專利名稱：聯(lián)合免疫基因療法和化學(xué)療法用于治療癌癥和過度增生性疾病的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于治療哺乳動物癌癥或過度增生性疾病的包含核酸、基 因遞送聚合物和至少一種附加的化學(xué)治療藥的藥物組合物。本發(fā)明還涉及 治療哺乳動物癌癥或過度增生性疾病的方法，其包括通過胖瘤內(nèi)、皿內(nèi) 或全身注射將癌細(xì)胞或任何其它的過度增生性細(xì)胞與所述組合物接觸。
背景技術(shù)：
癌癥是世界多個地方最常見的死亡原因并且每年全球診斷出超過二百
五十萬個癌癥病例。我們對癌癥分子生物學(xué)理解的最新ii^表明癌癥是因 受累的細(xì)胞異常增殖所致的遺傳性疾病。癌癥治療家目前專注于這樣的治 療策略，其涉及允許外源遞送的基因在肺瘤環(huán)境中表達(dá)的攜帶遺傳信息的 大分子，而非治療性蛋白質(zhì)本身。據(jù)信基因療法以多種對于常規(guī)方法而言 不可能的方式為癌癥患者提供治療益處.常規(guī)的小分子藥物通常通過與細(xì) 胞耙標(biāo)非特異性iM目互作用發(fā)揮功能，產(chǎn)生不想要的副作用并且不治療疾 病的根本原因。過去數(shù)年已引進(jìn)的蛋白質(zhì)藥物具有其固有局限性，原因在
于它們iS^降解和需要常常導(dǎo)致不想要的副作用的高劑量?；虔煼ㄔ趩?次注射后使用身體自身的細(xì)胞裝置以在特定組織和細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生持續(xù)治療性 水平的蛋白質(zhì)，因此提供了患者愿意配合的安全和有效的治療方法。
常用的癌癥基因療法策略包括通過l)局部注射、2)局部-區(qū)域注射或3) 全身注射實現(xiàn)的免疫療法、細(xì)胞消除(cell ablation )和札血管生成。癌癥 免疫療法是通過刺激抗癌細(xì)胞的免疫系統(tǒng)而對抗癌癥的有效方法。免疫細(xì) 胞因子通過使免疫細(xì)胞激活、成熟和分化在宿主免^應(yīng)發(fā)展中發(fā)揮重要
作用。已經(jīng)針對人的多種癌癥和癌癥的動物模型測試了數(shù)種細(xì)胞因子。見
Hum Gene Ther" 1998，第9巻，2223; Gene Ther. 1999，第6巻，833; Cancer Gene Ther. 2000，第7巻，1156; J. Control Rel. 2003，第87巻，177;和Cancer Res.， 2002,第62巻，4023。白細(xì)胞介素12 (IL-12)是在人癌癥治療中顯示巨 大前景的免疫刺激性細(xì)胞因子。見The Oncologist, 1996，第l巻，88。 IL-12 是由兩條共價連接的鏈p35和p40組成的70 kD異二聚體。IL-12的生物 學(xué)效應(yīng)包括通過靜息和激活的CD4+ T細(xì)胞、CD8+ T細(xì)胞以及天然殺傷 (NK)細(xì)胞誘導(dǎo)IFN々的產(chǎn)生。IL-12還增強(qiáng)激活的T細(xì)胞和NK細(xì)胞的
胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)反應(yīng)。
在動物模型中，已經(jīng)證實重組IL-12誘導(dǎo)明顯的T細(xì)胞介導(dǎo)性抗肺瘤 效應(yīng)，引起已建立的肺瘤退化，1^是全身性免疫記憶，見The Oncologist, 1996，第1巻，88。然而，重組IL-12的全身施用已經(jīng)在數(shù)個實驗性試驗和 初步人類試驗中引起劑量限制性毒性。見Lab Invest., 1994，第71巻，862; Science，1995，第270巻，908; / /"tef/eiwi 0;tofo"e及d， 1995，第14巻，335。 在最近的人臨床試驗中也觀察到伴I^M內(nèi)施用重組IL-12的劑量限制性 毒性。Clin. Cancer Res.， 2002，第8巻，3686?？稍诜瘟鑫恢镁植刻峁┲委?水平IL-12的基因遞送方法可以具有產(chǎn)生抗癌反應(yīng)而不引起全身毒性的優(yōu) 點。
病毒性和非病毒性基因遞送系統(tǒng)均已經(jīng)在癌癥動物模型中用于IL-12 基因遞送。病毒性方法因?qū)Χ拘該?dān)心具有嚴(yán)重的實用局限性，對毒性的擔(dān) 心主要因為增加的癌癥發(fā)生率和宿主系統(tǒng)對病毒抗原的強(qiáng)烈免疫反應(yīng)。因 非病毒性基因遞送系統(tǒng)具有較弱的毒性，故對其開發(fā)存在巨大興趣。已經(jīng) 證實使用非病毒性基因遞送系統(tǒng)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)用于遞送IL-12以 治療腎癌(Renca)和結(jié)腸細(xì)胞癌(CT26)。見Gene Ther" 1999，第6巻，833。 當(dāng)腫瘤經(jīng)受該基因治療時，腫瘤表現(xiàn)出IL-12蛋白質(zhì)療法的全部特征，例 如增加的NK細(xì)胞、CD4和CD8 T細(xì)胞浸潤、伴隨增加主要組織相容性復(fù) 合體(MHC)I類分子的表達(dá)。IL-12基因遞送可良好地得到耐受并且對同時
攜帶Renca和CT26腫瘤的動物高度有效。排斥腫瘤的小鼠同樣從隨后的 攻擊中受到保護(hù)，這提示存在長效的全身免疫。官能化的且毒性更^f氐的水 溶性脂質(zhì)聚合物(WSLP)已經(jīng)測試用于遞送IL-12基因至CT26結(jié)腸癌腫 瘤。見Mahato等，Mol. Ther.， 2001,第4巻，130。 IL-12質(zhì)粒(pIL-12)治療 以及WSLP (pIL-12/WSLP)治療比棵DNA產(chǎn)生更高水平的腫瘤內(nèi)基因表 達(dá)。
此外，細(xì)胞因子IL-12產(chǎn)生的次級效應(yīng)，即IFN々和氧化氮(NO)水平 在WSLP治療的腫瘤中與棵DNA相比較高。單次注射pIL-12/WSLP復(fù)合 體對腫瘤生長和動物存活產(chǎn)生次優(yōu)效應(yīng)，而重復(fù)遞送產(chǎn)生更好的功效，這 表明該系統(tǒng)遞送不充分。J. Control Release 2003，第87巻，177。類似地， 腫瘤內(nèi)注射在另 一種聚合物載體PAGA中的IL-12質(zhì)粒僅產(chǎn)生CT26肺瘤 的部分抑制。見Gene Ther.， 2002，第9巻，1075,這些結(jié)果確定需要更有效 的遞送系統(tǒng)。盡管在早期的臨床前試驗中它們的效力不足，聚合物基因栽
的基因遞送系統(tǒng):
已經(jīng)廣泛認(rèn)識到采用單一治療策略對抗癌癥通常因該疾病的多因素性 質(zhì)而無效。組合多于一種藥物以使抗癌反應(yīng)最大化目前逐漸得到廣泛應(yīng)用。 見Gene Ther.， 2000，第11巻，1852.已經(jīng)證實IL-12基因療法和IFN-a基 因療法間存在協(xié)同關(guān)系。以這兩種基因共治療Renca肺瘤引起100%肺瘤 排斥，其比通過單獨用IL-12(58。/。)或IFN-o(25。/。)的治療取得的肺瘤排斥 >^應(yīng)更高。類似地，用^i合基因療法治療CT26肺瘤顯示50。/。的排斥率， 其分別比從IL-12和IFN-a單獨治療中取得的17%和0%排斥率高.通過 聯(lián)合療法治療的腫瘤當(dāng)與經(jīng)單獨的基因療法處理的肺瘤相比顯示對肺瘤增 加的NK細(xì)胞和CD8 T細(xì)胞浸潤。將甲基鳥苷-DNA-甲基轉(zhuǎn)移酶(MGMT) 基因轉(zhuǎn)移至干細(xì)胞，同時進(jìn)行化學(xué)療法，保護(hù)了正常細(xì)胞免受化學(xué)療法作 用并減少化學(xué)療法的全身毒性。Nature Reviews Cancer 2004,第4巻，296。
此外，聯(lián)合基因療法增加肺瘤中抗原呈遞細(xì)胞(APC)上的CD40分 子數(shù)至高于以單獨治療所取得的水平。APC上CD40增加的上調(diào)與抗原呈
