專利名稱：糖鏈改變的抗磷脂酰肌醇聚糖3抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞毒活性、特別是抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)增強(qiáng)的對(duì)應(yīng)于磷脂酰肌醇聚糖3抗原的抗體(即，抗磷脂酰肌醇聚糖3抗體)及其制備方法。
背景技術(shù)：
磷脂酰肌醇聚糖3(GPC3)是存在于細(xì)胞表面上的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖家族中的一員。提示GPC3可能與發(fā)育和癌細(xì)胞增殖中的細(xì)胞分裂有關(guān)，但是其功能仍然不是很清楚。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與GPC3結(jié)合的各種抗體具有通過ADCC(抗體依賴性細(xì)胞毒性)活性以及CDC(補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性)活性抑制細(xì)胞增殖的作用(WO2003/000883)。GPC3在生物體內(nèi)被切割，以可溶性GPC3形式分泌到血液中，提示可以利用能檢測(cè)出可溶性GPC3形式的抗體進(jìn)行癌癥的診斷。(WO2004/022739、WO2003/100429、WO2004/018667)。
開發(fā)利用抗體的細(xì)胞毒活性的抗癌劑時(shí)，優(yōu)選使用的抗體具有高水平的ADCC活性，所以，需要具有高水平細(xì)胞毒活性的抗GPC3抗體。
已知抗體糖鏈的改變可以增強(qiáng)抗體的ADCC活性。例如，在WO99/54342中記載了通過改變抗體的糖基化提高ADCC活性。另外，在WO00/61739中記載了通過控制抗體糖鏈中巖藻糖的存在與否來調(diào)節(jié)ADCC活性。在WO02/31140中記載了通過使YB2/0細(xì)胞產(chǎn)生抗體，從而制備具有不含α-1，6核心巖藻糖的糖鏈的抗體。在WO02/79255中記載了具有含有平分型(bisecting)GlcNAc的糖鏈的抗體。但是，目前還沒有公開由于糖鏈的改變而增強(qiáng)ADCC活性的抗磷脂酰肌醇聚糖3抗體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供通過改變糖鏈組成增強(qiáng)ADCC活性的抗磷脂酰肌醇聚糖3抗體組合物以及制備該抗體的方法。
本發(fā)明人在進(jìn)行了各種研究后，發(fā)現(xiàn)具有α-1，6核心巖藻糖缺失的糖鏈的抗GPC3抗體具有高水平的細(xì)胞毒活性。所以，本發(fā)明提供抗體的糖鏈組成發(fā)生改變的抗GPC3抗體組合物，更具體而言，提供巖藻糖缺失的抗GPC3抗體的比例較大的抗體組合物。本發(fā)明的糖鏈改變的抗GPC3抗體組合物具有高水平的細(xì)胞毒活性，因此作為抗癌劑等細(xì)胞生長抑制劑是有用的。
本發(fā)明還提供一種抗GPC3抗體組合物的制備方法，其特征在于，其中所述抗體的糖鏈發(fā)生改變，包括以下步驟向YB2/0細(xì)胞等巖藻糖添加能力降低的宿主細(xì)胞中導(dǎo)入編碼抗GPC3抗體的核酸，培養(yǎng)該宿主細(xì)胞，獲得該抗體。向糖鏈上添加巖藻糖的能力降低的細(xì)胞優(yōu)選是巖藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白缺失的細(xì)胞。


圖1表示N-糖苷連接的糖鏈的基本結(jié)構(gòu)。
圖2表示在使用人外周血單核細(xì)胞(PBMC)、以HepG2細(xì)胞為靶細(xì)胞時(shí)嵌合抗體的ADCC活性。
圖3表示在使用人PBMC、以HuH-7細(xì)胞為靶細(xì)胞時(shí)嵌合抗體的ADCC活性。
圖4表示在使用人PBMC、以HuH-7細(xì)胞為靶細(xì)胞時(shí)抗體的ADCC活性。
圖5表示由FT-KO細(xì)胞產(chǎn)生的抗體(a，b，c)以及CHO細(xì)胞產(chǎn)生的抗體制備的缺失半乳糖的2-AB修飾的糖鏈的正相HPLC色譜圖。
圖6表示圖5中所示的峰G(0)以及G(0)-Fuc峰的推測(cè)結(jié)構(gòu)。
圖7表示FT-KO細(xì)胞產(chǎn)生的抗體(a)以及CHO細(xì)胞產(chǎn)生的抗體(b)的DSC(差示掃描量熱法)測(cè)定圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明以提供抗體的糖鏈組成發(fā)生變化的抗GPC3抗體組合物為特征。已知與抗體連接的糖鏈的結(jié)構(gòu)對(duì)抗體細(xì)胞毒活性的表達(dá)具有顯著影響。與抗體連接的糖鏈包括與抗體分子的天冬酰胺殘基側(cè)鏈上的N原子連接的N-糖苷連接的糖鏈、與抗體分子的絲氨酸或蘇氨酸殘基側(cè)鏈上的羥基連接的O-糖苷連接的糖鏈，本發(fā)明的重點(diǎn)在于N-糖苷連接的糖鏈中巖藻糖的存在與缺失。
