專利名稱：含有重組幾丁質(zhì)酶的果蔬防腐保鮮劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)與農(nóng)產(chǎn)品保鮮相結(jié)合的產(chǎn)物，特別涉及一種含有重組幾丁質(zhì)酶 的果蔬防腐保鮮劑及其生產(chǎn)過程及在新鮮果蔬保鮮中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
真菌病害是導(dǎo)致采收后果蔬腐爛的主要原因，由此造成的損失非常巨大。為有效地 防治真菌病害，近一個(gè)世紀(jì)以來(lái)，相關(guān)的科研工作者付出了許多艱辛的勞動(dòng)，也獲得了 一些行之有效的成果，如利用構(gòu)建工程菌培育抗病品種，這一途徑由于影響因素復(fù)雜， 抗真菌效果不一而未能商業(yè)化應(yīng)用。而對(duì)于采后果蔬常見的真菌病害，目前國(guó)內(nèi)外仍以 化學(xué)殺菌劑為主，在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)以其高效、低成本、使用方便等特點(diǎn)得到推廣使用， 但也造成了環(huán)境污染，安全性影響等一系列負(fù)面問題；此外， 一些殺菌劑雖對(duì)環(huán)境和人 體健康相對(duì)安全，但由于長(zhǎng)期使用導(dǎo)致病原菌抗性增加，防治效果逐年下降，用量不斷 增加，引起的農(nóng)藥殘留問題日趨嚴(yán)重。隨著人們對(duì)"綠色無(wú)公害食品"的重視，對(duì)農(nóng)藥 公害的不斷認(rèn)識(shí)，給化學(xué)農(nóng)藥的使用帶來(lái)很大的沖擊。轉(zhuǎn)基因研究的迅速發(fā)展為解決這 一問題提供了一條新途徑，通過這一途徑，可將外源抗病基因，如幾丁質(zhì)酶基因、e-l，
3- 葡萄糖酶基因、核糖體滅活蛋白基因(RIP)等等重組入酵母細(xì)胞，再分離、純化出 此活性蛋白，將一種或幾種活性蛋白協(xié)同作用，增強(qiáng)抗菌防腐效果，用于果蔬采后保鮮， 安全、營(yíng)養(yǎng)、高效，目前在國(guó)際上是一個(gè)全新領(lǐng)域。
植物致病真菌的細(xì)胞壁主要幾丁質(zhì)組成，它是一種由N-乙酰-D-葡萄糖胺以e-i，
4- 糖苷鍵連接形成的直鏈化合物。水解幾丁質(zhì)的幾丁質(zhì)酶幾乎存在于所有的高等植物 中，而且植物體內(nèi)并無(wú)幾丁質(zhì)酶的作用底物，因此幾丁質(zhì)酶被看作是植物抗真菌病害的 潛在物質(zhì)，成為目前抗真菌基因工程的研究熱點(diǎn)之一。幾丁質(zhì)酶能將真菌細(xì)胞壁的主要 成分幾丁質(zhì)降解為幾丁質(zhì)單糖，破壞細(xì)胞壁的骨架，從而具備抗真菌作用。通過幾丁質(zhì) 酶的作用可使大多數(shù)病害真菌喪失侵染能力和致病能力。此外，畢赤酵母作為真核表達(dá) 系統(tǒng)，可對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行翻譯后的加工和修飾，使其具有生物活性，并且在發(fā)酵罐中 可高密度發(fā)酵生產(chǎn)，可促使表達(dá)的蛋白大規(guī)模推廣應(yīng)用。
目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于將植物幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)入水稻、煙草、油菜、小麥等作物中以增強(qiáng) 植株抗真菌病害的報(bào)道很多，而將其轉(zhuǎn)化畢赤酵母，以獲得足量蛋白質(zhì)進(jìn)行體外抗菌能