遞更高的活化狀態(tài)相關(guān)。見Nature， 1998，第393巻，480; Nature, 1998，第393 巻，474和Nature, 1998，第393巻，478。類似的增加在mRNA水平上對趨 化因子IP-10和TCA-3觀察到。聯(lián):合基因療法因此協(xié)同性地增強(qiáng)抗腫瘤免 疫并且發(fā)現(xiàn)該效應(yīng)在腫瘤再攻擊研究中是長效的。類似的聯(lián)合基因療法研 究已經(jīng)由其它小組報道。見Laryngoscope2001，第111巻，815。建立的肺 瘤分別以pIFN-o/PVP、 pIL-2/脂類或pIL-12/PVP單獨處理或其組合處理。 與其它兩種療法相比，pIFN-o/PVP組合在與單獨治療相比時顯著地提高 抗腫瘤效應(yīng)。在另一項使用相同腫瘤模型的研究中，已經(jīng)證實用 pIL-12/PVP和pIL-2/脂類的聯(lián)合治療與單獨治療相比產(chǎn)生顯著更高的抗 肺瘤效應(yīng)。見Arch.Otolaryngol Head Neck Surg， 2001，第127巻，1319。
在另 一項研究中，腫瘤內(nèi)注射線型聚氮丙淀(PEI)與抗癌基因和促生長 素抑制素受體亞型2(sst2)的聚復(fù)合體(polyplexes)產(chǎn)生對胰腫瘤的生長和轉(zhuǎn) 移至肺的顯著抑制。Curr Opin Biotechnol， 2002，第13巻，128。腫瘤中PEI 介導(dǎo)性遞送sst2引起凋亡增加以及活化胱天蛋白酶-3和聚(ADP-核糖)途 徑。持續(xù)遞送DNA/PEI的聚復(fù)合體至實體瘤產(chǎn)生比大丸劑遞送所實現(xiàn)的 更高表達(dá)。Gene Ther.， 1999，第10巻，1659。樹狀聚合物(dendrimers)通過 Fas-L和HSV-I胸苷激酶的腫瘤內(nèi)基因轉(zhuǎn)移分別用于抑制胰癌和肝細(xì)胞 癌。見Gene Ther.， 2003,第10巻，434和Gene Ther.， 2000，第7巻，53。
使用細(xì)胞毒藥物和細(xì)胞因子的化學(xué)-免疫療法提供用于改善肺瘤性疾 病治療的新方法.已經(jīng)在鼠L1210白血病模型中研究了 IL-12蛋白質(zhì)與環(huán) 磷跣胺、紫杉醇、順鉑或阿霉素組合的治療功效。見Int. J. Cancer, 1998，第 77巻,720。單獨以IL-12或上述化學(xué)治療劑之一治療L1210白血病產(chǎn)生中 度抗白血病效果。IL-12與環(huán)磷酰胺或紫杉醇的組合與單獨給予這些藥物 相比不引起抗白血病效果增加。然而。IL-12與阿霉素的組合增加抗白血 病效果，與此同時IL-12與順鉑的組合具有中度的增強(qiáng)效果。
然而在鼠黑素瘤MmB16模型中，IL-12 +紫杉醇的組合比單獨治療 更有效。Cancer Lett, 1999，第147巻，67。也已經(jīng)檢驗了與亞德里亞霉素、 環(huán)磷酰胺或5-FU組合的IL-12蛋白質(zhì)在MB-49膀胱癌和B16黑素瘤中的
抗腫瘤功效。見，Clin. Cancer Res.， 1997，第3巻，1661。與化學(xué)療法組合， IL-12施用增加抗腫瘤活性，而不引起額外的毒性。在通過IL-12或環(huán)磷酰 胺難以治療的小鼠肉瘤MCA207中，重組IL-12與環(huán)磷酰胺的組合比單獨 治療產(chǎn)生更好的抗腫瘤反應(yīng)。J. Immunol, 1998，第160巻，1369。在小鼠 乳腺瘤中，包含靜脈內(nèi)紫杉醇化學(xué)療法和腫瘤內(nèi)IL-12基因療法 (IL-12/WSLP)的聯(lián)合療法比單獨治療更有效。見Molecular Therapy, 2004， 第9巻，829。聯(lián)合療法的益處取決于紫杉醇的遞送栽體。當(dāng)紫杉醇制劑在 聚合物制劑中時，觀察到紫杉醇和IL-12基因療法間的協(xié)同性相互作用。 作為比較，與一種廣泛用于癌癥治療的紫杉醇制劑_ Cremophor EL(Taxof)的組合沒有協(xié)同性，i^明觀察到的益處是制劑特異性的。
為從涉瓦基因療法的聯(lián)合方法中實現(xiàn)想要的結(jié)果，重要的是選擇適宜 的基因遞送系統(tǒng)。在前述的組合實驗中所用的基因遞送系統(tǒng)(Molecular Therapy，2004，第9巻，829)是水溶性脂質(zhì)聚合物PEI-膽固醇(WSLP).在本 發(fā)明中，我們描述結(jié)構(gòu)上區(qū)別于WSLP的一類新聚合物栽體(PEG-PEI-膽 固醇)，因為它含有設(shè)計旨在改善基因遞送系統(tǒng)的藥物代謝動力學(xué)、安全性 和功效的親水聚合物和與膜相互作用的配體(例如，膽固醇)，以單獨或 與化學(xué)治療劑組*進(jìn)抗癌基因的轉(zhuǎn)染活性的多種幾何構(gòu)型排布。腫瘤組 織中與WSLP相比的PPC的轉(zhuǎn)染活性優(yōu)勢在

圖1和圖2中顯示。
臨床上已經(jīng)檢驗了兩種化學(xué)治療劑的組合或者化學(xué)治療劑與細(xì)胞因子 的組合。雖然這些組合已經(jīng)產(chǎn)生更明顯的腫瘤退化，但是長期存活的益處 微不足道并且細(xì)胞毒性已經(jīng)成為問題.這歸咎于伴隨化學(xué)療法和重組蛋白 療法的固有全身毒性。必須設(shè)計新的和更有效的聯(lián)合方法以改善未來的癌
癥治療。在本發(fā)明中，我們描述了用于治療癌癥的新的聯(lián)合方法，包括以 聚合物載體遞送的基于核酸的治療法和至少 一種化學(xué)治療劑。
發(fā)明簡述
本發(fā)明提供用于癌癥治療的包含核酸、基因遞送聚合物和至少一種藥 劑的藥物組合物。此外，本發(fā)明還提供用于通過體內(nèi)(/w v/vo)施用包含
核酸、基因遞送聚合物和至少一種藥劑的藥物組合物，抑制哺乳動物中腫 瘤細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移的方法。
核^A選自質(zhì)粒DNA、 siRNA、有義RNA、反義RNA和核酶中的一 員。質(zhì)粒DNA是含有如此DNA序列的基因表達(dá)系統(tǒng)，該DNA序列編碼 選自白細(xì)胞介素-2、白細(xì)胞介素-4、白細(xì)胞介素-7、白細(xì)胞介素-12、白細(xì) 胞介素-15、干擾素-a、干擾素W、干擾素々、集落刺激因子、粒細(xì)胞-巨噬 細(xì)胞刺激因子、抗血管生成劑、肺瘤抑制基因、胸苷激酶、eNOS、 iNOS、 p53、 p16、 TNF-a、 Fas-配體、突變的癌基因、腫瘤抗原、病毒抗原或細(xì) 菌抗原的抗癌或抗增殖蛋白.質(zhì)粒DNA還可以編碼shRNA分子，所述 shRNA分子設(shè)計為旨在抑制參與肺瘤細(xì)胞或其它過度增生性細(xì)胞生長或 維持的蛋白質(zhì)。質(zhì)粒DNA可以同時編碼治療性蛋白質(zhì)和一種或多種 shRNA。此外，所述組合物的核酸還可以是質(zhì)粒DNA與包括有義RNA、 反義RNA或核酶的合成RNA的混合物。
基因遞送聚合物是陽離子型聚合物或非縮合型聚合物。陽離子型聚合 物選自聚賴氨酸、聚氮丙啶、聚氮丙咬(PEI)的官能化衍生物、聚甲基吖丙 啶、"lli^糖苷-聚胺、二脫氧-二氨基-b-環(huán)糊精、精胺和亞精胺。適用于本 發(fā)明的陽離子型基因遞送聚合物的一個實例是包含PEI主鏈、脂類和親水 聚合物間隔區(qū)的PEI衍生物，其中脂類直接地結(jié)合至聚氮丙啶主鏈或共價 地結(jié)合至聚乙二醇間隔區(qū)，該間隔區(qū)I^通過可生物相容的鍵結(jié)合至PEI。 本發(fā)明的陽離子型基因遞送聚合物還可以包含把向部分，包括抗體或抗體 片段、細(xì)胞受體、生長因子受體、細(xì)胞因子受體、葉酸、轉(zhuǎn)鐵蛋白、表皮 生長因子(EGF)、胰島素、脫唾液酸血清類黏蛋白、甘露糖-6^酸(單核細(xì) 胞)、甘露糖(巨噬細(xì)胞、某些B細(xì)胞)、LewisX和唾液酰LewisX(內(nèi)皮細(xì)胞)、 N-乙?；樘前?T細(xì)胞)、半乳糖(結(jié)腸癌細(xì)胞)和凝血調(diào)節(jié)蛋白(小鼠肺內(nèi) 皮細(xì)胞)、融合劑如多粘菌素B和血凝素HA2、抗溶酶體劑、核定位信號 (NLS)如T-抗原等。另一種基因遞送聚合物是非縮合型聚合物，選自聚乙 烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚(丙交酯共乙交酯)(PLGA)以及PLGA和PEG 的三單元共聚物.基因遞送聚合物還可以是非縮合型聚合物。此類非縮合
型聚合物包括聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、泊洛沙姆、聚谷氨酸、明膠、 聚磷酸酯、絲-彈性蛋白樣水凝膠、瓊脂糖水凝膠、脂微管、聚(丙交酯共 乙交酯)以及聚乙二醇連接的聚(丙交酯共乙交酯)。
在前述組合物的一個實施方案中，藥劑是選自紫杉烷類、鉑、阿霉素、
環(huán)磷酰胺、托泊替康、卡莫司汀(BCNU)或其組合的化學(xué)治療藥。尤其優(yōu)選 紫杉醇、卡鉑、托泊替康、吉西他濱和其任意組合。
