專利名稱：棕點(diǎn)湍蛙活性多肽及其基因和在制藥中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種棕點(diǎn)湍蛙(Amolops loloensis)活性多肽及其基因和在制藥中的應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
自從抗生素發(fā)明以來，人類在控制和治療微生物感染疾病中取得了較大的成就。但隨著“傳統(tǒng)抗生素”的持續(xù)使用，不斷產(chǎn)生出諸多新問題。目前，微生物抗藥性已成為臨床微生物感染疾病治療的重大問題，以至于某些病原細(xì)菌已沒有臨床治療的一線藥物。萬古霉素抗性的葡萄球菌、腸球菌以及其他革蘭氏陰性感染疾病目前均是世界范圍內(nèi)的臨床難題，三類主要引起腦膜炎的細(xì)菌在臨床上也出現(xiàn)了強(qiáng)的抗藥性，抗青霉素、氯霉素腦膜炎雙球菌、肺炎球菌，對(duì)抗新頭孢菌素抗生素的肺炎球菌也廣泛出現(xiàn)。因此新一類抗生素的研制已成為當(dāng)務(wù)之急和國(guó)際上的熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，多肽抗生素具有廣譜的抗菌活性，同時(shí)具有“傳統(tǒng)抗生素”無法比擬的優(yōu)越性如在最小作用濃度時(shí)，快速而廣譜地殺滅微生物(包括目前臨床抗藥菌)；對(duì)真菌也有抑制作用；不會(huì)誘導(dǎo)抗藥菌株的產(chǎn)生；對(duì)于局部感染和全身感染都有效，有希望成為新一代抗菌劑，其研制目前受到廣泛重視。
很多兩棲類動(dòng)物在中國(guó)屬于傳統(tǒng)中藥和民族藥物而廣泛應(yīng)用，如中華蟾蜍(Bufo gargarizans)，大蹼鈴蟾(Bombina maxima)，黑斑蛙(pelophylaxnigromaculata)，沼蛙(Hylarana guentheri)和澤蛙(Euphlyctislimnocharis)等。這些兩棲類動(dòng)物的皮膚和內(nèi)臟具有廣泛的藥理活性和臨床療效。已報(bào)道藥理活性有廣譜抗微生物作用、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、局部麻醉、免疫調(diào)節(jié)、心血管系統(tǒng)作用等。在國(guó)外，兩棲類皮膚特定藥理活性單體化合物的尋找已是新藥發(fā)明的熱點(diǎn)。據(jù)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，已從各種生物來源分離得到不同的活性多肽，而且有些已進(jìn)入臨床治療。如從爪蟾(Xenopus laevis)皮膚分泌液獲得的活性多肽Magainin具廣譜抗微生物作用，同時(shí)具有抗腫瘤活性，在美國(guó)已獲準(zhǔn)作為廣譜抗菌藥物，其基因工程產(chǎn)品已進(jìn)入三期臨床；Intrabiotics公司生產(chǎn)的活性多肽IB-367已獲準(zhǔn)用于治療癌癥病人因多種細(xì)菌感染而引起的口腔潰瘍一期臨床試驗(yàn)；Applied Microbiology公司與Astra公司合作用活性多肽nisin治療胃潰瘍的臨床試驗(yàn)也取得良好的療效。
我國(guó)對(duì)兩棲類藥物的應(yīng)用有悠久的歷史，但對(duì)其活性成分和藥理性質(zhì)的研究主要集中于生物堿等有機(jī)小分子，對(duì)其皮膚活性肽類物質(zhì)研究不多。棕點(diǎn)湍蛙(Amolops loloensis)主要分布于四川、云南省，是我國(guó)特色資源動(dòng)物之一。
發(fā)明人將本發(fā)明的棕點(diǎn)湍蛙活性多肽全序列氨基酸結(jié)構(gòu)經(jīng)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜尋比較，未發(fā)現(xiàn)有任何相同多肽。發(fā)明人將本發(fā)明的棕點(diǎn)湍蛙活性多肽編碼基因經(jīng)基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜尋比較，未發(fā)現(xiàn)有任何相同基因。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新的具有廣譜抗微生物(包括革蘭氏陰、陽性細(xì)菌，真菌)的棕點(diǎn)湍蛙活性多肽及其基因和在制藥中的應(yīng)用。