圖1表示與抗體連接的N-糖苷連接的糖鏈的基本結(jié)構(gòu)。如圖1的IgG基本糖鏈(1)以及(3)所示，N-糖苷連接的糖鏈具有1個(gè)甘露糖(Man)和2個(gè)N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)部分以β-1，4鍵連接的基本結(jié)構(gòu)(核心)[-Manβ1-4GlcNACβ1-4GlcNAc-]。該結(jié)構(gòu)右側(cè)的GlcNAc稱為還原末端，左側(cè)的Man稱為非還原末端。當(dāng)巖藻糖(Fuc)與還原末端連接時(shí)，通常采用在還原末端N-乙酰葡糖胺的6位與巖藻糖的1位之間以α鍵連接的形式。另一方面，在圖1的IgG基本糖鏈(2)中所示的糖鏈中，在基本結(jié)構(gòu)(核心)的非還原末端除了上述2個(gè)糖鏈以外，還通過β1，4鍵連接了1個(gè)N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)。該種類型的N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)被稱為“平分型N-乙酰葡糖胺”。具有平分型N-乙酰葡糖胺的糖鏈可以是O-糖苷連接的糖鏈或N-糖苷連接的糖鏈，是通過N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶III(GnTIII)使N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移到糖鏈上而形成的。編碼該酶的基因已經(jīng)被克隆，并公開了其氨基酸序列以及編碼該酶的DNA的核苷酸序列(NCBI數(shù)據(jù)庫(登錄號(hào)D13789))。
在本發(fā)明中，糖鏈組成發(fā)生改變或變化的抗體組合物(糖鏈改變的抗體組合物)是指具有與由作為參照標(biāo)準(zhǔn)的宿主細(xì)胞產(chǎn)生的抗體組合物不同的糖鏈組成的抗體組合物。
在本發(fā)明中，糖鏈組成發(fā)生變化與否，是以由作為參照標(biāo)準(zhǔn)的宿主細(xì)胞產(chǎn)生的抗體組合物為參照標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷。如果抗體組合物具有與作為參照標(biāo)準(zhǔn)的抗體組合物不同的糖鏈組成，則認(rèn)為該抗體組合物是糖鏈組成發(fā)生變化的抗體組合物。
在本發(fā)明中，作為參照標(biāo)準(zhǔn)的宿主細(xì)胞是CHO DG44細(xì)胞。CHODG44細(xì)胞可以從例如Invitrogen公司購得。
糖鏈組成發(fā)生變化的抗體組合物的例子包括，例如，抗體組合物中巖藻糖(例如，α-1，6核心巖藻糖)缺失的抗體的比例增加的抗體組合物，和抗體組合物中具有連接的平分型N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)的抗體的比例增加的抗體組合物。
作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案，抗體組合物中巖藻糖缺失的抗體的比例高于作為參照標(biāo)準(zhǔn)的抗體組合物。
由于一些抗體具有多個(gè)N-糖苷糖鏈，所以本發(fā)明的巖藻糖缺失的抗體中不僅包括完全沒有連接巖藻糖的抗體，也包括與抗體連接的巖藻糖部分的數(shù)目降低的抗體(至少在1個(gè)或1個(gè)以上的糖鏈中沒有巖藻糖的抗體)。
利用宿主細(xì)胞制備糖鏈發(fā)生改變的抗體時(shí)，通常難以得到含有都具有相同糖鏈的均一抗體的組合物。所以，如果本發(fā)明的糖鏈組成發(fā)生變化的抗體組合物是，例如，巖藻糖缺失的抗體的比例增加的抗體組合物，則本發(fā)明的糖鏈組成發(fā)生變化的抗體組合物可含有巖藻糖缺失的抗體和巖藻糖不缺失的抗體，但巖藻糖缺失的抗體的總比例高于由作為參照標(biāo)準(zhǔn)的宿主細(xì)胞制備的抗體組合物中的比例。在本發(fā)明的巖藻糖缺失的抗體的比例高的抗體組合物中，巖藻糖缺失的抗體的比例沒有特別限定，但優(yōu)選為20％以上，較優(yōu)選為50％以上，最優(yōu)選為90％以上。
在本發(fā)明的添加平分型N-乙酰葡糖胺的抗體比例高的抗體組合物中，添加平分型N-乙酰葡糖胺的抗體的比例沒有特別限定，但優(yōu)選為20％以上，較優(yōu)選為50％以上，最優(yōu)選為90％以上。