在前述組合物的另一個實施方案中，藥劑是選自CD20抗體、 HER2/neu抗體、抗VEGF抗體、表皮生長因子受體抗體和其放射性同位 素綴合物的抗癌抗體。
本發(fā)明還提供用于通過腫瘤內(nèi)、皿內(nèi)、氣管內(nèi)、顱內(nèi)或全身施用包 含核酸、核酸遞送聚合物和至少一種附加的化學(xué)治療藥的藥物組合物治療 哺乳動物癌癥的方法。哺乳動物癌癥選自卵巢、乳腺、腦、頭和頸、肝、 肺、前列腺、腎、結(jié)腸、胰、甲狀腺、膀胱、腹腔、胸腔和皮膚的原發(fā)性 或轉(zhuǎn)移性腫瘤。核酸和基因遞送聚合物在藥劑施用之前或之后通過腫瘤內(nèi)、 皿內(nèi)、氣管內(nèi)或口服或全身施用加以施用.例如，在某些情況下，優(yōu)選 在藥劑(例如，化學(xué)療法)之前施用核酸(例如，pIL-12 DNA/聚合物)，因為 這將有效地增強(qiáng)瘤對藥劑的敏感性并促進(jìn)抗癌反應(yīng)，在另一情況下，優(yōu)選 在基因遞送(例如，pIL-12/PPC)之前給予藥劑(例如，化學(xué)療法)以允許藥劑 引起腫瘤破壞以及釋放待由治療性基因(例如，pIL-12/聚合物)稍后利用的 腫瘤抗原，用于^JL針對目的癌的高度特異且強(qiáng)烈的治療反應(yīng)。
以所述藥物組合物(核酸加上基因遞送聚合物和一種或多種化學(xué)治療 劑)治療腫瘤導(dǎo)致腫瘤縮小和壽命延長。根據(jù)本發(fā)明方法的基因療法(核酸 和基因遞送聚合物)與化學(xué)療法(化學(xué)治療劑)的聯(lián)合產(chǎn)生相加效果和/或協(xié) 同效果。將本發(fā)明方法的功效定義為，但不限于腫瘤大小的縮減或腫瘤密 度的減少、淋巴細(xì)胞計數(shù)的增加或中性細(xì)胞計數(shù)的增加或存活的改善或以 上全部。此外，根據(jù)本發(fā)明方法的基因療法(核酸和基因遞送聚合物)與化 學(xué)療法(化學(xué)治療劑)的聯(lián)合降低化學(xué)治療劑毒性并逆轉(zhuǎn)腫瘤對化學(xué)療法的 抗性。毒性在本文中定義為對臨店J見察到的治療相關(guān)的任意不利效果，包
括但不限于異常血液學(xué)或血清化學(xué)或器官毒性。此外，根據(jù)本發(fā)明方法的 基因療法(核酸和基因遞送聚合物)與次優(yōu)劑量的化學(xué)療法(化學(xué)治療劑)的 組合增強(qiáng)抗癌效果至如此水平，其等于或高于以優(yōu)化劑量的化學(xué)治療劑所 取得的水平，但具有更少毒性。
在所述的聯(lián)合療法中，核^A選自質(zhì)粒DNA、 siRNA、有義RNA、 反義RNA和核酶中的一員。核酸可以是含有如此DNA序列的基于質(zhì)粒的 基因表達(dá)系統(tǒng)，該DNA序列編碼選自白細(xì)胞介素-2、白細(xì)胞介素-4、白細(xì) 胞介素-7、白細(xì)胞介素-12、白細(xì)胞介素-15、干擾素-a、干擾素-j8、干擾素 -7、集落刺激因子、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞刺激因子、抗血管生成劑、腫瘤抑制 基因、胸苷激酶、eNOS、 iNOS、 p53、 p16、 TNF-of、 Fas-配體、突變的 癌基因、腫瘤抗原、病毒抗原或細(xì)菌抗原的抗癌蛋白質(zhì)或抗增殖蛋白質(zhì)。 質(zhì)粒DNA還可以編碼shRNA分子，所述shRNA分子設(shè)計為旨在抑制參 與腫瘤細(xì)胞或其它過度增生性細(xì)胞生長或維持的蛋白質(zhì)。質(zhì)粒DNA可以 同時編碼治療性蛋白質(zhì)和一種或多種shRNA.此外，所述組合物的核酸還 可以M粒DNA與合成RNA的混合物?；蜻f送聚合物是陽離子型聚合 物或非縮合型聚合物。陽離子型聚合物選自聚賴氨酸、聚氮丙啶、聚氮丙 咬(PEI)的官能化衍生物、聚甲基吖丙啶、^J4t苷-聚胺、二脫氧-二M -b-環(huán)糊精、精胺和亞精胺。適用于本發(fā)明的陽離子型基因遞送聚合物的一 個實例是包含聚氮丙咬(PEI)主鏈、脂類和聚乙二醇間隔區(qū)的聚氮丙咬衍生 物，其中脂類直接地結(jié)合至聚氮丙啶主鏈或共價地結(jié)合至聚乙二醇間隔區(qū)， 該間隔區(qū)隨后通過可生物相容的鍵結(jié)合至PEI。本發(fā)明的陽離子型基因遞 送聚合物還可以包含把向部分，包括抗體或抗體片段、細(xì)胞受體、生長因 子受體、細(xì)胞因子受體、葉酸、轉(zhuǎn)鐵蛋白、表皮生長因子(EGF)、胰島素、 脫唾液酸血清類黏蛋白、甘露糖-6^酸(單核細(xì)胞)、甘露糖(巨噬細(xì)胞、某 些B細(xì)胞)、LewisX和唾液酰LewisX(內(nèi)皮細(xì)胞)、N-乙?；樘前?T細(xì)胞)、 半乳糖(結(jié)腸癌細(xì)胞)和凝血調(diào)節(jié)蛋白(小鼠肺內(nèi)皮細(xì)胞)、融合劑如多粘菌素 B和血凝素HA2、抗溶酶體劑、核定位信號(NLS)如T-抗原等?；蜻f送 聚合物是非縮合型聚合物，其選自聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚(丙交酯
共乙交酯)(PLGA)以及PLGA和PEG的三單元共聚物?；瘜W(xué)治療藥是選 自紫杉烷類、鉑、阿霉素、環(huán)磷酰胺、托泊替康、卡莫司汀(BCNU)或其組 合的成員。尤其優(yōu)選紫杉醇、卡鉑、托泊替康、吉西他濱和其任意組合。
在前述方法的另一個實施方案中，藥劑是選自CD20抗體、HER2/neu 抗體、抗VEGF抗體、表皮生長因子受體抗體和其放射性同位素綴合物的 抗癌抗體。
本發(fā)明還提供通過肺瘤內(nèi)、皿內(nèi)、氣管內(nèi)、顱內(nèi)或全身施用包含基 于質(zhì)粒的基因表達(dá)系統(tǒng)和基因遞送聚合物的藥物組合物用于治療哺乳動物 癌癥或過度增生性疾病的方法，其中所述藥物組合物不含化學(xué)治療藥。哺 乳動物癌癥選自卵巢、乳腺、腦、頭和頸、肝、肺、前列腺、腎、結(jié)腸、 胰、甲狀腺、膀胱、腹腔、胸腔和皮膚的原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性肺瘤。核^& 于質(zhì)粒的含有如此DNA序列的基因表達(dá)系統(tǒng)，該DNA序列編碼選自白細(xì) 胞介素-2、白細(xì)胞介素-4、白細(xì)胞介素-7、白細(xì)胞介素-12、白細(xì)胞介素-15、 干擾素-a、干擾素-/3、干擾素-7、集落刺激因子、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞刺激因 子、抗血管生成劑、胂瘤抑制基因、胸苷激酶、eNOS、 iNOS、 p53、 p16、 TNF-a、 Fas-配體、突變的癌基因、腫瘤抗原、病毒抗原或細(xì)菌抗原的抗 癌或抗增殖蛋白。質(zhì)粒DNA還可以編碼shRNA分子，所述shRNA分子 設(shè)計為旨在抑制參與胂瘤細(xì)胞或其它過度增生性細(xì)胞生長或維持的蛋白 質(zhì)。質(zhì)粒DNA可以同時編碼治療性蛋白質(zhì)和一種或多種shRNA。此外， 所述組合物的核酸還可以是質(zhì)粒DNA與合成RNA的混合物。
陽離子型聚合物選自聚氮丙啶、聚氮丙咬(PEI)的官能化衍生物、聚甲基吖 丙啶、^J^苷-聚胺、二脫氧-二M-b-環(huán)糊精、精胺和亞精胺。適用于 本發(fā)明的陽離子型基因遞送聚合物的一個實例是包含聚氮丙啶(PEI)主鏈、 脂類和聚乙二醇間隔區(qū)的聚氮丙咬衍生物，其中脂類直接地結(jié)合至聚氮丙 啶主鏈或共價地結(jié)合至聚乙二醇間隔區(qū)，該間隔區(qū)隨后通過生物可容納的 鍵結(jié)合至PEI。本發(fā)明的陽離子型基因遞送聚合物還可以包含耙向部分， 包括抗體或抗體片段、細(xì)胞受體、生長因子受體、細(xì)胞因子受體、葉酸、
轉(zhuǎn)鐵蛋白、表皮生長因子(EGF)、胰島素、脫唾液酸血清類黏蛋白、甘露 糖-6"#酸(單核細(xì)胞)、甘露糖(巨噬細(xì)胞、某些B細(xì)胞)、Lewisx和唾液酰 Lewis"內(nèi)皮細(xì)胞)、N-乙?；樘前?T細(xì)胞)、半乳糖(結(jié)腸癌細(xì)胞)和凝血 調(diào)節(jié)蛋白(小鼠肺內(nèi)皮細(xì)胞)、融合劑如多粘菌素B和血凝素HA2、抗溶酶 體劑、核定位信號(NLS)如T-抗原等。另一種基因遞送聚合物是非縮合型 聚合物，選自聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚(丙交酯共乙交酯)(PLGA)以 及PLGA和PEG的三單元共聚物。以所述藥物組合物(核酸加上基因遞送 聚合物以及一種或多種化學(xué)治療劑)治療腫瘤導(dǎo)致肺瘤縮減和壽命延長.
