專利名稱：能催化吲哚生成靛藍的P450BM－3Glu435Thr變體基因及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物化工中的基因工程領域，尤其是涉及一種能催化吲哚生成靛藍的P450BM-3Glu435Thr變體基因及其用途。
背景技術：
作為一種最早發(fā)現(xiàn)的天然染料之一，靛藍染料的使用具有相當悠久的歷史。從古埃及木乃伊穿著的一些服裝到我國馬王堆出土的藍色麻織物等都是由靛藍染成的。200多年前法國大革命和美國獨立戰(zhàn)爭時的旗幟上也染有靛藍的顏色。這種染料之所以能夠長期、廣泛地為人們所喜愛，是由于它在染著堅牢度和耐光堅牢度上都是其它染料無法比擬的，故常被稱為“染料之王”。遠古時代主要是從靛藍植物如菘藍、蓼藍、木藍等中獲得。19世紀中葉，以紡織工業(yè)革命為先導的產(chǎn)業(yè)革命也促進染料的需求大幅度增加，當時雖然在東印度尤其是孟加拉一帶開辟了數(shù)十萬英畝良田用于種植靛藍植物，然而仍無法滿足印染業(yè)的需要，以致用化學方法合成染料的課題，已經(jīng)擺在化學家面前。1897年西德BASF生產(chǎn)的合成靛藍問世，它以生產(chǎn)簡便、原料充足、純度高、易貯運、使用方便等優(yōu)點后來居上，迅速普及從而使得具有幾千年歷史的植物靛藍黯然失色。本世紀60年代之后，天然靛藍終于銷聲匿跡，退出了歷史舞臺。進入80年代之后，隨著社會現(xiàn)代化程度的日益提高，環(huán)境保護和勞動保護意識逐漸普及，人們開始認識到了合成化學工業(yè)的一系列有損健康、污染環(huán)境的弊病。如合成靛藍中使用的苯胺和鄰苯二甲酸酐能導致人體急性和慢性中毒，對呼吸道和中樞神經(jīng)及肝臟均有一定損害。到了20世紀，生物轉(zhuǎn)化合成天然靛藍開始引起了科學工作者的注意。生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)靛藍產(chǎn)生的有害廢物比化學方法少，既節(jié)能又廉價，對保護自然環(huán)境，維持生態(tài)平衡等方面無疑都是具有重要意義的。因此很多研究者認為發(fā)展生物法生產(chǎn)靛藍極具有前途的。
在P450酶系中，P450BM-3是從巨大芽孢桿菌(B.megaterium)中發(fā)現(xiàn)的具有脂肪酸羥基化活性的P450酶，在NADPH和O2存在下，它具有快速催化鏈長大約為C12-C18的飽和脂肪酸的加單氧酶活性。在國外，德國斯圖加特大學技術生化研究所R.D.Schmid領導的科研小組于2000年利用定向進化技術獲得具有三個突變位點的P450BM-3(F87V/A74G/L188Q)，他們發(fā)現(xiàn)這一突變酶能催化吲哚生成靛藍。詳見“Directed evolution of thefatty-acid hydroxylase P450 BM-3 into an indole-hydroxylatingcatalyst”《Chemistry-A European Journal》Li Q S，Schwaneberg U，F(xiàn)ischer P，Schmid R D.2000，61531-1536。本專利發(fā)明人在先的專利申請CN200410089167.6和CN200410089174.6中也曾公開了在P450BM-3(F87V/A74G/L188Q)的基礎上利用易錯PCR定向進化技術獲得催化吲哚活性更高的變體酶，但提高程度有限，生物轉(zhuǎn)化合成靛藍的大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化還有一定困難。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明在具有三個突變位點的P450BM-3(F87V/A74G/L188Q)變體基因的基礎上，通過在435氨基酸位點進行飽和突變定向進化進一步提高了其催化活性。
一種能催化吲哚生成靛藍的P450BM-3Glu435Thr變體基因，利用飽和突變定向進化技術介導的隨機突變，通過篩選獲得，其堿基序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，原P450BM-3(F87V/A74G/L188Q)基因中的第435氨基酸位點的谷氨酸突變?yōu)樘K氨酸的密碼子。
本發(fā)明還提供了所述變體基因所表達的變體酶在催化吲哚生成靛藍中的應用。
本發(fā)明采用飽和突變定向進化技術進化P450BM-3(F87V/A74G/L188Q)，在435氨基酸位點設計一對包含不確定突變位點的引物(正、反向)，對模板質(zhì)粒pET28α(+)P450BM-3(F87V/A74G/L188Q)退火后用Pfu聚合酶循環(huán)延伸使堿基在一定程度上隨機錯誤引入獲得突變基因文庫，并通過一定的篩選方法獲得一種變體基因，按此設計思想，通過在435氨基酸位點設計一對引物，這對引物在設計過程中在435氨基酸位點能夠引入隨機的突變，通過高保真度的PfuTurbo聚合酶進行PCR擴增，然后轉(zhuǎn)化到E.coliBL21中，涂布到到含有30μg/ml卡那霉素LB瓊脂平板上，37℃過夜培養(yǎng)得到相應的突變體庫。
