光標記的序列。
在本發(fā)明的另一方面提供了根據(jù)本發(fā)明的失調(diào)的診斷方法，其中至少一種選自根據(jù)序列SEQ ID 1到SEQ ID 9和/或SEQ ID 47的多肽、其功能變體、編碼該多肽的核酸、前述核酸之一的變體和針對該多肽的抗體或其抗體片段的化合物在患者的樣品中被鑒定并且與參比文庫或參比樣品的至少一種化合物比較。
在本方法的優(yōu)選實施方案中，肝臟的失調(diào)是選自肝硬變、酒精肝疾病、慢性肝炎、威爾遜病、血色素沉著、肝細胞癌、良性肝腫癌和病灶性結(jié)節(jié)性增生癥的失調(diào)。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，上皮癌是不同于肝臟的器官的腺癌，該器官優(yōu)選為選自肺、胃、腎、結(jié)腸、前列腺、皮膚和乳腺的器官。
與本領(lǐng)域的狀況相比，該診斷試劑令人驚奇地允許肝臟失調(diào)和/或其他上皮癌的改良的、更敏感、更早、更快、和/或非侵入性的診斷。
優(yōu)選通過如上述的非侵入性方法從患者分離樣品。
例如，通過ELISA測定法的特定去調(diào)節(jié)的基因蛋白質(zhì)的血清檢測是一種應用，備選一種或一組去調(diào)節(jié)的基因產(chǎn)物的抗體，基于患病組織或來自患病個體的血清中表達的基因產(chǎn)物的表達水平的組合從該去調(diào)節(jié)的基因產(chǎn)物推出診斷得分。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的診斷試劑含有所描述的多肽或者上面更詳細描述的該多肽的免疫原性部分。該多肽或者其部分優(yōu)選結(jié)合例如，硝酸纖維素或尼龍的固相，可以例如與所研究的體液，例如，血液、血清、血漿、腹水、胸膜積液、腦脊液、唾液、尿、精液體外接觸，從而能夠例如與例如患者的血液中存在的自身免疫抗體反應。然后，例如，通過標記的抗人IgG抗體檢測抗體-肽復合物。標記包括，例如，酶，如過氧化物酶，其催化變色或化學發(fā)光反應。然后可容易而快速地通過該顏色檢測自身免疫抗體的存在和所存在的量。
此外，診斷試劑可以用于檢測從患者分離的樣品中存在的內(nèi)源抗體或者其片段，該抗體或者其片段針對根據(jù)本發(fā)明的多肽。這種自身免疫抗體的檢測可以通過本領(lǐng)域公知的方法實現(xiàn)，例如通過使用根據(jù)本發(fā)明的多肽或者其功能變體或者其部分作為探針的免疫親和測定法實現(xiàn)。優(yōu)選地，這種自身免疫抗體的存在表明該患者患有根據(jù)本發(fā)明的失調(diào)。
另一種診斷試劑是本發(fā)明的主題，該診斷試劑含有根據(jù)本發(fā)明的抗體自身。通過這些抗體，可能，例如，容易而快速地研究組織樣品關(guān)于所涉及的根據(jù)本發(fā)明的多肽是否以增量存在，以便從而得到包括肝臟失調(diào)，例如HCC的可能的疾病的指征。在這種情況中，根據(jù)本發(fā)明的抗體優(yōu)選被直接例如用上面已經(jīng)描述的酶或熒光分子標記，或者更普遍地例如，用特異的第二抗體間接檢測這些抗體。從而該特定抗體-肽復合物可例如，通過酶促變色反應容易且快速地檢測。
在本發(fā)明另一方面，提供了鑒定相對于參比文庫或參比樣品，在來自患者的樣品中差別表達的至少一種根據(jù)SEQ ID 10到SEQ ID 19的核酸，或者其變體的方法，所述方法包括下面的步驟(a)檢測從患者分離的樣品中至少一種根據(jù)SEQ ID 10到SEQID 19的核酸，或者其變體的表達，(b)將步驟(a)中檢測的所述核酸的表達與參比文庫或參比樣品中相同核酸的表達比較，(c)鑒定與參比文庫或參比樣品相比，在從患者分離的樣品中差別表達的所述核酸。
與本領(lǐng)域狀況相比，該方法令人驚奇地允許根據(jù)本發(fā)明的核酸的差別表達的改良的、更敏感、更早、更快和/或非侵入性鑒定，該鑒定為根據(jù)本發(fā)明的失調(diào)的診斷提供了有用的基礎。
優(yōu)選鑒定至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種，或者至少7種核酸。
在該方法的另一個優(yōu)選實施方案中，所述一種或幾種核酸通過基于PCR的檢測或者通過雜交測定法檢測。
在該方法的另一優(yōu)選的實施方案中，通過選自基于固相的篩選方法、雜交、扣除雜交、差別展示和RNA酶保護測定法的方法比較所述核酸的表達。
在該方法另一優(yōu)選的實施方案中，從患者分離的樣品選自肝臟組織、肝臟細胞、來自受到癌性轉(zhuǎn)化的另一器官的組織、來自該器官的細胞、血液、血清、血漿、腹水、胸膜積液、腦脊液、唾液、尿、精液、和糞便。
參比樣品優(yōu)選從選自相同患者的未患病樣品或者來自另一受試者的非患病樣品的來源分離。適宜參比樣品的選擇是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。具體地，參比樣品可選自肝臟組織、肝臟細胞、血液、血清、血漿、腹水、胸膜積液、腦脊液、唾液、尿、精液、和糞便。
在該方法的另一優(yōu)選的實施方案中，參比文庫是表達文庫或者數(shù)據(jù)庫，其含有關(guān)于樣品中至少一種根據(jù)本發(fā)明的核酸的非患病表達的克隆或數(shù)據(jù)，所述樣品優(yōu)選可以選自肝臟組織、肝臟細胞、血液、血清、血漿、腹水、胸膜積液、腦脊液、唾液、尿、精液、和糞便。
在本發(fā)明的另一方面，提供了肝臟失調(diào)，和/或另一上皮癌的診斷方法，該方法包括下面的步驟a)檢測從患者分離的樣品中至少一種根據(jù)SEQ ID 10到SEQID 19和/或SEQ ID 47的核酸，或者其變體的表達，b)將步驟(a)中檢測的所述核酸的表達與參比文庫或參比樣品中相同核酸的表達比較，c)鑒定與參比文庫或參比樣品相比，在從患者分離的樣品中差別表達的所述核酸，d)將步驟(c)中鑒定的所述核酸與病理學參比樣品或病理學參比文庫中差別表達的所述核酸匹配，其中所匹配的一種或幾種核酸指出該患者患有肝臟失調(diào)，和/或其他上皮癌。
與本領(lǐng)域的狀況相比，該診斷方法令人驚奇地允許肝臟失調(diào)和/或其他上皮癌的改良的、更敏感、更早、更快、和/或非侵入性的診斷。
優(yōu)選鑒定了至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、或至少7種核酸。
在該方法的另一優(yōu)選的實施方案中，所述一種或幾種核酸通過基于PCR的檢測或者通過雜交測定法檢測。
在該方法的另一優(yōu)選的實施方案中，通過選自基于固相的篩選方法、雜交、扣除雜交、差別展示和RNA酶保護測定法的方法比較所述核酸的表達。
在該方法另一優(yōu)選的實施方案中，從患者分離的樣品選自肝臟組織、肝臟細胞、來自受到癌性轉(zhuǎn)化的另一器官的組織、來自該器官的細胞、血液、血清、血漿、腹水、胸膜積液、腦脊液、唾液、尿、精液、和糞便。
參比樣品優(yōu)選從選自相同患者的未患病樣品或者來自另一受試者的非患病樣品的來源分離。適宜參比樣品的選擇是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。具體地，參比樣品可選自肝臟組織、肝臟細胞、血液、血清、血漿、腹水、胸膜積液、腦脊液、唾液、尿、精液、和糞便。
在該診斷方法的另一優(yōu)選的實施方案中，參比文庫是表達文庫或者數(shù)據(jù)庫，其含有關(guān)于樣品中至少一種根本發(fā)明的核酸的非患病表達的克隆或數(shù)據(jù)，所述樣品優(yōu)選可以選自肝臟組織、肝臟細胞、血液、血清、血漿、腹水、胸膜積液、腦脊液、唾液、尿、精液、和糞便。
在該診斷方法的另一優(yōu)選的實施方案中，病理學參比樣品分離自另一患者的患病樣品。后一患者已經(jīng)被診斷為含有將要被診斷的根據(jù)本發(fā)明的失調(diào)。適宜的病理學參比樣品的選擇是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。具體地，病理學參比樣品可以選自肝臟組織、肝臟細胞、血液、血清、血漿、腹水、胸膜積液、腦脊液、唾液、尿、精液、和糞便。
在該診斷方法的另一優(yōu)選的實施方案中，病理學參比文庫為數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫含有關(guān)于相對于參比樣品或參比文庫中的對照表達，從患有將要在該發(fā)明性方法中診斷的根據(jù)本發(fā)明的失調(diào)的至少一個患者(排除處于診斷中的患者)分離的樣品中至少一種根據(jù)本發(fā)明的核酸的差別表達的數(shù)據(jù)。該病理學參比數(shù)據(jù)庫優(yōu)選還涉及差別表達文庫，該文庫含有相對于參比樣品或參比文庫中的對照表達，從患有將要在該發(fā)明方法中診斷的根據(jù)本發(fā)明的失調(diào)的至少一個患者(排除處于診斷中的患者)分離的樣品中差別表達的根據(jù)本發(fā)明的核酸。適宜的病理學參比文庫的選擇是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。
優(yōu)選地，該肝臟失調(diào)是選自肝硬變、酒精肝疾病、慢性肝炎、威爾遜病、血色素沉著、肝細胞癌、良性肝腫癌和病灶性結(jié)節(jié)性增生癥的失調(diào)。具體地，上皮癌是不同于肝臟的器官的腺癌，該器官優(yōu)選選自肺、胃、腎、結(jié)腸、前列腺、皮膚和乳腺。
術(shù)語“檢測核酸”在本發(fā)明的意義內(nèi)指優(yōu)選從樣品中存在的其他組分的背景中揭露、顯示、分開或允許識別根據(jù)本發(fā)明的核酸的方法。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的并且包括基于原位雜交、PCR擴增、凝膠電泳、RNA印跡、固相陣列(基因芯片)的方法、核酸酶保護方法(如在Alberts，等人(2002)細胞分子生物學，第四版(Garland，紐約，美國)中描述和引用的)。
術(shù)語“將步驟(a)中檢測的所述核酸的表達與參比文庫或參比樣品中相同核酸的表達比較”在本發(fā)明的意義內(nèi)指通過實驗方法如差別展示、扣除雜交、RNA酶保護測定法，或者特別是DNA芯片雜交在定量或定性水平上比較兩組所述核酸的表達。而且，這里還包括比較步驟(a)中檢測的所述核酸的實驗數(shù)據(jù)與參比文庫中相同核酸的表達。
術(shù)語“鑒定與參比文庫或參比樣品相比，在從患者分離的樣品中差別表達的所述核酸”在本發(fā)明的意義內(nèi)被理解為表示選擇與參比文庫或參比樣品相比差別表達的所述核酸，該選擇滿足下面的標準與參比文庫或參比樣品相比所檢測的核酸的差別表達水平被上調(diào)高約2倍，優(yōu)選高約5倍，更優(yōu)選高約10倍。
術(shù)語“將步驟(c)中鑒定的所述核酸與病理學參比樣品或病理學參比文庫中差別表達的所述核酸匹配”在本發(fā)明的意義內(nèi)被理解為指步驟(c)中鑒定的所述核酸與病理學參比樣品或病理學參比文庫中差別表達的所述核酸相比。然后，也在病理學參比樣品或病理學參比文庫中差別表達的步驟(c)中鑒定的所述核酸被匹配，即所述相同對被鑒定和分配。因為病理學參比樣品或病理學參比文庫中所述核酸的差異表達表明根據(jù)本發(fā)明的失調(diào)，所以與樣品中差異表達的這種對應指出該患者患有該失調(diào)。
優(yōu)選地，通過如上述的非侵入性或優(yōu)選最小侵入性方法(包括靜脈穿刺)從患者分離樣品。
根據(jù)本發(fā)明的診斷方法允許肝臟失調(diào)和/或上皮癌的更早檢測，和/或該失調(diào)的非侵入性診斷，該檢測或診斷基于相對于參比樣品和/或參比文庫，在從患有肝臟失調(diào)和/或上皮癌的動物和/或人類患者分離的樣品中檢測的根據(jù)本發(fā)明的核酸的基本上一致的表達模式。該方法的額外優(yōu)點是其還提供了表征肝臟失調(diào)的不同亞型，如例如HCC的亞型的新的診斷參數(shù)。
術(shù)語根據(jù)本發(fā)明的核酸的“基本一致的表達模式”指如果所比較的患者或受試者分別處于相同的或者相當?shù)牟±頎顩r或者健康狀況下，從患者到患者或者受試者到受試者基本上可以再現(xiàn)的表達模式。
在本發(fā)明的另一方面提供了鑒定至少一種根據(jù)SEQ ID 1到SEQ ID 9和/或SEQ ID 47的多肽，或者其功能變體的方法，相對于參比文庫或參比樣品，在來自患者的樣品中該多肽或其變體差別表達，所述方法包括下面的步驟(a)檢測從患者分離的樣品中至少一種根據(jù)SEQ ID 1到SEQID9和/或SEQ ID 47的多肽，或者其功能變體的表達，(b)將步驟(a)中檢測的所述多肽的表達與參比文庫或參比樣品中所述多肽的表達比較，(c)鑒定與參比文庫或參比樣品相比，在從患者分離的樣品中差別表達的所述多肽。
與本領(lǐng)域狀況相比，該方法令人驚奇地允許根據(jù)本發(fā)明的多肽的差別表達的改良的、更敏感、更早、更快和/或非侵入性鑒定，該鑒定為根據(jù)本發(fā)明的失調(diào)的診斷提供了有用的基礎。
優(yōu)選鑒定至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種，或者至少7種多肽。
優(yōu)選地，通過如上述的非侵入性或最小侵入性方法(包括靜脈穿刺)從患者分離樣品。
在該方法的另一實施方案中，樣品為如更上面定義的樣品。參比樣品優(yōu)選為如上定義的參比樣品。
在該方法的另一優(yōu)選實施方案中，參比文庫是表達文庫或者數(shù)據(jù)庫，其含有關(guān)于樣品中至少一種根據(jù)本發(fā)明的多肽的非患病表達的克隆或數(shù)據(jù)，所述樣品優(yōu)選可以選自肝臟組織、肝臟細胞、血液、血清、血漿、腹水、胸膜積液、腦脊液、唾液、尿、精液、和糞便。這種數(shù)據(jù)庫作為根據(jù)本發(fā)明的cDNA微陣列表達分析的結(jié)果而產(chǎn)生并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。上面已經(jīng)描述了可以根據(jù)本發(fā)明使用的其他參比文庫。
在本發(fā)明的另一方面，提供了診斷肝臟失調(diào)和/或上皮癌的方法，該方法包括步驟a)檢測從患者分離的樣品中至少一種根據(jù)SEQ ID 1到SEQ ID9和/或SEQ ID 47的核酸，和/或其功能變體的表達，
b)將步驟(a)中檢測的所述多肽的表達與參比文庫或參比樣品中所述多肽的表達比較，c)鑒定與參比文庫或參比樣品相比，在從患者分離的樣品中差別表達的所述多肽，d)將步驟(c)中鑒定的所述多肽與病理學參比樣品或病理學參比文庫中差別表達的所述多肽匹配，其中所匹配的一種或幾種多肽指出該患者患有肝臟失調(diào)，和/或其他上皮癌。
與本領(lǐng)域的狀況相比，該診斷方法令人驚奇地允許肝臟失調(diào)和/或其他上皮癌的改良的、更敏感、更早、更快、和/或非侵入性的診斷。
優(yōu)選鑒定了至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、或至少7種多肽。
在本發(fā)明的意義內(nèi)術(shù)語“檢測多肽”指優(yōu)選從樣品中存在的其他組分的背景中揭露、顯示、分開和/或允許識別根據(jù)本發(fā)明的多肽的方法。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的并且包括凝膠電泳、層析技術(shù)、免疫印跡分析、免疫組織化學、基于酶的免疫測定法、質(zhì)譜、高壓液相色譜、表面胞質(zhì)團共振，和/或如上述的抗體和蛋白質(zhì)陣列(Ausubel，F(xiàn).A.等人，編輯，1990，當前分子生物學方案(CurrentProtocols in Molecular Biology).Greene Publishing andWiley-Interscience，紐約，USA，第10章；Myszka和Rich 2000，Pharm.Sci.Technol.Today 3310-317)。優(yōu)選地，通過例如用物理剪切或超聲方法破碎細胞從樣品制備蛋白質(zhì)和多肽。蛋白質(zhì)用還原劑處理和加熱變性和穩(wěn)定化并且該蛋白質(zhì)在電泳聚丙烯酰胺凝膠上按大小分級分離。
在本發(fā)明的意義內(nèi)術(shù)語“將步驟(a)中檢測的所述多肽的表達與參比文庫或參比樣品中相同多肽的表達比較”指通過實驗方法如二維凝膠電泳、層析分離技術(shù)、免疫印跡分析、表面胞質(zhì)團共振、免疫組織化學、和基于酶的免疫測定法在定量或定性水平上比較兩組所述多肽的表達。在二維凝膠電泳中，根據(jù)本領(lǐng)域中技術(shù)人員熟知的方法，所有多肽首先根據(jù)第一電泳維中的等電點分離然后通過大小分離。此外，還包括將步驟1中所檢測的至少一種多肽的數(shù)據(jù)與如上定義的參比文庫中多肽的表達比較。
術(shù)語“鑒定與參比文庫或參比樣品相比，在從患者分離的樣品中差別表達的所述多肽”在本發(fā)明的意義內(nèi)被理解為表示選擇與參比文庫或參比樣品相比差別表達的所述多肽，該選擇滿足下面的標準與參比文庫或參比樣品相比所檢測的多肽的差別表達水平被上調(diào)高約2倍，優(yōu)選高約5倍，更優(yōu)選高約10倍。
術(shù)語“將步驟(c)中鑒定的所述多肽與病理學參比樣品或病理學參比文庫中差別表達的所述多肽匹配”在本發(fā)明的意義內(nèi)被理解為指步驟(c)中鑒定的所述多肽與病理學參比樣品或病理學參比文庫中差別表達的所述多肽相比。然后，也在病理學參比樣品或病理學參比文庫中差別表達的步驟(c)中鑒定的所述多肽被匹配，即所述相同對被鑒定和分配。因為病理學參比樣品或病理學參比文庫中所述多肽的差異表達表明根據(jù)本發(fā)明的失調(diào)，所以與樣品中差異表達的這種對應指出該患者患有該失調(diào)。
優(yōu)選地，通過如上述的非侵入性或優(yōu)選最小侵入性方法(包括靜脈穿刺)從患者分離樣品。
在該方法的另一實施方案中，樣品為更上面定義的樣品。參比樣品優(yōu)選為如上定義的參比樣品。
在該診斷方法的另一優(yōu)選的實施方案中，參比文庫是表達文庫或者數(shù)據(jù)庫，其含有關(guān)于樣品中至少一種根本發(fā)明的核酸的非患病表達的克隆或數(shù)據(jù)，所述樣品優(yōu)選可以選自肝臟組織、肝臟細胞、血液、血清、血漿、腹水、胸膜積液、腦脊液、唾液、尿、精液、和糞便。
根據(jù)本發(fā)明的數(shù)據(jù)庫的例子以及根據(jù)本發(fā)明可用的實驗參比文庫如上所述。
在本發(fā)明診斷方法的另一優(yōu)選實施方案中，病理學參比樣品是如上所述的參比樣品。
在該診斷方法的另一優(yōu)選的實施方案中，病理學參比文庫為數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫含有關(guān)于相對于參比樣品或參比文庫中的對照表達，從患有將要在該發(fā)明方法中診斷的根據(jù)本發(fā)明的失調(diào)的至少一個患者(排除處于診斷中的患者)分離的樣品中根據(jù)本發(fā)明的多肽的差別表達的數(shù)據(jù)。該病理學參比數(shù)據(jù)庫還涉及差別表達文庫，該文庫含有相對于參比樣品或參比文庫中的對照表達，從患有將要在該發(fā)明方法中診斷的根據(jù)本發(fā)明的失調(diào)的至少一個患者(排除處于診斷中的患者)分離的樣品中差別表達的根據(jù)本發(fā)明的多肽。適宜的病理學參比文庫的選擇是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。
優(yōu)選地，該肝臟失調(diào)是選自肝硬變、酒精肝疾病、慢性肝炎、威爾遜病、血色素沉著、肝細胞癌、良性肝腫癌和病灶性結(jié)節(jié)性增生癥的失調(diào)。具體地，上皮癌是不同于肝臟的器官的腺癌，該器官優(yōu)選選自肺、胃、腎、結(jié)腸、前列腺、皮膚和乳腺。
根據(jù)本發(fā)明的診斷方法允許肝臟失調(diào)和/或上皮癌的更早檢測，和/或該失調(diào)的非侵入性診斷，該檢測或診斷基于相對于參比文庫，在從患有肝臟失調(diào)和/或上皮癌的動物和/或人類患者分離的樣品中檢測的根據(jù)本發(fā)明的多肽的基本上一致的表達模式。該方法的額外優(yōu)點是其還提供了表征肝臟失調(diào)的不同亞型，如例如HCC的亞型的新的診斷參數(shù)。
術(shù)語根據(jù)本發(fā)明的多肽的“基本一致的表達模式”指如果所比較的患者或受試者分別處于相同的或者相當?shù)牟±頎顩r或者健康狀況下，從患者到患者或者受試者到受試者基本上可以再現(xiàn)的表達模式。
在本發(fā)明的另一方面，提供了含有選自根據(jù)本發(fā)明的多肽、其功能變體、編碼前述多肽之一的核酸、前述核酸之一的變體、為前述核酸之一的非功能突變變體的核酸、具有與前述核酸之一互補的序列的核酸、含有前述核酸之一的載體、含有前述核酸之一的細胞、含有前述載體的細胞、針對前述多肽之一的抗體或該抗體的片段、含有編碼前述抗體的核酸的載體、含有含有編碼前述抗體的核酸的載體的細胞和含有含有編碼前述抗體片段的核酸的載體的細胞中的至少一種化合物的藥物組合物，其與適宜的添加劑或助劑組合或在一起。在優(yōu)選的實施方案中，該藥物組合物含有至少一種根據(jù)本發(fā)明的細胞，其與適宜的添加劑或助劑組合或在一起。
當與本領(lǐng)域肝臟失調(diào)和/或其他上皮癌的療法的狀態(tài)相比時，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物令人驚奇地提供了改良的、持續(xù)的和/或更有效的治療。
按本發(fā)明理解的藥物組合物包括可用于預防和/或治療肝臟失調(diào)和/或上皮癌的藥物。藥物組合物包括，例如，通過細胞系統(tǒng)，優(yōu)選真核系統(tǒng)中的特異抗體基因片段的表達產(chǎn)生的穩(wěn)定的重組抗體。重組抗體治療劑例如，通過注射到患病肝臟區(qū)或靜脈或動脈血管系統(tǒng)中或者肝門靜脈而被遞送?？梢栽谝?guī)則的時間間隔重復注射以實現(xiàn)治療效能。根據(jù)本發(fā)明的治療劑還可以與其他化學品、抗體或其他治療應用組合使用以提高效能。
