專利名稱：一種快速高效篩選嗜鹽菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用試管斜面培養(yǎng)法快速高效篩選嗜鹽菌的方法。
背景技術(shù)：
近年來，在許多以前被認為是生命禁區(qū)的區(qū)域，發(fā)現(xiàn)了各種各樣的新的生命形式。它們生存繁衍的場所恰恰是一些極端環(huán)境，如嗜鹽菌、嗜熱菌、嗜冷菌、嗜酸菌、嗜堿菌、嗜壓菌等，這些統(tǒng)稱為極端微生物。極端微生物具有獨特的基因類型，特殊的生理機制和特殊的代謝產(chǎn)物，作為地球上的邊緣生命現(xiàn)象，極端微生物頗為耐人尋味。它在生命起源、系統(tǒng)進化等方面將給人們許多重要的啟示，在生命行為的原理上也將拓展人們的概念。目前，極端微生物已成為國際研究的熱門領(lǐng)域，日本、美國及歐洲的許多國家都啟動了極端微生物的研究計劃，在揭示極端生命形式的奧秘，利用其特殊機制和特殊產(chǎn)物等方面共同努力并展開競爭，已形成了國際趨勢。
嗜鹽微生物通常生活在鹽湖、鹽堿地、海水、曬鹽池和鹽漬食物等高鹽環(huán)境中，屬于極端環(huán)境微生物。嗜鹽微生物具有獨特的基因類型，特殊的生理機制和特殊的代謝產(chǎn)物，因而嗜鹽微生物的研究將在開發(fā)新的微生物資源，在微生物生理、遺傳和分類乃至生命科學(xué)及其相關(guān)學(xué)科許多領(lǐng)域，如功能基因組學(xué)、生物電子器材等的研究、生物進化、生命起源研究等方面提供理論資料；嗜鹽微生物又具有極大的應(yīng)用價值，其特殊機制及特殊產(chǎn)物(如，視紫紅質(zhì)、相似性溶質(zhì)、酶、多聚物、脂質(zhì)體)，將使某些新的生物技術(shù)手段成為可能，它是奠定高效率低成本生物技術(shù)新工藝的基礎(chǔ)，嗜鹽微生物的應(yīng)用將改變整個生物技術(shù)的面貌。嗜鹽微生物在能源、食品、生物電子、制鹽、醫(yī)藥、培育轉(zhuǎn)基因植物以及環(huán)境整治等方面正顯示出巨大的開發(fā)潛力。
我國具有廣闊的鹽域環(huán)境和比較豐富的嗜鹽微生物資源，正等待我國科學(xué)工作者大力開發(fā)和探索，因此快速高效篩選嗜鹽菌菌種意義十分重大。
以往人們篩選嗜鹽菌都是采用平板分離法，但由于嗜鹽菌在平板上生長非常緩慢，而且長時間培養(yǎng)中的平板水分過度蒸發(fā)，致使菌體周圍鹽度大增，滲透壓增加，不利于菌體生長，進而使嗜鹽菌生長更加緩慢，給嗜鹽菌篩選造成困難，往往長時間得不到純化的嗜鹽菌菌株，篩選菌種的效率極低，使嗜鹽菌這一寶貴的生物資源不能迅速得到開發(fā)。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服傳統(tǒng)平板培養(yǎng)的嗜鹽菌生長速度緩慢的弊端，本發(fā)明的目的是提供一種快速高效篩選嗜鹽菌的方法。
本發(fā)明按照如下步驟篩選嗜鹽菌a、將采集的嗜鹽菌固體樣品1g或液體樣品1ml置于盛100mL液體培養(yǎng)基的300mL三角瓶中，在光照條件下33-37℃、120r/min搖床培養(yǎng)3-5d，富集菌體；b、然后用接菌環(huán)取一環(huán)富集培養(yǎng)液在制備好的大試管固體培養(yǎng)基斜面上連續(xù)劃曲線；c、然后在培養(yǎng)箱33-37℃下培養(yǎng)2-4d，獲得斜面單菌落；d、仔細觀察斜面，挑取具有嗜鹽菌典型特征的菌落再次在固體培養(yǎng)基試管斜面上連續(xù)劃線，培養(yǎng)，選取斜面單菌落再次在無菌斜面上連續(xù)劃線，如此反復(fù)三次進行分離純化，得到純培養(yǎng)嗜鹽菌菌株。
本發(fā)明采用大試管固體培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)法進行分離純化及保藏，并非傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)法進行分離純化。采用試管斜面分離純化和培養(yǎng)是因為斜面表面水分散失的速度非常緩慢，菌體生長的環(huán)境改變不大，因此菌體生長較快。一般比平板培養(yǎng)要快3-4倍。因此篩選嗜鹽菌菌株的效率也就大大提高。
