專利名稱：一種高產(chǎn)嗜鹽脂肪酶的嗜鹽古生菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高產(chǎn)嗜鹽脂肪酶的極端嗜鹽菌菌株，屬生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
脂肪酶廣泛應用于洗滌劑、食品、醫(yī)藥、制革、紡織等領(lǐng)域。脂肪酶生物技術(shù)應用于 被污染環(huán)境的生物修復以及廢物處理是一個新興的領(lǐng)域。石油開采和煉制過程中產(chǎn)生的油 泄漏，油脂加工過程中產(chǎn)生的含脂廢物以及飲食業(yè)產(chǎn)生的廢物，都可以用不同來源的脂肪 酶進行有效的處理。脂肪酶在生物修復受污染環(huán)境中獲得了廣泛應用。一項歐洲專利報道 了利用脂肪酶抑制和去除冷卻水系統(tǒng)中的生物膜沉積物。隨著海水代用工程的發(fā)展，高鹽污水的生物處理成為研究的熱點，而普通微生物 及其酶類在高鹽條件下的應用受到限制，嗜鹽菌及其嗜鹽脂肪酶的應用將為高鹽污水處理 提供新的工具。極端嗜鹽菌是生長在高鹽極端環(huán)境的一類微生物，主要存在于鹽湖、鹽堿湖、鹽 沼、死海和鹽場等環(huán)境中。Baratti等人2006年首次報道了嗜鹽古生菌Natronococcus sp.產(chǎn)嗜鹽脂肪酶，酶活力達到50U/L。所以拓寬嗜鹽脂肪酶的來源，提高產(chǎn)酶能力以提高 其應用價值成為研究的熱點，

發(fā)明內(nèi)容
要解決的問題本發(fā)明的目的是提供一種可以在高鹽發(fā)酵培養(yǎng)基中大量積累脂肪酶的 Haloterrigena sp.屬嗜鹽古生菌菌株。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明人從來自鹽湖的菌種樣品中篩選獲得了一株嗜鹽脂肪酶產(chǎn)生菌，對 這株菌進行了發(fā)酵研究。脂肪酶產(chǎn)生菌篩選培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)基(g/L)=NaCl 200. 0 ；KCl 2. 0 ；MgSO4. 7H20 20. 0 ；FeSO4. 7H20 0. 04 ；酪 蛋白氨基酸7. 5 ；酵母粉10. 0 ；檸檬酸三鈉3. 0 ；橄欖油10. 0若丹明Bi. 0 ；pH 7. 5發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)=NaCl 200. 0 ；KCl 2. 0 ；MgSO4. 7H20 20. 0 ；FeSO4. 7H20 0. 04 ；酪 蛋白氨基酸7. 5 ；酵母粉10. 0 ；檸檬酸三鈉3. 0 ；橄欖油10. 0 ；pH 7. 5經(jīng)過平板初篩和搖瓶復篩獲得的嗜鹽古生菌在高鹽培養(yǎng)基上生長良好，菌落表面 光滑，邊緣整齊，紅色。革蘭氏染色陰性，鏡檢為桿狀。為鑒定其類型，分別對其進行了分子 鑒定和生理生化鑒定，該菌好氧或兼性厭氧，生長溫度范圍為30 60°C，最適生長溫度為 420C ；適宜生長pH范圍6. 0 9. 0，最適生長pH 7. 0 ；在0. 5 5. 2mol/L NaCl范圍內(nèi)均能 生長，最適生長濃度為3. 5mol/L。該菌僅能較好的利用蔗糖、果糖，淀粉水解試驗、明膠水解 試驗、酪素降解試驗、硝酸鹽還原試驗呈陽性；噴哚試驗、過氧化氫酶試驗、硫化氫試驗呈陰 性。該菌株16S rDNA全長序列為1581bp (GenBank登錄號EU557270)，與具有最高同源性的菌株 Haloterrigena thermotolerans strain IOR (GenBank 登錄號AY994199) 的相似度為 99%，結(jié)合形態(tài)特征和生理生化特性，將其鑒定為嗜鹽古生菌Haloterrigena sp.，命名為 Haloterrigena sp. Z4。該生物材料保藏信息該極端嗜鹽菌的分類名稱為Haloterrigena thermotolerans，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心簡稱中國 微生物菌種保藏中心，地址為北京市朝陽區(qū)大屯路(中科院微生物研究所)，保藏日期為 2008年4月21日，保藏編號CGMCC No2463。在發(fā)酵研究過程中發(fā)現(xiàn)，該菌可以以橄欖油、花生油、芝麻油、菜籽油、茶油為誘導 物產(chǎn)脂肪酶，添加橄欖油，42°C、pH 7. 5、妝(1濃度3.511101/1時產(chǎn)酶最高，達到22~ ml 。


圖1不同誘變物對產(chǎn)酶的影響圖2NaCl濃度、pH和溫度對產(chǎn)酶的影響有益效果提供了一種具有工業(yè)應用潛力的高產(chǎn)嗜鹽脂肪酶的優(yōu)良菌株。