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案棕點(diǎn)湍蛙活性多肽棕點(diǎn)湍蛙活性多肽是中國(guó)兩棲類棕點(diǎn)湍蛙活性多肽基因編碼的一種單鏈多肽，分子量2664.36道爾頓，等電點(diǎn)9.70，多肽全序列一級(jí)結(jié)構(gòu)為Phe Leu ProLeu Ala Val Ser Leu Ala Ala Asn Phe Leu Pro Lys Leu Phe Cys Lys Ile Thr Lys LysCys-AMIDATION。
棕點(diǎn)湍蛙活性多肽基因的克隆包括棕點(diǎn)湍蛙皮膚總RNA提取，mRNA純化，mRNA反轉(zhuǎn)錄及cDNA文庫構(gòu)建，設(shè)計(jì)引物，利用PCR方法篩選棕點(diǎn)湍蛙活性多肽基因。擴(kuò)增引物長(zhǎng)度為25個(gè)核苷酸，其序列為5’ATAAGACATCTGATGTGCATTTAGC 3’，PCR另一擴(kuò)增引物為CLONTECH公司SMARTTMcDNA Library Construction Kit中的5’PCR Primer引物，其序列為5’AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT 3’。所獲陽性單克隆進(jìn)行基因核苷酸序列測(cè)定?；驕y(cè)序結(jié)果表明編碼棕點(diǎn)湍蛙活性多肽的基因由448個(gè)核苷酸組成，自5’端至3’端序列為taagcagtgg tatcaacgca gagtggccat tacggccggg ggagacctcc actgaagtct 60tccagctctc tacattctca gcaccaactg aactacccga acccaaagat gttcaccttg120aagaaatccc tgttactcct tttcttcctt gggaccatca acttatctct ctgcgagcaa180gagagagatg ccgatgagga agaaagaaga gatgatgatg aaatggatgt tgaagtggaa240aaacgatttt taccacttgc ggtcagtctg gccgctaatt tcttgcccaa actattttgt300aaaataacca aaaaatgttg aaactctgaa aatggaattg gaaatcatct gatgttgaat360atcatttagc taaatgcaca tcagatgtct tataaaaaaa taaagatatc tcaaacatca420aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 448編碼棕點(diǎn)湍蛙成熟活性多肽為第247-318位核苷酸，其氨基酸序列為Phe Leu Pro Leu Ala Val Ser Leu Ala Ala Asn Phe Leu Pro Lys Leu1 5 10 15Phe Cys Lys Ile Thr Lys Lys Cys-AMIDATION。
20棕點(diǎn)湍蛙活性多肽基因作為基因工程制備棕點(diǎn)湍蛙活性多肽的應(yīng)用。
棕點(diǎn)湍蛙活性多肽的制備方法根據(jù)編碼棕點(diǎn)湍蛙活性多肽的基因推斷棕點(diǎn)湍蛙活性多肽的氨基酸序列，用自動(dòng)多肽合成儀合成其全序列。通過HPLC反相C18柱層析脫鹽、純化。然后用HPLC方法鑒定其純度，分子量測(cè)定采用快原子轟擊質(zhì)譜法(Fast atom bombardmentmass spectrometry，F(xiàn)AB-MS)，等電聚焦電泳測(cè)定等電點(diǎn)，用自動(dòng)氨基酸測(cè)序儀測(cè)定氨基酸序列結(jié)構(gòu)。
棕點(diǎn)湍蛙活性多肽具有顯著的抑制細(xì)菌和真菌生長(zhǎng)的作用，可以作為制備病原微生物感染疾病的治療藥物的應(yīng)用。