本發(fā)明的糖鏈組成發(fā)生變化的抗GPC3抗體組合物可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法得到。
例如，巖藻糖缺失的抗體可以通過在不具有添加α-1，6核心巖藻糖的能力或該能力降低的宿主細(xì)胞中表達(dá)抗GPC3抗體進(jìn)行制備。
本發(fā)明對(duì)不具有添加巖藻糖的能力或該能力降低的宿主細(xì)胞沒有特別限定，但是本發(fā)明可以使用巖藻糖轉(zhuǎn)移酶活性缺失或降低的宿主細(xì)胞、高爾基體內(nèi)的巖藻糖濃度降低的宿主細(xì)胞等。更具體而言，宿主細(xì)胞的例子包括大鼠骨髓瘤YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細(xì)胞(簡稱為YB2/0細(xì)胞)(保藏為ATCC CRL 1662)、FTVIII敲除CHO細(xì)胞(WO02/31140)、Lec13細(xì)胞(WO03/035835)、巖藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白缺失的細(xì)胞(WO 2005/017155)等。
本文使用的術(shù)語“巖藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白缺失的細(xì)胞”是指細(xì)胞中巖藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的存在量少于正常細(xì)胞的細(xì)胞、或巖藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的結(jié)構(gòu)異常而導(dǎo)致巖藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能下降的細(xì)胞。作為巖藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白缺失的細(xì)胞的例子包括，例如，巖藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因被敲除的細(xì)胞(以下稱為“FT-KO細(xì)胞”)、巖藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的一部分缺失或突變的細(xì)胞、巖藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)系統(tǒng)具有缺陷的細(xì)胞等。編碼中國倉鼠巖藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因的核苷酸序列及其氨基酸序列分別示于SEQ IDNO126以及127。
另外，利用SEQ ID NO126中所示的核苷酸序列，使用RNA干涉(RNAi)能得到本發(fā)明的巖藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白缺失的細(xì)胞。RNAi是指如下現(xiàn)象在向細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入雙鏈RNA(dsRNA)時(shí)，與該RNA序列匹配的細(xì)胞內(nèi)mRNA特異性降解，無法表達(dá)為蛋白質(zhì)。RNAi通常使用雙鏈RNA，但本發(fā)明并不局限于此，例如，也可以使用由自身互補(bǔ)的單鏈RNA分子形成的雙鏈RNA。對(duì)于形成雙鏈分子的區(qū)域，該分子可以在所有的區(qū)域都是雙鏈，也可以一部分區(qū)域(例如，兩個(gè)末端或一個(gè)末端)為單鏈。本發(fā)明對(duì)于RNAi使用的寡聚RNA的長度沒有特別限定。本發(fā)明的寡聚RNA的長度為，例如，5～1000個(gè)堿基(或者在雙鏈分子中為5～1000bp)，優(yōu)選為10～100個(gè)堿基(或者在雙鏈分子中為10～100bp)，最優(yōu)選為15～25個(gè)堿基(在雙鏈分子中為15～25bp)，特別優(yōu)選19～23個(gè)堿基(在雙鏈分子中為19～23bp)的長度。