附圖簡述
圖1顯示基因遞送聚合物PEG-PEI-膽固醇(PPC)和水溶性脂質(zhì)聚合物 PEI-Chol (WSLP)之間在基因轉(zhuǎn)移功效上的差異。將受試聚合物與安光素 酶質(zhì)粒復(fù)合并腫瘤內(nèi)施用至4T1乳腺腫瘤。此后24小時在腫瘤組織內(nèi)定 量螢光素酶表達(dá)。
圖2顯示增加PE&PEI-Cho1中的PEG:PEI比率對基因通過肺瘤內(nèi)施 用質(zhì)粒/PPC復(fù)合體轉(zhuǎn)移至4Tl實體瘤的功效的影響。將以不同PEG:PEI 比率合成的PPC聚合物與安光素酶質(zhì)粒復(fù)合并胂瘤內(nèi)施用至4T1乳腺肺 瘤。24小時后在腫瘤組織內(nèi)定量安光素酶表達(dá)。
圖3顯示IL-12基因通過肺瘤內(nèi)施用(A)pmlL-12/PPC復(fù)合體轉(zhuǎn)移至乳 腺實體瘤和通過腹膜內(nèi)注射(B)pmlL-12/PPC復(fù)合體轉(zhuǎn)移至腹膜彌散性卵 巢腫瘤(ID8腫瘤)。將PPC與小鼠IL-12基因表達(dá)質(zhì)粒(pmIL-12)復(fù)合 并腫瘤內(nèi)施用至4T1乳腺肺瘤以;SjaM內(nèi)施用至攜帶ID8皿腫瘤的小 鼠。IL-12水平24小時后在4T1腫瘤內(nèi)以及在1、 2、 3和7日后在攜帶ID8 腫瘤的動物的腹水內(nèi)定量。
圖4顯示J^內(nèi)施用pmIL-12/PPC后IFN々產(chǎn)生的時間過程。PPC 與小鼠IL-12基因表狄粒(pmlL-12)復(fù)合并^M內(nèi)施用至攜帶ID8 ,腫 瘤的小鼠。IFN-y水平在1、 2、 3和7日后在腹水內(nèi)定量。
圖5顯示通過,內(nèi)施用pmlL-12/PPC復(fù)合體對,彌散性卵巢肺瘤
的劑量依賴性抑制。以多種DNA劑量制備的pmIL-12/PPC復(fù)合體,內(nèi) 施用至攜帶劇度彌散性ID8肺瘤的小鼠。對動物定期稱重以評估治療對腫 瘤載量的影響，并記錄存活數(shù)據(jù)。
圖6顯示通過腹膜內(nèi)施用pmlL-12/PPC復(fù)合體的攜帶腹膜彌散性卵巢 腫瘤的小鼠的存活改善。
圖7顯示通過劇度內(nèi)施用pmlL-12/PPC復(fù)合體的攜帶腹膜彌散性結(jié)腸 直腸腫瘤的小鼠的存活改善。pmIL-12/PPC復(fù)合體皿內(nèi)施用至攜帶腫瘤 的小鼠。監(jiān)測試驗動物和對照動物的存活。
圖8顯示通過艦內(nèi)施用pmIL-12/PPC復(fù)合體的攜帶GL-261神經(jīng)膠 質(zhì)瘤的小鼠的存活改善。pmIL-12/PPC復(fù)合體在肺瘤^tiA時施用至顱腔。 監(jiān)測試驗動物和對照動物的存活。
圖9顯示通過腫瘤內(nèi)施用pmIL-12/PPC復(fù)合體對皮下鱗狀細(xì)胞癌的抑 制。pmIL-12/PPC復(fù)合體在肺瘤^A^ 6-7日肺瘤內(nèi)施用至皮下SCCVII 腫瘤并且治療每周重復(fù)一次持續(xù)4周。為評估治療功效，定期測量腫瘤大 小。
圖IO顯示通過包含皿內(nèi)pmlL-12/PPC和靜脈內(nèi)紫杉醇的聯(lián)合療法 對紐彌散性卵巢腫瘤的抑制。pmIL-12/PPC復(fù)合體在^肺瘤細(xì)胞21 曰后通過皿內(nèi)注射施用.7日后重復(fù)pmlL-12/PPC治療。紫杉醇在首次 基因注射前一 日靜脈內(nèi)施用僅一次。監(jiān)測試驗動物和對照動物的存活。
圖11顯示通過包含腹膜內(nèi)pmlL-12/PPC和吉西他濱化學(xué)療法的聯(lián)合 療法對劇溪彌散性ID8卵巢腫瘤的抑制。攜帶腫瘤的小鼠在肺瘤l 14 日后以腹膜內(nèi)吉西他濱治療并且治療每周重復(fù)一次共4次治療。首次 pmIL-12/PPC治療在腫瘤植入17日后通過JSU度內(nèi)注射給予并每周重復(fù)一 次共4次治療。監(jiān)測試驗動物和對照動物的存活。
圖12顯示包含皿內(nèi)pmlL-12/PPC和卡鉑/紫杉醇化學(xué)療法的聯(lián)合療 法對,彌散性卵巢肺瘤的抑制。化學(xué)療法治療在肺瘤;HUV15日后開始， 卡鉑每周給予一次持續(xù)4周并且紫杉酚每隔一周給予一次共2次治療。首 次pmIL-12/PPC治療在肺瘤^ 18日后通過J^J溪內(nèi)注射給予并且每周重
復(fù)一次共4次治療。監(jiān)測試驗動物和對照動物的存活。
圖13顯示通過肺瘤內(nèi)施用pmIL-12/PPC復(fù)合體和環(huán)磷酰胺化學(xué)療法 對SCCVII肺瘤的抑制。pmIL-12/PPC復(fù)合體在腫瘤^tA 6-7日后腫瘤內(nèi) 施用至皮下SCCVII腫瘤并且每周重復(fù)一次共4周。環(huán)磷酰胺在基因注射 前一日靜脈內(nèi)施用并且在14日后重復(fù)。為評估治療功效，定期測量肺瘤大 小。
圖14顯示通過腫瘤內(nèi)施用pmlL-12/PPC復(fù)合體和BCNU化學(xué)療法對 GL261神經(jīng)膠質(zhì)瘤的抑制。pmIL-12/PPC復(fù)合體在腫瘤^時施用至顱 腔，BCNU作為Gliadel糯米紙嚢劑(wafer)在腫瘤^LX5日后施用。監(jiān) 測試驗動物和對照動物的存活。
圖15顯示IL-12/PPC基因療法添加至低劑量卡鉑/紫杉醇化學(xué)療法沒 有增加毒性，作為比較，用高劑量卡鉑/紫杉醇化學(xué)療法的治療引起30%比 例的治療相關(guān)性死亡?；瘜W(xué)療法治療在腫瘤^15日后開始，卡鉑每周給 予一次持續(xù)4周并且紫杉酚每隔一周給予一次共2次治療。首次 pmIL-12/PPC治療在腫瘤^1X 18日后通過蒯溪內(nèi)注射給予并且每周重復(fù) 一次共4次治療。整個治療循環(huán)重復(fù)三次。監(jiān)測試驗動物和對照動物的存 活。
發(fā)明詳述
在公開和描述本組合物及用于遞送生物活性劑的方法之前，應(yīng)當(dāng)理解 本發(fā)明不限于本文中〃〉開的具體設(shè)置、方法步驟和材料。還應(yīng)當(dāng)理解本文 中采用的術(shù)語僅用于描述具體實施方案的目的并且不意圖是限制性的，因
此本發(fā)明的范圍僅受附帶的權(quán)利要求書及其等效物限制。
必須指出如本說明書及所附權(quán)利要求書中所用，單數(shù)形式"一個"和 "該"包括復(fù)數(shù)稱謂，除非上下文清楚地說明。因此，對含有"一個二硝^鍵" 的聚合物的稱謂包括對兩個或多個如此二石危鍵的稱謂，對"一個配體"的稱 謂包括對一個或多個如此配體的稱謂以及對一種藥物的稱謂包括對兩種或 多種如此藥物的稱謂。
在描述本發(fā)明并要求本發(fā)明的權(quán)利時，將使用與以下描述的定義相一 致的如下術(shù)語。
"轉(zhuǎn)染"應(yīng)當(dāng)意指核酸從對細(xì)胞為外在的環(huán)境轉(zhuǎn)運至內(nèi)部的細(xì)胞環(huán)境， 尤其指細(xì)胞漿和/或細(xì)胞核。不受任何具體理論束綽，應(yīng)當(dāng)理解可以將核酸 包封于一種或多種陽離子型聚合物/核酸復(fù)合體中或黏附至此復(fù)合體或由 其攜帶后遞送至細(xì)胞。特定的轉(zhuǎn)染實例為將核酸遞送至細(xì)胞核。核酸包括
DNA和RNA以及其合成性同類物。此類核酸包括錯義、反義、無義以及 產(chǎn)生蛋白質(zhì)的核苷酸，控制蛋白質(zhì)、肽和核酸產(chǎn)生的開啟和關(guān)閉和調(diào)節(jié)速 率的核苷酸。尤其，它們可以是，但不限于基因組DNA、 cDNA、 mRNA、 tRNA、 rRNA、雜交序列或合成性或半合成性序列，并且其為天然來源的 或人工來源的。此夕卜，核酸可以在大小上變化，范圍從寡核苷酸至染色體。 這些核酸可以AA的、動物的、植物的、細(xì)菌的、病毒的或合成性來源。 它們可以由本領(lǐng)域沖支術(shù)人員所知的任何才支術(shù)荻得。
如本文中所用，術(shù)語"藥劑"或"藥物"或任何其它類似術(shù)語意指適用于
生物的物質(zhì)或化合物，其引:所需要的生物學(xué)的或藥物學(xué)的效;，該效^ 可以包括但不限于(l)具有對生物的預(yù)防性效果并防止不想要的生物學(xué)效 果如阻止感染，(2)緩解由疾病引起的病癥，例如緩解因疾病所致的疼痛或 炎癥，和/或(3)或者緩解、減少或完全消除來自生物中的疾病。效果可以是 局部的，如提供局部麻醉效果，或它可以是全身性的.
本發(fā)明本身不涉及新藥物或新類型的生物活性劑。相反，本發(fā)明涉及 可生物相容的陽離子型共聚物組合物以及使用如此組合物用于遞逸基因或 其它生物活性劑的方法，其中所述的其它生物活性劑在目前技術(shù)領(lǐng)域存在 或可能稍后確立作為活性劑并且適用于通過本發(fā)明遞送。此類物質(zhì)包括廣 泛類型的通常遞送至身體的化合物。通常，這包括但不限于核酸，如DNA、 RNA和寡核苷酸；抗感染藥如抗生素和抗病毒藥；鎮(zhèn)痛藥和鎮(zhèn)痛藥組合； 食欲抑制藥；驅(qū)蠕蟲藥；抗關(guān)節(jié)炎藥；平喘藥；抗驚厥藥；抗抑郁藥；抗 糖尿病藥；止瀉藥；抗組胺藥；抗炎藥；抗偏頭痛制劑；止惡心藥；抗腫
瘤藥；抗震顫麻痹藥；止癢藥；抗精神藥；退熱藥；解痙藥；抗膽堿能藥； 擬交感神經(jīng)藥；黃噤呤衍生物；心血管制劑包括鉀通道、鈣通道阻滯劑、/3-阻滯劑、a-阻滯劑和抗心律失常藥；抗高血壓藥；利尿藥和抗利尿藥；血 管舒張藥包括全身神經(jīng)、心神經(jīng)、周圍神經(jīng)和腦神經(jīng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興 奮劑、血管抑制藥；咳嗽和感冒制劑，包括減充血藥；激素，如雌二醇和 其它固醇類，包括皮質(zhì)類固醇；催眠藥；免疫抑制藥；肌肉松弛藥；副交 感神經(jīng)阻滯藥；精神興奮劑；鎮(zhèn)靜藥和安定藥。通過本發(fā)明的方法，可以 遞送例如處于離子化的、非離子化的、游離堿、酸加成鹽等所有形式的藥 物，同樣可以遞送高分子量或低分子量藥物。對于待遞送生物活性劑的屬 或種類的唯一限制是可以迅速通過常規(guī)實驗確定的官能度的限制。
如本文中所用，術(shù)語"可生物相容的"或"生物降解，，定義為將物質(zhì)通
過溶解化水解或通過生物形成的存在物(en份ies)轉(zhuǎn)化為復(fù)雜性較低的中間 產(chǎn)物或終產(chǎn)物，其中存在物可以是生物的酶或其它產(chǎn)物。
如本文中所用，"有效量"意指核酸或生物活性劑的量，其足以提供所 需的局部或全身效果和并以任何醫(yī)學(xué)治療的合理風(fēng)險/損益比實施。
如本文中所用"肽"意指任何長度的肽并且包括蛋白質(zhì)。術(shù)語"多肽"和 "寡肽"用于本文中而無任何具體大小限制的意思，除非說明具體的大小。 可以利用的代表性肽選自催產(chǎn)素、血管升壓素、腎上腺皮質(zhì)激素、表皮生 長因子、促乳素、促黃體素釋放素或黃體生成素^l^放激素、生長激素、生 長激素釋放因子、胰島素、促生長素抑制素、胰高血糖素、干擾素、胃泌 素、四肽胃泌素、五肽胃泌素、尿抑胃素(urogastroine)、腸M液素、 降鉀素、腦啡肽、內(nèi)啡肽、血管緊張素、腎素、緩激肽、桿菌肽、多粘菌 素、黏菌素、短桿菌酪肽、短桿菌J1UL合成的類似物、修飾物和其藥學(xué)活 性片段、單克隆抗體和可溶性疫苗。對可以利用的肽或蛋白質(zhì)藥物的唯一 限制是官能度的限制。
如本文中所用，糖的"衍生物"例如包括糖的酸形式，例如糖醛酸，糖 的胺，例如半乳糖胺；糖的磷酸酯，例如甘露糖-6-磷酸等。
如本文中所用，"施用"和類似術(shù)語意指遞送組合物至正在接受治療的
個體以致該組合物能夠在全身循環(huán)，其中組合物結(jié)合至乾細(xì)胞并通過內(nèi)吞 作用攝入。因此組合物優(yōu)選地全身施用至個體， 一般通過皮下、肌內(nèi)、經(jīng) 皮、靜脈內(nèi)或,內(nèi)途徑。用于此用途的注射劑可以制備為常規(guī)形式，作 為液體溶液或混懸液，或為這樣的固體形式，其適用于在注射前制備為液 體中的溶液或混懸液，或制備為乳劑。可用于施用的合適賦形劑包括例如
水、鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇等；以及根據(jù)需要，少量輔料如濕潤劑或 乳化劑、緩沖劑等。
如本文中所用，"功效"和類似術(shù)語意指腫瘤的消失或肺瘤大小的縮減 或腫瘤密度的降低或淋巴細(xì)胞計數(shù)的增加或嗜中性細(xì)胞計數(shù)的增加或存活 改善或以上全部。
如本文中所用，"毒性，，定義為臨床觀察到的任意的治療相關(guān)的不利效 果，包括但不限于異常的血液學(xué)或血清化學(xué)結(jié)果或器官毒性.