本發(fā)明還涉及產(chǎn)生用于根據(jù)本發(fā)明的失調(diào)，例如，HCC的治療和/或預防的藥物組合物的方法，其中選自根據(jù)本發(fā)明的多肽、其功能變體、編碼前述多肽之一的核酸、前述核酸之一的變體、為前述核酸之一的非功能突變變體的核酸、具有與前述核酸之一互補的序列的核酸、含有前述核酸之一的載體、含有前述核酸之一的細胞、含有前述載體的細胞、針對前述多肽之一的抗體或該抗體的片段、含有編碼前述抗體的核酸的載體、含有含有編碼前述抗體的核酸的載體的細胞和含有含有編碼前述抗體片段的核酸的載體的細胞中的至少一種組分與適宜的添加劑組合或混合。
本發(fā)明還涉及通過用于根據(jù)本發(fā)明的失調(diào)，例如，HCC的治療和/或預防的方法產(chǎn)生的藥物組合物，其含有選自根據(jù)本發(fā)明的多肽、其功能變體、編碼前述多肽之一的核酸、前述核酸之一的變體、為前述核酸之一的非功能突變變體的核酸、具有與前述核酸之一互補的序列的核酸、含有前述核酸之一的載體、含有前述核酸之一的細胞、含有前述載體的細胞、針對前述多肽之一的抗體或該抗體的片段、含有編碼前述抗體的核酸的載體、含有含有編碼前述抗體的核酸的載體的細胞和含有含有編碼前述抗體片段的核酸的載體的細胞中的至少一種組分，如果適宜，該組分與適宜的添加劑或助劑在一起。本發(fā)明還涉及該藥物組合物的用途，用于肝臟失調(diào)，例如，HCC和上皮癌的預防和/或治療。
優(yōu)選地，該藥物組合物用于治療選自肝硬變、酒精肝疾病、慢性肝炎、威爾遜病、血色素沉著、肝細胞癌、良性肝腫癌和病灶性結(jié)節(jié)性增生癥的失調(diào)。具體地，該藥物組合物用于治療上皮癌，該上皮癌是不同于肝臟的器官的腺癌，該器官優(yōu)選為選自肺、胃、腎、結(jié)腸、前列腺、皮膚和乳腺的器官。
也可以以本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的常規(guī)方式，例如，通過口服應用或者靜脈內(nèi)注射根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物實施治療。從而可能施用含有適宜的添加劑或助劑，如，例如，生理鹽溶液、軟化水、穩(wěn)定劑、蛋白酶抑制劑的藥物組合物。
通過使用自體或異體細胞可以實現(xiàn)治療，該治療基于細胞的使用，該細胞表達至少一種根據(jù)本發(fā)明的多肽、其功能變體或編碼該多肽的核酸，或者其變體。優(yōu)選的細胞包括肝細胞，例如，肝細胞的原代培養(yǎng)物、肝臟定居干細胞或祖細胞，或者血細胞。該細胞可與適宜的載體材料應用于組織，優(yōu)選血液或者注射到肝臟。這種療法優(yōu)選基于如下觀念當根據(jù)本發(fā)明的多肽表達和/或釋放時，該多肽刺激需要該治療的患者中的免疫應答。
優(yōu)選地，該治療方法抑制根據(jù)本發(fā)明的至少一種多肽的功能和/或表達和/或根據(jù)本發(fā)明的至少一種核酸的功能和/或表達。表達和/或功能的這種抑制優(yōu)選顯著降低了所靶定核酸/多肽的表達和/或功能。該表達和/或功能的抑制優(yōu)選消除了所靶定核酸和/或多肽的表達和/或功能。所靶定核酸和/或多肽的表達和/或功能的降低或消除可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的用于確定多肽/核酸的表達和/或功能的常規(guī)測定法確定。具體地，確定該功能的這種測定法包括比較藥物組合物施用之前和之后所靶定的核酸和/或多肽的生物學活性的方法。優(yōu)選地，用于確定表達的這種測定法包括比較藥物組合物施用之前和之后所靶定的核酸和/或多肽的表達水平的方法。
優(yōu)選通過使用具有與根據(jù)本發(fā)明的核酸之一互補的序列的核酸完成這種治療，即，降低或消除根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄的核酸的翻譯從而抑制所靶定核酸/多肽的功能和/或表達的反義分子或RNA干擾分子。優(yōu)選地，具有互補序列的這種核酸可以以載體或者含有這種核酸的細胞的形式使用。在多肽水平上，可以尤其通過使用針對根據(jù)本發(fā)明的多肽的抗體或抗體片段實施治療。該抗體或抗體片段可以直接施用于患者或者優(yōu)選地編碼該抗體的核酸包含在載體中，該載體優(yōu)選包含在細胞中。該細胞或者載體然后可以施用于需要這種治療的患者。
當與肝臟失調(diào)，和/或其他上皮癌的療法的本領(lǐng)域狀態(tài)相比時，根據(jù)本發(fā)明的治療方法令人驚奇地提供了改良的、持續(xù)的和/或更有效的治療。
本發(fā)明還涉及治療肝臟失調(diào)患者的方法，其中選自根據(jù)本發(fā)明的多肽、其功能變體、編碼該多肽的核酸、前述核酸之一的變體、為前述核酸之一的非功能突變變體的核酸、具有與前述核酸之一互補的序列的核酸、含有前述核酸之一的載體、含有前述核酸之一的細胞、含有前述載體的細胞、針對前述多肽之一的抗體或該抗體的片段、含有編碼前述抗體的核酸的載體、含有含有編碼前述抗體的核酸的載體的細胞和含有含有編碼前述抗體片段的核酸的載體的細胞中的至少一種組分，任選與適宜的添加劑和/或助劑組合，以治療有效量被施用于需要這種治療的患者。
優(yōu)選地，該治療方法針對選自肝硬變、酒精肝疾病、慢性肝炎、成爾遜病、血色素沉著、肝細胞癌、良性肝腫癌和病灶性結(jié)節(jié)性增生癥的失調(diào)。該治療方法尤其針對上皮癌，該上皮癌是不同于肝臟的器官的腺癌，該器官優(yōu)選為選自肺、胃、腎、結(jié)腸、前列腺、皮膚和乳腺的器官。
使用這種化合物或細胞的方法已經(jīng)在上面詳細描述。
術(shù)語“治療有效量”指對患者施用導致如上定義的“有效治療”的化合物的量?；衔锏闹委熡行Я康拇_定是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。
這種治療方法允許如上描述的肝臟失調(diào)和/或上皮癌的有效治療。
在本發(fā)明的另一方面提供了刺激患有肝臟失調(diào)和/或上皮癌的患者對根據(jù)本發(fā)明的多肽，或者其功能變體的免疫應答的方法，其中選自根據(jù)本發(fā)明的多肽、其功能變體、編碼前述多肽之一的核酸、前述核酸之一的變體、含有前述核酸之一的載體、含有前述核酸之一的細胞、含有前述載體的細胞中的至少一種組分以有效刺激該患者中免疫應答的量施用于需要這種治療的患者。
當與肝臟失調(diào)和/或其他上皮癌的療法的本領(lǐng)域狀況相比時，根據(jù)本發(fā)明的刺激免疫應答的方法令人驚奇地提供了改良的、持續(xù)的和/或更有效的免疫。
在本發(fā)明的另一方面，提供了防止患者發(fā)生肝臟失調(diào)和/或上皮癌的方法，其中選自根據(jù)本發(fā)明的多肽、其功能變體、編碼前述多肽之一的核酸、前述核酸之一的變體、具有與前述核酸之一互補的序列的核酸、為前述核酸之一的非功能突變變體的核酸、含有前述核酸之一的載體、含有前述核酸之一的細胞和含有前述載體的細胞中的至少一種組分被以治療有效量施用于需要這種預防性治療的患者。
當與肝臟失調(diào)和/或其他上皮癌的療法的本領(lǐng)域狀況相比時，根據(jù)本發(fā)明的預防方法令人驚奇地提供了改良的、持續(xù)的和/或更有效的預防措施。
優(yōu)選地，該預防方法和/或刺激免疫應答的方法針對選自肝硬變、酒精肝疾病、慢性肝炎、威爾遜病、血色素沉著、肝細胞癌、良性肝腫癌和病灶性結(jié)節(jié)性增生癥的肝臟失調(diào)。具體地，該預防方法和/或刺激免疫應答的方法優(yōu)選針對上皮癌，該上皮癌是不同于肝臟的器官的腺癌，該器官優(yōu)選為選自肺、胃、腎、結(jié)腸、前列腺、皮膚和乳腺的器官。
在本發(fā)明的另一方面涉及鑒定至少一種藥學活性化合物的方法，該方法包括下面的步驟a)提供根據(jù)SEQ ID 1到9或SEQ ID 47的至少一種多肽，或者其功能變體，b)將所述多肽與懷疑是藥學活性的化合物接觸，c)測定步驟(a)的所述多肽與懷疑為藥學活性的化合物的相互作用，d)鑒定直接或間接與步驟(a)的所述多肽相互作用的懷疑具有藥學活性的所述化合物。
優(yōu)選地，所述多肽以選自所述多肽附著到柱子、所述多肽粘附到陣列、所述多肽包含在電泳凝膠中、所述多肽粘附到膜和所述多肽被細胞表達等的形式提供。
優(yōu)選通過選自基于酶或熒光的細胞報道分子測定法的方法測定相互作用，其中檢測了懷疑具有藥學活性的化合物與包含步驟(a)的所述多肽的重組融合蛋白之間的相互作用。還優(yōu)選可以通過表面胞質(zhì)團共振、HPLC和質(zhì)譜測定相互作用。直接或間接相互作用優(yōu)選選自誘導所述多肽的表達、抑制所述多肽的表達、激活所述多肽的功能、抑制所述多肽的功能。
術(shù)語“藥學活性物質(zhì)”在本發(fā)明的意義內(nèi)被理解為指在適宜條件下可以與根據(jù)SEQ ID 1到9和/或SEQ ID 47的多肽，或者其功能變體(被SEQ ID 10到19)編碼)相互作用的所有那些分子、化合物和/或組合物和物質(zhì)混合物，如果適宜與適當?shù)奶砑觿┖?或助劑一起。可能的藥學活性物質(zhì)是簡單化學(有機或無機)分子或化合物，但是也可以包括肽、蛋白質(zhì)或它們的復合物。藥學活性物質(zhì)的實例是來自化合物文庫的有機分子，已經(jīng)分析了這些化合物的藥學活性。由于它們的相互作用，藥學活性物質(zhì)可以影響該多肽的體內(nèi)或體外表達和/或功能或者備選地僅僅結(jié)合上述多肽或者以共價或非共價方式進行其他的相互作用。
可以根據(jù)本發(fā)明使用的適宜的試驗系統(tǒng)基于用雙雜交系統(tǒng)(Fields和Stemglanz，1994，Trendsin Genetics，10，286-292；Colas和Brent，1998 TIBTECH，16，355-363)鑒定相互作用。在該試驗系統(tǒng)中，細胞被表達融合蛋白的表達載體轉(zhuǎn)化，該融合蛋白由至少一種根據(jù)本發(fā)明的多肽和轉(zhuǎn)錄因子如Gal4或LexA的DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成。所轉(zhuǎn)化的細胞還含有報道基因，其啟動子含有相應DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合位點。另一表達載體表達由已知的或未知的多肽和活化結(jié)構(gòu)域(例如，來自Gal4或單純皰疹病毒VP16)組成的另一融合蛋白，通過轉(zhuǎn)化該表達載體，如果第二種融合蛋白與所研究的根據(jù)本發(fā)明的多肽相互作用，那么報道基因的表達可被極大地增加表達中的這種增加可以用于鑒定新的相互作用配偶體(例如通過制備來自例如肝臟組織或者患病肝臟組織的cDNA文庫，目的是構(gòu)建第二種融合蛋白)。在優(yōu)選的實施方案中，相互作用配偶體是根據(jù)SEQ ID 1到SEQ ID 9和/或SEQ ID 47(被SEQ ID 10到19編碼)的多肽或者其功能變體的抑制劑。該試驗系統(tǒng)還可用于篩選抑制根據(jù)本發(fā)明的多肽和相互作用配偶體之間相互作用的物質(zhì)。這種物質(zhì)降低正在表達根據(jù)本發(fā)明的多肽和相互作用配偶體的融合蛋白的細胞中報道基因的表達(Vidal和Endoh，1999，Trends in Biotechnology，17374-81)。這樣，可以快速鑒定可用于肝臟失調(diào)和/或上皮癌的治療和/或預防的新的活性化合物。
用于鑒定對蛋白質(zhì)的表達發(fā)揮影響的藥學活性物質(zhì)的測定法是技術(shù)人員熟知的(見，例如，Sivaraja等人，2001，US 6.183.956)。這樣，表達根據(jù)SEQ ID 2的多肽或者功能變體的細胞可以被作為分析體外基因表達的試驗系統(tǒng)培養(yǎng)，優(yōu)選肝臟細胞。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法在例如mRNA或蛋白質(zhì)水平上分析基因表達。這樣，將一種或多種假定的藥學活性物質(zhì)加入到細胞培養(yǎng)物后，測量根據(jù)SEQ ID1到SEQ ID 9和/或SEQ ID 47(被SEQ ID 10到19編碼)的多肽的量并與對照培養(yǎng)物中相應的量比較。這例如通過特異針對SEQ ID 1到SEQ ID 9和/或SEQ ID 47(被SEQ ID 10到19編碼)的多肽或者其功能變體的抗體進行，該抗體可用于檢測細胞裂解物中存在的該多肽。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法使用，例如，ELISA或蛋白質(zhì)印跡可以定量表達的多肽的量。關(guān)于這點，可能實施作為高通量方法的分析并分析非常多的物質(zhì)作為根據(jù)SEQ ID 1到SEQ ID 9和/或SEQ ID47(被SEQ ID 10到19編碼)的多肽的表達的調(diào)制劑的適合性(Sivaraja等人，2001，US 6.183.956)。關(guān)于這點，所要分析的物質(zhì)可以來自物質(zhì)文庫(見，例如，DE19816414，DE19619373)，其可以含有數(shù)千種物質(zhì)，這些物質(zhì)通常是非常異源的。
現(xiàn)在將通過附圖和實施例進一步闡明本發(fā)明，這些附圖和實施例代表本發(fā)明的優(yōu)選實施方案和特征而不限制本發(fā)明。


圖1HCC中RNA表達水平提供了HCC對未患病肝臟在cDNA微陣列實驗中表達值的概括性箱形圖(boxplot)。該箱形圖是表達值比例的log2的圖解表示，中位值通過每個箱子中的水平線指出。每個箱子的范圍表明iqr；觸須表明1.5倍iqr。不落在該范圍內(nèi)的比例用小圓指出。對于根據(jù)本發(fā)明的每種核酸，在HCC中上升的表達是明顯的。除了OBcl5(SEQ ID11)，表達值以相似比例一致地上升，患者和對照樣品中OBcl5的表達差異是最顯著的。
圖2當與正常組織和其他類型的癌相比時HCC中OBcl5的表達特異性通過使用引物OBcl5-p8，SEQ ID 66；OBcl5-p9，SEQ ID 67；和OBcl5-p10，SEQ ID 68，Taqman熒光標記的基因特異探針的摻入和水解監(jiān)視OBcl5特異PCR產(chǎn)物的量。通過定量RT-PCR(Q-PCR)進行的HCC＝A，F(xiàn)NH＝B中OBcl5(SEQ ID 11)表達的定量評定與正常組織(C＝非癌性(正常)肝臟；D＝肺正常；F＝結(jié)腸正常；H＝睪丸正常；J＝肌肉正常；K＝皮膚正常；L＝心臟正常；M＝腎正常)和其他癌(E＝肺癌；G＝結(jié)腸癌；I＝睪丸癌)中的表達模式比較。如Wilcoxon檢驗(選項對＝“假”)進行的Mann-Whitney-U檢驗(非正態(tài)分布數(shù)據(jù)的非參數(shù)檢驗)提供了較大的兩組(HCC)(＝Wilcoxon值，W)的等級的總和并顯示出所有組織樣品中OBcl5分布中的顯著差異(P-值)，如表7中所示。(HCC＝肝細胞癌；FNH＝病灶性結(jié)節(jié)性增生癥；NNL＝非瘤性(正常)肝臟；Lung N＝肺正常；Col N＝結(jié)腸正常；Tst.N＝睪丸正常；Ms.N＝肌肉正常；Skin N＝皮膚正常；Hrt.N＝心臟正常；Kdny.N＝腎正常)和其他癌(Lung C＝肺癌；Col.C＝結(jié)腸癌；Tst.C＝睪丸癌)。
表7各種組織樣品中Obcl5的分布

圖3表示獨立HCC樣品和對照中核酸(SEQ ID 10到19)表達的RT-PCR數(shù)據(jù)在使用每種cDNA模板的平行實驗中包括應用“管家”基因甘油醛磷酸脫氫酶(GAPDH)以控制cDNA質(zhì)量。將進行30-40個PCR循環(huán)的5到10％的RT-PCR反應產(chǎn)物加到瓊脂糖凝膠，這里描繪出溴化乙錠染色的DNA凝膠。從HCC文庫純化的DNA作為根據(jù)本發(fā)明的每種核酸的陽性對照(C)。在該分析中包括兩個獨立的HCC樣品(H)與一種未患病肝臟樣品(N)以代表根據(jù)本發(fā)明的核酸。M＝分子量標準參比物(100bp序列梯)。
圖4A/B通過RNA印跡驗證差別基因表達在如該圖上指示的RNA印跡放射自顯影圖的圖像中，來自三個未患病肝臟(L)和2個HCC組織(H)的庫的RNA樣品的獨立評定證實了OBcl1(SEQ ID 10)和OBcl5(SEQ ID 11)的增加的表達。來自對每種序列(A，頂部；特定信號)特異的反義鏈探針和作為陰性對照(B，底部)的相應有義鏈探針的結(jié)果闡明了反義探針雜交的特異性。
圖5HCC對NNL中OBcl5 RNA定位原位雜交分析檢測肝細胞癌(HCC)和非瘤性肝(NLL)樣品中OBcl5RNA。放射性同位素標記的反義探針(as)與組織切片上OBcl5 RNA特異雜交并通過放射自顯影感光乳劑對切片的顯影來檢測。黑點是來自乳劑的顯影的銀顆粒，指示對OBcl5 RNA的特異雜交?；パa的有義探針(s)盡管具有與反義探針的化學相似性但是不能原位雜交OBcl5RNA。因此，有義探針作為板A和C中的陰性對照而僅檢測到背景信號。OBcl5 RNA在板B中所示的NNL中略微檢測到并在HCC原位中清楚地指示，如通過板D中許多銀顆粒點所證明的。每個板以200倍(200X)的放大率顯示。
圖6OBcl5 RNA表達的siRNA-介導的擊倒將HepG2細胞用對OBcl5 RNA序列特異的siRNA寡核苷酸或者用作為陰性對照的具有相同組成但是被擾亂的序列轉(zhuǎn)染(表10)。這些特異性寡核苷酸與OBcl5 RNA相互作用并使OBcl5 RNA去穩(wěn)定從而減少該RNA在肝癌細胞中的水平，該過程稱為OBcl5 RNA水平的擊倒(knockdown)。在平行轉(zhuǎn)染中使用陰性對照擾亂的寡核苷酸以為隨后的實驗讀出提供對照參比RNA。使用Q-PCR確定與來自三個獨立實驗(A、B和C)的擾亂的寡核苷酸轉(zhuǎn)染的(對照)細胞相比，特異寡核苷酸轉(zhuǎn)染的細胞(實驗的)中OBcl5 RNA和成視網(wǎng)膜細胞瘤蛋白質(zhì)1(RB1)mRNA的表達水平。Y軸代表OBcl5 mRNA剩余活性的log2百分數(shù)值(白色，左柱)；而RB1 mRNA log2比例值指示OBcl5 siRNA轉(zhuǎn)染的細胞與對照寡核苷酸轉(zhuǎn)染的HepG2細胞相比RB 1mRNA的水平的增加倍數(shù)(黑色，右柱)。特異siRNA寡核苷酸介導的OBcl5 RNA的降低是明顯的。實驗細胞而不是對照細胞中RB 1mRNA的上升的水平表明OBcl5表達負調(diào)節(jié)該腫瘤抑制劑mRNA的水平。
圖7組織中的DAP3蛋白質(zhì)表達將蛋白質(zhì)提取物進行免疫印跡分析，該分析使用對DAP和β-肌動蛋白蛋白質(zhì)特異的抗體以確定人組織中這些蛋白質(zhì)的表達水平。用綴合辣根過氧化物酶(HRP)的第二抗體孵育并用化學發(fā)光的HRP底物檢測免疫復合物后，通過光密度分析帶的強度并將每種信號標準化為相應β-肌動蛋白信號的強度。每個泳道中代表的組織在表8中定義，表8還包括這些組織中DAP3蛋白質(zhì)水平的定量分析。這些分析指出DAP3蛋白質(zhì)(HCC中被特異上調(diào)的DAP3 mRNA的功能產(chǎn)物)在HCC中也高度過表達。
表8圖7中檢查的組織和人組織提取物中DAP3蛋白質(zhì)表達水平的光密度定量。

圖8HCC去調(diào)節(jié)的基因的表達與肝癌細胞增殖的相關(guān)性對靜止細胞用血清刺激8小時(黑色柱)和12小時(白色柱)之后肝癌細胞(Hep3B)中根據(jù)本發(fā)明的靶標基因序列的增殖依賴的表達。提供了來自cDNA微陣列實驗讀出的血清-刺激的對靜止表達的log2-轉(zhuǎn)化的比例。與靜止肝癌細胞相比增殖肝細胞中這些序列表達水平的實質(zhì)性增加表明這些序列對于肝癌細胞生長在功能上是重要的。
具體實施例方式
實施例實施例1HCC扣除cDNA文庫的制備根據(jù)標準方法(Chomczynski和Sacchi，1987，Anal.Biochem.162156-159)使用TRIZOL試劑(Invitrogen)從三個病理學家證實的HCC腫瘤樣品和三個病理學家證實的未患病人肝臟樣品分離RNA。用于產(chǎn)生cDNA文庫的組織來自被通知關(guān)于該組織用于研究目的，包括商業(yè)研究的特定知情同意的患者。按照Clontech實驗室的“PCR選擇cDNA扣除試劑盒”中的使用說明中描述的反轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶將mRNA轉(zhuǎn)化成雙鏈cDNA。為了富集HCC中特異增加和減少的cDNA，通過根據(jù)該試劑盒中提供的使用說明的扣除抑制雜交(SSH)和Diatchenko等人(1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 936025-6030)所描述的除去在參比肝臟庫和HCC中以共同和相似水平表達的cDNA。在兩個方面實施SSH步驟(從HCC cDNA扣除未患病的肝臟cDNA和從未患病的肝臟cDNA扣除HCC cDNA)從而所得cDNA分子代表在HCC中被上調(diào)的和被下調(diào)的核酸序列但是不代表未差別表達的那些核酸序列。另外，產(chǎn)生標準化但是未扣除的HCC cDNA文庫以更好地代表HCC組織中的稀有mRNA轉(zhuǎn)錄物。這些cDNA通過連接到該質(zhì)粒而被單獨克隆到pCRII載體(Invitrogen)然后通過電泳轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XL-1-Blue電穿孔-感受態(tài)細胞(Stratagene)中。按照載體和感受態(tài)細胞的供應商所描述的實施克隆。將克隆的差別表達的cDNA涂在選擇(氨芐西林)培養(yǎng)基上以分離單個克隆。從每個SSH文庫分離960個克隆，從標準化HCC文庫分離到576個克隆，并在96-孔微量滴定板中建立培養(yǎng)物。這些cDNA克隆一起提供了對人HCC組織特異的mRNA表達的獨特代表。
