專利名稱：非洲馬瘟病毒熒光定量rt－pcr檢測試劑及制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種以非洲馬瘟病毒基因片段為靶目標(biāo)設(shè)計合成的生物制劑，尤其是能夠?qū)Ψ侵揆R瘟病毒進行檢測的試劑以及這種試劑的制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
非洲馬瘟(African Horse Sickness，AHS)是由昆蟲傳播的、主要感染馬和其它馬屬動物的一種急性或亞急性病毒性蟲媒傳染病。本病主要發(fā)生在非洲，后來傳遍了中東并侵入亞洲部分地區(qū)。以發(fā)熱及皮下結(jié)締組織和肺水腫以及內(nèi)臟出血為特征，以地方性和季節(jié)性(春夏多雨季節(jié))流行為主要形式。其危害主要是引起馬、騾致死，新疫區(qū)病馬死亡率高達95％。國際獸疫局(OIE)將該病確定為A類動物傳染病，我國也將其確定為進境動物一類傳染病。
非洲馬瘟病毒(AHSV)屬于呼腸孤病毒科(Reoviridae)環(huán)狀病毒屬(Orbivirus)，病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)為雙鏈RNA病毒，由7個結(jié)構(gòu)蛋白(VP1、VP2、VP3-VP7)和10個雙鏈RNA片段組成，病毒子外部衣殼蛋白由VP2和VP5組成，內(nèi)部衣殼蛋白主要由VP3和VP7組成，這四種蛋白質(zhì)在AHSV的9個血清型中高度保守，其中VP7最保守。少數(shù)內(nèi)部衣殼蛋白由VP1、VP4、VP6組成，病毒還有幾種非結(jié)構(gòu)蛋白。目前已鑒定AHSV有9個抗原性不同的血清型，這些病毒與其它環(huán)狀病毒(藍舌病病毒和鹿流行性出血病)無交叉反應(yīng)。
用可溶性AHSV抗原或重組VP7的間接ELISA，已被證明是一種檢測AHSV群特異性抗體的好方法，特別適用于大量調(diào)查。免疫印跡試驗也被用于檢查AHS抗體，該方法特別適用于少量血清檢查。最近有報道表明，以非結(jié)構(gòu)蛋白NS3為抗原的間接ELISA，能夠?qū)⒏腥続HSV的動物或以AHS活疫苗免疫的動物與以純化的病毒子制備的滅活疫苗免疫的動物區(qū)分開，這一試驗方法目前正在進一步評估中。補體結(jié)合反應(yīng)(CF)過去使用較廣，但有些血清具有抗補體作用，因此，目前CF的使用正在減少。病毒中和試驗(VN)可用來進行血清學(xué)分型，在診斷和檢驗檢疫中使用不多。
病毒分離方法費時，不能作出快速診斷，且需要選用敏感的宿主或細胞。因此，研究建立特異、敏感、可對低含量AHSV病毒感染、隱性感染或持續(xù)帶毒宿主進行準確檢測的方法，在檢疫、診斷、分子流行病學(xué)研究具有重要意義。檢測AHSV特異性核酸的最好方法是反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)，它將高敏感性、高特異性和高準確性結(jié)為一體，不像細胞培養(yǎng)分離病毒時易受臨床樣品中中和抗體的干擾，是研究AHSV病原學(xué)和持續(xù)感染的良好檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種利用非洲馬瘟病毒VP7基因序列設(shè)計合成的、能快速、準確地檢測非洲馬瘟病毒的非洲馬瘟病毒熒光定量RT-PCR檢測試劑。
本發(fā)明的另一目的是提供這種檢測試劑的制備方法。
本發(fā)明的再一目的是提供這種檢測試劑的應(yīng)用。
本發(fā)明系選擇非洲馬瘟病毒VP7基因的保守片段為靶目標(biāo)，根據(jù)VP7基因的特點和引物、探針設(shè)計的原則，設(shè)計合成引物和探針。將設(shè)計的多對引物和探針進行最佳配對篩選實驗，得到最適合的引物和探針。
本發(fā)明所述的非洲馬瘟病毒熒光定量RT-PCR檢測試劑包含一對特異性引物和一條特異性熒光探針，擴增目標(biāo)片段長度為69bp，引物和探針序列為引物AHSV-VP7-F5’-TGT CAC CGT TGA TGG AGT AAA TG-3’AHSV-VP7-R5’-TTC ACT GGT GCA ATG GTA TTC C-3’探針(FAM)5’-TGC GGC TGG AGA TGT CGT CGC-3’(TAMRA)。