新的癌癥治療策略集中在允許經(jīng)外源遞送的基因在肺瘤環(huán)境中表達(dá)的 攜帶遺傳信息的遞送性大分子，而不是治療性蛋白質(zhì)本身。與病毒性遞送 系統(tǒng)相比，認(rèn)為利用非病毒性基因遞送系統(tǒng)的方法更安全，但是現(xiàn)存聚合 物系統(tǒng)的實際應(yīng)用因為效率低并不令人滿意。最近公開了一項策略，從而 通過膽固醇的共價結(jié)合形成水溶性脂質(zhì)聚合物(WSLP )增強(qiáng)低分子量PEI 的基因轉(zhuǎn)染效率。見Mol Ther.， 2001， 4， 130。用WSLP明顯比通過未修飾 的PEI更好地轉(zhuǎn)移IL-12基因至實體瘤，并且引起更顯著的肺瘤抑制。
本發(fā)明提供新的聚合物系統(tǒng)PEG-PEI-膽固醇(PPC)，其與WSLP (PEI-膽固醇)不同在于它含有PEG部分并且在腫瘤中產(chǎn)生顯著較高的轉(zhuǎn)染 效率(圖1)。設(shè)計添加PEG旨在增強(qiáng)生物環(huán)境中核^/聚合物復(fù)合體的穩(wěn)定 性以克服現(xiàn)有技術(shù)(WSLP)的缺陷。此外，添加PEG鏈允許配體摻入至PPC 鏈以改善遞送的組織選擇性。例如在現(xiàn)有技術(shù)(WSLP)中直接連接于PEI 主鏈的膽固醇部分可以從PEI主鏈進(jìn)一 步延伸以產(chǎn)生更靈活的幾何形狀用 于細(xì)胞受體相互作用?？刂泼繂挝籔EI主鏈的PEG分子數(shù)目對于實現(xiàn)轉(zhuǎn) 染活性的最佳強(qiáng)化重要。如圖2中所示，腫瘤基因轉(zhuǎn)移的幅度取決于不同 PPC成分、PEG、 PEI和膽固醇之間的比率。組合物的優(yōu)選范圍是在固定
的膽固醇含量時PEG:PEI摩爾比率2-4。 PEI和膽固醇間的最佳比率是 1:0.5至1:1。以治療性基因檢驗PPC促il^因轉(zhuǎn)移至肺瘤的能力。含有小 鼠IL-12基因的表i^t粒(pmlL-12)與PPC以11:1氮(N)對磷酸(P)比率(N:P 比率)復(fù)合并且腫瘤內(nèi)施用至具有4T1實體瘤的小鼠或皿內(nèi)施用至具有 蒯度彌散性卵巢腫瘤的小鼠。
在兩種腫瘤模型中，IL-12基因轉(zhuǎn)移表現(xiàn)為IL-12水平的增加(圖3)。 在攜帶皿腫瘤的小鼠中，治療后IL-12水平在24小時內(nèi)升高并且在7曰 內(nèi)降低至基線。IL-12作用的動力學(xué)與IL-12作用的下游媒介IFN-7的升高 密切相關(guān)(圖4)。 IFN-7水平的升高如所預(yù)期^W^遲并且在7日后仍然高 于基線。這些數(shù)據(jù)表明包含IL-12表達(dá)質(zhì)粒和PPC的組合物能夠在不同腫 瘤類型中并通過不同施用途徑表明IL-12基因轉(zhuǎn)移。通過pmlL-12/PPC介 導(dǎo)的IL-12基因轉(zhuǎn)移具有治療顯著性，因為它引起肺瘤生長的顯著抑制。
在具有皿彌散性卵巢肺瘤的小鼠內(nèi)，皿內(nèi)施用DNA劑量為10-250 pg的pmIL-12/PPC復(fù)合體(N:P比率ll:l)以劑量依賴性方式顯著地減少腫 瘤載量(圖5)并改善存活(圖6)。還在結(jié)腸直腸癌中觀察到 pmlL-12/PPC(N :P比率11:1)的治療效果。與未治療的動物相比，在具有 ,彌散性結(jié)腸直腸癌的小鼠中皿內(nèi)施用25 /tg的pmIL-12/PPC復(fù)合體 顯著地延長其存活(圖7)。通過pmIL-12/PPC的IL-12基因轉(zhuǎn)移的抗癌功 效還在肺瘤內(nèi)施用后的實體瘤內(nèi)觀察到.圖8顯示肺瘤內(nèi)注射 pmIL-12/PPC對GL261腦腫瘤生長的影響。通過局部遞送pIL-12/PPC復(fù) 合體(N:P比率ll :1)對小鼠GL261神經(jīng)膠質(zhì)瘤顱內(nèi)^V物的治療顯著地增 強(qiáng)存活。在具有皮下^的頭和頸鱗狀細(xì)胞癌的小鼠內(nèi)，每周一次持續(xù)四 周腫瘤內(nèi)施用pmIL-12/PPC復(fù)合體產(chǎn)生顯著的腫瘤生長逸率抑制(圖9)。 還在卵巢肺瘤和乳腺腫瘤內(nèi)觀察到pmIL-12/PPC復(fù)合體的抗癌效果。
本發(fā)明的組合物(核酸和基因遞送聚合物)當(dāng)體內(nèi)施用時未產(chǎn)生不利的 副作用。例如，沒有與j^內(nèi)或皮下施用pmlL-12/PPC相關(guān)的化合物相關(guān) 的死亡或臨床中毒跡象。pmlL-12/PPC在每只動物10/tg、 50/tg和250 /tg 劑量上在雄性和雌性小鼠中得到良好耐受。IP和SC劑量組內(nèi)動物的組織
病理學(xué)檢查表明沒有因pmIL-12/PPC所致的全身毒性證據(jù)，輕微炎癥在位 于或接近于注射部分的器官中明顯，但是在一個月恢復(fù)時間期間消退。這 些結(jié)果證實當(dāng)通過不同施用模式給予時，用于癌癥治療的核^/聚合物組合
物有效地對抗類型廣泛的癌癥，并且體內(nèi)重復(fù)遞送不引起嚴(yán)重毒性。
已經(jīng)廣泛認(rèn)識到抗癌癥的單獨治療策略通常因該疾病的多因素性質(zhì)無 效。人們正日益認(rèn)識到聯(lián)合多于一種藥物以使抗癌反應(yīng)最大化的益處。盡 管臨床前數(shù)據(jù)令人鼓舞，然而迄今已檢驗的化學(xué)"t學(xué)組合或化學(xué)-細(xì)胞因 子組合的臨床成功因化學(xué)治療藥和重組細(xì)胞因子蛋白質(zhì)的固有毒性仍不令 人滿意。這證明需要更安全的化學(xué)-免疫療法方法以克服蛋白質(zhì)毒性并改善 功效。在本發(fā)明中，我們聯(lián)合化學(xué)治療劑與局部施用至腫瘤部位的抗癌基 因的基因遞送以改善治療安全性和功效，安全和有效的抗癌基因局部遞送 與標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)治療劑的聯(lián)合將增強(qiáng)抗癌反應(yīng)和患者存活，不引起毒性。該聯(lián) 合療法將減少化學(xué)療法劑量并且增加腫瘤對化學(xué)療法的敏感性。在;^發(fā)明 中，已經(jīng)證實包含與陽離子型基因遞送聚合物復(fù)合的抗癌基因和至少一種 附加的化學(xué)治療藥的藥物組合物比單獨施用基因療法或化學(xué)療法更有效。 此外當(dāng)通過不同的施用途徑給予時，聯(lián)合療法有效地對抗類型廣泛的癌癥， 并且不對個體治療引起毒性。
聯(lián)合療法的抗癌反應(yīng)針對^腹膜腔的卵巢腫瘤展示。靜脈內(nèi)施用紫 杉醇(Taxof) (8 mg/Kg)或J^M內(nèi)施用pmIL-12質(zhì)粒(25 -100 ng)/PPC復(fù)合 體(N:P比率11 :l)在攜帶胂瘤的小鼠中引起胂瘤的減少和改善的存活。 pmIL-12/PPC治療比紫杉醇治療更有效。聯(lián)合IL-12基因和紫杉醇療法產(chǎn) 生比單獨治療更大的治療反應(yīng)(圖10)。當(dāng)IL-12基因療法與另一種化學(xué)治 療劑吉西他濱(Gemza,)聯(lián)合時，觀察到聯(lián)合療法在卵巢癌上的類似效果 (圖11)。當(dāng)與pmlL-12/PPC治療同時使用時，吉西他濱的抗癌活性顯著增 強(qiáng)。研究了 IL-12基因療法與兩種化學(xué)治療劑的混合物的聯(lián)合，如圖12中 所示，當(dāng)與單獨的IL-12療法或單獨的化學(xué)療法比較時，IL-12基因療法與 卡柏(Paraplatin⑧)/紫杉醇混合物聯(lián)合引起增強(qiáng)的存活。IL-U基因療法加 至次優(yōu)劑量的卡鉑/紫杉醇增強(qiáng)了類似于用高化學(xué)療法劑量實現(xiàn)的治療功