實施例2HCC cDNA微陣列的制備和雜交建立SSH cDNA文庫克隆的1ml培養(yǎng)物并將通過使用對cDNA插入片段側(cè)翼的載體序列特異的引物進行的PCR擴增cDNA插入片段插入。M13正向(5′-GTAAAACGACGGCCAG-3′；SEQ ID 20)和M13反向引物(5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′；SEQ ID 21)用于克隆插入片段的PCR擴增。將50微升細菌培養(yǎng)物在95℃熱變性10分鐘，離心除去碎片，并且在標準PCR[1X Amplitaq PCR緩沖液，2.5mM MgCl2，37.5nM每種引物，0.5mM每種dATP、dCTP、dGTP和dTTP和1.5單位AmplitaqDNA聚合酶(Applied Biosystems)]中包含2μl上清液。反應條件為95℃5分鐘然后是35個如下循環(huán)94℃30秒，60℃30秒，72℃60秒；然后72℃7分鐘并冷卻到4℃。通過在含有0.4μg/ml溴化乙錠的1％瓊脂糖凝膠上5％PCR的電泳并在1×Tris乙酸EDTA(TAE；40mMTris-乙酸鹽，1mM EDTA，pH7.5)中運行來證實cDNA插入片度的擴增。使用Genetic Microsystems 417cDNA陣列機器人將每種SSH克隆擴增的插入序列固定到唾液酸化(sialinized)的玻璃顯微載玻片(GAPS Coming)上以產(chǎn)生定制的HCC cDNA微陣列。將cDNA插入片段點到玻片的方案是根據(jù)Hedge等人(2000，Biotechniques 29548-560)所公布的只是所點的PCR產(chǎn)物直接來自PCR微量滴定板而不純化或者調(diào)節(jié)cDNA緩沖液。除了SSH cDNA克隆插入片段，許多對照DNA被點到微陣列上作為雜交反應的對照。此外，相應于以前報導與癌相關(guān)的基因的約2000個可以公開得到的cDNA克隆購買于德國基因組研究中心(German Genome Research Center(RZPD))，如上述的將這些克隆擴大(expand)、擴增并點到這些微陣列上。為了制備雜交探針，使用反轉(zhuǎn)錄酶根據(jù)標準方法(Hedge等人，2000，Biotechniques 29548-560)將20微克來自額外的病理學證實的肝臟失調(diào)的RNA和來自相同量的合并的未患病的肝臟RNA分別轉(zhuǎn)化成cy5-熒光-標記的和cy3-熒光標記的cDNA(cy5-CTP和cy3-CTP，Pharmacia)。使用該方案，這些標記的cDNA競爭性地雜交到HCC微陣列。在5×SCC(0.75M檸檬酸鈉，75mM檸檬酸鈉，pH7.0)；0.1％SDS(十二烷基硫酸鈉)和1％BSA(牛血清白蛋白)中42℃預雜交45分鐘后，在含有50％甲酰胺、5×SSC，和0.1％SDS的緩沖液中42℃進行過夜雜交。雜交的載玻片在嚴格條件中洗滌(每個在1×SSC、0.1％SDS中42℃洗滌兩次，每次2分鐘；每個在0.1×SSC、0.1％SDS中室溫下洗滌兩次，每次4分鐘；每個在0.05×SSC中室溫下洗滌兩次，每次2分鐘)，干燥并用Genetic Microsystem 418cDNA微陣列掃描儀和相關(guān)的Imagene 4.1成像分析軟件根據(jù)生產(chǎn)商的推薦分析。
實施例3根據(jù)本發(fā)明的核酸和多肽的差別表達的獨立驗證如上詳述的從人類患者樣品分離RNA。用于該分析的HCC樣品不是來自與用于產(chǎn)生HCC SSH文庫或者cDNA微陣列芯片雜交(見上面的實施例，表3A/3B，4和圖1)相同的患者。除了HCC樣品，從獨立的未患病的肝臟樣品制備RNA以評價未患病肝臟組織中根據(jù)本發(fā)明的核酸的表達。此外，從另外的未患病的和癌組織制備RNA以評價其他正常人組織和其他人類癌中根據(jù)本發(fā)明的核酸的表達。使用本領(lǐng)域中公知的標準方法(Sambrook等人，分子克隆(Molecular Cloning)，第二版，1989，冷泉港出版社，NY，美國，5.52-5.55頁)通過Superscript反轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)在dATP、dCTP、dGTP、和dTTP(每種0.4mM)、7.5nM隨機6-核苷酸引物(六聚體)、10mM二硫蘇糖醇和1單位RNA酶抑制劑中將1μg RNA轉(zhuǎn)變成單鏈cDNA。然后在PCR實驗中通過用對根據(jù)本發(fā)明的每種核酸特異的引物對從cDNA擴增這些序列來確定根據(jù)本發(fā)明的核酸的存在與否。用于該分析的引物在下面的表9中給出。
表9RT-PCR引物與它們各自SEQ ID號

這些引物也可用于根據(jù)本發(fā)明的失調(diào)的診斷，但是技術(shù)人員也可以設計對根據(jù)本發(fā)明的給定核酸特異的其他引物。該PCR包括0.5％cDNA、1×Amplitaq PCR緩沖液、2.5mM MgCl2、37.5nM每種引物、0.5mM每種dATP、dCTP、dGTP和dTTP和1.5單位Amplitaq DNA聚合酶(Applied Biosystems)。按照每種引物對所需優(yōu)化PCR條件，通常為94℃3分鐘和30個如下循環(huán)94℃15秒，60℃30秒，72℃60秒，然后冷卻到4℃。通過在含有0.5μg/ml溴化乙錠的1％瓊脂糖凝膠上5-10％PCR的電泳并在1×Tris乙酸EDTA(TAE)緩沖液上運行來證實cDNA插入片度的擴增。包括cDNA合成前樣品的RNA酶處理以及反轉(zhuǎn)錄酶的缺失的RT-PCR標準對照常規(guī)地展示了這些反應的特異性。根據(jù)在凝膠上是否觀察到正確的分子大小的離散帶為反應的表達(+)或無表達(-)打分。在這些條件下非常弱的或者模糊的帶記為(+/-)。HCC和未患病肝臟中這些驗證研究的概述在表6中給出。在圖3中提供了代表獨立HCC和未患病肝臟樣品中這些分析的數(shù)據(jù)。
定量RT-PCR(Q-PCR)也證實了相對于未患病肝臟在肝癌和其他肝臟失調(diào)中根據(jù)本發(fā)明的序列的過表達。對于這些研究，使用如在實施例5中詳細描述并在圖2和6中圖解的使用TaqMan水解引物策略和SYBR Green插入染料策略。
在圖4中圖解了根據(jù)本發(fā)明的核酸的差別表達的另外的獨立的確證。在該情況中，將來自兩個HCC樣品和未患病肝臟的15μg RNA在1％瓊脂糖凝膠上進行變性電泳分離，該瓊脂糖凝膠含有2.2M甲醛和1×MOPS緩沖液(10mM 4-嗎啉丙烷磺酸、1mM EDTA、5mM乙酸鈉，pH7.0)，電泳在1×MOPS緩沖液中運行。使用RNA(northern)印跡技術(shù)將按大小分級的變性RNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜(GeneScreen，New EnglandNuclear)并將該變性RNA用紫外光交聯(lián)到膜，所有的都根據(jù)技術(shù)人員熟知的方法(Sambrook等人，分子克隆，第二版，1989，冷泉港出版社，NY，Press，NY，USA，7.39-7.52頁)。通過前面實施例中描述的PCR擴增從OBcl1和OBcl5(SEQ ID No.10和11)的SSH克隆分離cDNA克隆插入片段。在1×標記緩沖液0.5mM ATP、CTP、GTP、10mM二硫蘇糖醇中α-32P-UTP存在下，使用SP6和T7RNA聚合酶，和20單位適宜的RNA聚合酶37℃35分鐘從該模板合成相應于這些序列的單鏈放射性標記的RNA探針。所得反義探針與相應的mRNA序列互補并從而預期特異雜交RNA印跡上的mRNA序列。相反地，有義探針序列與該mRNA的序列匹配從而不雜交該mRNA。相同的RNA印跡在15ml 250mM磷酸二氫鈉、250mM磷酸氫二鈉、7％SDS、1Mm EDTA和1％BSA中68℃下預雜交至少30分鐘。為了雜交，除去預雜交緩沖液并用含有上述有義和每種反義RNA探針的相同緩沖液代替，在68℃過夜。RNA印跡被在嚴格條件(2×SSC，0.1％SDS室溫下洗滌兩次，每次15分鐘；1×SSC，0.1％SDS 68℃兩次，每次10分鐘)下洗滌，干燥并暴露于x-射線薄膜以產(chǎn)生放射自顯影照片。如在圖4中所看到的，每種反義探針特異雜交離散的HCC RNA但是僅僅微弱的或者根本不雜交未患病的肝臟RNA。這些結(jié)果的特異性通過缺少來自OBcl1和OBcl5的相應有義探針的特異性信號闡明。此外，使用OBcl1反義探針，不同分子量的RNA是明顯的。該結(jié)果最可能代表離散的mRNA種類，其可能由備選剪接產(chǎn)生。基于如下發(fā)現(xiàn)預期這些種類在GenBank序列數(shù)據(jù)庫中報導相應于該序列的一些不同大小的cDNA克隆。
此外，原位雜交揭示當與NNL組織樣品相比時HCC中的強OBcl5RNA表達。根據(jù)Fickert等人(Am J Pathol.2002年2月；160(2)491-9.)的方案，如上述的合成用于RNA印跡的S35-標記的探針。用于體外轉(zhuǎn)錄的模板從含有OBcl5 3’cDNA的質(zhì)粒擴增。用于產(chǎn)生體外轉(zhuǎn)錄模板的引物(MWG Biotech，Munich，德國)為OBcl5-p6正向引物(5’-aatctgcaagccaggaagagt-3’，SEQ ID 48)和M13for(5’-gtaaaacgacggccag-3’，SEQ ID 20)，它們針對包括兩個外顯子的橫跨OBcl5RNA的365個堿基的T7反義探針(SEQ ID 11從核苷酸95到484)；和M13rev(5′-caggaaacagctatgac-3′，SEQ ID 21)和OBcl5-p7反向引物(5′-tctagtttcagttttgatgatattttg-3′，SEQ ID 49)，它們針對包括兩個外顯子的橫跨OBcl5序列的436個堿基的SP6有義探針(SEQ ID No 11從核苷酸436到1)。為了擴增這些模板，用AppliedBiosystems Gene Amp PCR System 270進行PCRs，其包括10pM正向引物、10pM反向引物、1pM dNTPs(Invitrogen)、PCR緩沖液II、5m M MgCl2(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)、217ng模板質(zhì)粒DNA、2.5U AmpliTaq聚合酶(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)，通常為94℃3分鐘，94℃30秒，50℃30秒，72℃50秒，最后3步重復25次，然后72℃3分鐘用于最后的延伸。PCR產(chǎn)物中DNA的量通過光譜測定法使用Smart Spec 3000(BIO-RAD，Hercules，CA)確定。使用轉(zhuǎn)錄緩沖液(Boehringer Mannheim，德國)中的每種模板200ng、100mM二硫蘇糖醇(DTT)、1mM每種rNTP、RNA酶抑制劑(Eppendorf，Hamburg，德國)、α-S35-UTP(Amersham Bioscience)、RNA-聚合酶SP6/T7(Boehringer Mannheim)，在37℃下實施體外轉(zhuǎn)錄測定法2小時。除去未摻入的核苷酸(無RNA酶的MicroSpin S-200HR柱，AmershamBioscience，Buckinghamshire，UK)，模板DNA用2單位無RNA酶的DNA酶在37℃消化10分鐘。為了得到150bp的平均探針大小，使用水解緩沖液(400mM NaHCO3，600mM Na2CO3，100m MDTT)在60℃水解42分鐘并在0.1M乙酸鈉、10mM DTT和1％冰乙酸中中和。轉(zhuǎn)錄探針用LiCl/異丙醇沉淀并重懸在含有25mM DTT的50％甲酰胺中。HCC的和非瘤性正常肝切片的石蠟包埋的組織學證實的樣品在Microm HM 355S切片機(Microm，Waldorf，德國)上以2.5微米切割并以每個載玻片2個切片在Superfrost載玻片(Menze1-Glser，Braunschweig，德國)上封片。所有切片過夜干燥，將干燥的切片加熱到60℃1小時并在二甲苯中脫蠟30分鐘。用100％、90％、70％和50％的梯度乙醇進行脫水，然后在Tris緩沖液(TBS緩沖液)中洗滌4次，每次3分鐘，然后將切片在含有4％低聚甲醛的磷酸緩沖液(PBS緩沖液)中固定。幾次PBS洗滌后，將切片在0.2M HCl中變性10分鐘并在TBS中再洗滌4次，每次3分鐘。37℃下在含有2mM CaCl2的TBS中20μg/ml無RNA酶的蛋白酶K(F.Hoffman La Roche Ltd.Basel，瑞士)中消化蛋白質(zhì)20分鐘。通過將載玻片在4℃TBS中孵育5分鐘終止反應。隨后，將切片在TBS緩沖液中室溫下再次洗滌3次，每次4分鐘，并在含有乙酸酐的0.1M Tris緩沖液(pH8)中孵育。切片在50％、70％、90％、100％梯度乙醇并最后在氯仿中脫水，然后空氣干燥2小時。為了雜交，將標記的探針(1×106cpm/切片；探針放射活性用LKBWallac確定，1211RACKBETA液體閃爍計數(shù)器)在50μl/切片雜交緩沖液中稀釋，該雜交緩沖液含有12.5mM pH6.8的磷酸緩沖液、12.5mM Tris、0.4M NaCl、3mM EDTA、1.25×Denhardts溶液、50％甲酰胺、12.5％葡聚糖硫酸鹽、0.1M DTT、100nM S-rATP(Boehringer Mannheim)、60ng酵母tRNA，和20ng聚腺苷酸(Boehringer Mannheim)。切片在52℃在含有2×標準檸檬酸鹽溶液(SSC)pH7和50％甲酰胺的濕室中過夜雜交。然后，切片用甲酰胺緩沖液(10mM磷酸緩沖液pH6.8、10mM Tris-HCl pH7.7、0.3M NaCl、5mM EDTA、0.1×Denhardt s溶液、0.07％β-巰基乙醇，和50％甲酰胺)洗滌兩次，分別為1小時和2小時。此后切片在10mM Tris-HCl pH7.4、0.5M NaCl、2.5mM EDTA和0.07％β-巰基乙醇中洗滌兩次，每次15分鐘。在含有20μg/ml RNA酶A(Boehringer Mannheim)的相同緩沖液中38℃下實施RNA酶處理30分鐘，然后在37℃用甲酰胺洗滌緩沖液洗滌過夜。切片隨后在2×SSC和0.07％β巰基乙醇中45℃下洗滌30分鐘，然后在0.1×SSC和0.07％β巰基乙醇中45℃下再洗滌30分鐘。此后切片在50％、70％、90％、100％的梯度乙醇中脫水并空氣干燥。最后，載玻片在Ilford K2光乳劑(Ilford Ltd.Mobberly，Cheshire，UK)中包被。10、14和17天的曝光后，用KodakD 19顯影劑(Eastman Kodak，Rochester NY)進行顯影。切片用蘇木精復染色并在水性封片介質(zhì)(Aquatex-EM Science，Gibbstown，NJ)中封片。顯影暗點，來自乳劑的銀顆粒指示對OBcl5RNA的特異雜交(圖5)?；パa有義探針盡管具有與反義探針的化學相似性但是不能原位雜交OBcl5RNA。所以有義探針作為陰性對照(圖5，板A和C中)，其中僅僅檢測到背景信號。OBcl5RNA在NNL中略微檢測到(圖5中所示，板B中)并在HCC原位清楚的指示，如通過大量銀顆粒點所證明的(圖5，板D中)。
此外，蛋白質(zhì)表達分析指出DAP3蛋白質(zhì)(HCC中特異上調(diào)的DAP3mRNA的功能產(chǎn)物)也在HCC中特異地上調(diào)。為了檢測各種組織中DAP3蛋白質(zhì)表達，使用來自冰凍組織(貯存在液氮中)的蛋白質(zhì)提取物進行標準蛋白質(zhì)印跡分析，見圖7。使用冰凍切片機(cyrocut，LeicaCM3050)得到50μm切片(HCC，正常肝臟和各種器官樣品)，其中在每個切割過程之前、之間和之后通過切片的H&E染色檢驗所細查的組織的同一性和同質(zhì)性。將組織切片重懸在補加2μg/ml亮抑蛋白酶肽、2μg/ml胃蛋白酶抑制劑、2μg/ml抑酶肽、1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)、和2mM二硫蘇糖醇的冰冷卻的RI PA緩沖液(50mM Tris-HCl pH7.4，250mM NaCl，0.1％SDS，1％脫氧膽酸鹽，1％NP-40)中然后通過在冰上超聲(5秒的2次猝發(fā))處理勻漿。在冰上孵育20分鐘后，通過在微離心機中4℃下以13000rpm 15分鐘的兩個離心步驟使裂解物澄清并收集上清液。通過Bradford測定法(Biorad)使用牛血清白蛋白作為標準確定蛋白質(zhì)濃度。等量蛋白質(zhì)(通常10-30μg)在12％SDS-PAGE凝膠上分離并通過半干印跡(TE70，Amersham)電泳轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Hybond-P，Amersham)。將膜在封閉溶液[TBS-T(25mM Tris-HCl pH7.4，137mM NaCl，3mM KCl，含有0.1％Tween-20)中5％奶]中室溫下封閉1小時并在攪拌下與第一抗體溶液(在TBS-T/1％奶中制備)在4℃孵育過夜。使用對下面的抗原特異的抗體∶DAP 3(1∶1000；BD Transduction Laboratories)和β-肌動蛋白(1∶5000，Sigma)。除去第一抗體溶液并在TBS-T中幾次洗滌后，將膜與綴合HRP(辣根過氧化物酶)的第二抗體(兔抗鼠1∶1000；Dako)在室溫下孵育1小時。在TBS-T中洗滌幾次后，通過化學發(fā)光(ECL，Amersham)并使x-光片曝光進行檢測(圖7)。使用ChemiImager 5500軟件(AlphaInnotech)以光密度法分析帶的強度并將每種信號標準化到相應于β-肌動蛋白信號的強度(表8)。
這些數(shù)據(jù)提供了HCC中根據(jù)本發(fā)明的核酸和多肽的去調(diào)節(jié)表達的獨立驗證。根據(jù)本發(fā)明的核酸和多肽的表達在未患病肝臟中或者不存在或者僅以非常低的水平被觀察到，從而證實了通過雜交到cDNA微陣列鑒定的這些核酸的差別表達。這些結(jié)果提供了令人驚奇的證明，即根據(jù)本發(fā)明的核酸和多肽可用于診斷、預防和/或治療根據(jù)本發(fā)明的失調(diào)。
實施例4在正增殖的肝癌(肝細胞瘤)細胞系中根據(jù)本發(fā)明的序列增加在5％CO237℃的濕潤培養(yǎng)箱中補加10％胎牛血清(FBS)的DMEM中培養(yǎng)人肝癌細胞系(HepG2，Hep3B)。細胞分離到約20％融合并隨后通過在沒有血清時培養(yǎng)3天使細胞靜止。在饑餓期后，通過向培養(yǎng)基中加入10％FBS刺激細胞增殖。在誘導細胞生長之前和之后(0、8和12小時)采樣用于制備RNA和用于通過FACS(熒光激活細胞分類術(shù))分析確定細胞在細胞周期中的位置。因此，為了通過碘化丙錠(PI)染色確定細胞周期分布，將細胞通過胰蛋白酶消化收獲，以磷酸緩沖液(PBS)洗滌兩次并最后重懸在500μl PBS中。隨后，加5ml預冷卻的甲醇。在-20℃孵育10分鐘后，將細胞懸浮物直接用于FACS分析，之后在PBS中洗滌3次，重懸在500μl碘化丙錠(PI)染色緩沖液(DNA-Prep Stain，Part No.6604452；Beckman Coulter)中并在37℃孵育15分鐘。最后，加入70μl 1M NaCl并在EPICS XL-MCL流式細胞儀(Beckman Coulter)上分析前將樣品保持在避光保護的冰上。從異步(asynchronous)細胞群體制備的細胞用作參比。
所分離的RNA用于通過cDNA微陣列分析監(jiān)測靜止的與正在增殖的肝癌細胞中基因的表達。如實施例2中描述的用熒光染料標記后，將RNA在特定開發(fā)的HCC-特異性cDNA微陣列芯片上雜交，該微陣列芯片還含有對照基因，已知這些對照基因以獨立于細胞周期的方式表達。最后，使用ImaGene 4.1和GeneSight軟件包分析數(shù)據(jù)。加入血清前分離的0小時樣品所得到的信號用作參比。在圖8中提供了來自cDNA實驗讀出的血清刺激的與靜止表達的log2-轉(zhuǎn)化的比例。
這些數(shù)據(jù)指出根據(jù)本發(fā)明的序列與人肝臟腫瘤細胞增殖相關(guān)。與本領(lǐng)域的狀況相比，這些核酸和多肽因此令人驚奇地允許肝臟失調(diào)和/或上皮癌的改良的、更敏感的、更早、更快和/或非侵入性診斷。
實施例5根據(jù)本發(fā)明的序列的升高的表達在肝臟失調(diào)，特別是肝癌中的功能上的重要角色詳細的序列分析揭示了OBcl5 RNA和真核生物非編碼RNA之間的序列相似性。此外，用多種方法檢測來自該RNA的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的多種嘗試都沒有揭示這種產(chǎn)物。因此，該RNA可能不被翻譯成多肽而是其自身具有功能(例如，調(diào)節(jié)的)性質(zhì)。使用根據(jù)TransMessenger轉(zhuǎn)染試劑手冊(TransMessenger Transfection Reagent Handbook)(Qiagen，10/2002)的方案，實施了用小干涉RNA(siRNA)寡核苷酸(siRNA介導的OBcl5 RNA的擊倒)減少正在增殖的人肝癌細胞中OBcl5 RNA的水平。設計雙鏈小干涉RNA(siRNA)寡核苷酸探針(表10)用于相應于OBcl5(SEQ ID 11)的RNA水平的原位耗盡并且該雙鏈小干涉RNA寡核苷酸探針由Qiagen提供。
表10雙鏈小干涉RNA(siRNA)寡核苷酸探針
。