本發(fā)明所述的非洲馬瘟病毒熒光定量RT-PCR檢測試劑的制備方法由以下步驟組成一、選擇AHSV VP7基因的保守片段為靶目標(biāo)，其基因片段的擴增目標(biāo)核苷酸序列為TGTCACCGTTGATGGAGTAAATGTTGCGGCTGGAGATGTCGTCGCATGGAATACCATTGCACCAGTGAA；二、根據(jù)VP7基因的特點和引物、探針設(shè)計的原則，應(yīng)用primer Express軟件和primer prere5.0軟件，設(shè)計引物和探針；三、引物和探針的合成采用β-乙腈亞磷酸胺化學(xué)合成法，使用全自動DNA合成儀進行OligoDNA的合成；
四、探針合成同時進行兩端熒光標(biāo)記，探針5’端標(biāo)記的熒光報告基團是FAM，3’端標(biāo)記的熒光淬滅基團為TAMAR；五、將設(shè)計合成的多對引物和探針進行最佳配對篩選實驗后，初步確定候選引物和探針；六、經(jīng)過大量的反應(yīng)條件優(yōu)選、對比試驗和驗證試驗，從候選引物和探針中確定最佳的引物和探針，并經(jīng)過大量臨床樣品的檢測應(yīng)用評估，得到如上所述的擴增效率和特異性最好的引物和探針。
實時熒光定量RT-PCR將PCR與熒光檢測相結(jié)合，克服了傳統(tǒng)反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)費時、易污染、擴增后需電泳檢測和每次檢測的樣品數(shù)量少等缺點，可對樣品中的AHSV進行準確的定量檢測，具有簡單、易操作、結(jié)果直觀、敏感性高、特異性強、重復(fù)性好等優(yōu)點，已成為病原體檢測的重要方法。本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果為1、本試劑與常規(guī)的RT-PCR相比較，該方法具有快速、特異、敏感、可定量、可同時檢測大量樣品等優(yōu)點。非洲馬瘟病毒熒光定量RT-PCR可對樣品中低含量的AHSV病毒、隱性感染或持續(xù)帶毒宿主進行準確檢測，是一種AHSV檢測的良好方法。
2、本試劑可對細胞培養(yǎng)物、分泌物、血液、組織等多種樣品中的AHSV進行快速檢測，樣品適用范圍廣，沒有生物安全隱患，使用安全的優(yōu)點。
3、本熒光定量RT-PCR試劑除了具有特異性高、敏感性強外，可同時進行大量樣品檢測，具有高通量性，可減少RNA、cDNA或PCR產(chǎn)物污染的風(fēng)險。比常規(guī)PCR快速，無需擴增后的電泳分析。克服了常規(guī)RT-PCR和免疫捕獲RT-PCR產(chǎn)生的產(chǎn)物須電泳檢測、費時、不敏感和不能定量的缺點。
4、與常規(guī)PCR相比，熒光定量PCR作出一個定量的、客觀的估計，判定出陽性、陰性和可疑。CT值為30.00可確定為陽性和陰性的臨界值(cut-off)。更重要的是熒光定量RT-PCR特別適用于保存時間長而無法進行分離病毒的大批量樣品的檢測。
5、本試劑所組成的試劑盒可在收到樣品后4小時之內(nèi)作出定性、定量檢測結(jié)果。該熒光定量RT-PCR試劑盒是一種檢測臨床樣品中AHSV的敏感和可靠的方法。
具體實施例方式
1、AHSV VP7基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建按照黃培堂等譯《分子克隆實驗指南》(第三版)，中國科學(xué)出版社，2003年1月，第1217頁至第1259頁，進行非洲馬瘟病毒VP7基因克隆和測序，構(gòu)建AHSV VP7基因重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒命名為pBAD-VP7。