本發(fā)明的有益效果在于由棕點(diǎn)湍蛙活性多肽編碼基因推導(dǎo)其氨基酸結(jié)構(gòu)，合成的棕點(diǎn)湍蛙活性多肽具有顯著的抑制細(xì)菌和真菌生長(zhǎng)的作用。該棕點(diǎn)湍蛙活性多肽具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、人工合成方便、抗菌譜系廣的有益特點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一棕點(diǎn)湍蛙活性多肽基因克隆I、棕點(diǎn)湍蛙皮膚總RNA提取A.活體棕點(diǎn)湍蛙用水清洗干凈，放入液氮中速凍4小時(shí)，取皮膚組織，稱重，取300mg皮膚組織，加入10ml總RNA提取緩沖液(Trizol溶液，美國(guó)GIBCOBRL公司產(chǎn)品)，于20ml玻璃勻漿器中勻漿30分鐘。
B.加入等體積酚/氯仿溶液，劇烈混勻，室溫放置10分鐘，4℃，12000rpm離心10分鐘，棄除沉淀。
C.上清加入等體積的異丙醇，室溫放置10分鐘，4℃，12000rpm離心10分鐘，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即為棕點(diǎn)湍蛙皮膚總RNA。
II、棕點(diǎn)湍蛙皮膚mRNA的純化棕點(diǎn)湍蛙皮膚mRNA分離純化采用美國(guó)PROMEGA公司的PolyATtractmRNA Isolation Systems試劑盒。
A.取棕點(diǎn)湍蛙皮膚總RNA 500μg溶于500μl DEPC水中，放入65℃水浴10分鐘，加人3μl的Oligo(dT)探針和13μl 20×SSC溶液，混勻，放置室溫冷卻，稱為A液。
B.磁珠(SA-PMP)的洗滌將磁珠輕彈混勻，至磁力架吸附30秒，棄上清，加0.5×SSC 0.3ml，至磁力架吸附30秒，最后加0.1ml 0.5×SSC懸浮，稱之為B液。
C.將A液加入B液中，室溫放置10分鐘，至磁力架吸附30秒，棄上清，用0.1×SSC洗滌4次，最后棄上清，加0.1ml DEPC水懸浮，至磁力架上吸附30秒，將上清移至新的試管，再加入0.15ml DEPC水重新懸浮，至磁力架吸附30秒，移上清至上述試管，則上清中為純化的棕點(diǎn)湍蛙皮膚mRNA。
D.加入1/10體積3M乙酸鈉，pH5.2，等體積異丙醇，于-70℃放置30分鐘，4℃，12000rpm離心10分鐘，棄上清，沉淀溶解于10μl DEPC水中。
III、棕點(diǎn)湍蛙皮膚cDNA文庫構(gòu)建采用CLONTECH公司CreatorTMSMARTTMcDNA Library Construction Kit質(zhì)粒cDNA文庫構(gòu)建試劑盒。
A.cDNA第一鏈合成(mRNA反轉(zhuǎn)錄)1.在0.5ml無菌的離心管加入1μl棕點(diǎn)湍蛙皮膚mRNA、1μl SMARTIV寡聚核苷酸、1μl CDS III/3’PCR引物，加2μl去離子水使總體積達(dá)到5μl。
2.混勻離心管中的試劑并短暫離心，72℃保溫2分鐘。
3.將離心管在冰上孵育2分鐘。
4.在離心管中加入以下試劑2.0μl 5×第一鏈緩沖、1.0μl 20mM二硫蘇糖醇、1.0μl 10mM dNTP混合物、1.0μl PowerScript反轉(zhuǎn)錄酶。
5.混合離心管中試劑并短暫離心，在42℃保溫1小時(shí)。
6.將離心管置于冰上中止第一鏈的合成。
7.從離心管取2μl所合成的cDNA第一鏈備用。
B.采用長(zhǎng)末端聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LD-PCR)方法擴(kuò)增第二鏈1.95℃預(yù)熱PCR儀。
2.將2μl cDNA第一鏈(mRNA反轉(zhuǎn)錄)、80μl去離子水、10μl 10×Advantage 2PCR緩沖、2μl 50×dNTP混合物、2μl 5’PCR引物、2μl CDS III/3’PCR引物以及2μl大腸桿菌聚合酶離心管進(jìn)行反應(yīng)。
3.在PCR儀中按以下程序擴(kuò)增①95℃20秒鐘②22個(gè)循環(huán)95℃ 5秒鐘68℃ 6分鐘4.循環(huán)結(jié)束后，將離心管中合成的cDNA雙鏈進(jìn)行抽提。C.PCR產(chǎn)物用PROMEGA公司的WizardSV Gel and PCR Clean-UpSystem試劑盒進(jìn)行抽提回收，步驟如下1.將通過PCR得到的cDNA雙鏈加入等體積的膜結(jié)合緩沖顛倒混勻，然后將混和液轉(zhuǎn)入離心純化柱，室溫靜置5分鐘，使DNA充分與硅膠膜結(jié)合。16,000g離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液。