接種HepG2細胞(每孔密度為3×104個細胞)并在37℃孵育24小時并根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明(Invitrogen方案)將這些細胞用1.5μlOligofectamine試劑(Invitrogen)和2.5μl 20μM雙鏈siRNA寡核苷酸母液轉(zhuǎn)染。孵育24小時后，如實施例2中描述的分離總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。通過將熒光標記的引物或者包括Taqman探針水解系統(tǒng)和熒光雙鏈DNA插入分子如SYBR綠的各種基于熒光的指示劑的摻入來監(jiān)視PCR產(chǎn)物。根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明(GeneAmp5700序列檢測系統(tǒng)，用戶手冊；PE Biosystems)進行實驗。因此，如下使用5700序列檢測系統(tǒng)(Applera)進行基于TaqMan方法的實時定量RT-PCR分析如實施例3中描述的將500ng總RNA反轉(zhuǎn)錄并且該cDNA模板的1∶4稀釋液用于Q-PCR(相應于6.25ng RNA)，30μl終體積中包括5-8pmol/μl每種引物。根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明使用Q-PCR的溫度，使用40個循環(huán)。進行一式三份的反應。
使用7000序列檢測系統(tǒng)(Applera)進行基于SYBR-綠的方法的實時Q-PCR分析。根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明用SYBR-Green Universal PCRMaster Mix(Applera)進行PCR，使用相應于如上6.25ng RNA的cDNA、和每種引物的經(jīng)驗確定的量(RB和β-肌動蛋白，反應樣品中10pmol每種引物)，終體積30μl。根據(jù)使用說明手冊使用SYBR-RT-PCR的溫度。這些反應也循環(huán)40次并進行一式三份反應。通過Q-PCR使用GAPDH或者β-肌動蛋白RNA水平的平行Q-PCR確定作為參比在基于如前述的TaqMan(所用GAPDH引物＝GAPDH-p1，SEQ ID 56；GAPDH-P2，SEQID 57；GAPDH-p3，SEQ ID 58)(所用β-肌動蛋白引物＝bActin-p1，SEQ ID 59；bActin-p2，SEQ ID 60；bActin-p3，SEQ ID 61)或者SYBRGreen(用作SYBR green分析的參比的β-肌動蛋白引物＝bActin-p4，SEQ ID 62；bActin-p5，SEQ ID 63)的分析中確定靶標RNA水平(在該情況下為OBcl5 RNA)擊倒的百分比。根據(jù)Pfaffl(NucleicAcids Research(2001)5月1日，29(9)e45)描述的方法確定RNA水平的改變。
在其中肝細胞中OBcl5 RNA的水平被擊倒的實驗中，已確定當OBcl5 RNA水平降低時，編碼該腫瘤抑制基因成視網(wǎng)膜細胞瘤蛋白質(zhì)1(RB1)的mRNA的水平被以劑量依賴的方式上調(diào)數(shù)倍(圖6)(所用RB1Q-PCR引物＝RB1-p1，SEQ ID 64；RB1-p2，SEQ ID 65)。可得到清楚的結(jié)論HCC中OBcl5 RNA的上升的表達可以提供RB1的負調(diào)節(jié)并因此促進腫瘤細胞生長。從而，用siRNA寡核苷酸降低正在增殖的人肝癌細胞中OBcl5 RNA的水平(擊倒)證明了肝臟失調(diào)，特別是肝癌中OBcl5 RNA的上升的表達的功能上的重要作用。
另一實驗，其中設計了用以擊倒肝癌細胞中DAP3 mRNA(SEQ ID 14)的siRNA寡核苷酸，提供了令人驚奇的形態(tài)學影響(表10中提供了用于DAP3 siRNA擊倒研究的oligo序列)。在DAP3 siRNA oligo處理的細胞中而不是同樣地但是使用其他siRNA oligo(如擾亂的序列siRNA oligo對照)處理的細胞中，觀察到細胞形態(tài)學的極大改變，包括細胞體積的變大。這些被處理的細胞保持粘附到培養(yǎng)基質(zhì)，但是還觀察到使用這些實施例中描述的標準方法不能從這些被處理的細胞中提取RNA和蛋白質(zhì)。在同樣處理的肝癌細胞中用相似的siRNA oligo處理卻沒有這種效果，這證明這些觀測是肝癌細胞中DAP3mRNA水平的擊倒所特有的。因此DAP3 mRNA的過表達對于肝癌細胞的活力可能是關(guān)鍵的。這些觀察進一步證明DAP3在肝腫瘤細胞中的功能上的重要作用。
這些結(jié)果進一步令人驚奇的證明根據(jù)本發(fā)明的核酸和/或多肽可用于診斷、預防和/或治療根據(jù)本發(fā)明的失調(diào)。
實施例6使用HCC特異探針的診斷方法可以建立優(yōu)選基于聚合酶鏈式反應(PCR)的根據(jù)本發(fā)明的失調(diào)的診斷方法。本發(fā)明的核酸序列的標準PCR檢測足夠鑒定，例如，患者血流中循環(huán)的HCC腫瘤細胞。然而，腫瘤活檢材料(如來自細針活檢)中本發(fā)明的核酸序列的表達的檢測將也是該診斷方法的優(yōu)選的指示劑。本發(fā)明的核酸序列，例如，OBcl5(SEQ ID 11)，在多數(shù)患病組織中沒有檢測到并且在例如HCG中相對特異的表達。還證明了肝硬變和HCC中該核酸的上升的表達，指出這種方法用于肝臟疾病診斷的潛在的辨別力(圖1，2，5和表5A/B)。
PCR診斷將優(yōu)選需要約1pg，優(yōu)選至少100ng，更優(yōu)選至少1μg從患者材料分離的RNA。在優(yōu)選的利用中，將根據(jù)標準方法從來自例如優(yōu)選通過最小侵入性靜脈穿刺方法得到的循環(huán)血液的白細胞級分分離RNA。在該優(yōu)選的情況中，該方法將檢測血液循環(huán)系統(tǒng)中HCC腫瘤細胞的存在?？梢灶愃频貜母闻K活檢材料分離RNA。
對于OBcl5的特異檢測，例如，PCR診斷法可以包括對OBcl5核酸特異的幾種引物，包括用于從患者樣品產(chǎn)生的RNA合成cDNA的特異反義引物(引物OBcl5-p1；5′-GCCACAGGTTGAACACTTAATTTG-3′；SEQID 42；來自SEQ ID 11的核苷酸350-327)。類似地，特異PCR引物為例如，OBcl5-p2(5′-AGGAAGAGTCGTCACGAGAACC-3′；SEQ ID 43；來自SEQ ID 11的核苷酸107-128)和OBcl5-p3(5′-ATAATGCTGTGCTTAGTTTATTGCC-3′；SEQ ID 44；來自SEQ ID 11上的核苷酸313-289)。通過提供對OBcl5核酸插入片段特異并在引物OBcl5-p2和-p3內(nèi)部(巢式)的另外的引物組(例如OBcl5-p4；5′-GATCGTGGACATTTCAACCTC-3′；SEQ ID 45；來自SEQ ID 11上的核苷酸147-167；和OBcl5-p5；5′-TCTTGCTTGATGCTTTGGTC-3′；SEQ ID 46；來自SEQ ID 11上的核苷酸280-261)可以提高敏感性、特異性和質(zhì)量控制。使用TaqMan Q-PCR，利用例如OBcl5-8，SEQ ID 66(5′-ATCTGCAAGCCAGGAAGAGTC-3′)；OBcl5-p9，SEQ ID 67(5′-CTTGCTTGATGCTTTGGTCTGT-3′)；和OBcl5-p10，SEQ ID 68，(5′-CCAGACCATGCAGGAACTCTGATCGTGGAC-3′)也可以在如圖2中圖解的檢測策略中實現(xiàn)OBcl5mRNA水平的定量評定。
可以從患者RNA樣品制備cDNA，之后用無RNA酶的DNA酶-1(Roche)消化RNA以消除基因組DNA的潛在污染。通過包含用于從OBcl5基因的不同外顯子的序列擴增的引物，從而來自基因組DNA模板的PCR產(chǎn)物(由此不反映相應于OBcl5的mRNA的表達)將大于RNA特異的PCR產(chǎn)物，從而進一步控制污染可能性。通過例如OBcl5特異的OBcl5-p1(約1μM)，利用反轉(zhuǎn)錄酶[如約2單位/反應的Maloney鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶(Roche)]在適宜的緩沖液如50mM Tris-HCl、6mM MgCl2、40mM KCl、和10mM二硫蘇糖醇，pH8.5中引發(fā)cDNA合成。cDNA合成反應中還需要的是dATP、dCTP、dGTP和dTTP，每種約1mM，RNA酶抑制劑，如約1-10個單位/反應的胎盤RNA酶抑制劑(Roche)。cDNA合成將優(yōu)選在42℃下進行30到60分鐘，然后在95℃加熱10分鐘以變性RNA模板。所得cDNA可用作PCR的模板以檢測血樣(或者肝臟活檢樣品)中的OBcl5。優(yōu)選還提供OBcl5的PCR檢測所需的額外試劑，包括10×Taq DNA聚合酶緩沖液(500mM Tris-ClpH8.3，25mM MgCl2，0.1％Triton X-100)；dATP、dCTP、dCTP和dTTP的混合物，每種終濃度為0.2mM；Taq DNA聚合酶(2.5U/反應)，和OBcl5特異引物如OBcl5-p2、OBcl5-p3、OBcl5-p4、和OBcl5-p5(0.1-1μM終濃度)。優(yōu)選還包括用OBcl5序列插入片段從質(zhì)?？寺CR擴增這種DNA的陽性對照(1-10ng/反應)。該PCR可以例如進行22-40個循環(huán)，每個循環(huán)為95℃30秒，60℃30秒，72℃60秒。如上面所指出的，通過使用位于用最初的PCR引物組擴增的序列內(nèi)的另外的OBcl5引物組可以在該診斷方法中實現(xiàn)優(yōu)選的另外的敏感性和特異性。在該情況中，隨后將使用類似于第一次PCR反應中所用的那些條件只是優(yōu)選使用引物OBcl5-p4和OBcl5-p5來擴增巢式序列，該反應中包括1-10μl第一次PCR產(chǎn)物作為模板DNA。備選地，優(yōu)選用第一引物組(OBcl5-p2和OBcl5-p3)實施反應10-15個循環(huán)，之后將1-10μl該反應物包括在新的PCR反應中作為模板，該新的PCR反應使用引物OBcl5-p4和OBcl5-p5(并包括所有必須的PCR組分)。將優(yōu)選利用如本領(lǐng)域公知的并且在前面實施例中描述的瓊脂糖凝膠電泳檢測OBcl5特異的PCR產(chǎn)物。該診斷法中所包括的將優(yōu)選為作為這種基于PCR的診斷性試驗的可比較的液體或組織提取物作為對照。這可以包括來自未患病個體的血清或血漿和/或來自適當動物模型的血清、血漿或組織提取物。如果相對于對照，從患者分離的樣品中根據(jù)本發(fā)明的核酸的PCR確定的表達如使用引物OBcl5-p4和OBcl5-p5得到的該反應的產(chǎn)物被上調(diào)，并且如果尤其該上調(diào)的表達與如圖1中圖解的失調(diào)特異性(平均)表達比基本上匹配，那么這種匹配指出該患者患有該失調(diào)。
也可以理解該方法的變通方案。可以利用熱穩(wěn)定的具有反轉(zhuǎn)錄酶活性的DNA聚合酶(如Titan一管(one-tube)或Roche的Carboxydothermus DNA聚合酶一組RT-PCR系統(tǒng))在單個反應容器中順序地或者同時實施cDNA合成和PCR擴增。備選地，通過熒光標記的引物或者PCR產(chǎn)物的各種基于熒光的指示劑(包括Taqman探針水解系統(tǒng)，如上述，和熒光雙鏈DNA插入分子如SYBR綠)的摻入監(jiān)視PCR產(chǎn)物?；跓晒獾姆椒ň哂袃?yōu)勢，因為PCR產(chǎn)物的積累可被連續(xù)監(jiān)視以實現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的核酸的表達的靈敏的定量評定。這對于在根據(jù)本發(fā)明的血液或組織中增加并且在未患病患者和組織中以低水平存在的核酸是尤其有利的，從而得到關(guān)于該核酸表達水平的定量信息。此外，關(guān)于該實例，核酸表達水平的準確定量促進例如肝硬變和HCC之間的差示診斷。該數(shù)據(jù)與所提供的標準數(shù)據(jù)的比較可指示存在或者不存在疾病，該比較為這種診斷方法提供了重要的優(yōu)勢。
該診斷策略的其他變通方案包括同時檢測根據(jù)本發(fā)明的多種核酸和/或根據(jù)本發(fā)明的核酸與和該失調(diào)有關(guān)的其他核酸。還設想了根據(jù)本發(fā)明的核酸的基于雜交的診斷檢測。在該情況下，mRNA檢測優(yōu)選使用RNA印跡、RNA酶保護或者在患者細胞或者組織活檢樣品上的原位雜交，該mRNA檢測也是有效的。
通過類似方法和它們的變通方法，根據(jù)本發(fā)明的核酸和/或根據(jù)本發(fā)明的核酸與其他核酸可用于診斷根據(jù)本發(fā)明的失調(diào)。
實施例7通過根據(jù)本發(fā)明的多肽的抗體檢測的診斷方法根據(jù)本發(fā)明的失調(diào)的優(yōu)選診斷方法基于針對根據(jù)本發(fā)明的多肽的抗體。例如，診斷方法可優(yōu)選使用借助于酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)的特異上調(diào)的基因蛋白質(zhì)的血清檢測。在簡單形式中，該診斷測定法優(yōu)選包括微量滴定板或微量滴定板的一條(例如，用根據(jù)本發(fā)明的多肽如OBcl5.pr(SEQ ID 2)或DAP3(SEQ ID 5)特異的分離并純化的抗體包被的)?？贵w可以是例如親和純化的多克隆抗體，如例如通常在兔中產(chǎn)生的多克隆抗體，或者如根據(jù)本領(lǐng)域成熟的方法通常在小鼠中產(chǎn)生并純化的單克隆抗體(Cooper，H.M.和Paterson，Y.，(2000)，Current Protocols in Molecular Biology(Ansubel，F(xiàn).A.等人，編者)11.12.1-11.12.9頁，Greene Publ.& Wiley Intersci.，NY)；(Fuller S.A.等人，(1992)，In Current Protocols inMolecular Biology(Ansubel，F(xiàn).A.等人，編者)11.4.1-11.9.3頁，Greene Publ.& Wiley Intersci.，NY)。優(yōu)選地，該抗體可以是如Knappik等人(2000，J.Molec.Biol.29657-86)或者Chadd和Chamow(2001 Curr.Opin.Biotechnol.12188-94)所描述的從噬菌體展示文庫淘選和純化得到的重組抗體或者其片段。優(yōu)選通過將抗OBcl5.pr或者抗DAP3.pr抗體在標準包被溶液如磷酸緩沖液(PBS)中稀釋到1-100μg/ml實現(xiàn)抗體包被?？贵w優(yōu)選在37℃60分鐘內(nèi)，或者室溫或4℃下過夜結(jié)合到微量滴定板孔(如Nunc Maxisorp免疫板)的吸附表面。樣品結(jié)合到所包被的孔之前，優(yōu)選將孔在濃縮的蛋白質(zhì)溶液(如磷酸緩沖液中的5％牛血清白蛋白或者重懸在相同緩沖液中的5％無脂干奶粉)中室溫下孵育15-60分鐘完全將孔封閉以防止非特異結(jié)合。優(yōu)選地，患者樣品材料然后被應用于微量滴定板孔，稀釋到封閉溶液中以增加檢測的特異性。該樣品可以是例如根據(jù)本領(lǐng)域中熟知的方法從組織活檢或手術(shù)切除制備的血漿或者血清或者蛋白質(zhì)提取物(Smith，J.A.(2001)In，Current Protocols in MolecularBiology，Ausubel，F(xiàn).A.等人，編者)10.0.1-10.0.23頁，GreenePubl.& Wiley Intersci.，NY)。具體地，將患者樣品與抗體包被的孔在室溫或者4℃下接觸30-120分鐘(或者更長)。優(yōu)選通過用例如標準洗滌緩沖液如0.1M Tris緩沖液與0.02-0.1％Tween20充分洗滌除去非-特異相互作用的蛋白質(zhì)。優(yōu)選洗滌3-10分鐘并重復3-5次?；颊邩悠分蠨AP3.pr多肽的檢測為例如通過與第二種獨立的抗-DAP 3.pr抗體隨后的結(jié)合反應來實現(xiàn)，該抗-DAP3.pr抗體如上描述的產(chǎn)生，識別標準二位“三明治”型ELISA中DAP3.pr多肽的不同表位。第二抗-OBcl5.pr抗體或DAP3.pr抗體的結(jié)合為例如通過將孔在抗體(例如，封閉溶液中1-100μg/ml的濃度)中室溫下孵育30-60分鐘，然后通過如前面步驟中的充分洗滌來實現(xiàn)。第二抗體可以優(yōu)選直接偶聯(lián)到在適當?shù)孜锎嬖谙履軌虍a(chǎn)生生色或者生熒光反應產(chǎn)物的酶，如堿性磷酸酶。備選地，例如，偶聯(lián)到酶的抗物種且抗同種型特異的第三抗體可以用于產(chǎn)生反應產(chǎn)物，優(yōu)選可以在標準分光光度板讀出儀器中檢測該反應產(chǎn)物。對于反應產(chǎn)物顯影，所洗滌的(如上)的抗體-抗原-酶復合物被優(yōu)選在室溫下暴露于生色底物，如來自Roche的AttoPhos約10分鐘，反應可以用低pH緩沖液如50mM Tris-HCl pH5.5終止，或者可以直接測定。通過例如測量每孔中酶反應產(chǎn)物的量以及分光光度計中適當波長(在該情況中為420nm)處的激發(fā)來確定被特異結(jié)合的OBcl5.pr多肽或DAP3.pr多肽的量。優(yōu)選在平板讀出器中在發(fā)射波長(在該情況中為560nm)下進行檢測。該診斷法中優(yōu)選包括OBcl5蛋白質(zhì)標準或DAP3蛋白質(zhì)標準，如例如純化的重組OBcl5.pr多肽或者DAP3.pr多肽。在ELISA中優(yōu)選平行包括該蛋白質(zhì)標準的稀釋系列作為反應的標準和推導出如本領(lǐng)域中熟知的用于多肽表達水平比較的蛋白質(zhì)標準曲線。在該診斷法中應該優(yōu)選提供特定肝臟失調(diào)的濃度范圍相應的指示。此外，優(yōu)選還應該包括可比較的液體或組織提取物以作為這種ELISA試驗的對照。這可以優(yōu)選包括來自未患病個體的血清或血漿和/或來自適宜的動物模型的血清、血漿或組織提取物。這種ELISA檢測診斷法在本領(lǐng)域中是普通的(見例如，Hauschild等人，2001，Cancer Res.158169-77)。通過ELISA確定的樣品對照蛋白質(zhì)水平與ELISA確定的失調(diào)特異蛋白質(zhì)表達比值相比較，該比值優(yōu)選在患有根據(jù)本發(fā)明的失調(diào)的患者的病理學家證實的組織中相對于對照樣品確定。如果樣品對照的蛋白質(zhì)水平基本上匹配失調(diào)特異的蛋白質(zhì)表達比，那么該匹配優(yōu)選表明該患者患有該失調(diào)。優(yōu)選地，為一種以上的根據(jù)本發(fā)明的多肽實施這種診斷。
此外，該診斷法可以檢測存在于從患者分離的樣品中的針對根據(jù)本發(fā)明的多肽的內(nèi)源性抗體，或者其功能變體或者其片段，該抗體或者其片段針對根據(jù)本發(fā)明的多肽。這種自身免疫抗體的檢測可以通過本領(lǐng)域中公知的方法，例如通過免疫親和測定法如上面詳述的ELISA，使用根據(jù)本發(fā)明的多肽或者其功能變體或者其部分作為探針來完成。這種自身免疫抗體的存在指出該患者患有根據(jù)本發(fā)明的失調(diào)。
此外或者備選地，可以制備基于根據(jù)本發(fā)明的至少一種多肽的組織化學檢測的相關(guān)診斷試劑盒。在這種試劑盒中，可以包括例如對根據(jù)本發(fā)明的多肽特異的一種或幾種純化的抗體以及優(yōu)選地檢測該一種或幾種抗體與患者細胞或組織切片結(jié)合所必需的試劑。這些試劑包括，例如，針對根據(jù)本發(fā)明的多肽或其功能變體的特異抗物種和亞型的特異第二抗體，該第二抗體優(yōu)選偶聯(lián)到能夠催化例如生色底物的酶或者偶聯(lián)到熒光團(如例如，得克薩斯紅)。優(yōu)選還包括酶的底物以及洗滌和孵育緩沖液。這種試劑盒的另外的任選的組分可以是陽性對照組織的切片，例如肝臟或組織或來自特異表達該多肽的細胞的被包裝的沉淀的切片作為陽性組織對照。所提供的使用說明將包括根據(jù)本發(fā)明的多肽檢測的抗原回收的優(yōu)選的和/或備選方法或者，例如，指出應該使用冰凍的而不是福爾馬林固定并石蠟包埋的組織材料。在該情況中，應該優(yōu)選包括固定冰凍的組織樣品切片的推薦方法，例如，浸在冰-冷卻的丙酮中10分鐘。其他使用說明將優(yōu)選提供關(guān)于用于基因產(chǎn)物檢測的抗體的濃度以及例如，組織暴露于所提供的免疫學試劑的推薦的和建議的孵育時間和溫度。還可以包括抗體孵育的優(yōu)選反應緩沖液，如含有包含3％正常綿羊血清的磷酸緩沖液的0.01％-0.1％吐溫20。還將優(yōu)選包括在特定抗體中孵育之前和之后組織切片洗滌的特定條件，如，例如，用含有磷酸緩沖液的0.1％吐溫20洗滌4次，每次5分鐘。這種免疫組織化學檢測方案是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。通常，該試劑盒將優(yōu)選包括作為用戶指南的從陽性和陰性組織樣品所得到的特定免疫組織化學染色的一組圖像，尤其是指出哪種結(jié)果指示患者患有所要診斷的失調(diào)。這種試劑盒的利用將優(yōu)選排除、支持或證實前面提到的根據(jù)本發(fā)明的肝臟失調(diào)、肝癌或上皮癌的診斷。
如上面關(guān)于基于核酸的診斷方法所說明的，基于根據(jù)本發(fā)明的多肽的檢測和/或定量的診斷法可以包括一種或多種這種多肽。而且，在這些診斷法中可以使用這些多肽與根據(jù)本發(fā)明的失調(diào)有關(guān)的其他肽同時檢測。
對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，可以對本發(fā)明的組合物和方法進行各種修改。從而，如果這些修改和變化位于所附權(quán)利要求和它們的等價權(quán)利要求的范圍內(nèi)，那么本發(fā)明將覆蓋這些修改和變化。此處引用的所有出版物被完整地并入作為參考。
序列表<110>ORIDIS BIOMED Forschungs-und Entwicklungs GmbHGuelly，ChristianBuck，Charles R.