從突變體庫中挑選藍色的活性克隆接種到200μL含有30μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基的96微孔板中，37℃過夜培養(yǎng)，取40μL該過夜培養(yǎng)液加入到一個新的600μL含有30μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基的1.2mL容積的96微孔板中，在37℃培養(yǎng)至OD600為0.5～0.7時，加入IPTG(終濃度0.5mmol/L)誘導并在30℃繼續(xù)培養(yǎng)24h，4000r/min離心半個小時收獲細胞，用300μL的pH7.5磷酸鹽裂解緩沖液(0.1mg/mL溶解酶，1μg/mLDNAseI)重懸細胞，在37℃培育1h后，立即置于-80℃冷凍1h，室溫解凍，4000r/min離心30min，吸取200μL的含有P450BM-3的上清液到一個新的96微孔分析板中，加入2μL100mmol/L吲哚底物(吲哚溶解在DMSO中)，在室溫下培育10min，然后加20μL2mg/mL的NADPH啟動反應，在670nm處在線監(jiān)控吸收值的變化30min，篩選出活力高于原酶的菌株挑選出來并提取質(zhì)粒進行全自動DNA測序，發(fā)現(xiàn)突變位點為Glu435→Thr。
本發(fā)明獲得的變體酶對吲哚具有更高催化活力，通過酶動力學曲線的測定，與具有三個突變位點的P450BM-3(F87V/A74G/L188Q)變體酶以及本專利發(fā)明人在先的專利申請CN200410089167.6和CN200410089174.6中公開了的P450BM-3變體酶相比較，催化效率顯著提高，上升4.7倍之多。該變體基因的獲得為生物合成染料靛藍提供了更加具有應用價值的新酶，同時為染料靛藍的生物生產(chǎn)提供了更加廣闊的應用前景。
具體實施例方式
飽和突變引物的設計和PCR擴增產(chǎn)物的獲得上游引物5’-CGAGCTGGATATTAAANNNACTTTAACG-3’下游引物5’-CGTTAAAGTNNNTTTAATATCCAGCTCG-3’向500μL的eppendorf管中加入100pmol的dNTPs，各15pmol的上游引物和下游引物，大約2ng pET28α(+)P450BM-3作為模板DNA，2.5 U PfuDNA聚合酶，5μL的含有25mmol/L的MgCl2的Pfu PCR緩沖液，然后用無菌蒸餾水加至總體積50μL。反應參數(shù)是通過95℃變性1min后，在95℃30s，引物3948℃-56℃，2min；引物43550℃-56℃，2min，72℃16min，經(jīng)過18個循環(huán)，然后72℃延伸2min，得到PCR擴增產(chǎn)物。
突變文庫的構(gòu)建將上述PCR擴增后的PCR產(chǎn)物用DpnI消化2小時后轉(zhuǎn)化到E.coliBL21中，涂布到到含有30μg/ml卡那霉素LB瓊脂平板上，37℃過夜培養(yǎng)得到相應的突變體庫。
對吲哚具有高催化活性的變體基因的的篩選從突變體庫中挑選藍色的活性克隆接種到200μL含有30μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基的96微孔板中，37℃過夜培養(yǎng)，取40μL該過夜培養(yǎng)液加入到一個新的600μL含有30μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基的1.2mL容積的96微孔板中，在37℃培養(yǎng)至OD600為0.5～0.7時，加入IPTG(終濃度0.5mmol/L)誘導并在30℃繼續(xù)培養(yǎng)24h，4000r/min離心半個小時收獲細胞，用300μL的pH7.5磷酸鹽裂解緩沖液(0.1mg/mL溶解酶，1μg/mL DNAseI)重懸細胞，在37℃培育1h后，立即置于-80℃冷凍1h，室溫解凍，4000r/min離心30min，吸取200μL的含有P450BM-3的上清液到一個新的96微孔分析板中，加入2μL100mmol/L吲哚底物(吲哚溶解在DMSO中)，在室溫下培育10min，然后加20μL2mg/mL的NADPH啟動反應，在670nm處在線監(jiān)控吸收值的變化30min，將吸收值高于親本酶的突變體挑選出來再進行至少3次類似的篩選實驗，篩選出活力高于原酶的菌株挑選出來并提取質(zhì)粒進行全自動DNA測序，發(fā)現(xiàn)突變位點為Glu435→Thr。