2.加入700μl的洗脫液(含乙醇)于離心純化柱中，16,000g離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液。
3.重復(fù)步驟2。
4.16,000g離心5分鐘。
5.將離心純化柱置于新的離心管中。
6.加入30μl超純水，在室溫下靜置5分鐘。
7.16,000g離心1分鐘，管底溶液即為所純化過的cDNA雙鏈。
D.大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞的制備1.挑取單個(gè)DH5α菌落，接種于3ml不含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，次日取上述菌液按比例1∶100再接種于50ml LB培養(yǎng)液中，37℃振蕩2小時(shí)。當(dāng)OD600值達(dá)到0.35時(shí)，收獲細(xì)菌培養(yǎng)物。
2.將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個(gè)無菌、一次性使用的、用冰預(yù)冷的50ml聚丙烯管中，在冰上方置10min，使培養(yǎng)物冷卻至0℃。
3.于4℃以4100r/min離心10min，以回收細(xì)胞。
4.倒出培養(yǎng)液，將管倒置1min以使最后的痕量培養(yǎng)液流盡。
5.每50ml初始培養(yǎng)液且30ml預(yù)冷的0.1mol/L CaCl2-MgCl2溶液(80mmol/L MgCl2，20mmol/L CaCl2)重懸每份細(xì)胞沉淀。
6.于4℃以4100r/min離心10min，以回收細(xì)胞。
7.倒出培養(yǎng)液，將管倒置1min以使最后的痕量培養(yǎng)液流盡。
8.每50ml初始培養(yǎng)物用2ml用冰預(yù)冷的0.1mol/L CaCl2重懸每份細(xì)胞沉淀，分裝后備用。
E.酶切、連接以及連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化1.在微量離心管中加入1μl Takara pMD18-T載體、4μl棕點(diǎn)湍蛙cDNA雙鏈溶液，全量為5μl。
2.加入5μl(等量)的連接酶緩沖混合物。
3.16℃反應(yīng)2小時(shí)。
4.全量(10μl)加入至100μl DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，冰中放置30分鐘。
5.42℃加熱90秒鐘后，再在冰中放置1分鐘。
6.加入37℃溫浴過的LB培養(yǎng)基890μl，37℃緩慢振蕩培養(yǎng)60分鐘。
7.取200μl涂布于含有X-Gal、IPTG、Amp的LB培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)16小時(shí)，形成單菌落。
8.每個(gè)LB平皿用5ml LB液體培養(yǎng)基洗滌菌落，加30％甘油凍存。構(gòu)建的cDNA大約含1×106個(gè)單獨(dú)克隆。
IV、棕點(diǎn)湍蛙活性多肽基因克隆篩選擴(kuò)增引物長(zhǎng)度為25個(gè)核苷酸，其序列為5’ATAAGACATCTGATGTGCATTTAGC 3’，PCR另一擴(kuò)增引物為CLONTECH公司SMARTTMeDNA Library Construction Kit中的5’PCR Primer引物，其序列為5’AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT 3’。
PCR反應(yīng)在如下條件下進(jìn)行94℃30秒鐘，52℃45秒鐘和72℃2分30秒鐘，35個(gè)循環(huán)。
首先滴定構(gòu)建的細(xì)菌cDNA文庫，然后用含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基稀釋至適當(dāng)?shù)募?xì)菌濃度(大約5000個(gè)細(xì)菌/毫升，和30個(gè)細(xì)菌/毫升分別用于首輪篩選第二輪篩選)，在96孔培養(yǎng)板上按8×8矩陣鋪板(共64孔，每孔100μl)，37℃過夜培養(yǎng)。按行、列分別合并細(xì)菌培養(yǎng)液，有16個(gè)樣品進(jìn)行PCR鑒定，交叉陽性孔細(xì)菌樣品進(jìn)入第二輪篩選。
