專(zhuān)利名稱(chēng)：多殺巴斯德氏菌聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及獸醫(yī)學(xué)和水產(chǎn)學(xué)診斷技術(shù)，特別是一種多殺巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)PCR快速檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法。利用PCR技術(shù)特異性擴(kuò)增16S-23S核糖體RNA轉(zhuǎn)錄間區(qū)，達(dá)到區(qū)分多殺巴斯德氏菌和相近致病菌的目的，能夠大大提高診斷多殺巴斯德氏菌的效率。
背景技術(shù)：
多殺巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)是巴斯德氏菌屬中最重要的畜禽致病菌，它是能引起多種畜禽巴氏桿菌病(亦稱(chēng)出血性敗血癥)的病原體，主要可引起家禽霍亂的暴發(fā)性流行，牛的出血性敗血病、原發(fā)性或繼發(fā)性肺炎等。目前對(duì)于多殺巴斯德氏菌的診斷主要基于生化檢驗(yàn)，對(duì)于多殺巴斯德氏菌的診斷需要排除在生化性狀上極其相近的其它致病菌，并且要經(jīng)過(guò)數(shù)目眾多的一組反應(yīng)才能確診，而且有時(shí)結(jié)果并不準(zhǔn)確。目前，對(duì)于該致病菌的檢測(cè)效率十分低下，完全確診需要5天的時(shí)間。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種多殺巴斯德氏菌PCR快速檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法。運(yùn)用PCR技術(shù)檢測(cè)多殺巴斯德氏菌的方法，提高了檢測(cè)效率和檢測(cè)的準(zhǔn)確度，本發(fā)明通過(guò)分析特異性DNA檢測(cè)多殺巴斯德氏菌，不需要像生化鑒定那樣進(jìn)行多組實(shí)驗(yàn)，可大大節(jié)省時(shí)間，勞動(dòng)力和檢驗(yàn)成本，結(jié)果重現(xiàn)性好，檢測(cè)精確。
本發(fā)明提供的多殺巴斯德氏菌PCR快速檢測(cè)試劑盒包括(1)DNA提取試劑TE緩沖液，5-15mmol/L Tris，0.5-1.5mmol/L EDTA，pH8.0；溶菌酶，濃度10-20mg/mL，pH8.0；蛋白酶K溶液，濃度10-20mg/mL，pH8.0；Tris飽和酚，pH8.0；乙酸鈉，濃度2-5mol/L；乙醇，濃度95％；(2)PCR試劑盒成分為10×buffer含100mmol/L Tris-HCl，450-550mmol/L KCl，pH8.3；dNTPsdATP，dTTP，dCTP，dGTP混合物，每種濃度5-15mmol/L；特異性寡核苷酸引物引物1為5’CGAAAGCAAAAGAGTGAA 3’、引物2為5’CCGTAATCAGACCTATCC 3’，各引物濃度均為5-15μmol/L；雙蒸水；Taq DNA聚合酶5u/μL；MgCl210-20mmol/L；使用多殺巴斯德氏菌PCR快速檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法程序如下(1)DNA抽提挑取疑似菌落加入到0.4mL TE緩沖液(pH8.0)中振蕩混勻。加入100μL溶菌酶溶液，37℃保溫10分鐘，加同體積Tris飽和酚(pH8.0)，強(qiáng)烈振蕩，10000r/min離心3分鐘，取上清液，重復(fù)酚抽提；取上清液，加入0.1倍體積的乙酸鈉(3mol/L)，混勻，再加等體積的冰乙醇，混勻后低溫靜置30分鐘，12000r/min離心5分鐘，棄上清，加70％冷乙醇洗滌一次，室溫下12000r/min離心5分鐘，棄上清，加入50μL TE溶液，置-20℃保存；(2)PCR擴(kuò)增①PCR反應(yīng)混合物成分成分 體系中各組分最終濃度PCR緩沖液10mmol/L Tris-HCl，50mmol/LKClMgCl21.5mmol/LTaq DNA聚合酶1.5u引物10.3μmol/L引物20.3μmol/LdNTPs每種80nmol/LDNA樣品 50ng雙蒸水 補(bǔ)足至50μL②PCR方法中擴(kuò)增程序1)94℃5分鐘2)94℃30秒3)58℃30秒4)72℃30秒5)回到第2)-4)步 重復(fù)30次6)72℃5分鐘(3)被檢測(cè)樣品目的PCR擴(kuò)增和電泳檢驗(yàn)PCR產(chǎn)物用1.5％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳后用溴化乙錠染色，電泳結(jié)果在紫外光分析儀下觀察，如果發(fā)現(xiàn)有特異性擴(kuò)增產(chǎn)生的DNA片段，引物1、引物2擴(kuò)增結(jié)果得到178bp的特異片段，說(shuō)明樣品有多殺巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)感染或污染，反之則沒(méi)有。