Zatloukal，Kurt<120>多肽與編碼這些多肽的核酸和它們用于預防、診斷或治療肝臟失調(diào)和上皮癌的用途<130>Oridis Biomed<140>1223FPC<141>2003-09-22<160>73<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>654<212>PRT<213>人<400>1Met Tyr Ser Ser Ser Cys Glu Thr Thr Arg Ash Thr Thr Gly Ile Glu1 5 10 15Glu Ser Thr Asp Gly Met Ile Leu Gly Pro Glu Asp Leu Ser Tyr Gln20 25 30Ile Tyr Asp Val Ser Gly Glu Ser Asn Ser Ala Val Ser Thr Glu Asp35 40 45Leu Lys Glu Cys Leu Lys Lys Gln Leu Glu Phe Cys Phe Ser Arg Glu50 55 60Asn Leu Ser Lys Asp Leu Tyr Leu Ile Ser Gln Met Asp Ser Asp Gln65 70 75 80Phe Ile Pro Ile Trp Thr Val Ala Asn Met Glu Glu Ile Lys Lys Leu85 90 95
Thr Thr Asp Pro Asp Leu Ile Leu Glu Val Leu Arg Ser Ser Pro Met100 105 110Val Gln Val Asp Glu Lys Gly Glu Lys Val Arg Pro Ser His Lys Arg115 120 125Cys Ile Val Ile Leu Arg Glu Ile Pro Glu Thr Thr Pro Ile Glu Glu130 135 140Val Lys Gly Leu Phe Lys Ser Glu Asn Cys Pro Lys Val Ile Ser Cys145 150 155 160Glu Phe Ala His Asn Ser Asn Trp Tyr Ile Thr Phe Gln Ser Asp Thr165 170 175Asp Ala Gln Gln Ala Phe Lys Tyr Leu Arg Glu Glu Val Lys Thr Phe180 185 190Gln Gly Lys Pro Ile Met Ala Arg Ile Lys Ala Ile Asn Thr Phe Phe195 200 205Ala Lys Asn Gly Tyr Arg Leu Met Asp Ser Ser Ile Tyr Ser His Pro210 215 220Ile Gln Thr Gln Ala Gln Tyr Ala Ser Pro Val Phe Met Gln Pro Val225 230 235 240Tyr Asn Pro His Gln Gln Tyr Ser Val Tyr Ser Ile Val Pro Gln Ser245 250 255Trp Ser Pro Asn Pro Thr Pro Tyr Phe Glu Thr Pro Leu Ala Pro Phe260 265 270Pro Asn Gly Ser Phe Val Asn Gly Phe Asn Ser Pro Gly Ser Tyr Lys275 280 285
Thr Asn Ala Ala Ala Met Asn Met Gly Arg Pro Phe Gln Lys Asn Arg290 295 300Val Lys Pro Gln Phe Arg Ser Ser Gly Gly Ser Glu His Ser Thr Glu305 310 315 320Gly Ser Val Ser Leu Gly Asp Gly Gln Leu Asn Arg Tyr Ser Ser Arg325 330 335Asn Phe Pro Ala Glu Arg His Asn Pro Thr Val Thr Gly His Gln Glu340 345 350Gln Thr Tyr Leu Gln Lys Glu Thr Ser Thr Leu Gln Val Glu Gln Asn355 360 365Gly Asp Tyr Gly Arg Gly Arg Arg Thr Leu Phe Arg Gly Arg Arg Arg370 375 380Arg Glu Asp Asp Arg Ile Ser Arg Pro His Pro Ser Thr Ala Glu Ser385 390 395 400Lys Ala Pro Thr Pro Lys Phe Asp Leu Leu Ala Ser Asn Phe Pro Pro405 410 415Leu Pro Gly Ser Ser Ser Arg Met Pro Gly Glu Leu Val Leu Glu Asn420 425 430Arg Met Ser Asp Val Val Lys Gly Val Tyr Lys Glu Lys Asp Asn Glu435 440 445Glu Leu Thr Ile Ser Cys Pro Val Pro Ala Asp Glu Gln Thr Glu Cys450 455 460Thr Ser Ala Gln Gln Leu Asn Met Ser Thr Ser Ser Pro Cys Ala Ala465 470 475 480
Glu Leu Thr Ala Leu Ser Thr Thr Gln Gln Glu Lys Asp Leu Ile Glu485 490 495Asp Ser Ser Val Gln Lys Asp Gly Leu Asn Gln Thr Thr Ile Pro Val500 505 510Ser Pro Pro Ser Thr Thr Lys Pro Ser Arg Ala Ser Thr Ala Ser Pro515 520 525Cys Asn Asn Asn Ile Asn Ala Ala Thr Ala Val Ala Leu Gln Glu Pro530 535 540Arg Lys Leu Ser Tyr Ala Glu Val Cys Gln Lys Pro Pro Lys Glu Pro545 550 555 560Ser Ser Val Leu Val Gln Pro Leu Arg Glu Leu Arg Ser Asn Val Val565 570 575Ser Pro Thr Lys Asn Glu Asp Asn Gly Ala Pro Glu Asn Ser Val Glu580 585 590Lys Pro His Glu Lys Pro Glu Ala Arg Ala Ser Lys Asp Tyr Ser Gly595 600 605Phe Arg Gly Asn Ile Ile Pro Arg Gly Ala Ala Gly Lys Ile Arg Glu610 615 620Gln Arg Arg Gln Phe Ser His Arg Ala Ile Pro Gln Gly Val Thr Arg625 630 635 640Arg Asn Gly Lys Glu Gln Tyr Val Pro Pro Arg Ser Pro Lys645 650<210>2<211>72
<212>PRT<213>人<400>2Met Gly Val Glu Leu Met Met Glu Leu Glu Pro Leu Gln Gly Asn Glu1 5 10 15Glu Thr Arg Ala Leu Phe Met Pro Arg Glu Asp Thr Ala Arg Pro Gln20 25 30Ser Ala Ser Gln Glu Glu Ser Ser Arg Glu Pro Asp His Ala Gly Thr35 40 45Leu Ile Val Asp Ile Ser Thr Ser Arg Thr Val Ile Gln Asn Ala Tyr50 55 60Val Ser Leu Glu Glu Thr Leu Lys65 70<210>3<211>367<212>PRT<213>人<400>3Met Leu Pro Pro Arg Arg Leu Gln Thr Leu Leu Arg Gln Ala Val Glu1 5 10 15Leu Gln Arg Asp Arg Cys Leu Tyr His Asn Thr Lys Leu Asp Asn Asn20 25 30Leu Asp Ser Val Ser Leu Leu Ile Asp His Val Cys Ser Arg Arg Gln35 40 45Phe Pro Cys Tyr Thr Gln Gln Ile Leu Thr Glu His Cys Asn Glu Val50 55 60
Trp Phe Cys Lys Phe Ser Asn Asp Gly Thr Lys Leu Ala Thr Gly Ser65 70 75 80Lys Asp Thr Thr Val Ile Ile Trp Gln Val Asp Pro Asp Thr His Leu85 90 95Leu Lys Leu Leu Lys Thr Leu Glu Gly His Ala Tyr Gly Val Ser Tyr100 105 110Ile Ala Trp Ser Pro Asp Asp Asn Tyr Leu Val Ala Cys Gly Pro Asp115 120 125Asp Cys Ser Glu Leu Trp Leu Trp Asn Val Gln Thr Gly Glu Leu Arg130 135 140Thr Lys Met Ser Gln Ser His Glu Asp Ser Leu Thr Ser Val Ala Trp145 150 155 160Asn Pro Asp Gly Lys Arg Phe Val Thr Gly Gly Gln Arg Gly Gln Phe165 170 175Tyr Gln Cys Asp Leu Asp Gly Asn Leu Leu Asp Ser Trp Glu Gly Val180 185 190Arg Val Gln Cys Leu Trp Cys Leu Ser Asp Gly Lys Thr Val Leu Ala195 200 205Ser Asp Thr His Gln Arg Ile Arg Gly Tyr Asn Phe Glu Asp Leu Thr210 215 220Asp Arg Asn Ile Val Gln Glu Asp His Pro Ile Met Ser Phe Thr Ile225 230 235 240Ser Lys Asn Gly Arg Leu Ala Leu Leu Asn Val Ala Thr Gln Gly Val245 250 255
His Leu Trp Asp Leu Gln Asp Arg Val Leu Val Arg Lys Tyr Gln Gly260 265 270Val Thr Gln Gly Phe Tyr Thr Ile His Ser Cys Phe Gly Gly His Asn275 280 285Glu Asp Phe Ile Ala Ser Gly Ser Glu Asp His Lys Val Tyr Ile Trp290 295 300His Lys Arg Ser Glu Leu Pro Ile Ala Glu Leu Thr Gly His Thr Arg305 310 315 320Thr Val Asn Cys Val Ser Trp Asn Pro Gln Ile Pro Ser Met Met Ala325 330 335Ser Ala Ser Asp Asp Gly Thr Val Arg Ile Trp Gly Pro Ala Pro Phe340 345 350Ile Asp His Gln Asn Ile Glu Glu Glu Cys Ser Ser Met Asp Ser355 360 365<210>4<211>188<212>PRT<213>人<400>4Met Asp Val Asn Ile Ala Pro Leu Arg Ala Trp Asp Asp Phe Phe Pro1 5 10 15Gly Ser Asp Arg Phe Ala Arg Pro Asp Phe Arg Asp Ile Ser Lys Trp20 25 30Asn Asn Arg Val Val Ser Asn Leu Leu Tyr Tyr Gln Thr Asn Tyr Leu35 40 45Val Val Ala Ala Met Met Ile Ser Ile Val Gly Phe Leu Ser Pro Phe
50 55 60Asn Met Ile Leu Gly Gly Ile Val Val Val Leu Val Phe Thr Gly Phe65 70 75 80Val Trp Ala Ala His Asn Lys Asp Val Leu Arg Arg Met Lys Lys Arg85 90 95Tyr Pro Thr Thr Phe Val Met Val Val Met Leu Ala Ser Tyr Phe Leu100 105 110Ile Ser Met Phe Gly Gly Val Met Val Phe Val Phe Gly Ile Thr Phe115 120 125Pro Leu Leu Leu Met Phe Ile His Ala Ser Leu Arg Leu Arg Asn Leu130 135 140Lys Asn Lys Leu Glu Asn Lys Met Glu Gly Ile Gly Leu Lys Arg Thr145 150 155 160Pro Met Gly Ile Val Leu Asp Ala Leu Glu Gln Gln Glu Glu Gly Ile165 170 175Asn Arg Leu Thr Asp Tyr Ile Ser Lys Val Lys Glu180 185<210>5<211>398<212>PRT<213>人<400>5Met Met Leu Lys Gly Ile Thr Arg Leu Ile Ser Arg Ile His Lys Leu1 5 10 15Asp Pro Gly Arg Phe Leu His Met Gly Thr Gln Ala Arg Gln Ser Ile20 25 30
Ala Ala His Leu Asp Asn Gln Val Pro Val Glu Ser Pro Arg Ala Ile35 40 45Ser Arg Thr Asn Glu Asn Asp Pro Ala Lys His Gly Asp Gln His Glu50 55 60Gly Gln His Tyr Asn Ile Ser Pro Gln Asp Leu Glu Thr Val Phe Pro65 70 75 80His Gly Leu Pro Pro Arg Phe Val Met Gln Val Lys Thr Phe Ser Glu85 90 95Ala Cys Leu Met Val Arg Lys Pro Ala Leu Glu Leu Leu His Tyr Leu100 105 110Lys Asn Thr Ser Phe Ala Tyr Pro Ala Ile Arg Tyr Leu Leu Tyr Gly115 120 125Glu Lys Gly Thr Gly Lys Thr Leu Ser Leu Cys His Val Ile His Phe130 135 140Cys Ala Lys Gln Asp Trp Leu Ile Leu His Ile Pro Asp Ala His Leu145 150 155 160Trp Val Lys Asn Cys Arg Asp Leu Leu Gln Ser Ser Tyr Asn Lys Gln165 170 175Arg Phe Asp Gln Pro Leu Glu Ala Ser Thr Trp Leu Lys Asn Phe Lys180 185 190Thr Thr Asn Glu Arg Phe Leu Asn Gln Ile Lys Val Gln Glu Lys Tyr195 200 205Val Trp Asn Lys Arg Glu Ser Thr Glu Lys Gly Ser Pro Leu Gly Glu210 215 220
Val Val Glu Gln Gly Ile Thr Arg Val Arg Asn Ala Thr Asp Ala Val225 230 235 240Gly Ile Val Leu Lys Glu Leu Lys Arg Gln Ser Ser Leu Gly Met Phe245 250 255His Leu Leu Val Ala Val Asp Gly Ile Asn Ala Leu Trp Gly Arg Thr260 265 270Thr Leu Lys Arg Glu Asp Lys Ser Pro Ile Ala Pro Glu Glu Leu Ala275 280 285Leu Val His Asn Leu Arg Lys Met Met Lys Asn Asp Trp His Gly Gly290 295 300Ala Ile Val Ser Ala Leu Ser Gln Thr Gly Ser Leu Phe Lys Pro Arg305 310 315 320Lys Ala Tyr Leu Pro Gln Glu Leu Leu Gly Lys Glu Gly Phe Asp Ala325 330 335Leu Asp Pro Phe Ile Pro Ile Leu Val Ser Asn Tyr Asn Pro Lys Glu340 345 350Phe Glu Ser Cys Ile Gln Tyr Tyr Leu Glu Asn Asn Trp Leu Gln His355 360 365Glu Lys Ala Pro Thr Glu Glu Gly Lys Lys Glu Leu Leu Phe Leu Ser370 375 380Asn Ala Asn Pro Ser Leu Leu Glu Arg His Cys Ala Tyr Leu385 390 395<210>6<211>261
<212>PRT<213>人<400>6Met Ala Gly Pro Glu Leu Leu Leu Asp Ser Asn Ile Arg Leu Trp Val1 5 10 15Val Leu Pro Ile Val Ile Ile Thr Phe Phe Val Gly Met Ile Arg His20 25 30Tyr Val Ser Ile Leu Leu Gln Ser Asp Lys Lys Leu Thr Gln Glu Gln35 40 45Val Ser Asp Ser Gln Val Leu Ile Arg Ser Arg Val Leu Arg Glu Asn50 55 60Gly Lys Tyr Ile Pro Lys Gln Ser Phe Leu Thr Arg Lys Tyr Tyr Phe65 70 75 80Asn Asn Pro Glu Asp Gly Phe Phe Lys Lys Thr Lys Arg Lys Val Val85 90 95Pro Pro Ser Pro Met Thr Asp Pro Thr Met Leu Thr Asp Met Met Lys100 105 110Gly Asn Val Thr Asn Val Leu Pro Met Ile Leu Ile Gly Gly Trp Ile115 120 125Asn Met Thr Phe Ser Gly Phe Val Thr Thr Lys Val Pro Phe Pro Leu130 135 140Thr Leu Arg Phe Lys Pro Met Leu Gln Gln Gly Ile Glu Leu Leu Thr145 150 155 160Leu Asp Ala Ser Trp Val Ser Ser Ala Ser Trp Tyr Phe Leu Asn Val165 170 175
Phe Gly Leu Arg Ser Ile Tyr Ser Leu Ile Leu Gly Gln Asp Asn Ala180 185 190Ala Asp Gln Ser Arg Met Met Gln Glu Gln Met Thr Gly Ala Ala Met195 200 205Ala Met Pro Ala Asp Thr Asn Lys Ala Phe Lys Thr Glu Trp Glu Ala210 215 220Leu Glu Leu Thr Asp His Gln Trp Ala Leu Asp Asp Val Glu Glu Glu225 230 235 240Leu Met Ala Lys Asp Leu His Phe Glu Gly Met Phe Lys Lys Glu Leu245 250 255Gln Thr Ser Ile Phe260<210>7<211>403<212>PRT<213>人<400>7Met Ser Gly Arg Val Gly Asp Leu Ser Pro Arg Gln Lys Glu Ala Leul 5 10 15Ala Lys Phe Arg Glu Asn Val Gln Asp Val Leu Pro Ala Leu Pro Asn20 25 30Pro Asp Asp Tyr Phe Leu Leu Arg Trp Leu Arg Ala Arg Ser Phe Asp35 40 45Leu Gln Lys Ser Glu Ala Met Leu Arg Lys His Val Glu Phe Arg Lys50 55 60
Gln Lys Asp Ile Asp Asn Ile Ile Ser Trp Gln Pro Pro Glu Val Ile65 70 75 80Gln Gln Tyr Leu Ser Gly Gly Met Cys Gly Tyr Asp Leu Asp Gly Cys85 90 95Pro Val Trp Tyr Asp Ile Ile Gly Pro Leu Asp Ala Lys Gly Leu Leu100 105 110Phe Ser Ala Ser Lys Gln Asp Leu Leu Arg Thr Lys Met Arg Glu Cys115 120 125Glu Leu Leu Leu Gln Glu Cys Ala His Gln Thr Thr Lys Leu Gly Arg130 135 140Lys Val Glu Thr Ile Thr Ile Ile Tyr Asp Cys Glu Gly Leu Gly Leu145 150 155 160Lys His Leu Trp Lys Pro Ala Val Glu Ala Tyr Gly Glu Phe Leu Cys165 170 175Met Phe Glu Glu Asn Tyr Pro Glu Thr Leu Lys Arg Leu Phe Val Val180 185 190Lys Ala Pro Lys Leu Phe Pro Val Ala Tyr Asn Leu Ile Lys Pro Phe195 200 205Leu Ser Glu Asp Thr Arg Lys Lys Ile Met Val Leu Gly Ala Asn Trp210 215 220Lys Glu Val Leu Leu Lys His Ile Ser Pro Asp Gln Val Pro Val Glu225 230 235 240Tyr Gly Gly Thr Met Thr Asp Pro Asp Gly Asn Pro Lys Cys Lys Ser245 250 255
Lys Ile Asn Tyr Gly Gly Asp Ile Pro Arg Lys Tyr Tyr Val Arg Asp260 265 270Gln Val Lys Gln Gln Tyr Glu His Ser Val Gln Ile Ser Arg Gly Ser275 280 285Ser His Gln Val Glu Tyr Glu Ile Leu Phe Pro Gly Cys Val Leu Arg290 295 300Trp Gln Phe Met Ser Asp Gly Ala Asp Val Gly Phe Gly Ile Phe Leu305 310 315 320Lys Thr Lys Met Gly Glu Arg Gln Arg Ala Gly Glu Met Thr Glu Val325 330 335Leu Pro Asn Gln Arg Tyr Asn Ser His Leu Val Pro Glu Asp Gly Thr340 345 350Leu Thr Cys Ser Asp Pro Gly Ile Tyr Val Leu Arg Phe Asp Asn Thr355 360 365Tyr Ser Phe Ile His Ala Lys Lys Val Asn Phe Thr Val Glu Val Leu370 375 380Leu Pro Asp Lys Ala Ser Glu Glu Lys Met Lys Gln Leu Gly Ala Gly385 390 395 400Thr Pro Lys<210>8<211>251<212>PRT<213>人<400>8Met Asp Met Lys Arg Arg Ile His Leu Glu Leu Arg Asn Arg Thr Pro
1 5 10 15Ala Ala Val Arg Glu Leu Val Leu Asp Asn Cys Lys Ser Asn Asp Gly20 25 30Lys Ile Glu Gly Leu Thr Ala Glu Phe Val Asn Leu Glu Phe Leu Ser35 40 45Leu Ile Asn Val Gly Leu Ile Ser Val Ser Asn Leu Pro Lys Leu Pro50 55 60Lys Leu Lys Lys Leu Glu Leu Ser Glu Asn Arg Ile Phe Gly Gly Leu65 70 75 80Asp Met Leu Ala Glu Lys Leu Pro Asn Leu Thr His Leu Asn Leu Ser85 90 95Gly Asn Lys Leu Lys Asp Ile Ser Thr Leu Glu Pro Leu Lys Lys Leu100 105110Glu Cys Leu Lys Ser Leu Asp Leu Phe Asn Cys Glu Val Thr Asn Leu115 120125Asn Asp Tyr Arg Glu Ser Val Phe Lys Leu Leu Pro Gln Leu Thr Tyr130 135140Leu Asp Gly Tyr Asp Arg Glu Asp Gln Glu Ala Pro Asp Ser Asp Ala145 150 155 160Glu Val Asp Gly Val Asp Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Gly Glu Asp165 170 175Glu Glu Asp Glu Asp Asp Glu Asp Gly Glu Glu Glu Glu Phe Asp Glu180 185 190Glu Asp Asp Glu Asp Glu Asp Val Glu Gly Asp Glu Asp Asp Asp Glu
195 200 205Val Ser Glu Glu Glu Glu Glu Phe Gly Leu Asp Glu Glu Asp Glu Asp210 215 220Glu Asp Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Gly Gly Lys Gly Glu Lys Arg225 230 235 240Lys Arg Glu Thr Asp Asp Glu Gly Glu Asp Asp245 250<210>9<211>151<212>PRT<213>人<400>9Met Pro Arg Gly Ser Arg Ser Arg Thr Ser Arg Met Ala Pro Pro Ala1 5 10 15Ser Arg Ala Pro Gln Met Arg Ala Ala Pro Arg Pro Ala Pro Val Ala20 25 30Gln Pro Pro Ala Ala Ala Pro Pro Ser Ala Val Gly Ser Ser Ala Ala35 40 45Ala Pro Arg Gln Pro Gly Leu Met Ala Gln Met Ala Thr Thr Ala Ala50 55 60Gly Val Ala Val Gly Ser Ala Val Gly His Thr Leu Gly His Ala Ile65 70 75 80Thr Gly Gly Phe Ser Gly Gly Ser Asn Ala Glu Pro Ala Arg Pro Asp85 90 95Ile Thr Tyr Gln Glu Pro Gln Gly Thr Gln Pro Ala Gln Gln Gln Gln100 105 110