力研究的報(bào)道僅有一例，有人將新型芥菜幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)入畢赤酵母中，但對(duì)誘導(dǎo)表達(dá) 的條件和抑菌效果未作深入研究。所以到目前為止，還沒有一種有效的，成本較低的且 可以規(guī)?；a(chǎn)重組幾丁質(zhì)酶的方法及在果蔬采后貯藏保鮮中應(yīng)用的果蔬防腐保鮮劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的所要解決的技術(shù)問題是提供一種含有重組幾丁質(zhì)酶的果蔬防腐保鮮 劑。它含有從畢赤酵母中誘導(dǎo)分泌表達(dá)的重組幾丁質(zhì)酶及制備方法，適用于多種水果蔬 菜的保鮮。
本發(fā)明的技術(shù)方案
一種含有重組幾丁質(zhì)酶的果蔬防腐保鮮劑，其特征在于其主要組分為重組幾 丁質(zhì)酶2%，離子緩沖液0.001%，低聚糖1%,其余為水。
含有重組幾丁質(zhì)酶，它是將ClassI型堿性幾丁質(zhì)酶基因通過分子生物學(xué)手段轉(zhuǎn)
入畢赤酵母，再用甲醇誘導(dǎo)其分泌于發(fā)酵液中，然后從發(fā)酵后的上清液中提取。 重組幾丁質(zhì)酶是從搖瓶發(fā)酵而來(lái)或者用發(fā)酵罐工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)得到。離子緩沖液
為pH5 8的磷酸緩沖液。
一種含有重組幾丁質(zhì)酶的果蔬防腐保鮮劑，其使用方法采收前噴霧或者采收后
噴霧、浸蘸處理，應(yīng)用于果蔬的果實(shí)、莖、葉的貯藏保鮮，提高果蔬對(duì)主要采后病原真 菌灰霉菌、根霉等的抗病性，減少貯藏過程中的常見病原菌引起的腐爛，延長(zhǎng)果蔬貯藏 保鮮時(shí)間。
本發(fā)明技術(shù)特點(diǎn)及效果1.生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，易于操作。2.成本低廉，可工廠化 大批量生產(chǎn)。3.施用方法簡(jiǎn)單，受外界環(huán)境影響較小。4.采收前或采收后應(yīng)用都能起 到防治作用。5.無(wú)污染，無(wú)公害，無(wú)毒副作用。6.采用浸蘸或噴霧方式處理均可。
含有重組幾丁質(zhì)酶的果蔬防腐保鮮劑的抑菌效果
此果蔬防腐保鮮劑對(duì)于多種病原真菌具有一定的抑制效果，能夠有效的抵御病原
真菌的侵染以及殺死新生菌絲體。下面我們以其對(duì)草莓根霉的抑制效果為例進(jìn)行說(shuō)明
在試驗(yàn)條件下，草莓根霉的菌絲生長(zhǎng)很快，對(duì)照在48h時(shí)已長(zhǎng)滿整個(gè)平板，而用發(fā)酵上 清液處理的平板菌落擴(kuò)展比較緩慢，在抑菌率達(dá)到66.5% (圖1)。 30h時(shí)抑菌率有所下 降，為51.5%%


圖1 發(fā)酵上清液對(duì)草莓根霉的抑制效果曲線圖
圖2發(fā)酵上清液對(duì)根騫生長(zhǎng)的抑制效果是實(shí)驗(yàn)實(shí)物圖A處理后30h B處理后50h
在實(shí)驗(yàn)過程中也發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)酶不僅能夠抑制菌絲生長(zhǎng)，還能夠抑制孢子萌發(fā)。50h 后觀察到對(duì)照與處理的培養(yǎng)皿中都已布滿菌絲，不同的是對(duì)照的菌絲細(xì)長(zhǎng)，并產(chǎn)生大量 孢子，而此時(shí)用上清液(含幾丁質(zhì)酶)處理的菌絲粗短，且無(wú)孢子產(chǎn)生。