效(圖12)，不引發(fā)毒性。
在實體瘤內(nèi)也觀察到通過聯(lián)合療法對抗癌反應(yīng)的改善。例如在頭和頸 的皮下鱗狀細(xì)胞癌中，靜脈內(nèi)施用化學(xué)治療劑環(huán)磷酰胺(150 mg/kg)顯著地 減少腫瘤生長，但是未完全抑制腫瘤生長(圖13)。腫瘤內(nèi)僅注射 pmIL-12/PPC引起約30。/。的腫瘤生長抑制。相對于單獨治療，環(huán)磷酰胺加 pmIL-12/PPC的聯(lián)合療法引起腫瘤生長的完全抑制。完全排斥率從用環(huán)磷 酰胺的僅10%明顯地增加至用環(huán)磷酰胺加pmIL-12/PPC復(fù)合體的55%。 在GL261腦胂瘤中單次腫瘤內(nèi)注射次優(yōu)劑量(1.5 ]Li g)的pmIL-12/PPC復(fù) 合體未顯著地增強(qiáng)動物的存活率。然而，該次優(yōu)劑量的pmlL-12/PPC與化 學(xué)治療劑BCNU(Gliade^wafer)的聯(lián)合在存活率上產(chǎn)生顯著增強(qiáng)(圖14)。
采用高劑量化學(xué)療法的癌癥治療伴隨嚴(yán)重的毒性.為枱，驗IL-12/PPC 加至低劑量化學(xué)療法是否引起治療相關(guān)性毒性，攜帶腹膜彌散性印巢腫瘤 的小鼠以IL-12/PPC和低劑量化學(xué)療法的三個治療循環(huán)處理并監(jiān)測毒性征 兆.直接比較以三個循環(huán)高劑量化學(xué)療法治療處理的動物。如圖15中所示， 高劑量化學(xué)療法組的50%因治療相關(guān)性毒性死亡(即在達(dá)到40克之前)， 而IL-12/PPC +低劑量化學(xué)療法組沒有一只動物死于治療毒性。這些結(jié)果 表明用于癌癥的常規(guī)化學(xué)療法(高劑量)的毒性可以通過降低化學(xué)療法劑量 并加入更安全和有效的IL-12基因療法而顯著減少。
這些數(shù)據(jù)顯示了包含IL-12質(zhì)粒和新型基因遞送聚合物的組合物的抗 癌功效及該組合物用單種化學(xué)治療劑或化學(xué)治療劑混合物的加強(qiáng).聯(lián)合方 法提供這樣的方法，通過該方法增強(qiáng)次優(yōu)劑量的化學(xué)療法方案的功效，而 不增加毒性。
如下實施例將使本領(lǐng)域技術(shù)人員更清楚地理解如何實施本發(fā)明。應(yīng)當(dāng) 理解，盡管結(jié)合本發(fā)明優(yōu)選的具體實施方案，本發(fā)明已經(jīng)得到描述，然而 隨后的實施方案意在說明而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的其它方面對于 與本發(fā)明有關(guān)的本領(lǐng)域技術(shù)人員將顯而易見。
實施例1
通過局部施用pIL-12/PPC復(fù)合體將IL-12基因轉(zhuǎn)移至腹膜彌散性腫瘤
或皮下腫瘤
檢測了局部遞送pIL-12/PPC復(fù)合體以在攜帶皮下腫瘤和劇溪彌散性 腫瘤的小鼠中產(chǎn)生IL-12水平的能力。對于皮下肺瘤研究，雌性BALB/c 小鼠(7周齡，14-18克)在左腹側(cè)和右腹側(cè)分別以lxl(^個4T1細(xì)胞作皮下 (sc)注射。腫瘤達(dá)到約60mm3的腫瘤大小后，以含有6 pg DNA的 pmIL-12/PPC復(fù)合體注射它們。小鼠在24小時后處死并收獲它們的腫瘤 用于通過ELISA分析mlL12。注射后24小時腫瘤中的mIL-12水平示于 圖3A。
對于腹膜肺瘤研究，雌性C57/BL6小鼠以500^1體積內(nèi)的5xl06個ID8 細(xì)胞作皿內(nèi)(ip)注射.當(dāng)肺瘤負(fù)荷(小鼠重量)達(dá)到約20克(注射細(xì)胞 后~21日)時，治療開始。小鼠于500/d體積內(nèi)的11:1氮(N)對磷酸(P)比 率(N:P比率)的單劑量pmIL-12/PPC作腹膜內(nèi)注射。腹水在小鼠經(jīng) pmlL-12/PPC治療后的1、 2、 3和7日從攜帶腫瘤的動物中取出。mIL-12 和IFN-7的水平通過ELISA測定并對總腹水進(jìn)行歸一化。結(jié)果表明在腹水 中觀察到顯著水平的mIL-12，治療后l日達(dá)峰值水平，治療后7日水平下 跌至接近基線(圖3B).類似地觀察到IFN-7的水平升高，但峰值水平相對 于IL-12水平在時間上推遲(3天峰值)并且在治療后至7日下跌但仍顯 著地高于基線水平(圖4)。
實施例2
通過皿內(nèi)施用pIL-12/PPC復(fù)合體治療皿彌散性卵巢肺瘤 小鼠以500;d體積內(nèi)的5xl06個ID8細(xì)胞作皿內(nèi)注射。當(dāng)腫瘤負(fù)荷 (小鼠重量)達(dá)到約20克(注射細(xì)胞后 21日)時，治療開始。小鼠于500/d 體積內(nèi)的以11:1 N:P比率與PPC復(fù)合的10-250 ]tig的pIL-12作J^M內(nèi)注 射，每周一次持續(xù)三周。小鼠在研究期間定期稱重。重量增加明顯因提供 間接評估疾病i^和腫瘤負(fù)荷的腹水聚集引起。pmIL-12/PPC治療引起肺 瘤負(fù)荷的劑量依賴性抑制(圖5)以及動物存活延長(圖6)。 實施例3
通過劇度內(nèi)施用pIL-12/PPC復(fù)合體治療^M彌散性結(jié)腸直腸肺瘤
小鼠以500/tl體積內(nèi)的0.1xl(^個CT26細(xì)胞作^M內(nèi)注射。治療在肺 瘤;ti/v 1日后開始。小鼠于500/d體積內(nèi)的以11:1 N:P比率與PPC復(fù)合的 50 /tg pmIL-12或與LPPC6復(fù)合的25 pg pIL-12作^M內(nèi)注射，每周一次 持續(xù)五周。LPPC6是一分子mPEG和6分子膽固醇分別與之結(jié)合的15KD 線型聚氮丙啶。如圖7中所示，在這種高度侵入性肺瘤模型中pmIL-12/PPC 和pmlL-12/LPPC6治療在存活上產(chǎn)生超過未治療對照的顯著改善。
實施例4
通過肺瘤內(nèi)施用pIL-12/PPC復(fù)合體治療腦癌
局部遞送pmIL-12/PPC復(fù)合體的效果在小鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤模型中檢驗， 腫瘤通過顱內(nèi)注射1 x 10s個GL261神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)皿入小鼠大腦皮層， 同時共注射pmIL-12/PPC復(fù)合體。監(jiān)視動物的任何神經(jīng)毒性征兆并根據(jù)需 要進(jìn)行尸檢，以證實死亡原因是顱內(nèi)肺瘤。存活使用Kaplan-Meier存活分 析作圖。以質(zhì)粒劑量范圍2.5 -30 /tg單次顱內(nèi)注射施用的pmIL-12/PPC復(fù) 合體受到良好耐受，因為未觀察到明顯的不利效果。以質(zhì)粒劑量15Mg單次 注射的pmIL-12/PPC復(fù)合體在動物存活方面產(chǎn)生顯著增強(qiáng)(圖8).