V、棕點(diǎn)湍蛙活性多肽基因序列測(cè)定和結(jié)果提取質(zhì)粒DNA用雙脫氧法測(cè)定核苷酸序列，使用儀器為美國(guó)AppliedBiosystems373A全自動(dòng)核苷酸序列測(cè)定儀，測(cè)序引物為BcaBESTTMSequencingPrimer RV-M和BcaBESTTMSequencing Primer M13-47，BcaBESTTMSequencingPrimer RV-M序列5`GAGCGGATAACAATTTCACACAGG 3’，BcaBESTTMSequencing Primer M13-475’CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 3’。基因測(cè)序結(jié)果自5’端至3’端序列為taagcagtgg tatcaacgca gagtggccat tacggccggg ggagacctcc actgaagtct 60tccagctctc tacattctca gcaccaactg aactacccga acccaaagat gttcaccttg120aagaaatccc tgttactcct tttcttcctt gggaccatca acttatctct ctgcgagcaa180gagagagatg ccgatgagga agaaagaaga gatgatgatg aaatggatgt tgaagtggaa240aaacgatttt taccacttgc ggtcagtctg gccgctaatt tcttgcccaa actattttgt300aaaataacca aaaaatgttg aaactctgaa aatggaattg gaaatcatct gatgttgaat360atcatttagc taaatgcaca tcagatgtct tataaaaaaa taaagatatc tcaaacatca420aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 448棕點(diǎn)湍蛙活性多肽基因核苷酸的序列表為序列長(zhǎng)度為448個(gè)堿基，序列類型核酸，鏈數(shù)單鏈，拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀，序列種類cDNA，來源棕點(diǎn)湍蛙皮膚。
編碼棕點(diǎn)湍蛙成熟活性多肽為第247-318位核苷酸，其氨基酸序列為Phe Leu Pro Leu Ala Val Ser Leu Ala Ala Asn Phe Leu Pro Lys Leu1 5 10 15Phe Cys Lys Ile Thr Lys Lys Cys-AMIDATION。
20棕點(diǎn)湍蛙活性多肽基因作為基因工程制備棕點(diǎn)湍蛙活性多肽的應(yīng)用。
實(shí)施例二制備棕點(diǎn)湍蛙活性多肽
I、棕點(diǎn)湍蛙活性多肽的制備方法根據(jù)編碼棕點(diǎn)湍蛙活性多肽的基因推斷棕點(diǎn)湍蛙活性多肽的氨基酸序列，用自動(dòng)多肽合成儀合成其全序列。通過HPLC反相C18柱層析脫鹽、純化。
II、分子量測(cè)定采用快原子轟擊質(zhì)譜法(Fast atom bombardment massspectrometry，F(xiàn)AB-MS)，以甘油∶間硝基芐醇∶二甲亞砜(1∶1∶1，V∶V∶V，體積比)為底物，Cs+作為轟擊粒子，電流為1μA，發(fā)射電壓為25Kv。
III、純化的棕點(diǎn)湍蛙活性多肽用高效液相色譜HPLC方法鑒定其純度，分子量測(cè)定采用快原子轟擊質(zhì)譜法，等電聚焦電泳測(cè)定等電點(diǎn)，用自動(dòng)氨基酸測(cè)序儀測(cè)定氨基酸序列結(jié)構(gòu)。
棕點(diǎn)湍蛙活性多肽是中國(guó)兩棲類動(dòng)物棕點(diǎn)湍蛙活性多肽基因編碼的一種單鏈多肽，分子量2664.36道爾頓，等電點(diǎn)9.70，多肽氨基酸全序列一級(jí)結(jié)構(gòu)為苯丙氨酸-亮氨酸-脯氨酸-亮氨酸-丙氨酸-纈氨酸-絲氨酸-亮氨酸-丙氨酸-丙氨酸-天冬酰胺-苯丙氨酸--亮氨酸-脯氨酸-賴氨酸-異亮氨酸-蘇氨酸-賴氨酸-賴氨酸-酰胺化半胱氨酸(Phe Leu Pro Leu Ala Val Ser Leu Ala Ala Asn Phe Leu Pro Lys LeuPhe Cys Lys Ile Thr Lys Lys Cys-AMIDATION)。