本方法自始至終采用試管斜面培養(yǎng)技術(shù)，大大加快了嗜鹽菌的生長速度，提高效率3-4倍，克服了傳統(tǒng)平板培養(yǎng)的嗜鹽菌生長速度緩慢的弊端；另外，自菌株分離到菌株保藏?zé)o需改變培養(yǎng)基的組成，可一次性大量制備斜面供多次分離純化使用，減少了多次制備培養(yǎng)基的麻煩，由此也提高了嗜鹽菌篩選的效率。
具體實施例方式
具體實施方式
一本實施方式按照下述方法篩選嗜鹽菌菌株(1)采樣嗜鹽菌主要生長在鹽湖、鹽堿湖、鹽沼、死海、死谷、鹽場、曬鹽池、鹽堿地、海洋、沙漠、鹽漬物(如腌魚、腌菜、鹽獸皮等鹽制品上)以及企業(yè)(如制革、造紙、制奶酪、肉類、海產(chǎn)品加工、石油開采和加工、食品罐裝、石油發(fā)酵、染料、農(nóng)藥、醫(yī)藥中間體、氯丁橡膠、石油和天然氣的回收、印染、沿海地區(qū)海水利用后滲入城市下水道等)排放的高鹽廢水等高鹽環(huán)境中。根據(jù)嗜鹽菌研究的目的選擇采樣地點，然后按無菌操作采集水樣、泥樣或土樣等。
(2)培養(yǎng)基的配方(g/l)酸水解酪素5、酵母膏12、細菌蛋白胨6、檸檬酸三鈉3、KCl3、MgSO4·7H2O18、CaCl20.2、FeSO40.001，NaCl的量視需要添加(因為中度嗜鹽菌最適生長鹽濃度29～146g/l NaCl，極端嗜鹽菌最適生長鹽濃度146～304g/l，因此，分離中度嗜鹽菌時添加130g NaCl，分離極端嗜鹽菌時添加200g NaCl)，固體培養(yǎng)基加瓊脂18-20，PH調(diào)至7.5。
(3)步驟將采集的固體樣品1g(液體樣1ml)置于盛100mL液體培養(yǎng)基的300mL三角瓶中，在光照條件下33-35℃(分離極端嗜鹽菌35-37℃)120r/min搖床培養(yǎng)3-5d，富集菌體。然后用接菌環(huán)取一環(huán)富集培養(yǎng)液在預(yù)先制備好的大試管(30mm×200mm)固體培養(yǎng)基斜面上連續(xù)劃曲線，每環(huán)菌液連續(xù)劃5個斜面。斜面培養(yǎng)基的鹽度根據(jù)分離不同嗜鹽菌確定(分離極端嗜鹽菌時200g/l，中度嗜鹽菌時130g/l)。然后在培養(yǎng)箱33-37℃下培養(yǎng)2-4d，獲得斜面單菌落。仔細觀察，挑取具有典型特征的菌落再次在無菌斜面上連續(xù)劃線，培養(yǎng)，選取斜面單菌落，如此反復(fù)三次進行分離純化，便可得到純培養(yǎng)嗜鹽菌菌株。保存純菌株于斜面，低溫保藏。
具體實施例方式
二按照本發(fā)明的快速高效篩選嗜鹽菌的方法，從威海市的高鹽環(huán)境，僅用16d分離了68株菌，對這些菌株進行了形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、生理生化以及核酸特征的鑒定，所鑒定的菌株100％為嗜鹽菌株。傳統(tǒng)的方法分離純化一株嗜鹽菌一般需要40-70d(不同菌株有所不同)，此法則需12-20d，提高效率3-4倍。具體步驟如下(1)樣品來源樣品采自威海市路道口鹽場曬鹽池鹽水、鹽泥；威海市金泓化工有限公司排放的高鹽廢水、污泥；威海市金海灘海岸海水、海泥。
(2)培養(yǎng)基的配方(g/l)酸水解酪素5、酵母膏12、細菌蛋白胨6、檸檬酸三鈉3、KCl3、MgSO4·7H2O18、CaCl20.2、FeSO40.001，NaCl的量視需要添加(分離中度嗜鹽菌時添加130g NaCl，分離極端嗜鹽菌時添加200g NaCl)，固體培養(yǎng)基加瓊脂18-20，PH值調(diào)至7.5。
(3)富集培養(yǎng)將采集的固體樣品1g(液體樣1ml)置于盛100mL液體培養(yǎng)基的300mL三角瓶中，其中分離中度嗜鹽菌的三角瓶中添加130g/l NaCl，33-35℃120r/min搖床培養(yǎng)3d，富集菌體。分離極端嗜鹽菌的三角瓶中添加200g/l NaCl，在光照條件下35-37℃120r/min搖床培養(yǎng)5d，富集菌體。
(4)分離和純化用接菌環(huán)分別從兩種鹽度(130g/l NaCl；200g/l NaCl)的三角瓶取一環(huán)富集培養(yǎng)液在預(yù)先制備好的大試管(30mm×200mm)固體培養(yǎng)基斜面(分離極端嗜鹽菌的斜面含NaCl 200g/l，分離中度嗜鹽菌的斜面含NaCl130g/l)上劃曲線，每環(huán)菌液連續(xù)劃5個斜面。每個三角瓶共取10環(huán)。然后將劃線的斜面在培養(yǎng)箱培養(yǎng)。其中分離中度嗜鹽菌的斜面在35℃下培養(yǎng)2-3d，分離極端嗜鹽菌的斜面37℃下光照培養(yǎng)3-4d，獲得斜面單菌落。仔細觀察斜面，用接菌環(huán)挑取具有典型特征的菌落再次在無菌斜面上劃線，培養(yǎng)，選取斜面單菌落，如此反復(fù)三次進行分離純化，獲得純培養(yǎng)嗜鹽菌菌株。低溫保藏純菌株于斜面。