Pro Cys Leu Tyr Glu Ile Lys Gln Phe Leu Glu Cys Ala Gln Asn Gln115 120 125Gly Asp Ile Lys Leu Cys Glu Gly Phe Asn Glu Val Leu Lys Gln Cys130 135 140Arg Leu Ala Asn Gly Leu Ala145 150<210>10<211>6497<212>DNA<213>人<400>10ccgggtggag gggcaaggcg agtgtgtgtc cttatcctag caattggggc gcgggcctgt 60gagccagttg gagttgcggc ggcgggaacg attgggctga gcagaggacg acatgttgct 120tttcgtggag catttatggg gttaagtggc atgggatttc tgtttctgat agtaaatagc 180aggtagcatc taaaggaact ggtttaaatc ctaatgccaa agtatggcaa gaaattgctc 240ctggaaatac tgatgccacc ccagtaactc atggaactga aagctcttgg catgaaatag 300cagctacatc aggtgctcat cctgagggta atgcagagct ctcagaagat atatgtaaag 360aatatgaagt aatgtattct tcatcttgtg aaaccacaag aaatactaca ggcattgaag 420aatcaactga tgggatgatt ttaggaccag aagatctgag ttaccaaata tatgatgttt 480ccggagaaag caattcagca gtttctacag aagacctaaa agaatgtctg aagaaacaat 540tagaattctg tttttcacga gaaaatttgt caaaggatct ttacttgata tctcaaatgg 600atagtgatca gttcatccca atttggacag ttgccaacat ggaagaaata aaaaagttga 660ctacagaccc tgatctaatt cttgaagtgt taagatcttc tcccatggta caagttgatg 720agaagggtga gaaagtgaga ccaagtcata agcgttgtat tgtaattctt agagagattc 780ctgaaacaac accaatagag gaagtgaaag gtttgttcaa aagtgaaaac tgccccaaag 840
tgataagctg tgagtttgca cacaatagca actggtatat cactttccag tcagacacag 900atgcacaaca ggcttttaaa tacttaagag aagaagttaa aacatttcag ggcaagccaa 960ttatggcaag gataaaagcc atcaatacat tttttgctaa gaatggttat cgattaatgg 1020attctagtat ctatagtcac cccattcaaa ctcaagcaca gtatgcctcc ccagtcttta 1080tgcagcctgt atataatcct caccaacagt actcggtcta tagtattgtg cctcagtctt 1140ggtctccaaa tcctacacct tactttgaaa caccactggc tccctttccc aatggtagtt 1200ttgtgaatgg ctttaattcg ccaggatctt ataaaacaaa tgctgctgct atgaatatgg 1260gtcgaccatt ccaaaaaaat cgtgtgaagc ctcagtttag gtcatctggt ggttcagaac 1320actcaacaga gggctctgta tccttggggg atggacagtt gaacagatat agttcaagaa 1380actttccagc tgaacggcat aaccccacag taactgggca tcaggagcaa acttaccttc 1440agaaggagac ttccactttg caggtggaac agaatgggga ctatggtagg ggcaggagaa 1500ctctcttcag aggtcgaaga cgacgagaag atgacaggat ctcaagacct catccttcaa 1560cagctgaatc aaaggctcca acaccaaagt ttgacttatt agcctcaaat tttccacctt 1620tacctggaag ttcatcaaga atgccaggtg aactcgtttt ggagaatagg atgtctgatg 1680ttgttaaagg tgtctacaaa gaaaaggata atgaagagtt gacaattagt tgcccagtgc 1740ctgcagatga gcagacagaa tgcacttctg cccagcaact caatatgagt accagttctc 1800catgtgctgc tgagcttact gcattaagca caactcagca agaaaaggat ctaatagaag 1860attcctctgt tcagaaggat ggtctcaatc agacaactat accagtttct cctccaagta 1920ctacaaagcc atcgagggca agtactgctt caccatgtaa taataacata aatgcagcta 1980cagctgtggc tctacaggaa ccccgaaagt taagttatgc tgaagtgtgc cagaagcccc 2040ctaaagagcc atcttcagtt cttgtgcagc cactacggga acttcgctcc aatgtggtgt 2100ctcccaccaa aaatgaagac aatggagctc ctgagaactc cgttgagaaa ccacatgaga 2160agccagaagc aagggctagt aaggattatt ctggcttccg aggcaatata atccccaggg 2220gagcagcagg aaaaatcagg gaacagagac gccagtttag ccatagggct atacctcagg 2280
gagtgactcg acgtaatggc aaagagcaat atgtgccacc cagatcacca aagtaaaaaa 2340caacaaaact attcaaaaac ttcactctct tcccattaaa cttgaactgt ggctatattg 2400aactgttttg gaggggaggg ggtagccagg aaggaaacaa gagaaagtac gtccatttca 2460ttatggattt tggagttgtg agtgatagga tcccaaaatt catctctaat gtggttttta 2520aatgctggag gattccaatc aatataaata tatatatata tatacacaca catatataaa 2580aagtataatt tttctatttt tgtttttggt tttaatttgc agagatttgc tgccaggaat 2640caattttgag ggttcagatt tagcttggaa gaaaaaaaag aaacatacat ccttcagtat 2700aggagatgag ggaatgagag aaaatatttt ttgaagaagc atttctgtaa aattagaaat 2760tacttttttt aatctattta aagtttggct tgaagaatgc catctctgac tatatggcct 2820tgtattgcaa agcagatcag tggctggggt gcctgttgtg ggtgtgagtg tgtacaagag 2880cgattgaagc caaatctgtt gtcatgttag taaatgattt gaaaactgaa tgtaatactt 2940gagtagattt ttttttctag tttgaaattt agtctgtctt tttgacctta ctaatatttc 3000atttaacaag ttgtaaaact ctgattgtac ttagagatgt gactaccaat cagtttgata 3060ctcaaggaaa gggggttatt caagaaattg aaaatttcat cttggacctc agtgcatcgg 3120tcaaatggat ttcagaggtt taaacttccc tgtgattccc cctgaatacc cccaaaatga 3180gaaacaaaat tttttttctt actccatttg ttactctctg ttctttgact gcccacccac 3240agaaaagcaa aataaccaac tacctactca attgtgtgtt tgtaattgct ttgagcagtc 3300tagtcaaatc atataaattg ttctaaattt cagaattgaa cattgaagta ttaactcttc 3360tgttcacaca tttagaattt tagctcccaa gatggtaggg cagactgacc gtacagtaat 3420ttatttgtcg ttagtgttaa agattaagca tagtaactga ctcttaagtg ttaaataatg 3480tagaagtaaa aaaatttttt ttaaaggctt aatttgggag gggggactta tttctgttta 3540cagtgtatta ccttccttcc ctcctcttct ccccccacac ccaacaaaat acagtttgga 3600attcactgaa acagtaccag caagtcatga gattttttag taaagatgag aaagatggtt 3660gaagaaaatt agtgcataat ttctcagtga ataaagttgt agctctcata tactaaatag 3720
acaagtttac atgctgttat ttagaaaatg actaaaatat taaaaaccgt gttgtgttaa 3780tctgttttaa gtcataccat gttcagagtt ctatgtaagg tgggttttat ttttctttta 3840agggatagtt tgtaatagta agaactgtcc catatgttag taaattacat atgtacaaat 3900tgaaactgta aattgtgaac actggaaagc accattgtga catagagtaa acatcttagt 3960aatatattaa agtgaatgta aatggtggtt aaaattacat tactgtgaaa ttcatcttcc 4020aactctaagt taagctttgg agatacatgt tagtggttaa ctgttaagag ctttgaaaac 4080actgcacata tctgtacaag ccagaattac tatttctttg acttattatt agcttggcag 4140ttgcttttga tttgattgtt ttatgacatg gtatactact atatttactc agtttgaaac 4200tattcatttc tacacactat ttttaaaaat tgcctactag gtgaaacata acaataaaac 4260tacctgtgct gaaatttggg ggaagtttag gtcctttaaa aaaacatatt aatcattgac 4320tacatctatg ataaaagtgc ttattttggt ttactaagat aatgcagttg gtggaaatga 4380taaacgtttt aagtgttaac atcctttgaa tgcgttggat ttcagagaat aaacattttg 4440taaaaatcac ttggtaagga ttataaactt aattactgca cttaaaatga aacattactt 4500tttttaaaca atgtgtcaca aatgtaggtc tgtattactt gtatgcttgt gtgacttact 4560gttagtccag ctctaaaaat ttaaaggttg taattgaaat acaagaaaag agccttcttt 4620tagaagaaag caagtatatt tttgctttta cttcaaatgt tatttaaagt agaaatttaa 4680tttgtagata taacctttaa aaattttctc attaagacaa tgtttttaat ttaatttgcc 4740tcattacatc taatagttcc catttgatgg catgtatagg gaagagtgag agagtgtgtg 4800tgtgtgtatg tgtgtgtaat atttatatat attcacagta tgtatttagc atttatttta 4860ttacagcaga tttaaagttt gtatctaaat aatgcctatg agttgtgtga agctcttggc 4920tttttttcca acgttacttt gtaactaatg agggtggatg ttcattgtag tttatttatt 4980tggttcttta gatggaggaa tttaaaaaat caaatttttc tcttcacctt tatgacttga 5040catttccttg atctgttgga ggctaaaagt aggtataaat gatattgaat gttgggtata 5100gtgatactct gccatagttc ttactgcatg aagagaacaa gagtcacaca agttcaccac 5160
tttgcacttc atagagaagg tacatagaga cattgcaaaa cctgtctcca tttgctatcc 5220tgataattaa ggttttcata atacctaggg cctgtctctg agtaatttta attttgccaa 5280atacactgac atttaaaata gtgatccatc taaatttttt tcagctgggt tttgaggaat 5340ataagagctt tcaatgataa aggtttgttg tagttgtctt atgtgctgaa tttgcagatg 5400atcagatgct gtgcagaatt ctgatttatt tttgtttcct aaaattaaga tagcttgaat 5460attatttcac attccttttt cttttttaaa taaacaggtt tgctttggaa aggcttaatg 5520atggaatgtt agcatcttca ctagggtaaa gaagaacaaa aagaatgttg ctggaacgta 5580aaatagtatt taaaagttaa tgaacacttc tctagttttc ttagttatgg ccttaataat 5640tagtctcttg gcttaaatgt ccactggttt tactttgaca cagttgaaca acactggggt 5700taagtctctg gtatttaggc tggcaatata tatattaacc atattttaaa agtaccaatt 5760ttgtttttac agaaaagata aaactcaaaa gagaacagtg tattccttct gaggggcttt 5820tataaattat taactataat atatgatgga ttttttccta attttttata tttccttaca 5880attttggtgg ccattaattt aactttaggc ttttgggcat atgctagtct gagcttccga 5940aaagatacat atatgtttcc cttttcatta gctgaatgag gatattttaa gaagttgaaa 6000gagaatttat tttcaagttg tgagtaaatc ctcctttgaa attcacctga ttattagata 6060acttaaagtt tatttttaaa agctgacaac tttttatgaa tcttcgagtt gacagttcct 6120aaaagcgtaa ctcagatatt aatgggctgt gtattaaatg gttttatttt cagttttgca 6180gcacagaaca ctgttgaaat atccatatca acttgatttt tttaacctaa ttcaggtgtc 6240ctttgcatct cttaaatgtt gggggtgggg gtcagagcca gttatccggc ttctgttttg 6300tcgattgctt agatttgttc ctgttgtcaa aactgttacc cccaaaattg gtgtgacaca 6360tgctcatgca taaaatgtta aaatgagtac atccttgtat ttgtatttgt tttcaacatc 6420gccaaggtgc tatgggaaat taacaaaatt agaaaaaaaa taaaattatt aaaaagcaaa 6480aaaaaaaaaa aaaaaaa 6497<210>11
<211>484<212>DNA<213>人<400>11atgggggtgg aactcatgat ggaattggag cctttacaag ggaatgaaga gacaagagct 60ctctttatgc cacgtgagga tacagcaagg ccccaatctg caagccagga agagtcgtca 120cgagaaccag accatgcagg aactctgatc gtggacattt caacctccag aactgtgatc 180caaaatgcat atgtatcttt ggaagaaact ctgaagtaaa ggccggaata ttctttgttt 240aaaacattaa aaacaaaaca gaccaaagca tcaagcaaga agtttcctgg caataaacta 300agcacagcat tattttttaa ggaacacaaa ttaagtgttc aacctgtggc aaatttgtac 360tttctccctg aattatgttg ttatcaaaga aaaaaattgg gaagcatggc aaaatatcat 420caaaactgaa actagaatta aactaaatta aaataaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 480aaaa 484<210>12<211>1904<212>DNA<213>人<400>12ctacgtgcaa aagcagaatg ggaaggctaa gggacagctt cccgatctaa actattggat 60aaacttcaga cctatttacc accatcagtg atgcttcccc cacggcgttt acagactctc 120ctgcggcagg cggtggaact acaaagggat cggtgcctat atcacaatac caaacttgat 180aataatctag attctgtgtc tctgcttata gaccatgttt gtagtaggag gcagttccca 240tgttatacgc agcagatac ttacggagcat tgtaatgaag tgtggttctg taaattctct 300aatgatggca ctaaactagc aacaggatca aaagatacaa cagttatcat atggcaagtt 360gatccggata cacacctgct aaaactgctt aaaacattag aaggacatgc ttatggcgtt 420tcttatattg catggagtcc agatgacaac tatcttgttg cttgtggccc agatgactgc 480tctgagcttt ggctttggaa tgtacaaaca ggagaactaa ggacaaaaat gagccagtct 540
catgaagaca gtttgacaag tgtggcttgg aatccagatg ggaagcgctt tgtgactgga 600ggtcagcgtg ggcagttcta tcagtgtgac ttagatggta atctccttga ctcctgggaa 660ggggtaagag tgcaatgcct ttggtgcttg agtgatggaa agactgttct ggcatcagat 720acacaccagc gaattcgggg ctataacttc gaggacctta cagataggaa catagtacaa 780gaagatcatc ctattatgtc ttttactatt tcaaaaaatg gccgattagc tttgttaaat 840gtagcaactc agggagttca tttatgggac ttgcaagaca gagttttagt aagaaagtat 900caaggtgtta cacaagggtt ttatacaatt cattcatgtt ttggaggcca taatgaagac 960ttcatcgcta gtggcagtga agatcacaag gtttacatct ggcacaaacg tagtgaactg 1020ccaattgcgg agctgacagg gcacacacgt acagtaaact gtgtgagctg gaacccacag 1080attccatcca tgatggccag cgcctcagat gatggcactg ttagaatatg gggaccagca 1140ccttttatag accaccagaa tattgaagag gaatgcagta gcatggatag ttgatggtga 1200atttggagca gacgacctct gtttaactta aaattagtcg tattttaatg gcttgggatt 1260tggtgcaaac aaacatgatt gatagctgga cagacatgct cgtcatgaaa aaagaaccat 1320ttctgaagcc cgattggggc caaacattta caccttgctt catagtaacc agttgagatg 1380aagcacgtcg ttagaacgtt gttggacacc atgttgaatt attcccccat cggttgtgaa 1440gaactgtgct acattcaggc ttacccattg aactcagtat atatattttt ttccttcctg 1500tcttttgtct ggcaggatac cattcttgtt gctcttctgt gtaatgaagt ttaaatgctt 1560gtttggaaaa ctttatttaa cagtttagaa ggcttgatag aaagagtgca ttagtctgaa 1620gagtatacat tggataggaa agaatttcct tcttttgttt ctccaaatct ttccgcctta 1680tttagcttga gatctttgca gcttggttca tggattctag ccttgcccgt tgcgcagtat 1740atactgatcc agatgataaa ccagtgaact atgtcaaaag cactctcaat attacatttg 1800acaaaaagtt ttgtactttt cacatagctt gttgccccgt aaaagggtta acagcacaat 1860tttttaaaaa taaattaaga agtatttaaa aaaaaaaaaa aaaa 1904<210>13
<211>2088<212>DNA<213>人<400>13cgctgtcaac tctccaactc agctcagctg atcggttgcc gccgccgccg ccgccagatt 60ctggaggcga agaacgcaaa gctgagaaca tggacgttaa tatcgcccca ctccgcgcct 120gggacgattt cttcccgggt tccgatcgct ttgcccggcc ggacttcagg gacatttcca 180aatggaacaa ccgcgtagtg agcaacctgc tctattacca gaccaactac ctggtggtgg 240ctgccatgat gatttccatt gtggggtttc tgagtccctt caacatgatc ctgggaggaa 300tcgtggtggt gctggtgttc acagggtttg tgtgggcagc ccacaataaa gacgtccttc 360gccggatgaa gaagcgctac cccacgacgt tcgttatggt ggtcatgttg gcgagctatt 420tccttatctc catgtttgga ggagtcatgg tctttgtgtt tggcattact tttcctttgc 480tgttgatgtt tatccatgca tcgttgagac ttcggaacct caagaacaaa ctggagaata 540aaatggaagg aataggtttg aagaggacac cgatgggcat tgtcctggat gccctagaac 600agcaggaaga aggcatcaac agactcactg actatatcag caaagtgaag gaataaacat 660aacttacctg agctagggtt gcagcagaaa ttgagttgca gcttgccctt gtccagacct 720atgttctgct tgcgtttttg aaacaggagg tgcacgtacc acccaattat ctatggcagc 780atgcatgtat aggccgaact attatcagct ctgatgtttc agagagaaga cctcagaaac 840cgaaagaaaa ccaccaccct cctattgtgt ctgaagtttc acgtgtgttt atgaaatcta 900atgggaaatg gatcacacga tttctttaag ggaattaaaa aaaataaaag aattacggct 960t ttacagcaacaatacgatt atcttatagg aaaaaaaaaa atcattgtaa agtatcaaga 1020caatacgagt aaatgaaaag gctgttaaag tagatgacat catgtgttag cctgttccta 1080aatccctaga attgtaatgt gtgggatata aattagtttt tattattctc ttaaaaatca 1140aagatgatct ctatcacttt gccacctgtt tgatgtgcag tggaaactgg ttaagccagt 1200tgttcatact tcctttacaa atataaagat agctgtttag gatattttgt tacatttttg 1260taaatttttg aaatgctagt aatgtgtttt caccagcaag tatttgttgc aaacttaatg 1320
tcattttcct taagatggtt acagctatgt aacctgtatt attctggacg gacttattaa 1380aatacaaaca gacaaaaaat aaaacaaaac ttgagttcta tttaccttgc acattttttg 1440ttgttacagt gaaaaaaatg gtccaagaaa atgtttgcca tttttgcatt gtttcgtttt 1500taactggaac atttagaaag aaggaaatga atgtgcattt tattaattcc ttaggggcac 1560aaggaggaca ataatagctg atcttttgaa atttgaaaaa cgtctttaga tgaccaagca 1620aaaagacttt aaaaaatggt aatgaaaatg gaatgcagct actgcagcta ataaaaaatt 1680ttagatagca attgttacaa ccatatgcct ttatagctag acattagaat tatgatagca 1740tgagtttata cattctatta tttttcctcc ctttctcatg tttttataaa taggtaataa 1800aaaatgtttt gcctgccaat tgaatgattt cgtagctgaa gtagaaacat ttaggtttct 1860gtagcattaa attgtgaaga caactggagt ggtacttact gaagaaactc tctgtatgtc 1920ctagaataag aagcaatgat gtgctgcttc tgatttttct tgcattttaa attctcagcc 1980aacctacagc catgatcttt agcacagtga tatcaccatg acttcacaga catggtctag 2040aatctgtacc cttacccaca tatgaagaat aaaattgatt aaaggtta 2088<210>14<211>1650<212>DNA<213>人<400>14gccttttttg cagtctcagg acgggcgctt tggagccggc cccaggcagc gtgtgtcggt 60cgcctagtct ggagaactag tcctcgactc acggtgaggg aatggaccga cacgggtatt 120gtaccgctga gggaaaggag cgggactccg gacctccagg agtgcaagga tgatgctgaa 180aggaataaca aggcttatct ctaggatcca taagttggac cctgggcgtt ttttacacat 240ggggacccag gctcgccaaa gcattgctgc tcacctagat aaccaggttc cagttgagag 300tccgagagct atttcccgca ccaatgagaa tgacccggcc aagcatgggg atcagcacga 360gggtcagcac tacaacatct ccccccagga tttggagact gtatttcccc atggccttcc 420