2、設(shè)計引物和探針本發(fā)明選擇AHSV VP7基因的保守片段為靶目標(biāo)，通過對GenBank中報道的AHSV 9個血清型中高度保守的基因片段VP7基因的DNA序列和上述1克隆和測序的非洲馬瘟病毒AHSV基因DNA序列進行同源性分析比較，選定AHSV VP7基因的保守片段(69bp)，根據(jù)VP7基因的特點和引物、探針設(shè)計的原則，設(shè)計引物和探針，引物和探針的合成采用β-乙腈亞磷酸胺化學(xué)合成法，使用全自動DNA合成儀進行OligoDNA的合成探針合成同時進行兩端熒光標(biāo)記，探針5’端標(biāo)記的熒光報告基團是FAM，3’端標(biāo)記的熒光淬滅基團為TAMAR。將設(shè)計合成的多對引物和探針進行最佳配對篩選實驗后，確定擴增效率和特異性最好的一對引物和一條探針，擴增目標(biāo)片段長度為69bp。
3、RNA提取非洲馬瘟病毒RNA和標(biāo)準品同時制備。參照黃禎祥主編《醫(yī)學(xué)病毒學(xué)基礎(chǔ)及實驗技術(shù)》，科學(xué)出版社(1990年)第143-146頁，先測定毒價，以Reed和Muench氏法計算TCID50。取100μL病毒原液，參照盧圣棟主編《分子生物學(xué)實驗室常用技術(shù)》，科學(xué)出版社(1999年)第61-62頁，酚/氯仿核酸抽提法提取RNA。用無RNA酶的超純水溶解總RNA，稀釋成相當(dāng)于10000、1000、100、10、1、0.1TCID50的每個反應(yīng)管。血液(抗凝血)、血清和細胞組織等材料直接提取RNA。熒光RT-PCR和常規(guī)RT-PCR試驗用同批次提取的RNA。
4、AHSV熒光定量RT-PCRAHSV熒光定量RT-PCR采用50μL體積反應(yīng)液，在7000型熒光定量PCR儀中，按下列反應(yīng)參數(shù)進行42℃30min反轉(zhuǎn)錄；95℃預(yù)變性5min；95℃變性15sec，60℃1min，擴增40個循環(huán)。
引物和探針的濃度進行精確篩選，以獲得最低的CT值和較高的熒光強度增加值(ΔRn)。每次檢測時，設(shè)立用水代替病毒RNA樣品的4個陰性對照(或正常組織、細胞陰性對照)；設(shè)立相當(dāng)于1000、100、10、1TCID50/每反應(yīng)管的FMDV標(biāo)準各4個對照；每個樣品檢測做3管平行試驗。在4個陰性對照為陰性、陽性對照為陽性時，整個試驗有效，可進一步判定結(jié)果。每個樣品須作多個備份，以進行穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗。
5、常規(guī)RT-PCR常規(guī)RT-PCR的上游引物和下游引物與熒光定量RT-PCR相同，擴增目標(biāo)片段長度為69bp，按常規(guī)方法進行擴增。檢測用3％瓊脂糖電泳分析，陽性擴增結(jié)果出現(xiàn)一條69bp特異性條帶。
6、AHSV熒光定量RT-PCR的特異性、敏感性用BTV、EHD、BVD、AKAV以及正常BHK21細胞、野外采集馬的組織樣品和血清進行特異性檢測比較。對AHSV細胞培養(yǎng)物、人工感染動物組織樣品進行10倍系列稀釋，用常規(guī)RT-PCR和熒光定量RT-PCR檢測，比較它們的敏感性。
7、熒光定量RT-PCR穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗在評估AHSV熒光定量RT-PCR檢測AHSV方法中的組內(nèi)和組間試驗的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性時，用相當(dāng)于1000TCID50的樣品RNA，在同樣反應(yīng)條件下，反復(fù)進行熒光定量RT-PCR檢測，每次試驗的每個樣品做6個平行的反應(yīng)管，重復(fù)12次。
8、標(biāo)準陽性對照樣品的制備、標(biāo)準曲線的建立及核酸拷貝數(shù)的計算上述1構(gòu)建的重組質(zhì)粒pBAD-VP7，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10，LB培養(yǎng)基(含Amp100μg/mL)增殖，堿裂解法提取，經(jīng)試劑盒純化，質(zhì)粒濃度用分光光度計測OD260定量。模板濃度的計算在作絕對定量時，首先制備標(biāo)準曲線。對標(biāo)準品進行10-1、10-2、10-3、10-4～10-7稀釋，通過測OD知道質(zhì)粒原液(標(biāo)準品)的濃度后，可計算出每個PCR管中模板的數(shù)量。