本發(fā)明利用多殺巴斯德氏菌的特異性基因，使用特異性引物通過(guò)PCR方法產(chǎn)生特異性片段，在已試驗(yàn)的35種不同屬或種的其它致病菌中均未發(fā)現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，有益效果在于基于DNA的鑒定方法適用于直接從患病禽獸含菌體液、組織等樣本中直接用PCR方法擴(kuò)增特異性靶基因，從而檢測(cè)多殺巴斯德氏菌。PCR方法具有檢測(cè)準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，可以快速、準(zhǔn)確地鑒定特異的目標(biāo)細(xì)菌。首先，它用PCR的方法擴(kuò)增細(xì)菌特異性靶基因，避免了反復(fù)培養(yǎng)，冗長(zhǎng)的一系列生化反應(yīng)，節(jié)約時(shí)間，勞動(dòng)力和成本；PCR鑒定方法不受培養(yǎng)條件和細(xì)菌生理狀態(tài)的影響，較生理生化鑒定方法更為準(zhǔn)確；能夠排除一些生理生化鑒定方法不能排除的干擾菌。


圖1引物特異性測(cè)試2陽(yáng)性樣本1檢測(cè)結(jié)果3陽(yáng)性樣本2檢測(cè)結(jié)果圖
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
實(shí)施例1樣本11.DNA抽提取患病雞組織，涂布于一次性分離培養(yǎng)血平板，然后根據(jù)菌落形態(tài)等特征做初步鑒定，挑取疑似菌落加入到0.4mL TE緩沖液(pH8.0)中振蕩混勻。加入100μL 20mg/mL，pH8.0的溶菌酶溶液，37℃保溫10分鐘，加同體積Tris飽和酚(pH8.0)，強(qiáng)烈振蕩，10000r/min離心3分鐘，取上清液，重復(fù)酚抽提。取上清液，加入0.1倍體積的乙酸鈉(3mol/L)，混勻，再加等體積的冰乙醇，混勻后低溫靜置30分鐘，12000r/min離心5分鐘，棄上清，加70％冷乙醇洗滌一次，室溫下12000r/min離心5分鐘，棄上清，加入50μL TE溶液，置-20℃保存。
2.PCR擴(kuò)增(1)PCR反應(yīng)混合物成分成分 體系中各組分最終濃度PCR緩沖液10mmol/L Tris-HCl，50mmol/LKClMgCl21.5mmol/LTaq DNA聚合酶1.5u引物10.3μmol/L引物20.3μmol/LdNTPs每種80nmol/LDNA樣品 50ng雙蒸水補(bǔ)足至 50μL(2)PCR方法中擴(kuò)增程序1)94℃5分鐘2)94℃30秒3)58℃30秒4)72℃30秒5)回到第2)-4)步，重復(fù)30次6)72℃5分鐘3.被檢測(cè)樣品目的PCR擴(kuò)增和電泳檢驗(yàn)PCR產(chǎn)物用1.5％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳后用溴化乙錠染色。電泳結(jié)果在紫外分析儀下觀察，可發(fā)現(xiàn)對(duì)多殺巴斯德氏菌進(jìn)行特異性擴(kuò)增產(chǎn)生的DNA片段，其中引物1、引物2擴(kuò)增結(jié)果可得到178bp的特異片段，結(jié)果如圖2。實(shí)驗(yàn)表明樣品中含有多殺巴斯德氏菌。
圖1引物特異性測(cè)試圖(純培養(yǎng)檢測(cè)，以多殺巴斯德氏菌為陽(yáng)性對(duì)照模板，以禽獸及魚(yú)類(lèi)常見(jiàn)病源細(xì)菌的純培養(yǎng)物DNA作為陰性對(duì)照模板，陰性對(duì)照沒(méi)有發(fā)現(xiàn)非特異擴(kuò)增，所用引物為引物1和引物2。)。