tcctcgcttt gtgatgcagg tgaagacatt cagtgaagct tgcctgatgg taaggaaacc 480agccctagaa cttctgcatt acctgaaaaa caccagtttt gcttatccag ctatacgata 540tcttctgtat ggagagaagg gaacaggaaa aaccctaagt ctttgccatg ttattcattt 600ctgtgcaaaa caggactggc tgatactaca tattccagat gctcatcttt gggtgaaaaa 660ttgtcgggat cttctgcagt ccagctacaa caaacagcgc tttgatcaac ctttagaggc 720ttcaacctgg ctgaagaatt tcaaaactac aaatgagcgc ttcctgaacc agataaaagt 780tcaagagaag tatgtctgga ataagagaga aagcactgag aaagggagtc ctctgggaga 840agtggttgaa cagggcataa cacgggtgag gaacgccaca gatgcagttg gaattgtgct 900gaaagagcta aagaggcaaa gttctttggg tatgtttcac ctcctagtgg ccgtggatgg 960aatcaatgct ctttggggaa gaaccactct gaaaagagaa gataaaagcc cgattgcccc 1020cgaggaatta gcacttgttc acaacttgag gaaaatgatg aaaaatgatt ggcatggagg 1080cgccattgtg tcggctttga gccagactgg gtctctcttt aagccccgga aagcctatct 1140gccccaggag ttgctgggaa aggaaggatt tgatgccctg gatcccttta ttcccatcct 1200ggtttccaac tataacccaa aggaatttga aagttgtatt cagtattatt tggaaaacaa 1260ttggcttcaa catgagaaag ctcctacaga agaagggaaa aaagagctgc tgttcctaag 1320taacgcgaac ccctcgctgc tggagcggca ctgtgcctac ctctaagcca agatcacagc 1380atgtgaggaa gacagtggac atctgcttta tgctggaccc agtaagatga ggaagtcggg 1440cagtacacag gaagaggagc caggcccttg tacctatggg attggacagg actgcagttg 1500gctctggacc tgcattaaaa tgggtttcac tgtgaatgcg tgacaataag atattccctt 1560gttcctaaaa ctttatatca gtttattgga tgtggttttt cacatttaag ataattatgg 1620ctcttttcct aaaaaataaa atatctttct 1650<210>15<211>1109<212>DNA<213>人
<400>15actggaagac caggcagccc agctgaaggc agtaagctcg gctcacagtc gcaggagagt 60tctggggtac acgggcaaag gggcttgaga aggcccggag gcgaagccga agagaagcaa 120ctgtgccccg gagaagagaa gctcgcccat tccagactgg gaaccagctt tcagtgaaga 180tggcagggcc agaactgttg ctcgactcca acatccgcct ctgggtggtc ctacccatcg 240ttatcatcac tttcttcgta ggcatgatcc gccactacgt gtccatcctg ctgcagagcg 300acaagaagct cacccaggaa caagtatctg acagtcaagt cctaattcga agcagagtcc 360tcagggaaaa tggaaaatac attcccaaac agtctttctt gacacgaaaa tattatttca 420acaacccaga ggatggattt ttcaaaaaaa ctaaacggaa ggtagtgcca ccttctccta 480tgactgatcc tactatgttg acagacatga tgaaagggaa tgtaacaaat gtcctcccta 540tgattcttat tggtggatgg atcaacatga cattctcagg ctttgtcaca accaaggtcc 600catttccact gaccctccgt tttaagccta tgttacagca aggaatcgag ctactcacat 660tagatgcatc ctgggtgagt tctgcatcct ggtacttcct caatgtattt gggcttcgga 720gcatttactc tctgattctg ggccaagata atgccgctga ccaatcacga atgatgcagg 780agcagatgac gggagcagcc atggccatgc ccgcagacac aaacaaagct ttcaagacag 840agtgggaagc tttggagctg acggatcacc agtgggcact agatgatgtc gaagaagagc 900tcatggccaa agacctccac ttcgaaggca tgttcaaaaa ggaattacag acctctattt 960tttgaagacc gagcagggat tagctgtgtc aggaacttgg agttgcactt aaccttgtaa 1020ctttgtttgg agctggcacc tcttgaaata aaaaggagga tgcacgagct ggcaggcatg 1080caaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa1109<210>16<211>2818<212>DNA<213>人<400>16ccctactccg cctctcggga tcctttaaga ggcggggctt ggctgccagc tccgcggccc 60
gggcaaaagg ctgggacttt actccgggtg gcggcgagga cgagtctgtg ctccatcagc 120tgccgcaccc gccgcctccc gcccccaaac cccatccccg cggttgagcc acgatgagcg 180gcagagtcgg cgatctgagc cccaggcaga aggaggcatt ggccaagttt cgggagaatg 240tccaggatgt gctgccggcc ctgccgaatc cagatgacta ttttctcctg cgttggctcc 300gagccagaag cttcgacctg cagaagtcgg aggccatgct ccggaagcat gtggagttcc 360gaaagcaaaa ggacattgac aacatcatta gctggcagcc tccagaggtg atccaacagt 420atctgtcagg gggtatgtgt ggctatgacc tggatggctg cccagtctgg tacgacataa 480ttggacctct ggatgccaag ggtctgctgt tctcagcctc caaacaggac ctgctgagga 540ccaagatgcg ggagtgtgag ctgcttctgc aagagtgtgc ccaccagacc acaaagttgg 600ggaggaaggt ggagaccatc accataattt atgactgcga ggggcttggc ctcaagcatc 660tctggaagcc tgctgtggag gcctatggag agtttctctg catgtttgag gaaaattatc 720ccgaaacact gaagcgtctt tttgttgtta aagcccccaa actgtttcct gtggcctata 780acctcatcaa acccttcctg agtgaggaca ctcgtaagaa gatcatggtc ctgggagcaa 840attggaagga ggttttactg aaacatatca gccctgacca ggtgcctgtg gagtatgggg 900gcaccatgac tgaccctgat ggaaacccca agtgcaaatc caagatcaac tacgggggtg 960acatccccag gaagtattat gtgcgagacc aggtgaaaca gcagtatgaa cacagcgtgc 1020agatttcccg tggctcctcc caccaagtgg agtatgagat cctcttccct ggctgtgtcc 1080tcaggtggca gtttatgtca gatggagcgg atgttggttt tgggattttc ctgaagacca 1140agatgggaga gaggcagcgg gcaggggaga tgacagaggt gctgcccaac cagaggtaca 1200actcccacct ggtccctgaa gatgggaccc tcacctgcag tgatcctggc atctatgtcc 1260tgcggtttga caacacctac agcttcattc atgccaagaa ggtcaatttc actgtggagg 1320tcctgcttcc agacaaagcc tcagaagaga agatgaaaca gctgggggca ggcaccccga 1380aataacacct tctcctatag caggcctggc cccctcagtg tctccctgtc aatttctacc 1440ccttgtagca gtcattttcg cacaaccctg aagcccaaag aaactgggct ggaggacaga 1500
cctcaggagc tttcatttca gttaggcaga ggaagagcga ctgcagtggg tctccgtgtc 1560tatcaaatac ctaaggagtc cccaggagct ggctggccat cgtgatagga tctgtctgtc 1620ctgtaaactg tgccaacttc acctgtccag ggacagcgaa gctgggggtg gcggggggca 1680tgtaccacag ggtggcagca gggaaaaaaa ttagaaaagg gtgaaagatt gggacttaac 1740acttcaggga agtcagctgc cggggagaaa cttgctccta aatgaacaca taagtttaga 1800tcgcaatgag gagtagcagg gtagctggtt gctagagtta cggtggggat cagaaactct 1860tccaaacatt ttagcactga ggctggggta gcttttggct tttcccaggt ctcaggaggt 1920ggcctgagtc agcacacatc ttcccactcg gtagacaggc tggcctctcc ctcactttga 1980gactttggca actcctgggc cacacggcct gcctctttga ttactaatga ttgtcagtga 2040ctcagagctt cctgggactt cgggtaccca cccgctgttc tccatgcaaa caaagcgcca 2100gggaaatgac ccacagggat cgcagctgca gggagggcca gggaggttgg gggtgggagt 2160gaatgctaaa agcagatcgt ccagtgccct tttcagtgct accggcctct caccaagcag 2220tcctccatgt gagcaacccc gagacaaaaa tgctaagtgg gatcaagaga gcagcactcg 2280gagagggtgt ttgccagtct gagtgtcccg cggtgcccgc caacccgctt cctgactgac 2340ctgagcaagg tcttactaag cagtcccatc tctgtgggag gcatgcaacg cgtgcaggga 2400gttcaggtgc cggtcggcgt agccaggcct ggaggccccc caggcaggag gccgcccaaa 2460ggcggggccg gcgtctcgca gactaggggc tgggggcggc cacagacggc ctcgaaacca 2520cagcccttac cccaatccca cgagccccgc caacgaacca caggtgctgg gctttagaga 2580acatgggaag gcggccccag acctggcggg aacgcctttc cctcagagcc aggccccggc 2640cccgtctggg aagctcatct tgcgaagctg agggagctca gggcaaaggc caggctagcg 2700cggaccggaa ggggccgagg ctgcacgggc ctctgccaga acgctcagga catcccggcc 2760tgggtttaca acgctgttag gaaaattaac caatgaataa agcaacgttc agtgcgca2818<210>17<211>1475<212>DNA
<213>人<400>17gtcgacgcgg ccgcgctccg ctcccgtgag taacttggct ccgggggctc cgctcgcctg 60cccgcacgcc gcccgccacc caggaccgcg ccgccggcct ccgccgctag caaacccttc 120cgacggccct cgctgcgcaa gccgggacgc ctctcccccc tccgcccccg ccgcggaaag 180ttaagtttga agagggggga agaggggaac atggacatga agaggaggat ccacctggag 240ctgaggaacc ggaccccggc agctgttcga gaacttgtct tggacaattg caaatcaaat 300gatggaaaaa ttgagggctt aacagctgaa tttgtgaact tagagttcct cagtttaata 360aatgtaggct tgatctcagt ttcaaatctc cccaagctgc ctaaattgaa aaagcttgaa 420ctcagtgaaa atagaatctt tggaggtctg gacatgttag ctgaaaaact tccaaatctc 480acacatctaa acttaagtgg aaataaactg aaagatatca gcaccttgga acctttgaaa 540aagttagaat gtctgaaaag cctggacctc tttaactgtg aggttaccaa cctgaatgac 600taccgagaga gtgtcttcaa gctcctgccc cagcttacct acttggatgg ctatgaccga 660gaggaccagg aagcacctga ctcagatgcc gaggtggatg gtgtggatga agaggaggag 720gacgaagaag gagaagatga ggaagacgag gacgatgagg atggtgaaga agaggagttt 780gatgaagaag atgatgaaga tgaagatgta gaaggggatg aggacgacga tgaagtcagt 840gaggaggaag aagaatttgg acttgatgaa gaagatgaag atgaggatga ggatgaagag 900gaggaagaag gtgggaaagg tgaaaagagg aagagagaaa cagatgatga aggagaagat 960gattaagacc ccagatgacc tgcagaaaca gaactgttca gtattggttg gactgctcat 1020ggattttgta gctgtttaaa aaaaaaaaaa aggtagctgt gatacaaacc ccaggacacc 1080cacccaccca aagagccaaa gaatagttcc tgtgacattc cgccttcctt ccatgtagtc 1140cctcttggta atctaccacc aagcttgtgg acttcacccc aacaaaattg taagcgttgt 1200taggtttttg tgtaagattc ttgctgtagc gtggatagct gtgattggtg agtcaaccgt 1260ctgtggctac cagttacact gagattgtaa cagcattttt actttctgta caacaaaaaa 1320gctttgtaaa taaaatctta acattttggg tctgtttttt catgctttgc tttttaatta 1380
ttattattat tttttttaca ttaggacatt ttatgtgaca actgccaaaa aagtattttt 1440aagaatttaa gcgaaataaa cagttactct ttggc 1475<210>18<211>841<212>DNA<213>人<400>18gcaaccactg cagctgggcc aagtcgctta gctcttcggt ggttgtcaca cgtccggagg 60cctagccgtc gcgtacctag gatgccgcgt ggaagccgaa gccgcacctc ccgcatggcc 120cctccggcca gccgggcccc tcagatgaga gctgcaccca ggccagcacc agtcgctcag 180ccaccagcag cggcaccccc atctgcagtt ggctcttctg ctgctgcgcc ccggcagcca 240ggtctgatgg cccagatggc aaccactgca gctggcgtgg ctgtgggctc tgctgtgggg 300cacacattgg gtcacgccat tactgggggc ttcagtggag gaagtaatgc tgagcctgcg 360aggcctgaca tcacttacca ggagcctcag ggaacccagc cggcacagca gcagcagcct 420tgcctctatg agatcaaaca gtttctggag tgtgcccaga accagggtga catcaagctc 480tgtgagggtt tcaatgaggt gctgaaacag tgccgacttg caaacggatt ggcctaatga 540agaagttcaa cctggagaga tggaaaatca gctctcataa ctaagttaat ttagtataaa 600aatagaattg atagtgaggg tataaagtgt aaccatcagt taaacctctc ctgtcattcc 660tagcttcctt gcttcagaat tgaaatggaa gtgggggtgt ccctactctg tagaatctgg 720gactgggcaa atgtttgtgt ggcctcctta aactagctgt tatgttatga ttttattctt 780tgtgagttaa ttagaataaa gtcattttct tacaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 840a 841<210>19<211>1486<212>DNA<213>人
<400>19gggctcgtca gatatattaa ttttacactt cagttttgat tggtgagaaa gtacccattc 60tcttcaaata atcaaagata attattattt tgttttgttt ttggaatcaa cagggaggcg 120caaagtataa agttgctgct aacatatata catatacatc catattttat aagggtgtct 180atgtatatat agacagtgtg tccacacaaa aaatagatac agttatcagt cagtcagttc 240ttccatgatt tagttttttt aaacgtagaa aagctattgt aaacgtctct ttccatttat 300tcttaatttt ttgacatatt ggtatttctt taaagggaaa tgaggaatgc acatcagtga 360ttgattgtca aacctcaccc cctgatttcc tacctaatct acccccacct aaccaatcaa 420tcacatccac aaattgtttt gtttgtttgt tagtcaggct tccaacagag ttcaatattt 480ctaacactct agtgcaataa aaattattat taaatagcta agaggtgtgc atgtgggaaa 540ggtcagtgca tatcccttta ggaggggaga atgttgtaat atatcagcta tcgagttgtt 600taaaaaaagt gtattcaatc gtatattgtc tatagtatgt gctatgaaat ttgcatttat 660gatatgtaac aggggcaaag ccaaattcat gttactctgt tcagtcagaa acattttgtg 720gcatacagca ttcctgggaa gtgctgtact ttgtttcgtt ttggttttag ttttgcattt 780agagtgcctt ataattgatg cctattttaa tagcatttct ttttagcttt tggttcgtat 840ttccattcac tgttcgtatc tgttactttc tattaaagca ttatctgttt accacatgta 900caaaaactct ttgaataata tgcattccta gttttcagcc aagacgggga tgttagtgat 960tgtaccagcc caaagcactt ggataatcag ggcccttctt ccttttataa tcaatcatca 1020acatcagaaa aagctacttg ttttatttat attcccttcc aaatccgctc tggaacatgc 1080agtaactgca ccaaacttat tttagtaaca aatatcattg gcaactttgg aatatatttg 1140atattccatt aggatttttc taaaagggga aataaactat atatatatat gtatcttacc 1200cccaattctt ccaacagaat ttctatagga agccatggat gatggcataa gtttgccaca 1260tattacatga ttttaaataa tcctcaaaat acccaaggaa ctcttaaaga gttttggtat 1320gagtatacta ctttggttta attttagctt catggatgtt ctgcatggaa ggatttttgt 1380tttccacatt ttcccattgc tagcagagtg aaatccaaga gaccaaacat ttgcaagcat 1440
tgtatttgag cacttttgta aaaaacaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 1486<210>20<211>16<212>DNA<213>噬菌體M13mp18<400>20gtaaaacgac ggccag 16<210>21<211>17<212>DNA<213>噬菌體M13mp18<400>21caggaaacag ctatgac 17<210>22<211>30<212>DNA<213>人<400>22caggtgaatt tcaaaggagg atttactcac 30<210>23<211>30<212>DNA<213>人<400>23gtgagtaaat cctcctttga aattcacctg 30<210>24<211>23<212>DNA<213>人<400>24gcaagccagg aagagtcgtc acg 23
<210>25<211>25<212>DNA<213>人<400>25tgccaggaaa cttcttgctt gatgc25<210>26<211>26<212>DNA<213>人<400>26agtaaccagt tgagatgaag cacgtc 26<210>27<211>28<212>DNA<213>人<400>27cagaagagca acaagaatgg tatcctgc 28<210>28<211>25<212>DNA<213>人<400>28aacttgagtt ctatttacct tgcac25<210>29<211>21<212>DNA<213>人<400>29ttgcttgggt catctaaaga c21<210>30<211>20
<212>DNA<213>人<400>30actcacgtgc aaggatgatg 20<210>31<211>20<212>DNA<213>人<400>31agctctcgga ctctcaactg 20<210>32<211>26<212>DNA<213>人<400>32cttctcctat gactgatcct actatg 26<210>33<211>21<212>DNA<213>人<400>33caggatgcag aactcaccct g21<210>34<211>21<212>DNA<213>人<400>34gcagatttcc cgtggctcct c21<210>35<211>22<212>DNA<213>人
<400>35gttgggcagc acctctgtca tc 22<210>36<211>22<212>DNA<213>人<400>36ctgtgacatt ccgccttcct tc 22<210>37<211>23<212>DNA<213>人<400>37ccacgctact gcaagaatct tac 23<210>38<211>23<212>DNA<213>人<400>38agaagttcaa cctggagaga tgg 23<210>39<211>24<212>DNA<213>人<400>39caaggaagct aggaatgaca ggag 24<210>40<211>24<212>DNA<213>人<400>40gcaaagccaa attcatgtta ctct 24
<210>41<211>27<212>DNA<213>人<400>41cagatacgaa cagtgaatgg aaatacg 27<210>42<211>24<212>DNA<213>人<400>42gccacaggtt gaacacttaa tttg 24<210>43<211>22<212>DNA<213>人<400>43aggaagagtc gtcacgagaa cc 22<210>44<211>25<212>DNA<213>人<400>44ataatgctgt gcttagttta ttgcc25<210>45<211>21<212>DNA<213>人<400>45gatcgtggac atttcaacct c21<210>46<211>20
<212>DNA<213>人<400>46tcttgcttga tgctttggtc 20<210>47<211>1254<212>PRT<213>小鼠<400>47Met Pro Gly Gly Ser Val Asn Ile Thr Cys Val Ala Val Gly Ser Pro1 5 10 15Met Pro Tyr Val Lys Trp Met Leu Gly Ala Glu Asp Leu Thr Pro Glu20 25 30Asp Asp Met Pro Ile Gly Arg Asn Val Leu Glu Leu Asn Asp Val Arg35 40 45Gln Ser Ala Asn Tyr Thr Cys Val Ala Met Ser Thr Leu Gly Val Ile50 55 60Glu Ala Ile Ala Gln Ile Thr Val Lys Ala Leu Pro Lys Pro Pro Gly65 70 75 80Thr Pro Val Val Thr Glu Ser Thr Ala Thr Ser Ile Thr Leu Thr Trp85 90 95Asp Ser Gly Asn Pro Glu Pro Val Ser Tyr Tyr Ile Ile Gln His Lys100 105 110Pro Lys Asn Ser Glu Glu Pro Tyr Lys Glu Ile Asp Gly Ile Ala Thr115 120 125Thr Arg Tyr Ser Val Ala Gly Leu Ser Pro Tyr Ser Asp Tyr Glu Phe130 135 140
Arg Val Val Ala Val Asn Asn Ile Gly Arg Gly Pro Ala Ser Glu Pro145 150 155 160Val Leu Thr Gln Thr Ser Glu Gln Ala Pro Ser Ser Ala Pro Arg Asp165 170 175Val Gln Ala Arg Met Leu Ser Ser Thr Thr Ile Leu Val Gln Trp Lys180 185 190Glu Pro Glu Glu Pro Asn Gly Gln Ile Gln Gly Tyr Arg Val Tyr Tyr195 200 205Thr Met Asp Pro Thr Gln His Val Asn Asn Trp Met Lys His Asn Val210 215 220Ala Asp Ser Gln Ile Thr Thr Ile Gly Asn Leu Val Pro Gln Lys Thr225 230 235 240Tyr Ser Val Lys Val Leu Ala Phe Thr Ser Ile Gly Asp Gly Pro Leu245 250 255Ser Ser Asp Ile Gln Val Ile Thr Gln Thr Gly Val Pro Gly Gln Pro260 265 270Leu Asn Phe Lys Ala Glu Pro Glu Ser Glu Thr Ser Ile Leu Leu Ser275 280 285Trp Thr Pro Pro Arg Ser Asp Thr Ile Ala Ser Tyr Glu Leu Val Tyr290 295 300Arg Asp Gly Asp Gln Gly Glu Glu Gln Arg Ile Thr Ile Glu Pro Gly305 310 315 320Thr Ser Tyr Arg Leu Gln Gly Leu Lys Pro Asn Ser Leu Tyr Tyr Phe325 330 335