例如，已知pBAD/Thio TOPO載體長4436bp，插入的AHSV VP7基因片段長1056bp，每個堿基的平均分子量是330，(每對堿基/bp是660，)質(zhì)粒原液約180μg/mL，阿弗加德羅常數(shù)(每mol的微粒數(shù))是6.02×1023/mol。那么每2μL的絕對模板數(shù)量是(180μg/mL×2μL×6.02×1023/mol)/[(4436+1056)bp×660g/(mol×bp)]＝5.8×1019。據(jù)此，10-4～10-7質(zhì)粒的模板分子數(shù)是5.8×1015～1012。做熒光定量RT-PCR檢測，以拷貝數(shù)或TCID50的對數(shù)為X軸，CT值為Y軸作回歸曲線，獲得標(biāo)準曲線。
9、引物和探針及其濃度的篩選選擇引物、探針、模板的最佳濃度配比，獲得熒光定量RT-PCR反應(yīng)的最低CT值和最高ΔRn，提高擴增效率和敏感性。應(yīng)用含有目的片段的質(zhì)粒標(biāo)準品和AHSV細胞毒，經(jīng)系列稀釋，制備DNA和RNA不同含量的檢測樣品。對設(shè)計的引物和探針，選用50nM、100nM、200nM、300nM、400nM和500nM的引物和探針終濃度，采用矩陣法優(yōu)選引物和探針的最佳濃度。
10、對AHSV樣品的檢測用熒光定量RT-PCR對AHSV細胞培養(yǎng)物、組織、BTV17、EHDV、BVDV、正常BHK21細胞、馬組織等試驗樣品進行檢測。提取的RNA稀釋后檢測，陽性樣品的CT值均小于或等于28.0，陰性對照樣品的CT值均大于30.0，試驗特異性強。CT值30.0可作為是陽性和陰性的臨界值。CT值大于30.0可判為陰性，CT值小于或等于28.0可判為陽性，在28.0-30.0之間為可疑，須重新試驗。熒光定量RT-PCR檢測AHSV的特異性強，敏感性高，重復(fù)性很好。
11、AHSV熒光定量RT-PCR標(biāo)準化試劑和檢測程序11.1試劑盒組成(50μl反應(yīng)×50次)根據(jù)上述1～10試驗結(jié)果，按照反應(yīng)條件優(yōu)選、對比試驗和驗證試驗確定的反應(yīng)條件，配制如下試劑盒組份


11.2操作方法11.2.1總RNA提取(1)取1ml-1.5ml組織樣品研磨上清液或液體樣品置1.5ml eppendorf管中，12000rpm，4℃，離心5min，棄上清液。
(2)加入1ml溶液I，充分振蕩混勻，置室溫5min，徹底裂解。
(3)加200μl溶液II，小心蓋上帽蓋，用力快速振蕩15sec，室溫放置3min。
(4)12000rpm，4℃，離心15min。
(5)小心吸取上層水相，轉(zhuǎn)移至一新的1.5ml eppendorf管中，加入500μl溶液III，混勻，室溫放置10min。
(6)13000rpm，4℃，離心10min，棄上清液。
(7)加1000μl溶液IV，充分振蕩混勻，12000rpm，4℃，離心5min。小心充上清液。管底部可見有乳白色膠樣RNA沉淀。
(8)小心打開管蓋，室溫自然干燥沉底的RNA。
(9)取11μl溶液IX置入已半干燥的沉底RNA，溶解RNA?？芍苯佑糜诜崔D(zhuǎn)錄或-70℃保存?zhèn)溆谩?br> 11.2.2反應(yīng)組份配制(1)取一支200μl光學(xué)PCR反應(yīng)管，反應(yīng)總體積為50μl，向反應(yīng)管中加入下列反應(yīng)物

(2)定量按需要對標(biāo)準品進行稀釋后制作標(biāo)準曲線，至少7個稀釋度。
(3)設(shè)立對照陽性對照和陰性對照各設(shè)2管。
11.2.3擴增按下列參數(shù)設(shè)置反應(yīng)條件

11.2.4結(jié)果分析和判定(1)結(jié)果分析條件設(shè)定直接讀取檢測結(jié)果?；€和閾值設(shè)定原則根據(jù)儀器噪聲情況進行調(diào)整，以閾值線剛好超過正常陰性樣品擴增曲線的最高點為準。
(2)質(zhì)控標(biāo)準——陰性對照無Ct值，并且無擴增曲線，一直為水平線。