具體實(shí)施例
含有重組幾丁質(zhì)酶的果蔬防腐保鮮劑，其主要組分為重組幾丁質(zhì)酶2%，離子緩 沖液0.001%,低聚糖1%,其余為水。
重組幾丁質(zhì)酶的果蔬防腐保鮮劑的制備
將ClassI型堿性幾丁質(zhì)酶基因通過分子生物學(xué)手段轉(zhuǎn)入畢赤酵母，再用甲醇誘導(dǎo) 其分泌于發(fā)酵液中，然后從發(fā)酵后的上清液中提取。
一、搖瓶發(fā)酵l.種子培養(yǎng)基YPD(W酵母抽提物，2%蛋白胨，1%葡萄糖)斜面培 養(yǎng)基則為上述成分再加入1. 5%的瓊脂制得。
2. 發(fā)酵培養(yǎng)基BMGY(19fe酵母抽提物，1%甘油，2%蛋白胨，0. 1M磷酸緩沖液，
1.34XYNB,4+10-5X生物素)。BMMY (1%酵母抽提物，0.5%甲醇，2%蛋白胨，0.1M 磷酸緩沖液，1.34%YNB, 4*10-5%生物素)。
3. 培養(yǎng)方法
于30'C生長(zhǎng)兩天的新鮮平板上取兩環(huán)單菌落接到種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)約18h，再以10 %的接種量轉(zhuǎn)接到BMGY中培養(yǎng)24h左右，離心棄上清液，菌體轉(zhuǎn)接到BMMY開始誘導(dǎo)， 每隔12h補(bǔ)加甲醇至預(yù)設(shè)濃度。搖床溫度為30°C，轉(zhuǎn)速200rpm，裝液量為30mL/150mL。
在誘導(dǎo)過程中可以添加0.01% 3%的油酸、非離子乳化劑、氧載體等物質(zhì)中一種或 幾種促進(jìn)目的蛋白酶的分泌表達(dá)。 二、工業(yè)化技術(shù)發(fā)酵工藝
技術(shù)路線1
YPD種子放大一接種基礎(chǔ)鹽(BSM)培養(yǎng)基一甘油生長(zhǎng)階段一甘油分批補(bǔ)料階段一 甲醇分批補(bǔ)料階段一甲醇誘導(dǎo)階段 技術(shù)路線2
YPD種子放大一接種BMGY培養(yǎng)基一甘油生長(zhǎng)階段一甘油分批補(bǔ)料階段一甲醇分 批補(bǔ)料階段一甲醇誘導(dǎo)階段 發(fā)酵條件
生長(zhǎng)期溫度29°C，轉(zhuǎn)速300rpm， pH5.0，溶氧30%以上；誘導(dǎo)期29°C，轉(zhuǎn)速 300rpm， pH6. 0,溶氧20%以上，28%的氨水維持pH值，采用泡敵作消泡劑，濃度為4%。
實(shí)例1:含有重組幾丁質(zhì)酶的果蔬防腐保鮮劑對(duì)葡萄的保鮮效果
采前一周用20(kg/l含有重組幾丁質(zhì)酶的果蔬防腐保鮮劑對(duì)葡萄果實(shí)進(jìn)行噴霧處
理，采收后及時(shí)預(yù)冷，按照目前生產(chǎn)中葡萄貯藏保鮮的常規(guī)保鮮工藝，葡萄保鮮期可延
長(zhǎng)28天，腐爛率降低30%。
實(shí)例2:含有重組幾丁質(zhì)酶的果蔬防腐保鮮劑對(duì)草莓的保鮮效果
采后用500mg/l含有重組幾丁質(zhì)酶的果蔬防腐保鮮劑對(duì)草莓進(jìn)行噴霧處理，15t下
貯藏25天時(shí)商品率比未經(jīng)該防腐保鮮劑處理提高20%，保鮮期可延長(zhǎng)8天。 實(shí)例3:含有重組幾丁質(zhì)酶的果蔬防腐保鮮劑對(duì)蒜薹的保鮮效果 預(yù)冷后用500mg/l含有重組幾丁質(zhì)酶的果蔬防腐保鮮劑對(duì)蒜薹進(jìn)行噴霧處理，貯藏
保鮮過程中定期與專用保鮮劑配伍噴霧處理，貯藏8個(gè)月后，腐爛率比未經(jīng)該重組幾丁
質(zhì)酶的果蔬防腐保鮮劑處理的蒜薑降低28%，保鮮期可延長(zhǎng)30天。