實施例5
通過腫瘤內(nèi)施用pIL-12/PPC復(fù)合體治療頭頸癌
檢驗局部施用pIL-12/PPC復(fù)M對皮下植入的鱗狀細(xì)胞(SCCVII)癌 生長的影響。將100 /il中的4x10s個鱗狀癌細(xì)胞在雌性CH3小鼠(6-9周齡， 17-22克)的右側(cè)腹部皮下^U^。 mIL-12質(zhì)粒與PPC以11:1 N:P比率復(fù)合 并在腫瘤;tiA后約11日開始以50 /d注射體積內(nèi)的25 /tg DNA劑量局部施 用至腫瘤，每周一次持續(xù)4周。使用治療組的12小鼠并使用卡尺量具每周 兩次監(jiān)測胂瘤生長。如圖9中所示，腫瘤內(nèi)施用pmIL-12/PPC復(fù)合體產(chǎn)生 部分的但顯著的肺瘤生長抑制。
實施例6
pIL-12/PPC加紫杉醇聯(lián)合療法用于治療,彌散性卵巢肺瘤 ,內(nèi)IL-12基因療法與紫杉醇化學(xué)療法聯(lián)合以增強(qiáng)對小鼠中彌散性 卵巢胂瘤的治療反應(yīng)。小鼠以500/d體積內(nèi)的5乂106個ID8細(xì)胞作,內(nèi)
注射。當(dāng)腫瘤負(fù)荷(小鼠重量)達(dá)到約20克(注射細(xì)胞后 21日)時，治 療開始。小鼠于500;tl體積內(nèi)的以11:1 N:P比率與PPC復(fù)合的25/*g pmlL-12作J^內(nèi)注射?；虔煼ㄔ谄呷蘸笾貜?fù)，形成每個研究總共兩次 注射(第1日、第8日)。紫杉醇(Taxo產(chǎn))以8 mg/kg劑量在注射體積250^1 中通過靜脈內(nèi)注射施用僅一次(第0日)。對于聯(lián)合療法，基因療法和化學(xué) 療法治療均如上所述給予。動物定期稱重以評估基因療法對腫瘤負(fù)荷的影 響'僅皿內(nèi)注射pmIL-12/PPC復(fù)合體導(dǎo)致皿腫瘤負(fù)荷的顯著減少. pmIL-12/PPC復(fù)合體對肺瘤負(fù)荷的抑制略高于紫杉醇對胂瘤負(fù)荷的抑制。 IL-12基因療法加至紫杉醇導(dǎo)致紫杉醇對腫瘤負(fù)荷作用和存活的改善(圖 10)。
實施例7
pIL-12/PPC加吉西他濱的聯(lián)合療法用于治療劇度彌散性卵巢癌 評估了 IL-12基因療法與吉西他濱(Gemza一)聯(lián)合的功效。吉西他濱 屬于一組通用的稱作抗代謝劑的化學(xué)療法藥物。吉西他濱用于治療胰癌、 乳腺癌(與紫杉醇一起)和肺癌(與順鉑一起)，并且目前正在臨床評估抗卵巢 癌的用途。對于本項研究，小鼠(C57BL/6)以500/d體積內(nèi)的2.5xl06 + ID8 細(xì)胞作皿內(nèi)注射以誘導(dǎo)彌散性腫瘤形成。在腫瘤^UM4日后，吉西他濱 以250/d體積內(nèi)的150 mg/kg劑量j^內(nèi)施用。治療每周重復(fù)，總共四次 治療。從肺瘤^LX17日后開始，所選擇的小鼠組于50(Vd體積內(nèi)的以11:1 N:P比率與PPC復(fù)合的25/ig IL-12質(zhì)粒作腹膜內(nèi)注射,質(zhì)粒施用每周重復(fù)， 總共四次治療。與兩種單一療法的任一療法相比，IL-12基因療法與吉西 他濱化學(xué)療法的聯(lián)合療法顯著地改善生存(圖11)。 實施例8
pIL-12/PPC加卡鉑/紫杉醇聯(lián)合療法用于治療劇度彌散性卵巢癌 用于卵巢癌的一線化學(xué)療法一直是賴劑(卡鉑、順鉑)和紫杉醇。因此， 我們有興趣評估與卡鉑/紫杉醇化學(xué)療法方案聯(lián)合的IL-12基因療法的用 途。小鼠(C57BL/6)以500/tl體積內(nèi)的2.5x106個ID8細(xì)胞作,內(nèi)注射。 化學(xué)療法治療在肺瘤植入15日后開始?？ㄣK(Paraplatii^)施用是250gl中
的40 mg/kg(高劑量)或以250 #1中的15 mg/kg(低劑量)，內(nèi)施用并且紫 杉醇(Taxol⑧)以250 中的8mg/kg(高劑量)給予或以250 /d中的3 mg/kg(低劑量),內(nèi)給予?？ㄣK每周給予一次共4次治療，并紫杉醇每2 周給予1次共2次治療。當(dāng)相同日給予卡鉑和紫杉醇時，首先施用紫杉醇 并且此后2小時施用卡鉑。從腫瘤植入18日后開始，所選組中的小鼠于 500]d體積內(nèi)的以11:1 N:P比率與PPC復(fù)合的25/ig IL-12質(zhì)粒作J^M內(nèi)治 療。質(zhì)粒施用每周重復(fù)共四次治療。在治療方案結(jié)束后，監(jiān)測動物的存活。 結(jié)果顯示IL-12基因療法和低劑量卡鉑/紫杉醇化學(xué)療法均產(chǎn)生類似的存活 結(jié)果(圖12)。相反，當(dāng)?shù)蛣┝炕瘜W(xué)療法與IL-12基因療法聯(lián)合時，功效提 高到與高劑量化學(xué)療法治療方案幾乎相同的水平。能夠使用與低劑量化學(xué) 療法聯(lián)合的IL-12基因療法以在維持治療功效同時使用較低的化學(xué)療法劑 量4吏毒性最小化，這是有利的。這將有效地允許患者在化學(xué)療法治療方案 上維持延伸的時間段，為更明顯加強(qiáng)的治療反應(yīng)提供機(jī)會。 實施例9
pIL-12/PPC加環(huán)磷酰胺聯(lián)合療法用于治療頭和頸癌 聯(lián)合腫瘤內(nèi)IL-12基因療法與環(huán)磷酰胺(Cytoxan⑧)化學(xué)療法以在頭和 頸癌內(nèi)增強(qiáng)治療反應(yīng)。100 pl中的4x10s個鱗狀癌細(xì)胞(SCCVII)在雌性 CH3小鼠(6-9周齡，17-22克)右腹側(cè)皮下植入，在環(huán)磷酰胺治療前五日(肺 瘤;tL^后約11日)，將mlL-12質(zhì)粒以11:1 N:P比率與PPC復(fù)合并以50 ;tl 注射體積中的25/igDNA劑量局部施用至腫瘤，每周1次，持續(xù)四周。環(huán) 砩酰胺療法以125/tl注射體積中的200 mg/kg劑量單獨地或與pIL-12基因 療法聯(lián)合作靜脈內(nèi)施用。環(huán)磷酖胺療法14日后重復(fù)，形成每項研究總共2 次注射。對于聯(lián)合療法，基因療法和化學(xué)療法治療均如上所述給予。使用 治療組的12只小鼠并使用卡尺量具每周兩次監(jiān)測肺瘤生長。如圖13中所 示，單獨地腫瘤內(nèi)施用pmIL-12/PPC復(fù)合體或靜脈內(nèi)注射環(huán)磷酰胺僅產(chǎn)生 部分的腫瘤生長抑制，而它們的聯(lián)合則產(chǎn)生完全抑制。與單獨用化學(xué)療法 治療的動物對照(10%)，存在用聯(lián)合療法治療的以更高百分比完全糸夂斥腫 瘤的動物(55%)。
實施例10
通過腫瘤內(nèi)pIL-12/PPC和BCNU聯(lián)合療法治療腦癌 局部遞送單獨的或與BCNU (Gliade產(chǎn))聯(lián)合的pmIL-12/PPC復(fù)合體的 效果在小鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤模型中檢驗。Gliadef糯米紙囊劑是亞硝基脲家族 的化學(xué)治療劑卡莫司汀或BCNU的聚合物制劑。通過顱內(nèi)注射lxl()S個 GL261神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞將腫瘤植入小鼠大腦皮層，同時共注射 pmIL-12/PPC復(fù)合體。在腫瘤植入5日后，含有10。/。BCNU的GHadel 在頂骨內(nèi)板下植入。監(jiān)視動物的任何神經(jīng)毒性征兆并根據(jù)需要進(jìn)行尸檢， 以證實死亡原因是顱內(nèi)肺瘤。存活使用Kaplan-Meier存活分析作圖。單次 顱內(nèi)注射質(zhì)粒劑量范圍為2.5-30 /tg的pmIL-12/PPC復(fù)合體受到良好耐 受，因為未觀察到明顯的不利效果。單次注射1.5/tg質(zhì)粒劑量的 pmIL-12/PPC復(fù)合體未增強(qiáng)存活率。然而，該次優(yōu)劑量pmIL-12/PPC與 BCNU的聯(lián)合顯著地增強(qiáng)存活(圖14)。源于聯(lián)合療法的存活增強(qiáng)在此模型 中高于歷史上單獨以BCNU所達(dá)到的存活增強(qiáng)(數(shù)據(jù)未顯示)。 實施例11
比較IL-12/PPC加低劑量卡鉑/紫杉醇聯(lián)合療法與高劑量卡鉑/紫杉醇 聯(lián)合療法的毒性
本申請人先前已經(jīng)證實IL-12/PPC與低劑量卡鉑(15 mg/kg)和紫杉醇 (3 mg/kg)療法的聯(lián)合產(chǎn)生類似于高劑量卡鉑(40 mg/kg)和紫杉醇(8 mg/kg) 化學(xué)療法的抗癌功效(實施例8，圖12)。在本實施例中，檢驗IL-12/PPC 加低劑量聯(lián)合化學(xué)療法的毒性是否比高劑量化學(xué)療法低。與先前實施例中 所用的僅一次治療循環(huán)相比，以三次治療循環(huán)將IL-12/PPC+低劑量化學(xué)療 法或高劑量化學(xué)療法施與攜帶皿彌散性卵巢腫瘤的小鼠.將如此的動物 死亡視為治療相關(guān)的死亡，其為在達(dá)到40克體重界限(因疾病a處死動 物的標(biāo)準(zhǔn))前出現(xiàn)的動物死亡并且在尸體剖檢中未顯現(xiàn)明顯腫瘤負(fù)荷。小 鼠(C57BL/6)以500^1體積內(nèi)的2.5x106個ID8細(xì)胞作J^M內(nèi)注射.化學(xué)療 法治療在腫瘤;&A15日后開始?？ㄣK(Paraplatin,施用是在250 /d中的 40 mg/kg(高劑量)或在250 pl中的15 mg/kg(低劑量)并且紫杉醇(Taxo產(chǎn))施
用是在250 pl中的8mg/kg(高劑量)或以250 中的3 mg/kg(低劑量)作艦 內(nèi)施用?？ㄣK每周給予一次共4次治療，并且紫杉醇每2周給予1次共2 次治療。在治療日，首先施用紫杉醇并且此后2小時施用卡鉑。從肺瘤植 入18日后開始，所選組中的小鼠于500/tl體積內(nèi)以11:1N:P比率與PPC 復(fù)合的IL-12質(zhì)粒作劇溪內(nèi)治療。質(zhì)粒施用每周重復(fù)共四次治療. 整個治療循環(huán)重復(fù)三次(共12周)，并且監(jiān)測動物的存活。如圖15中所 示，與IL-12/PPC +低劑量化學(xué)療法組中、單純的低劑量化學(xué)療法組或 IL-12/PPC治療組中的0%治療相關(guān)性死亡相比，高劑量化學(xué)療法組的30% 死于治療相關(guān)性務(wù)性(即在達(dá)到40克前)。這些結(jié)果表明與高劑量化學(xué)療法 方案比較，IL-12/PPC與低劑量化學(xué)療法的聯(lián)合產(chǎn)生相對較少的治療相關(guān) 性死亡，但產(chǎn)生相似的抗癌功效(圖12)。