上述RNAi法利用了下述現(xiàn)象與特定基因同源的、由有義RNA和反義RNA組成的dsRNA破壞該基因的轉(zhuǎn)錄物(mRNA)的同源部分?？梢允褂门c巖藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的全部序列對(duì)應(yīng)的雙鏈RNA，也可以使用與一部分序列對(duì)應(yīng)的較短dsRNA(例如，21～23bp)(小干擾dsRNA；siRNA)。該雙鏈RNA可以直接被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中，也可以在制成產(chǎn)生雙鏈RNA的載體后導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，從而在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生該雙鏈RNA。例如，可以將編碼巖藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的DNA的全部或一部分插入到載體中，使其形成反向重復(fù)序列，然后將該載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中?？梢园凑障率鑫墨I(xiàn)中的記載進(jìn)行RNAi方法Fire A.等，Nature(1998)，391，806-811、Montgomery M.K.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1998)，95，15502-15507、Timmons L.等，Nature(1998)，395，854、Sánchez A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1999)，96，5049-5054、Misquitta L.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1999)，96，1451-1456、Kennerdell J.R.等，Cell(1998)，95，1017-1026、Waterhouse P.M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1998)，95，13959-13964、Wianny F.等，Nature Cell Biol.(2000)，2，70-75等。
利用RNAi法獲得的巖藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白缺失的細(xì)胞可以以巖藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性為指標(biāo)進(jìn)行篩選。也可以基于蛋白質(zhì)印跡法或RNA印跡法所示的巖藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)進(jìn)行篩選。
糖鏈上添加了平分型N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)的抗體可以通過在具有在糖鏈中形成平分型N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)結(jié)構(gòu)的能力的宿主細(xì)胞中表達(dá)抗GPC3抗體進(jìn)行制備。
具有添加了平分型N-乙酰葡糖胺的糖鏈的抗體的一種制備方法已經(jīng)是公知的(WO 02/79255)。本發(fā)明對(duì)于具有在糖鏈中形成平分型N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)結(jié)構(gòu)的能力的宿主細(xì)胞沒有特別限定，可以包括，例如，具有含有編碼GnTIII的DNA的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。所以，可以使用具有含有編碼GnTIII的DNA的表達(dá)載體以及編碼抗GPC3抗體的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，制備具有添加了平分型N-乙酰葡糖胺的糖鏈的抗GPC3抗體。編碼GnTIII的DNA和編碼抗GPC3抗體的基因可以存在于同一載體上，也可以存在于不同的載體上。
提高抗體組合物中巖藻糖缺失的抗體或添加平分型N-乙酰葡糖胺的抗體的比例的另外一種方法是通過純化巖藻糖缺失的抗體或添加平分型N-乙酰葡糖胺的抗體來提高組合物中上述抗體的比例。
可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法進(jìn)行糖鏈的分析。例如，通過使N-糖苷酶F(Roche)等與抗體反應(yīng)，可以使糖鏈從該抗體上釋放出來。然后，可以利用使用纖維素柱的固相提取法(Shimizu Y.等，Carbohydrate Research 332(2001)，381-388)將糖鏈脫鹽，濃縮干燥，利用2-氨基吡啶進(jìn)行熒光標(biāo)記(Kondo A.等，Agricultural and BiologicalChemistry 548(1990)，2169-2170)。利用使用纖維素柱的固相提取從吡啶基氨基糖鏈(PA-糖鏈)中除去試劑，然后離心濃縮該糖鏈，得到純化的PA-糖鏈。然后，可以通過利用十八烷基硅烷(ODS)柱的反相HPLC分析測(cè)定該糖鏈。也可以使用利用ODS柱的反相HPLC分析和利用胺柱的正相HPLC分析的組合通過二維作圖分析這樣制備的PA-糖鏈。