圖中的各個(gè)泳道分別是1多殺巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)；2流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)；3胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)；4熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)；5嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)；6金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureaus)；7大腸桿菌(Escherichia coli)；8星狀諾卡氏菌(Nocardia asteroides)；9副溶血弧菌(Bibrio Parahemolyticus)；10腸炎沙門(mén)氏菌(Salmonellosis.enteritidis)；11雞基因組DNA；12魚(yú)基因組DNA；圖2樣本1檢測(cè)結(jié)果圖泳道1病雞樣本PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，所用引物為引物1和引物2；實(shí)施例2樣本21.DNA抽提取患病魚(yú)組織，涂布于一次性分離培養(yǎng)血平板，然后根據(jù)菌落形態(tài)等特征做初步鑒定，挑取疑似菌落加入到0.4mL TE緩沖液(pH8.0)中振蕩混勻。加入100μL 20mg/mL，pH8.0的溶菌酶溶液，37℃保溫10分鐘，加同體積Tris飽和酚(pH8.0)，強(qiáng)烈振蕩，10000r/min離心3分鐘，取上清液，重復(fù)酚抽提。取上清液，加入0.1倍體積的乙酸鈉(3mol/L)，混勻，再加等體積的冰乙醇，混勻后低溫靜置30分鐘，12000r/min離心5分鐘，棄上清，加70％冷乙醇洗滌一次，室溫下12000r/min離心5分鐘，棄上清，加入5為μL TE溶液，置-20℃保存。
2.PCR擴(kuò)增(1)PCR反應(yīng)混合物成分成分 體系中各組分最終濃度PCR緩沖液 10mmol/L Tris-HCl，50mmol/L mol/LKClMgCl21.5mmol/LTaq DNA聚合酶 1.5u引物1 0.3μmol/L引物2 0.3μmol/L
dNTPs 每種80nmol/LDNA樣品50ng雙蒸水補(bǔ)足至 50μL(2)PCR方法中擴(kuò)增程序1)94℃5分鐘2)94℃30秒3)58℃30秒4)72℃30秒5)回到第2)-4)步，重復(fù)30次6)72℃5分鐘3.被檢測(cè)樣品目的PCR擴(kuò)增和電泳檢驗(yàn)PCR產(chǎn)物用1.5％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳后用溴化乙錠染色。電泳結(jié)果在紫外分析儀下觀察，可發(fā)現(xiàn)對(duì)多殺巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)進(jìn)行特異性擴(kuò)增產(chǎn)生的DNA片段，其中引物1、引物2擴(kuò)增結(jié)果可得到178bp的特異片段，結(jié)果如圖3。實(shí)驗(yàn)表明樣品中含有多殺巴斯德氏菌。
圖3樣本2檢測(cè)結(jié)果圖。
泳道1病魚(yú)樣本PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，所用引物為引物1和引物2；后來(lái)通過(guò)16S rDNA測(cè)序證明，所檢驗(yàn)的目的菌落98％為多殺巴斯德氏菌(Pasteurellamultocida)。
SEQUENCE LISTING<110>南開(kāi)大學(xué)<120>多殺巴斯德氏菌聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法<130>20060706<160>2<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>18<212>DNA<213>多殺巴斯德氏菌
<400>1cgaaagcaaa agagtgaa18<210>2<211>18<212>DNA<213>多殺巴斯德氏菌<220>
<221>primer_bind<222>(1)..(18)<400>2ccgtaatcag acctatcc18
權(quán)利要求