實(shí)施例三棕點(diǎn)湍蛙活性多肽抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的作用抗菌活性檢測(cè)，采用杯碟法，培養(yǎng)基為普通瓊脂培養(yǎng)基。分別注入加熱融化的培養(yǎng)基20ml于平皿中作為底層，使其在皿底內(nèi)均勻攤布，凝固后，另取培養(yǎng)基適量加熱融化后，分別在每皿中加入5ml菌懸液，搖勻，使其在底層上均勻攤布，作為菌層。冷卻后，在平皿中等距離均勻放入已消毒的不銹鋼杯6個(gè)。第一個(gè)鋼杯加入0.1-0.3mg/ml濃度的待測(cè)化合物溶液0.1ml，其余鋼杯采用二倍稀釋法加入樣品液，37℃培養(yǎng)，觀察抑菌圈大小。抑菌圈10mm以上的作為最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)。細(xì)菌菌株來源于昆明醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，此試驗(yàn)重復(fù)四次，取平均值，結(jié)果如表1。
表1，棕點(diǎn)湍蛙活性多肽抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的作用
由表1可見，合成的棕點(diǎn)湍蛙活性多肽具有顯著的抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的作用。
棕點(diǎn)湍蛙活性多肽抑制真菌生長(zhǎng)的作用抗真菌活性檢測(cè)采用杯碟法，培養(yǎng)基為改良沙保氏(Sabousand)培養(yǎng)基。分別注入加熱溶化的培養(yǎng)基20ml于平皿中作為底層，使其在皿底均勻攤布，凝固后另取培養(yǎng)基適量加熱溶化，分別向每皿中加入5ml菌懸液，搖勻，使其在底層上均勻攤布，作為菌層。冷卻后，在平皿中等距離放入已消毒的不銹鋼杯5個(gè)。第一個(gè)鋼杯加入0.3mg/ml濃度的待測(cè)化合物溶液0.1ml，其余鋼杯采用二倍稀釋法加入樣品液，37℃培養(yǎng)，24h-48h后測(cè)量抑菌圈大小。抑菌圈10mm以上作為最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)。細(xì)菌菌株來源于云南大學(xué)微生物研究所，此實(shí)驗(yàn)做三個(gè)平行，取幾何平均值，結(jié)果如表2。
表2.棕點(diǎn)湍蛙活性多肽抑制真菌生長(zhǎng)的作用
由表2可見，合成的棕點(diǎn)湍蛙活性多肽具有顯著的抑制真菌生長(zhǎng)作用。
棕點(diǎn)湍蛙活性多肽及其基因和在制藥中的應(yīng)用-序列生成表SEQUENCE LISTING<110>南京農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>棕點(diǎn)湍蛙活性多肽及其基因和在制藥中的應(yīng)用<130>1<160>2<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>448<212>DNA<213>棕點(diǎn)湍蛙(Amolops loloensis)<400>1taagcagtgg tatcaacgca gagtggccat tacggccggg ggagacctcc actgaagtct 60tccagctctc tacattctca gcaccaactg aactacccga acccaaagat gttcaccttg 120aagaaatccc tgttactcct tttcttcctt gggaccatca acttatctct ctgcgagcaa 180gagagagatg ccgatgagga agaaagaaga gatgatgatg aaatggatgt tgaagtggaa 240aaacgatttt taccacttgc ggtcagtctg gccgctaatt tcttgcccaa actattttgt 300aaaataacca aaaaatgttg aaactctgaa aatggaattg gaaatcatct gatgttgaat 360atcatttagc taaatgcaca tcagatgtct tataaaaaaa taaagatatc tcaaacatca 420aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 448<210>2<211>24<212>PRT<213>棕點(diǎn)湍蛙(Amolops loloensis)<220>