應(yīng)當(dāng)理解以上所述實施方案僅說明本發(fā)明的應(yīng)用原理。可以衍生眾多 的修改和替代性實施方案而不脫離本發(fā)明的精神和范圍并且隨后的權(quán)利要 求書意圖覆蓋此類修改和調(diào)整。因此，盡管本發(fā)明已經(jīng)在附圖中得到展示 并結(jié)合目前認(rèn)為是最實用和優(yōu)選的本發(fā)明實施方案如上得以具體而詳細(xì)地 描述，對于本領(lǐng)域一般技術(shù)人員而言顯而易見可以進(jìn)行眾多修改而不脫離 本發(fā)明地原理和概念。
權(quán)利要求
1.用于治療癌癥或過度增生性疾病的藥物組合物，其包含核酸、基因遞送聚合物和至少一種藥劑。
2. 權(quán)利要求l所述的藥物組合物，其中核酸選自質(zhì)粒DNA、 siRNA、 有義RNA、反義RNA和核酶。
3. 權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中基因遞送聚合物是包含與脂類 和聚乙二醇共價連接的聚氮丙咬(PEI)主鏈的脂質(zhì)聚合物，以及至少一種用 于治療癌癥或過度增生性疾病的藥劑。
4. 權(quán)利要求l所述的藥物組合物，其中藥劑選自用于治療癌癥或過度 增生性疾病的化學(xué)治療藥、抗血管生成劑、抗癌肽、單克隆抗體和其混合 物，
5. 權(quán)利要求4所述的組合物，其中藥劑是化學(xué)治療劑或抗癌劑，其選 自亞德里亞霹素、博來霉素、順鉑、卡鉑、阿霉素、5-IL^嘧咬、紫杉醇、托泊替康、卡莫司汀、吉西他濱或同類任意相關(guān)的化學(xué)治療劑及其任意組 合。
6. 權(quán)利要求4所述的藥物組合物，其中藥劑為選自白細(xì)胞介素-2、白細(xì)胞介素-4、白細(xì)胞介素-7、白細(xì)胞介素-12、 IL-15、干擾素-a、干擾素-j8、干擾素々、集落刺激因子、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、抗血管生成劑、TNF-a、 eNOS、 iNOS、 IPIO、 p16、細(xì)菌抗原、病毒抗原、肺瘤抗原的多 肽和其任意組合。
7. 權(quán)利要求4所述的藥物組合物，其中藥劑是抗體。
8. 權(quán)利要求4所述的藥物組合物，其中藥劑是選自CD20抗體、 HER2/neu抗體、抗VEGF抗體、表皮生長因子受體抗體及其放射性同位 素綴合物的抗癌抗體。
9. 權(quán)利要求4所述的藥物組合物，其中所述藥劑是選自白細(xì)胞介素-2 、 白細(xì)胞介素-4、白細(xì)胞介素-7、白細(xì)胞介素-12、 IL-15、干擾素-0f、干擾素 -仏干擾素-7、集落刺激因子、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、抗血管生成劑、IPIO、 p16、 eNOS、 iNOS、 TNF-a、細(xì)菌抗原、病毒抗原、腫瘤抗 原的多M其4壬意組合。
10. 權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中基因遞送聚合物選自任一化學(xué) 修飾的聚氮丙咬、聚甲基吖丙啶、^tJ^苷-聚胺、二脫氧-二M-b-環(huán)糊 精、精胺、亞精胺、聚(2-二甲^J0乙基異丁烯酸、聚(賴氨酸)、陽離子化 明膠、樹狀聚合物、脫乙酰殼多糖及其任意組合。
11. 權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中基因遞送聚合物是選自聚乙烯 p比咯烷酮、聚乙烯醇、泊洛沙姆、聚谷氨酸、明膠、聚磷酸酯、絲-彈性蛋 白樣水凝膠、瓊脂糖水凝膠、脂微管、聚(丙交酯共乙交酯)、聚乙二醇連 接的聚(丙交酯共乙交酯)及其任意組合的非縮合型聚合物。
12. 用于在哺乳動物中抑制腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移并改善存活的方法， 其通過體內(nèi)施用根據(jù)權(quán)利要求1-11任一項中所述的包含核酸、基因遞送聚 合物和至少一種用于治療癌癥或過度增生性疾病的藥劑的藥物組合物而實 施。
13. 權(quán)利要求12所述的方法，其中所述核^A編碼選自如下的蛋白質(zhì) 的DNA質(zhì)粒白細(xì)胞介素-2、白細(xì)胞介素-4、白細(xì)胞介素-7、白細(xì)胞介素 -12、白細(xì)胞介素-15、干擾素-a、干擾素W、干擾素-7、集落刺激因子、粒 細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、抗血管生成劑、胸苷激酶、p53、 IPIO、 p16、 TNF-a、 Fas-配體、肺瘤抗原、病毒抗原、細(xì)菌抗原或其任意組合，
14. 權(quán)利要求12所述的方法，其中所述核^A編碼白細(xì)胞介素-12的 DNA質(zhì)粒。
15. 權(quán)利要求12所述的方法，其中所述核^編碼多于一種蛋白質(zhì)的 單種DNA質(zhì)粒，所述的蛋白質(zhì)選自白細(xì)胞介素-2、白細(xì)胞介素-4、白細(xì)胞 介素-7、白細(xì)胞介素-12、白細(xì)胞介素-15、干擾素-a、干擾素-/3、干擾素々、 集落刺激因子、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、抗血管生成劑、胸苷激酶、 p53、 IPIO、 p16、 TNF-a、 Fas-配體、肺瘤抗原、病毒抗原和細(xì)菌抗原的 任意組合。
16. 權(quán)利要求12所述的方法，其中所述核酸是編碼短發(fā)夾RNA的DNA 質(zhì)粒，其中短發(fā)夾RNA設(shè)計為旨在抑制肺瘤生長和轉(zhuǎn)移所需的蛋白質(zhì)表 達(dá)。
17. 權(quán)利要求12所述的方法，其中所述核^A設(shè)計為旨在抑制腫瘤生 長和轉(zhuǎn)移所需蛋白質(zhì)的表達(dá)的選自siRNA、有義RNA、反義RNA、核酶 及其4壬意組合的RNA。
18. 權(quán)利要求12所述的方法，其中核酸是編碼短發(fā)夾RNA和選自白 細(xì)胞介素-2、白細(xì)胞介素4、白細(xì)胞介素-7、白細(xì)胞介素-12、白細(xì)胞介素 -15、干擾素-a、干擾素W、干擾素々、集落刺激因子、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞刺 激因子、抗血管生成劑、胸苷激酶、p53、 IPIO、 p16、 TNF-a、 eNOS、 iNOS、 Fas-配體、肺瘤抗原、病毒抗原、細(xì)菌抗原及其任意組合的蛋白質(zhì)的單種 DNA質(zhì)粒。
19. 權(quán)利要求12所述的方法，其中核M選自siRNA、有義RNA、反 義RNA或核酶的RNA以及編碼選自白細(xì)胞介素-2、白細(xì)胞介素4、白細(xì) 胞介素-7、白細(xì)胞介素-12、白細(xì)胞介素-15、干擾素-a、干擾素-/3、干擾素 々、集落刺激因子、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落剌激因子、抗血管生成劑、胸苷 激酶、p53、 IPIO、 p16、 TNF-a、 eNOS、 iNOS、 Fas-配體、肺瘤抗原、 病毒抗原、細(xì)菌抗原或其任意組合的蛋白質(zhì)的質(zhì)粒DNA。
20. 權(quán)利要求12所述的方法，其中聚氮丙吱具有分子量100-500,000 道爾頓的線型構(gòu)型或分支構(gòu)型.
21. 權(quán)利要求12所述的方法，其中脂類和聚乙二醇均通過共價鍵直接 地連接至PEI主鏈。
22. 權(quán)利要求12所述的方法，其中脂類通過聚乙二醇間隔區(qū)連接至PEI 主鏈。
23. 權(quán)利要求12所述的方法，其中聚乙二醇具有50至20,000道爾頓 之間的分子量。
24. 權(quán)利要求12所述的方法，其中脂類是膽固醇、膽固醇衍生物、C12 至Qs脂肪酸或脂肪酸衍生物。
25，權(quán)利要求12所述的方法，其中聚乙二醇與PEI的摩爾比在0.1:1 至500:1的范圍內(nèi)。
26. 權(quán)利要求12所述的方法，其中脂類與PEI的摩爾比在0.1:1至500:1的范圍內(nèi)。
27. 權(quán)利要求12所述的方法，其中聚氮丙咬還包含乾向部分，其中靶 向部分直接連接至聚氮丙啶主鏈或通過聚乙二醇連接體連接。
28. 權(quán)利要求27所述的方法，其中靶向部分選自轉(zhuǎn)鐵蛋白、脫唾液酸 糖蛋白、抗體、抗體片段、低密度脂蛋白、白細(xì)胞介素、GM-CSF、 OCSF、 M-CSF、干細(xì)胞因子、促紅細(xì)胞生成素、表皮生長因子(EGF)、胰島素、 脫唾液酸血清類私蛋白、甘露糖-6^酸、甘露糖、LewisX和唾液酰LewisX、 N-乙?；樘前贰⑷~酸、半乳糖、乳糖和凝血調(diào)節(jié)蛋白、融合劑如多粘菌 素B和血凝素HA2、嗜溶酶體劑、核定位信號(NLS)及其任意組合。
29. 權(quán)利要求27所述的方法，其中脂質(zhì)聚合物與靶向部分的摩爾比在 1:0.1至1:100的范圍內(nèi)。
30. 權(quán)利要求12所述的方法，其中所述核酸與所述脂質(zhì)聚合物以脂質(zhì) 聚合物中的氮摩爾對DNA中的磷脧學(xué)爾為0.1:100至100:1的摩爾比復(fù)合。
31. 權(quán)利要求30所述的方法，其中所述核酸與所述脂質(zhì)聚合物以脂質(zhì) 聚合物中的氮摩爾對DNA中的磷脧學(xué)爾為0.1:100至100:1的摩爾比復(fù)合。
32. 權(quán)利要求12所述的方法，其中藥劑通過靜脈內(nèi)、經(jīng)口或皿內(nèi)施 用法進(jìn)行施用。
33. 權(quán)利要求12所述的方法，其中核酸和基因遞送聚合物在施用藥劑 前給予.
34. 權(quán)利要求12所述的方法，其中所述核酸和基因遞送聚合物在施用 藥劑后給予.
35. 權(quán)利要求12所述的方法，其中所述的聯(lián)合治療比單獨的治療更有效。
36. 權(quán)利要求12所述的方法，其中所述聯(lián)合治療的毒性等于或小于單 獨治療的毒性。
37. 權(quán)利要求12所述的方法，其中在核酸的最佳劑量和藥劑的次優(yōu)劑 量上的所述^i合治療產(chǎn)生高于或等同于最佳劑量藥劑的功效。.權(quán)利要求12所述的方法，其中包含所述核酸的最佳劑量和藥劑的 次優(yōu)劑量的所述聯(lián)合治療的毒性比最佳劑量藥劑的毒性低。
全文摘要
用于治療哺乳動物癌癥或過度增生性疾病的藥物組合物，其包含核酸、基因遞送聚合物和至少一種附加的化學(xué)治療藥，以及使用該藥物組合物用于通過腫瘤內(nèi)、腹膜內(nèi)或全身注射治療哺乳動物癌癥或過度增生性疾病的方法。
文檔編號C12N15/87GK101111154SQ200580047587
公開日2008年1月23日 申請日期2005年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月9日
發(fā)明者D·H·劉易斯, J·G·費威爾, J·賴斯, K·安瓦爾, M·馬塔爾 申請人:表達(dá)遺傳學(xué)公司