——陽性對照的Ct值應(yīng)小于28.0，并出現(xiàn)典型的擴增曲線，2個陽性對照擴增曲線基本重合，特別是在Threshold(熒光臨界值)附近。否則，此次實驗視為無效。
——定量用的標(biāo)準品擴增曲線出現(xiàn)典型的擴增曲線，指數(shù)區(qū)較明顯，7個點具良好的線性范圍，平臺區(qū)匯于一起，相關(guān)系數(shù)在0.99以上。
(3)結(jié)果描述及判定——陰性Ct值應(yīng)大于30.0或無擴增曲線，表示樣品中無非洲馬瘟病毒。
——陽性Ct值小于等于28.0，且出現(xiàn)典型的擴增曲線，表示樣品中存在非洲馬瘟病毒。
——有效原則Ct值在28.0～30.0的樣本建議重做。重做結(jié)果Ct值大于30.0或無擴增曲線者為陰性，否則為陽性。
——定量根據(jù)標(biāo)準曲線作出定量。
權(quán)利要求
1.一種非洲馬瘟病毒熒光定量RT-PCR檢測試劑，其特征在于包含一對特異性引物和一條特異性熒光探針，擴增目標(biāo)片段長度為69bp，引物和探針序列為引物AHSV-VP7-F5’-TGTCAC CGTTGATGGAGTAAATG-3’AHSV-VP7-R5’-TTC ACT GGT GCA ATG GTA TTC C-3’探針(FAM)5’-TGC GGC TGG AGA TGT CGT CGC-3’(TAMRA)。
2.按照權(quán)利要求1所述的非洲馬瘟病毒熒光定量RT-PCR檢測試劑的制備方法，其特征在于由以下步驟組成(一)、選擇非洲馬瘟病毒特異而各型病毒間比較保守的VP7基因序列的保守片段為靶目標(biāo)，其基因片段的擴增目標(biāo)核苷酸序列為TGTCACCGTTGATGGAGTAAATGTTGCGGCTGGAGATGTCGTCGCATGGAATACCATTGCACCAGTGAA；(二)、根據(jù)VP7基因的特點和引物、探針設(shè)計的原則，設(shè)計引物和探針；(三)、引物和探針的合成采用β-乙腈亞磷酸胺化學(xué)合成法，使用全自動DNA合成儀進行OligoDNA的合成；(四)、探針合成同時進行兩端熒光標(biāo)記，探針5’端標(biāo)記的熒光報告基團是FAM，3’端標(biāo)記的熒光淬滅基團為TAMAR；(五)、將設(shè)計合成的多對引物和探針進行最佳配對篩選實驗后，初步確定候選引物和探針；(六)、經(jīng)過大量的反應(yīng)條件優(yōu)選、對比試驗和驗證試驗，從候選引物和探針中確定最佳的引物和探針，并經(jīng)過大量臨床樣品的檢測應(yīng)用評估，得到如權(quán)利要求1所述的擴增效率和特異性最好的引物和探針。
3.權(quán)利要求1所述的非洲馬瘟病毒熒光定量RT-PCR檢測試劑在制備AHSV熒光定量RT-PCR標(biāo)準化試劑盒中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種以非洲馬瘟病毒基因片段為靶目標(biāo)設(shè)計合成的生物制劑，尤其是能夠?qū)Ψ侵揆R瘟病毒進行檢測的試劑以及這種試劑的制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明系選擇非洲馬瘟病毒特異而各型病毒間比較保守的VP7基因片段為靶目標(biāo)，根據(jù)VP7基因的特點和引物、探針設(shè)計的原則，設(shè)計合成引物和探針。將設(shè)計的多對引物和探針進行最佳配對篩選實驗，并經(jīng)過大量的反應(yīng)條件優(yōu)選、對比試驗和驗證試驗，得到最適合的引物和探針。本發(fā)明所述的非洲馬瘟病毒熒光定量RT－PCR檢測試劑包含一對特異性引物和一條特異性熒光探針，擴增目標(biāo)片段長度為69bp。
文檔編號C12Q1/68GK1840699SQ20061001061
公開日2006年10月4日 申請日期2006年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月6日
發(fā)明者花群義, 周曉黎, 董俊, 楊云慶, 徐自忠, 肖榮海, 尹尚蓮 申請人:云南出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心