<221>AMIDATION<222>(24)<400>2Phe Leu Pro Leu Ala Val Ser Leu Ala Ala Asn Phe Leu Pro Lys Leu1 5 10 15Phe Cys Lys Ile Thr Lys Lys Cys-AMIDATION20
權(quán)利要求
1.棕點(diǎn)湍蛙活性多肽，其特征在于該活性多肽是中國(guó)兩棲類棕點(diǎn)湍蛙活性多肽基因編碼的一種單鏈多肽，分子量2664.36道爾頓，等電點(diǎn)9.70，多肽全序列為Phe Leu Pro Leu Ala Val Ser Leu Ala Ala Asn Phe Leu Pro Lys Leu Phe Cys LysIle Thr Lys Lys Cys-AMIDATION。
2.棕點(diǎn)湍蛙活性多肽基因核苷酸序列，其特征在于cDNA由448個(gè)核苷酸組成，其自5’端至3’端序列為taagcagtgg tatcaacgca gagtggccat tacggccggg ggagacctcc actgaagtct60tccagctctc tacattctca gcaccaactg aactacccga acccaaagat gttcaccttg120aagaaatccc tgttactcct tttcttcctt gggaccatca acttatctct ctgcgagcaa180gagagagatg ccgatgagga agaaagaaga gatgatgatg aaatggatgt tgaagtggaa240aaacgatttt taccacttgc ggtcagtctg gccgctaatt tcttgcccaa actattttgt300aaaataacca aaaaatgttg aaactctgaa aatggaattg gaaatcatct gatgttgaat360atcatttagc taaatgcaca tcagatgtct tataaaaaaa taaagatatc tcaaacatca420aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 448
3.權(quán)利要求2所述的棕點(diǎn)湍蛙活性多肽基因核苷酸序列，其特征在于，編碼棕點(diǎn)湍蛙成熟活性多肽為第247-318位核苷酸，其氨基酸序列為Phe Leu Pro Leu Ala Val Ser Leu Ala Ala Asn Phe Leu Pro Lys Leu1 5 10 15Phe Cys Lys Ile Thr Lys Lys Cys-AMIDATION。20
4.權(quán)利要求1所述的棕點(diǎn)湍蛙活性多肽，作為制備病原微生物感染疾病的治療藥物的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種活性多肽及其基因和在制藥中的應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。該活性多肽是從中國(guó)兩棲類動(dòng)物棕點(diǎn)湍蛙基因編碼的一種單鏈多肽，分子量2664.36道爾頓，等電點(diǎn)9.70，多肽全序列一級(jí)結(jié)構(gòu)為Phe Leu Pro Leu Ala Val Ser Leu Ala Ala Asn Phe Leu Pro Lys Leu Phe Cys Lys Ile Thr Lys Lys Cys－AMIDATION。編碼棕點(diǎn)湍蛙活性多肽的基因由448個(gè)核苷酸組成，其中編碼成熟棕點(diǎn)湍蛙活性多肽為第247－318位核苷酸。人工合成的棕點(diǎn)湍蛙活性多肽具有顯著的抑制細(xì)菌和真菌生長(zhǎng)的作用，可以作為制備病原微生物感染疾病的治療藥物被應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N15/12GK1803835SQ200610010628
公開日2006年7月19日 申請(qǐng)日期2006年1月12日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月12日
發(fā)明者賴仞, 徐學(xué)清, 梁建國(guó), 韓曜平, 楊海龍, 李建許 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)