催化吲哚生成靛藍挑取含有P450BM-3Glu435Thr變體基因的陽性克隆接種到LB液體培養(yǎng)基中種子液為LB液體培養(yǎng)液，接種量1％-2％，培養(yǎng)基的體積為100毫升，PH7.0-7.5，搖床轉(zhuǎn)速為150-200轉(zhuǎn)\分鐘，在37℃培養(yǎng)至OD0.5-0.7時加入IPTG(0.5-1.0μm)誘導，然后將溫度轉(zhuǎn)為30℃繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時。在大腸桿菌中由于在色氨酸代謝途徑中，色氨酸能夠被大腸桿菌中的色氨酸酶催化成吲哚，而P450BM-3Glu435Thr能將吲哚催化成靛藍，這樣在發(fā)酵過程中就能生物生產(chǎn)大量的靛藍，但生成靛藍的量和P450BM-3變體酶的活性有關，P450BM-3變體酶的催化效率越高在同等培養(yǎng)條件下生物合成的靛藍的量就越多。
將培養(yǎng)液以4000-80000轉(zhuǎn)\分鐘離心10-20分鐘，放棄上清液，收獲離心后的細胞。離心后的細胞用水沖洗2-3次，加入適量的四氫呋喃(THF)提取藍色物質(zhì)，1000-2000轉(zhuǎn)\分鐘離心保留上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀干燥，再加入適量的乙醇提取藍色物質(zhì)中的靛玉紅，剩下的即為靛藍。
催化效率的測定將含有P450BM-3Glu435Thr變體基因的克隆接種到LB液體培養(yǎng)基中種子液為試管培養(yǎng)液，接種量1％-2％，培養(yǎng)基的體積為100毫升，PH7.0-7.5，搖床轉(zhuǎn)速為150-200轉(zhuǎn)\分鐘，在37℃培養(yǎng)至OD0.5-0.7時加入IPTG(0.5-1.0μm)誘導，然后將溫度轉(zhuǎn)為30℃繼續(xù)培養(yǎng)12小時。
再將培養(yǎng)液離心后，放棄上清液，收獲離心后的細胞，在冰浴條件下超聲破菌，再離心得到含有P450BM-3Glu435Thr變體基因的上清液，上清液采用金屬鰲合親和層析(IMAC)純化，其中金屬鰲合介質(zhì)為Ni-NTA介質(zhì)，并測定其催化吲哚的催化效率576.9，min-1·mM-1，是R.D.Schmid領導的科研小組獲得的具有三個突變位點的P450BM-3(F87V/A74G/L188Q)變體酶以及本專利發(fā)明人在先的專利申請CN200410089167.6和CN200410089174.6中公開了的P450BM-3變體酶的4.7倍之多。
SEQUENCE LISTING<110>浙江大學<120>能催化吲哚生成靛藍的P450BM-3Glu435Thr變體基因及其用途<160>1<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>3150<212>DNA<213>P450BM-3Glu435Thr<220>
<223>第435位的原谷氨酸的密碼子突變?yōu)樘K氨酸的密碼子<400>1atgacaatta aagaaatgcc tcagccaaaa acgtttggag agcttaaaaa tttaccgtta60ttaaacacag ataaaccggt tcaagctttg atgaaaattg cggatgaatt aggagaaatc120tttaaattcg aggcgcctgg tcgtgtaacg cgctacttat caagtcagcg tctaattaaa180gaagcatgcg atgaatcacg ctttgataaa aacttaagtc aaggacttaa atttgtacgt240gattttgcag gagacgggtt agttacaagc tggacgcatg aaaaaaattg gaaaaaagcg300cataatatct tacttccaag cttcagtcag caggcaatga aaggctatca tgcgatgatg360
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權利要求
1.一種能催化吲哚生成靛藍的P450BM-3Glu435Thr變體基因，其堿基序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。
2.如權利要求1所述的變體基因所表達的變體酶在催化吲哚生成靛藍中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種能催化吲哚生成靛藍的P450BM－3Glu435Thr變體基因，利用飽和突變定向進化技術介導的隨機突變，篩選獲得，其堿基序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，原P450BM－3(F87V/A74G/L188Q)基因中的第435位的谷氨酸的密碼子突變?yōu)樘K氨酸的密碼子。所得到的變體基因表達的變體酶通過酶動力學曲線的測定，與現(xiàn)有技術相比較，催化效率顯著提高，為生物合成染料靛藍提供了更加具有應用價值的新酶，同時為染料靛藍的生物生產(chǎn)提供了更加廣闊的應用前景。
文檔編號C12N9/02GK1900287SQ200610052588
公開日2007年1月24日 申請日期2006年7月21日 優(yōu)先權日2006年7月21日
發(fā)明者梅樂和, 李紅梅 申請人:浙江大學