(5)初步鑒定通過富集培養(yǎng)與大試管斜面分離純化，挑取具有典型特征的單菌落，總共獲得68株細菌，對它們進行了形態(tài)特征、培養(yǎng)特征及耐鹽特性等的初步鑒定，確定這些菌株均為嗜鹽菌菌株。又通過生理生化和核酸特征的鑒定確定了18個菌株的種或?qū)佟?br> 權(quán)利要求
1.一種快速高效篩選嗜鹽菌的方法，其特征在于所述方法采用大試管固體培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)法進行分離純化，具體步驟為a、將采集的嗜鹽菌固體樣品1g或液體樣品1ml置于盛100mL液體培養(yǎng)基的300mL三角瓶中，在光照條件下33-37℃、120r/min搖床培養(yǎng)3-5d，富集菌體；b、然后用接菌環(huán)取一環(huán)富集培養(yǎng)液在預(yù)先制備好的試管固體培養(yǎng)基斜面上連續(xù)劃曲線；c、然后在培養(yǎng)箱33-37℃下培養(yǎng)2-4天，獲得斜面單菌落；d、仔細觀察，挑取具有嗜鹽菌典型特征的菌落再次在固體培養(yǎng)基斜面上連續(xù)劃線，培養(yǎng)，選取斜面單菌落再次在無菌斜面上連續(xù)劃線，如此反復(fù)三次進行分離純化，得到純培養(yǎng)嗜鹽菌菌株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速高效篩選嗜鹽菌的方法，其特征在于所述嗜鹽菌篩選為極端嗜鹽菌的篩選或中度嗜鹽菌的篩選。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速高效篩選嗜鹽菌的方法，其特征在于分離極端嗜鹽菌時，液體培養(yǎng)基的配方為酸水解酪素5g/l、酵母膏12g/l、細菌蛋白胨6g/l、檸檬酸三鈉3g/l、KCl3g/l、MgSO4·7H2O18g/l、CaCl20.2g/l、FeSO40.001g/l，NaCl200g/l。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速高效篩選嗜鹽菌的方法，其特征在于分離中度嗜鹽菌時，液體培養(yǎng)基的配方為酸水解酪素5g/l、酵母膏12g/l、細菌蛋白胨6g/l、檸檬酸三鈉3g/l、KCl3g/l、MgSO4·7H2O18g/l、CaCl20.2g/l、FeSO40.001g/l，NaCl130g/l。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速高效篩選嗜鹽菌的方法，其特征在于所述大試管的規(guī)格為30mm×200mm。
全文摘要
一種快速高效篩選嗜鹽菌的方法，涉及一種利用試管斜面培養(yǎng)法快速高效篩選嗜鹽菌的方法。為了克服傳統(tǒng)平板培養(yǎng)的嗜鹽菌生長速度緩慢的弊端，本發(fā)明按照如下步驟篩選嗜鹽菌a.將采集的嗜鹽菌樣品置于盛液體培養(yǎng)基的三角瓶中，在光照條件下?lián)u床培養(yǎng)，富集菌體；b.然后用接菌環(huán)取一環(huán)富集培養(yǎng)液在預(yù)先制備好的大試管固體培養(yǎng)基斜面上連續(xù)劃曲線；c.然后在培養(yǎng)箱培養(yǎng)，獲得斜面單菌落；d.仔細觀察斜面，挑取具有嗜鹽菌典型特征的菌落再次在大試管固體培養(yǎng)基斜面上連續(xù)劃線，培養(yǎng)，如此反復(fù)三次進行分離純化，得到純培養(yǎng)嗜鹽菌菌株。本方法自始至終采用大試管斜面培養(yǎng)技術(shù)，實現(xiàn)了快速、高效篩選嗜鹽菌的目的，提高效率3－4倍。
文檔編號C12N1/20GK1916160SQ20061001048
公開日2007年2月21日 申請日期2006年9月4日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月4日
發(fā)明者馬放, 李維國, 蘇俊峰, 王光玉 申請人:哈爾濱工業(yè)大學(xué)