Arg Leu Ser Ala Arg Ser Pro Gln Gly Leu Gly Ala Ser Thr Ala Glu340 345 350Ile Ser Ala Arg Thr Met Gln Ser Met Phe Ala Lys Asn Phe His Val355 360 365Lys Ala Val Met Lys Thr Ser Val Leu Leu Ser Trp Glu Ile Pro Glu370 375 380Asn Tyr Asn Ser Ala Met Pro Phe Lys Ile Leu Tyr Asp Asp Gly Lys385 390 395 400Met Val Glu Glu Val Asp Gly Arg Ala Thr Gln Lys Leu Ile Val Asn405 410 415Leu Lys Pro Glu Lys Ser Tyr Ser Phe Val Leu Thr Asn Arg Gly Asn420 425 430Ser Ala Gly Gly Leu Gln His Arg Val Thr Ala Lys Thr Ala Pro Asp435 440 445Val Leu Arg Thr Lys Pro Ala Phe Ile Gly Lys Thr Asn Leu Asp Gly450 455 460Met Ile Thr Val Gln Leu Pro Asp Val Pro Ala Asn Glu Asn Ile Lys465 470 475 480Gly Tyr Tyr Ile Ile Ile Val Pro Leu Lys Lys Ser Arg Gly Lys Phe485 490 495Ile Lys Pro Trp Glu Ser Pro Asp Glu Met Glu Leu Asp Glu Leu Leu500 505 510Lys Glu Ile Ser Arg Lys Arg Arg Ser Ile Arg Tyr Gly Arg Glu Val515 520 525
Glu Leu Lys Pro Tyr Ile Ala Ala His Phe Asp Val Leu Pro Thr Glu530 535 540Phe Thr Leu Gly Asp Asp Lys His Tyr Gly Gly Phe Thr Asn Lys Gln545 550 555 560Leu Gln Ser Gly Gln Glu Tyr Val Phe Phe Val Leu Ala Val Met Asp565 570 575His Ala Glu Ser Lys Met Tyr Ala Thr Ser Pro Tyr Ser Asp Pro Val580 585 590Val Ser Met Asp Leu Asp Pro Gln Pro Ile Thr Asp Glu Glu Glu Gly595 600 605Leu Ile Trp Val Val Gly Pro Val Leu Ala Val Val Phe Ile Ile Cys610 615 620Ile Val Ile Ala Ile Leu Leu Tyr Lys Arg Lys Arg Ala Glu Ser Glu625 630 635 640Ser Arg Lys Ser Ser Leu Pro Asn Ser Lys Glu Val Pro Ser His His645 650 655Pro Thr Asp Pro Val Glu Leu Arg Arg Leu Asn Phe Gln Thr Pro Gly660 665 670Met Ala Ser His Pro Pro Ile Pro Ile Leu Glu Leu Ala Asp His Ile675 680 685Glu Arg Leu Lys Ala Asn Asp Asn Leu Lys Phe Ser Gln Glu Tyr Glu690 695 700Ser Ile Asp Pro Gly Gln Gln Phe Thr Trp Glu His Ser Asn Leu Glu705 7107 15 720
Val Asn Lys Pro Lys Asn Arg Tyr Ala Asn Val Ile Ala Tyr Asp His725 730 735Ser Arg Val Leu Leu Ser Ala Ile Glu Gly Ile Pro Gly Ser Asp Tyr740 745 750Val Asn Ala Asn Tyr Ile Asp Gly Tyr Arg Lys Gln Asn Ala Tyr Ile755 760 765Ala Thr Gln Gly Ser Leu Pro Glu Thr Phe Gly Asp Phe Trp Arg Met770 775 780Ile Trp Glu Gln Arg Ser Ala Thr Val Val Met Met Thr Lys Leu Glu785 790 795 800Glu Arg Ser Arg Val Lys Cys Asp Gln Tyr Trp Pro Ser Arg Gly Thr805 810 815Glu Thr His Gly Leu Val Gln Val Thr Leu Leu Asp Thr Val Glu Leu820 825 830Ala Thr Tyr Cys Val Arg Thr Phe Ala Leu Tyr Lys Asn Gly Ser Ser835 840 845Glu Lys Arg Glu Val Arg Gln Phe Gln Phe Thr Ala Trp Pro Asp His850 855 860Gly Val Pro Glu His Pro Thr Pro Phe Leu Ala Phe Leu Arg Arg Val865 870 875 880Lys Thr Cys Asn Pro Pro Asp Ala Gly Pro Met Val Val His Cys Ser885 890 895Ala Gly Val Gly Arg Thr Gly Cys Phe Ile Val Ile Asp Ala Met Leu900 905 910
Glu Arg Ile Lys His Glu Lys Thr Val Asp Ile Tyr Gly His Val Thr915 920 925Leu Met Arg Ala Gln Arg Asn Tyr Met Val Gln Thr Glu Asp Gln Tyr930 935 940Ile Phe Ile His Asp Ala Leu Leu Glu Ala Val Thr Cys Gly Asn Thr945 950 955 960Glu Val Pro Ala Arg Asn Leu Tyr Ala Tyr Ile Gln Lys Leu Thr Gln965 970 975Ile Glu Thr Gly Glu Asn Val Thr Gly Met Glu Leu Glu Phe Lys Arg980 985 990Leu Ala Ser Ser Lys Ala His Thr Ser Arg Phe Ile Ser Ala Asn Leu995 10001005Pro Cys Asn Lys Phe Lys Asn Arg Leu Val Asn Ile Met Pro Tyr101010151020Glu Ser Thr Arg Val Cys Leu Gln Pro Ile Arg Gly Val Glu Gly102510301035Ser Asp Tyr Ile Asn Ala Ser Phe Leu Asp Gly Tyr Arg Gln Gln104010451050Lys Ala Tyr Ile Ala Thr Gln Gly Pro Leu Ala Glu Thr Thr Glu105510601065Asp Phe Trp Arg Met Leu Trp Glu His Asn Ser Thr Ile Val Val107010751080Met Leu Thr Lys Leu Arg Glu Met Gly Arg Glu Lys Cys His Gln108510901095
Tyr Trp Pro Ala Glu Arg Ser Ala Arg Tyr Gln Tyr Phe Val Val110011051110Asp Pro Met Ala Glu Tyr Asn Met Pro Gln Tyr Ile Leu Arg Glu111511201125Phe Lys Val Thr Asp Ala Arg Asp Gly Gln Ser Arg Thr Val Arg113011351140Gln Phe Gln Phe Thr Asp Trp Pro Glu Gln Gly Val Pro Lys Ser114511501155Gly Glu Gly Phe Ile Asp Phe Ile Gly Gln Val His Lys Thr Lys116011651170Glu Gln Phe Gly Gln Asp Gly Pro Ile Ser Val His Cys Ser Ala117511801185Gly Val Gly Arg Thr Gly Val Phe Ile Thr Leu Ser Ile Val Leu119011951200Glu Arg Met Arg Tyr Glu Gly Val Val Asp Ile Phe Gln Thr Val120512101215Lys Met Leu Arg Thr Gln Arg Pro Ala Met Val Gln Thr Glu Asp122012251230Gln Tyr Gln Phe Cys Tyr Arg Ala Ala Leu Glu Tyr Leu Gly Ser123512401245Phe Asp His Tyr Ala Thr1250<210>48<211>21
<212>DNA<213>人<400>48aatc tgcaag ccaggaagag t 21<210>49<211>27<212>DNA<213>人<400>49tctagtttca gttttgatga tattttg 27<210>50<211>19<212>RNA<213>人<400>50ucugcaagcc aggaagagu 19<210>51<211>19<212>RNA<213>人<400>51acucuuccug gcuugcaga 19<210>52<211>19<212>RNA<213>人<400>52ccuccagaac ugugaucca 19<210>53<211>19<212>RNA<213>人
<400>53uggaucacag uucuggagg 19<210>54<211>19<212>RNA<213>人<400>54cuacaaauga gcgcuuccu 19<210>55<211>19<212>RNA<213>人<400>55aggaagcgcu cauuuguag 19<210>56<211>20<212>DNA<213>人<400>56ccacatcgct cagacaccat 20<210>57<211>17<212>DNA<213>人<400>57accaggcgcc caatacg 17<210>58<211>28<212>DNA<213>人<400>58caaatccgtt gactccgacc ttcacctt 28
<210>59<211>20<212>DNA<213>人<400>59aaggccaacc gcgagaagat 20<210>60<211>20<212>DNA<213>人<400>60gtcaccggag tccatcacga 20<210>61<211>32<212>DNA<213>人<400>61ccatgtacgt tgctatccag gctgtgctat cc32<210>62<211>25<212>DNA<213>人<400>62caactgggac gacatggaga aaatc25<210>63<211>22<212>DNA<213>人<400>63catggctggg gtgttgaagg tc 22<210>64<211>23
<212>DNA<213>人<400>64actctcacct cccatgttgc tca 23<210>65<211>23<212>DNA<213>人<400>65gctatccgtg cactcctgtt ctg 23<210>66<211>21<212>DNA<213>人<400>66atctgcaagc caggaagagt c21<210>67<211>22<212>DNA<213>人<400>67cttgcttgat gctttggtct gt 22<210>68<211>30<212>DNA<213>人<400>68ccagaccatg caggaactct gatcgtggac 30<210>69<211>21<212>DNA<213>人
<400>69atgccctgga tccctttatt c21<210>70<211>23<212>DNA<213>人<400>70tcatcccgac ttcctcatct tac 23<210>71<211>24<212>DNA<213>人<400>71aactccctta ttacactatc catt 24<210>72<211>24<212>DNA<213>人<400>72gtgttatgag gaaaagatta ggga 24<210>73<211>30<212>DNA<213>人<400>73tgcagccagg agaagcaaga gaacagaaat 30
權(quán)利要求
1.含有根據(jù)SEQ ID 2的序列的分離的多肽，或者其功能變體。
2.融合蛋白，其含有根據(jù)權(quán)利要求1的多肽。
3.編碼根據(jù)權(quán)利要求1的多肽的分離的核酸，或者其變體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的核酸，其中該核酸是單鏈或雙鏈RNA。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的核酸，其中該核酸含有根據(jù)SEQ ID 11的核酸。
6.一種載體，其含有核酸，所述核酸選自根據(jù)權(quán)利要求3的核酸和編碼根據(jù)SEQ ID 1到9或SEQ ID 47的多肽的核酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的載體，其中該載體選自敲除基因構(gòu)建體、質(zhì)粒、穿梭載體、噬菌粒、粘粒、病毒載體和表達載體。
8.含有根據(jù)權(quán)利要求3的核酸的細胞。
9.含有根據(jù)權(quán)利要求6的載體的細胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的細胞，其中該細胞是轉(zhuǎn)基因胚胎非人干細胞。
11.含有根據(jù)權(quán)利要求3的核酸的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物。
12.抗體或者其抗體片段，其中該抗體針對根據(jù)權(quán)利要求1的多肽或者針對根據(jù)權(quán)利要求3的核酸。
13.一種核酸，其含有具有與根據(jù)權(quán)利要求3的核酸互補的序列的核酸或者根據(jù)權(quán)利要求3的核酸的非功能突變變體。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的核酸，其中具有互補序列的核酸是反義分子或者RNA干擾分子。
15.含有根據(jù)權(quán)利要求13的核酸的載體。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的載體，其中該載體選自質(zhì)粒、穿梭載體、噬菌粒、粘粒、病毒載體，和表達載體。
17.含有根據(jù)權(quán)利要求13的核酸的細胞。
18.含有根據(jù)權(quán)利要求15的載體的細胞。
19.一種診斷試劑，其含有至少一種化合物，所述化合物選自根據(jù)權(quán)利要求1的多肽、根據(jù)SEQ ID 1到9或者SEQ ID 47的多肽、編碼前述多肽之一的核酸、前述核酸之一的變體和針對前述多肽之一的抗體或者抗體片段，與適宜的添加劑或者助劑組合或在一起。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的診斷試劑，其中核酸是探針。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的診斷試劑，其中探針是DNA探針。
22.藥物組合物，其含有至少一種組分，所述組分選自根據(jù)權(quán)利要求1的多肽、根據(jù)SEQ ID 1到9或者SEQ ID 47的多肽、前述多肽之一的功能變體、編碼前述多肽之一的核酸、前述核酸之一的變體、為前述核酸之一的非功能突變變體的核酸、具有與前述核酸之一互補的序列的核酸、含有前述核酸之一的載體、含有前述核酸之一的細胞、含有前述載體的細胞、針對前述多肽之一的抗體或該抗體的片段、針對前述多肽之一的功能變體的抗體或者該抗體的片段、含有編碼前述抗體之一的核酸的載體、含有含有編碼前述抗體之一的核酸的載體的細胞和含有含有編碼前述抗體片段之一的核酸的載體的細胞，與適宜的添加劑或者助劑組合或在一起。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的藥物組合物，其中具有互補序列的核酸是反義分子或者RNA干擾分子。
24.肝臟失調(diào)或者上皮癌的診斷方法，其中選自根據(jù)SEQ ID 1到9或者SEQ ID 47的序列的多肽、前述多肽之一的功能變體、編碼前述多肽之一的核酸、前述核酸之一的變體、為前述核酸之一的非功能突變變體的核酸、具有與前述核酸之一互補的序列的核酸、針對前述多肽之一的抗體或該抗體的片段和針對前述多肽之一的功能變體的抗體或者該抗體的片段中的至少一種化合物在患者的樣品中被鑒定并與參比文庫或參比樣品的至少一種化合物比較。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中肝臟失調(diào)是選自肝硬變、酒精肝疾病、慢性肝炎、威爾遜病、血色素沉著、肝細胞癌、良性肝腫瘤和病灶性結(jié)節(jié)性增生癥的失調(diào)。
26.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中上皮癌是選自肺、胃、腎、結(jié)腸、前列腺、皮膚和乳腺的器官的腺癌。
27.治療患有肝臟失調(diào)或者上皮癌的患者的方法，其中選自根據(jù)SEQ ID 1到9或者SEQ ID 47的多肽、前述多肽之一的功能變體、編碼前述多肽之一的核酸、前述核酸之一的變體、為前述核酸之一的非功能突變變體的核酸、具有與前述核酸之一互補的序列的核酸、含有前述核酸之一的載體、含有前述核酸之一的細胞、含有前述載體的細胞、針對前述多肽之一的抗體或該抗體的片段、針對前述多肽之一的功能變體的抗體或者該抗體的片段、含有編碼前述抗體的核酸的載體、含有含有編碼前述抗體的核酸的載體的細胞和含有含有編碼前述抗體片段的核酸的載體的細胞中的至少一種組分，與適宜的添加劑或者助劑組合或在一起，以治療有效量被施用于需要該治療的患者。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的治療方法，其中具有互補序列的核酸是反義分子或者RNA干擾分子。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的治療方法，其中RNA干擾分子以雙鏈RNA或者表達雙鏈RNA的載體的形式施用。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中RNA干擾分子具有選自15到30個核苷酸的大小范圍。
31.根據(jù)權(quán)利要求27到30之一的方法，其中肝臟失調(diào)是選自肝硬變、酒精肝疾病、慢性肝炎、威爾遜病、血色素沉著、肝細胞癌、良性肝腫癌和病灶性結(jié)節(jié)性增生癥的失調(diào)。
32.根據(jù)權(quán)利要求27到30之一的方法，其中上皮癌是選自肺、胃、腎、結(jié)腸、前列腺、皮膚和乳腺的器官的腺癌。
33.在患有肝臟失調(diào)或者上皮癌的患者中刺激針對根據(jù)SEQ ID 1到SEQ ID 9或者SEQ ID 47的序列的多肽或者其功能變體的免疫應答的方法，其中選自根據(jù)SEQ ID 1到9或者SEQ ID 47的多肽、其功能變體、編碼前述多肽之一的核酸、前述核酸之一的變體、含有前述核酸之一的載體、含有前述核酸之一的細胞和含有前述載體的細胞中的至少一種組分以有效刺激患者中免疫應答的量施用于需要這種治療的患者。
34.鑒定相對于參比文庫或者參比樣品，在分離自患者的樣品中差別表達的根據(jù)SEQ ID 10到SEQ ID 19的至少一種核酸或者其變體的方法，該方法包括下面的步驟(a)檢測從患者分離的樣品中至少一種根據(jù)SEQ ID 10到SEQID 19的核酸，或者其變體的表達，(b)將步驟(a)中檢測的所述核酸的表達與參比文庫或參比樣品中所述核酸的表達比較，(c)鑒定與參比文庫或參比樣品相比，在從患者分離的樣品中差別表達的所述核酸。
35.診斷肝臟失調(diào)或者上皮癌的方法，該方法包括下面的步驟(a)檢測從患者分離的樣品中至少一種根據(jù)SEQ ID 10到SEQID 19的核酸，或者其變體的表達，(b)將步驟(a)中檢測的所述核酸的表達與參比文庫或參比樣品中所述核酸的表達比較，(c)鑒定與參比文庫或參比樣品相比，在從患者分離的樣品中差別表達的所述核酸，(d)將步驟(c)中鑒定的所述核酸與病理學參比樣品或病理學參比文庫中差別表達的所述核酸匹配，其中匹配的核酸表明該患者患有肝臟失調(diào)或上皮癌。
36.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中在步驟(a)中鑒定了至少兩種核酸。
37.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中在步驟(a)中所述核酸的檢測是通過基于PCR的檢測或者通過雜交測定法。
38.根據(jù)權(quán)利要求35到37之一的方法，其中在步驟(b)中通過選自基于固相的篩選方法、雜交、扣除雜交、差別展示和RNA酶保護測定法的方法比較所述核酸的表達。
39.根據(jù)權(quán)利要求35到38之一的方法，其中從患者分離的樣品選自肝臟組織、肝臟細胞、來自受到癌性轉(zhuǎn)化的另一器官的組織、來自該器官的細胞、血液、血清、血漿、腹水、胸膜積液、腦脊液、唾液、尿、精液、和糞便。
40.根據(jù)權(quán)利要求35到39之一的方法，其中參比樣品分離自選自相同患者的未患病樣品和來自另一受試者的未患病樣品的來源。
41.根據(jù)權(quán)利要求35到40之一的方法，其中參比樣品選自肝臟組織、肝臟細胞、血液、血清、血漿、腹水、胸膜積液、腦脊液、唾液、尿、精液、和糞便。
42.根據(jù)權(quán)利要求35到41之一的方法，其中參比文庫是含有關(guān)于步驟(a)中所述核酸的肝臟失調(diào)特異性表達的克隆或數(shù)據(jù)的表達文庫或者數(shù)據(jù)庫。
43.根據(jù)權(quán)利要求35到42之一的方法，其中病理學參比樣品分離自選自來自患有肝臟失調(diào)或者上皮癌的另一患者的患病樣品的來源。
44.根據(jù)權(quán)利要求35到43的方法，其中病理學參比文庫是數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫含有關(guān)于相對于參比樣品或參比文庫中的對照表達，從患有肝臟失調(diào)或者上皮癌的另一患者分離的樣品中步驟(a)中所述核酸的差別表達的數(shù)據(jù)。
45.根據(jù)權(quán)利要求35到44的方法，其中肝臟失調(diào)是選自肝細胞癌、良性肝腫癌和肝硬變的失調(diào)。
46.根據(jù)權(quán)利要求35到44的方法，其中上皮癌是選自肺、胃、腎、結(jié)腸、前列腺、皮膚和乳腺的器官的腺癌。
47.鑒定相對于參比文庫或者參比樣品，在從患者分離的樣品中差別表達的至少一種根據(jù)SEQ ID 1到SEQ ID 9或SEQ ID 47的多肽，或者其功能變體的方法，該方法包括下面的步驟(a)檢測從患者分離的樣品中至少一種根據(jù)SEQ ID 1到SEQ ID9或SEQ ID 47的多肽，或者其功能變體的表達，(b)將步驟(a)中檢測的所述多肽的表達與參比文庫或參比樣品中所述多肽的表達比較，(c)鑒定與參比文庫或參比樣品相比，在從患者分離的樣品中差別表達的所述多肽。
48.肝臟失調(diào)或上皮癌的診斷方法，該方法包括下面的步驟(a)檢測從患者分離的樣品中至少一種根據(jù)SEQ ID 1到SEQ ID9或SEQ ID 47的多肽，或者其變體的表達，(b)將步驟(a)中檢測的所述多肽的表達與參比文庫或參比樣品中所述多肽的表達比較，(c)鑒定與參比文庫或參比樣品相比，在從患者分離的樣品中差別表達的所述多肽，和(d)將步驟(c)中鑒定的所述多肽與病理學參比樣品或病理學參比文庫中差別表達的所述多肽匹配，其中所匹配的多肽表明該患者患有肝臟失調(diào)，或上皮癌。
49.根據(jù)權(quán)利要求48的方法，其中鑒定了至少2種多肽。
50.根據(jù)權(quán)利要求48或49的方法，其中通過選自凝膠電泳、層析技術(shù)、免疫印跡分析、免疫組織化學、基于酶的免疫測定法、表面胞質(zhì)團共振、高壓液相色譜、質(zhì)譜、免疫組織化學和基于酶的免疫測定法的方法檢測多肽。
51.根據(jù)權(quán)利要求48到50之一的方法，其中通過選自二維凝膠電泳、層析分離技術(shù)、免疫印跡分析、表面胞質(zhì)團共振、免疫組織化學和基于酶的免疫測定法的方法比較多肽。
52.根據(jù)權(quán)利要求48到51之一的方法，其中從患者分離的樣品選自肝臟組織、肝細胞、來自受到癌性轉(zhuǎn)化的另一器官的組織、來自該器官的細胞、血液、血清、血漿、腹水、胸膜積液、腦脊液、唾液、尿、精液和糞便。
53.根據(jù)權(quán)利要求48到52之一的方法，其中參比樣品分離自選自相同患者的未患病樣品和另一受試者的未患病樣品的來源。
54.根據(jù)權(quán)利要求48到53之一的方法，其中參比樣品選自肝臟組織、肝細胞、血液、血清、血漿、腹水、胸膜積液、腦脊液、唾液、尿液、精液和糞便。
55.根據(jù)權(quán)利要求48到54之一的方法，其中參比文庫是含有關(guān)于步驟(a)的所述多肽的肝臟失調(diào)特異的表達的克隆或者數(shù)據(jù)的表達文庫或者數(shù)據(jù)庫。
56.根據(jù)權(quán)利要求48到55的方法，其中病理學參比樣品分離自選自來自患有肝臟失調(diào)和上皮癌的另一患者的患病樣品的來源。
57.根據(jù)權(quán)利要求48到56的方法，其中病理學參比文庫是數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫含有關(guān)于相對于參比樣品或參比文庫中的對照表達，從患有肝臟失調(diào)或上皮癌的另一患者分離的樣品中步驟(a)的所述多肽的差別表達的數(shù)據(jù)。
58.根據(jù)權(quán)利要求48到57的方法，其中肝臟失調(diào)是選自肝細胞癌、良性肝腫癌、和肝硬變的失調(diào)。
59.根據(jù)權(quán)利要求48到57之一的方法，其中上皮癌是選自肺、胃、腎、結(jié)腸、前列腺、皮膚和乳腺的器官的腺癌。
60.預防患者發(fā)生肝臟失調(diào)或上皮癌的方法，其中選自根據(jù)SEQ ID1到9或者SEQ ID 47的多肽、其功能變體、編碼前述多肽之一的核酸、前述核酸之一的變體、具有與前述核酸之一互補的序列的核酸、為前述核酸之一的非功能突變變體的核酸、含有前述核酸之一的載體，或其變體、含有前述核酸之一的細胞、或其變體、和含有前述載體的細胞中的至少一種組分，以治療有效量施用于需要這種預防性治療的患者。
61.鑒定藥學活性化合物的方法，該方法包括下面的步驟(a)提供根據(jù)SEQ ID 1到9或SEQ ID 47的至少一種多肽，或者其功能變體，(b)將所述多肽與懷疑具有藥學活性的化合物接觸，(c)測定步驟(a)的所述多肽與懷疑具有藥學活性的所述化合物的相互作用，(d)鑒定直接或間接與步驟(a)的所述多肽相互作用的懷疑具有藥學活性的所述化合物。
62.根據(jù)權(quán)利要求61的方法，其中步驟(a)的所述多肽附著到柱子、所述多肽附著到陣列、包含在電泳凝膠中、附著到膜或者被細胞表達。
63.根據(jù)權(quán)利要求61或62的方法，其中通過基于酶或熒光的細胞報道分子的方法測定相互作用。
64.根據(jù)權(quán)利要求61或62的方法，其中通過表面胞質(zhì)團共振、HPL、或質(zhì)譜測定相互作用。
65.根據(jù)權(quán)利要求61的方法，其中步驟(d)的直接或間接功能相互作用選自步驟(a)的所述多肽的表達的誘導、所述多肽的抑制、所述多肽的功能的激活和所述多肽的功能的抑制。
全文摘要
本發(fā)明涉及多肽與編碼這些多肽的核酸和它們用于預防、診斷和/或治療肝臟失調(diào)和致瘤性失調(diào)，特別是肝臟和其他上皮組織的癌、良性肝臟腫瘤如腺瘤和其他增生性肝臟失調(diào)如病灶性結(jié)節(jié)性增生癥(FNH)和肝硬變的用途。本發(fā)明還涉及診斷和治療這些失調(diào)的方法。
文檔編號C12N15/12GK1911962SQ20061011106
公開日2007年2月14日 申請日期2003年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月27日
發(fā)明者C·居利, C·布克, K·扎特羅卡爾 申請人:奧里迪斯生物醫(yī)學研究及開發(fā)有限責任公司