具體實施例方式實施例1 嗜鹽脂肪酶高產(chǎn)菌株的篩選將菌種轉(zhuǎn)接活化，37°C培養(yǎng)，挑取單菌落并點種于橄欖油_若丹明B平板37°C培 養(yǎng)7 14天，挑選有熒光圈的菌落經(jīng)劃線分離后獲得單菌落，接種于斜面培養(yǎng)基保存并進 行搖瓶發(fā)酵復篩。實施例2 脂肪酶酶活的測定脂肪酶酶活的測定采用比色法，其原理是p-NPB在脂肪酶的催化下分解生成一 分子對硝基苯酚，對硝基苯酚在410nm處有最大吸收峰，通過測量反應液在410nm處的吸光 值，可定量測定P-NPB氧化量，從而計算出脂肪酶的酶活單位。測定方法參考文獻進行，具體如下溶液Α:176μ1 ρ-ΝΡΒ溶于IOmL異丙醇，4°C保存溶液B :pH 8. 0，50mM Tris-HCl 緩沖液使用時將溶液A與溶液B按1 :9的體積比混合，配成3. 6mL底物反應液，加入 400 μ 1粗酶液，37°C反應lOmin，在410nm測吸光值。脂肪酶1個酶活單位的定義每分鐘釋放1 μ mol對硝基苯酚所需的酶量。酶活(U/ml)= (A410-O. 1084) X 2. 5 + 0. 0511實施例3 :16s rDNA菌種鑒定取指數(shù)生長期新鮮菌液，離心收集菌體，按基因組抽提試劑盒提取基因組DNA。擴 增用引物為古生菌通用引物，如下P1 正向引物 5 ‘ -ATTCCGGTTGATCCTGC-3 ‘P2 反向引物 5 ‘ -AGGAGGTGATCCAGCCGCAG-3 ‘PCR反應采用50 μ 1的體系，具體如下IOXbuffer5ul
dNTPs (2. 5mM)P1(IOpM)P2(IOpM)Taq DNA 聚合酶(5U/ul)Template DNAddH20
4ul 2ul 2ul
0. 6ul Iul
35. 4ulPCR擴增條件95°C變性lmin，50°C退火45s，72°C延伸90s，50 μ L體系，30個循 環(huán)。PCR擴增產(chǎn)物的純化按上海生工生物技術(shù)公司的小量膠回收PCR產(chǎn)物純化試劑盒說明， 測序由上海生工生物技術(shù)公司完成。經(jīng)測序后獲得的16S rDNA序列，在GenBank中進行BLAST比對確定其種屬。
實施例4 發(fā)酵過程研究搖瓶培養(yǎng)方法斜面種子活化后接入種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)12h，按10%接種量接入發(fā) 酵培養(yǎng)基進行產(chǎn)酶培養(yǎng)。不同誘導物對產(chǎn)酶的影響種子培養(yǎng)基中添加不同濃度的誘導物，37°C搖瓶發(fā)酵 84h，測定發(fā)酵液脂肪酶活力，以不添加誘導物的做為對照。溫度對產(chǎn)酶的影響分別在30、37、42、50、60°C搖瓶發(fā)酵84h，測定發(fā)酵液脂肪酶 活力，繪制產(chǎn)酶曲線。初始pH對產(chǎn)酶的影響發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH分別為4、5、6、7、7. 5、8、9、10、11，37°C 搖瓶發(fā)酵84h，測定發(fā)酵液脂肪酶活力，繪制產(chǎn)酶曲線。鹽濃度對產(chǎn)酶的影響發(fā)酵培養(yǎng)基NaCl濃度分別為0. 5、1. 5、2. 5、3. 5、4. 5、 5. 2mol/L，37°C搖瓶發(fā)酵84h，測定發(fā)酵液脂肪酶活力，繪制產(chǎn)酶曲線。
權(quán)利要求
一種能高產(chǎn)嗜鹽脂肪酶的屬于Haloterrigena sp.屬的極端嗜鹽菌菌株。
2.如權(quán)利要求1的菌株，其具有以下特征a.可以在0.5 5. 2mol/L NaCl濃度培養(yǎng)基中生長。b.在以橄欖油為誘導物的高鹽發(fā)酵培養(yǎng)基中大量積累嗜鹽脂肪酶。c.所產(chǎn)脂肪酶具有顯著的嗜鹽特點，在0.5 5. 2mol/L NaCl環(huán)境中均保持高活性。
3.如權(quán)利要求1的菌株，其是能產(chǎn)嗜鹽脂肪酶的Haloterrigenasp.屬的極端嗜鹽菌。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種能產(chǎn)嗜鹽脂肪酶的屬于Haloterrigena sp.屬的紅色嗜鹽古生菌菌株。本發(fā)明的菌株是從內(nèi)蒙古錫林浩特地區(qū)鹽湖中篩選得到的。發(fā)酵研究發(fā)現(xiàn)以1％橄欖油為誘導物該紅色菌株的產(chǎn)脂肪酶活力達到25U/ml。
文檔編號C12N1/20GK101892169SQ20081023585
公開日2010年11月24日 申請日期2008年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月28日
發(fā)明者張曉梅, 張萌, 竇文芳, 許正宏, 許泓瑜 申請人:江南大學