1.一種多殺巴斯德氏菌PCR快速檢測(cè)試劑盒，其特征在于試劑盒包括(1)DNA提取試劑TE緩沖液，5-15mmol/L Tris，0.5-1.5mmol/L EDTA，pH 8.0；溶菌酶，濃度10-20mg/mL，pH8.0；蛋白酶K溶液，濃度10-20mg/mL，pH8.0；Tris飽和酚，pH8.0；乙酸鈉，濃度2-5mol/L；乙醇，濃度95％；(2)PCR試劑盒成分為10×buffer含100mmol/L Tris-HCl，450-550mmol/L KCl，pH 8.3；dNTPsdATP，dTTP，dCTP，dGTP的混合物，每種濃度5-15mmol/L；特異性寡核苷酸引物引物1為5’-CGAAAGCAAAAGAGTGAA-3’、引物2為5’-CCGTAATCAGACCTATCC-3’，各引物濃度均為5-15μmol/L；雙蒸水；Taq DNA聚合酶5u/μL；MgCl210-20mmol/L。
2.一種使用多殺巴斯德氏菌PCR快速檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法，其特征在于，程序如下(1)DNA抽提挑取疑似菌落加入到0.4mL TE緩沖液(pH8.0)中振蕩混勻，加入100μL溶菌酶溶液，37℃保溫10分鐘，加同體積Tris飽和酚(pH8.0)，強(qiáng)烈振蕩，10000r/min離心3分鐘，取上清液，重復(fù)酚抽提；取上清液，加入0.1倍體積的乙酸鈉(3mol/L)，混勻，再加等體積的冰乙醇，混勻后低溫靜置30分鐘，12000r/min離心5分鐘，棄上清，加70％冷乙醇洗滌一次，室溫下12000r/min離心5分鐘，棄上清，加入50μL TE溶液，置-20℃保存；(2)PCR擴(kuò)增①PCR反應(yīng)混合物成分成分 體系中各組分最終濃度PCR緩沖液 10mmol/L Tris-HCl，50mmol/L KClMgCl21.5mmol/LTaq DNA聚合酶 1.5u引物1 0.3μmol/L引物2 0.3μmol/LdNTPs 每種80nmol/LDNA樣品 50ng雙蒸水補(bǔ)足至50μL②PCR方法中擴(kuò)增程序1)94℃ 5分鐘2)94℃ 30秒3)58℃ 30秒4)72℃ 30秒5)回到第2)-4)步，重復(fù)30次6)72℃ 5分鐘(3)被檢測(cè)樣品目的PCR擴(kuò)增和電泳檢驗(yàn)PCR產(chǎn)物用1.5％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳后用溴化乙錠染色，電泳結(jié)果在紫外光分析儀下觀察，如果發(fā)現(xiàn)有特異性擴(kuò)增產(chǎn)生的DNA片段，引物1、引物2擴(kuò)增結(jié)果得到150-200bp的特異片段，說(shuō)明樣品有多殺巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)感染或污染，反之則沒(méi)有。
3.多殺巴斯德氏菌PCR快速檢測(cè)試劑盒在檢測(cè)多殺巴斯德氏菌中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種多殺巴斯德氏菌PCR快速檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法。屬于獸醫(yī)學(xué)和水產(chǎn)學(xué)診斷技術(shù)領(lǐng)域，主要技術(shù)方案是利用PCR技術(shù)特異性擴(kuò)增16S－23S核糖體RNA轉(zhuǎn)錄間區(qū)，達(dá)到區(qū)分多殺巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)和相近致病菌的目的，并且能夠排除一些用傳統(tǒng)的生化鑒定難以排除的與多殺巴斯德氏菌相近的幾個(gè)致病菌。該方法與傳統(tǒng)方法相比能夠大大提高獸醫(yī)臨床診斷多殺巴斯德氏菌的效率，縮短診斷時(shí)間，準(zhǔn)確度更高，節(jié)省勞動(dòng)力和成本。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK1877297SQ20061001476
公開(kāi)日2006年12月13日 申請(qǐng)日期2006年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月12日
發(fā)明者黃熙泰, 周浩, 劉寅, 鄭澤軍, 李永君, 魏小娜 申請(qǐng)人:南開(kāi)大學(xué)