如圖2所示的在實(shí)驗(yàn)過程中也發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)酶不僅能夠抑制菌絲生長(zhǎng)，還能夠抑制孢 子萌發(fā)。50h后觀察到對(duì)照與處理的培養(yǎng)皿中都已布滿菌絲，不同的是對(duì)照的菌絲細(xì)長(zhǎng)， 并產(chǎn)生大量孢子，而此時(shí)用上清液(含幾丁質(zhì)酶)處理的菌絲粗短，且無(wú)孢子產(chǎn)生。
權(quán)利要求
1.一種含有重組幾丁質(zhì)酶的果蔬防腐保鮮劑，其特征在于其主要組分為重組幾丁質(zhì)酶2％，離子緩沖液0.001％，低聚糖1％，其余為水。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的含有重組幾丁質(zhì)酶的果蔬防腐保鮮劑，其特征在于含有重組幾丁質(zhì)酶，它是將ClassI型堿性幾丁質(zhì)酶基因通過分子生物學(xué)手段轉(zhuǎn)入畢赤酵母，再用甲醇誘導(dǎo)其分泌于發(fā)酵液中，然后從發(fā)酵后的上清液中提取。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的含有重組幾丁質(zhì)酶的果蔬防腐保鮮劑，其特征在于重組幾 丁質(zhì)酶是從搖瓶發(fā)酵而來(lái)或者用發(fā)酵罐工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)得到。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的含有重組幾丁質(zhì)酶的果蔬防腐保鮮劑，其特征在于離子緩沖液為Ph5~8的磷酸緩沖液。
5. —種含有重組幾丁質(zhì)酶的果蔬防腐保鮮劑，其使用方法:采收前噴霧或者采收后噴霧、 浸蘸處理，應(yīng)用于果蔬的果實(shí)、莖、葉的貯藏保鮮，提高果蔬對(duì)主要采后病原真菌灰霉 菌、根霉等的抗病性，減少貯藏過程中的常見病原菌引起的腐爛，延長(zhǎng)果蔬貯藏保鮮時(shí) 間。
全文摘要
一種含有重組幾丁質(zhì)酶的果蔬防腐保鮮劑，該果蔬防腐保鮮劑主要活性成分為重組幾丁質(zhì)酶，是將ClassI型堿性幾丁質(zhì)酶基因通過分子生物學(xué)手段轉(zhuǎn)入畢赤酵母，再用甲醇誘導(dǎo)其分泌于發(fā)酵液中，然后從發(fā)酵后的上清液中提取。此外還含有維持其活性的離子緩沖液，協(xié)同抗菌作用的低聚糖等。它作為果蔬防腐保鮮劑，在采收前使用能夠誘導(dǎo)新鮮果蔬抗病性反應(yīng)；采收后應(yīng)用則能夠抵御病原菌的侵染或殺死新生菌絲體，用于防治果蔬采后灰霉菌、根霉及曲霉等病原真菌引起的腐爛。本發(fā)明屬生物技術(shù)在果蔬采后病害腐爛防治上的應(yīng)用，其生產(chǎn)工藝成熟，生產(chǎn)和使用的成本低廉，為果蔬采后防腐保鮮提供了低成本、高效、無(wú)毒的無(wú)公害生物誘導(dǎo)抗病保鮮劑，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號(hào)A23B7/14GK101112209SQ200610015008
公開日2008年1月30日 申請(qǐng)日期2006年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月28日
發(fā)明者關(guān)文強(qiáng), 仲 吳, 李麗秀, 閻瑞香, 黃艷鳳 申請(qǐng)人:國(guó)家農(nóng)產(chǎn)品保鮮工程技術(shù)研究中心(天津)