本發(fā)明的糖鏈改變的抗GPC3抗體只要能與GPC3結(jié)合即可，沒有特別限定。與GPC3的結(jié)合優(yōu)選是特異性結(jié)合。本發(fā)明優(yōu)選的抗GPC3抗體包括具有下面表1所示的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)序列的抗體。
表1

表1(續(xù))

具有上述表中列出的CDR序列的抗體具有高水平的細(xì)胞毒活性。具有上述表中列出的CDR序列的抗體識(shí)別GPC3上的氨基酸524-563的表位。由于識(shí)別氨基酸524-563的表位的抗體具有高水平的細(xì)胞毒活性，因此，優(yōu)選作為本發(fā)明的抗GPC3抗體。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案中，本發(fā)明的糖鏈組成發(fā)生變化的抗體組合物以ADCC活性增強(qiáng)為特征。在本發(fā)明中，ADCC活性是否增強(qiáng)，可以與作為參照標(biāo)準(zhǔn)的抗體組合物進(jìn)行比較來確定。如果本發(fā)明的抗體組合物顯示高于該參照標(biāo)準(zhǔn)的ADCC活性，則ADCC活性被判斷為增強(qiáng)。
ADCC活性的測(cè)定可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法進(jìn)行，例如，可以通過混合效應(yīng)細(xì)胞、靶細(xì)胞以及抗GPC3抗體，然后檢測(cè)ADCC的程度，從而進(jìn)行測(cè)定。更具體而言，例如，可以利用小鼠脾細(xì)胞、從人外周血(PBMC)或骨髓中分離得到的單核細(xì)胞等作為效應(yīng)細(xì)胞，可以使用人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系HuH-7等表達(dá)GPC3的人類細(xì)胞作為靶細(xì)胞。預(yù)先用51Cr標(biāo)記靶細(xì)胞，向其中加入抗GPC3抗體后進(jìn)行培養(yǎng)，然后以相對(duì)于靶細(xì)胞的適當(dāng)比例加入效應(yīng)細(xì)胞，一起進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)后收集上清液，通過計(jì)數(shù)上清液中的放射性測(cè)定ADCC活性。
抗GPC3抗體可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法制備抗GPC3抗體。例如，使用GPC3作為敏化抗原，根據(jù)常規(guī)免疫方法進(jìn)行免疫，然后，利用常規(guī)細(xì)胞融合法使得到的免疫細(xì)胞與公知的親代細(xì)胞融合，再利用常規(guī)篩選方法篩選單克隆抗體產(chǎn)生細(xì)胞，從而制備上述抗體。具體而言，可以如下所述地制備單克隆抗體。首先，基于Lage，H.等，Gene 188(1997)，151-156中公開的基因/氨基酸序列，通過表達(dá)GPC3(MXR7)得到用作獲得抗體的敏化抗原的GPC3。即，將編碼GPC3的基因序列插入公知的表達(dá)載體中，用該載體轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞后，利用公知的方法從該宿主細(xì)胞或培養(yǎng)上清液中純化目標(biāo)人磷脂酰肌醇聚糖3蛋白質(zhì)。然后，使用該純化的GPC3蛋白質(zhì)作為敏化抗原。也可以以GPC3的部分肽作為敏化抗原。此時(shí)，可以根據(jù)人GPC3的氨基酸序列化學(xué)合成部分肽。被本發(fā)明的抗GPC3抗體識(shí)別的GPC3分子上的表位沒有限制，只要本發(fā)明的抗GPC3抗體可以識(shí)別GPC3分子上存在的任何表位。這是因?yàn)榭笹PC3抗體通過其ADCC活性、CDC活性、或抑制生長因子活性顯示細(xì)胞生長抑制活性，而且，與抗GPC3抗體連接的諸如放射性同位素、化學(xué)治療藥物、細(xì)菌毒素等細(xì)胞毒性物質(zhì)的作用也能抑制細(xì)胞生長。因此，用于制備本發(fā)明的抗GPC3抗體的抗原可以是GPC3的任何片段，只要它含有存在于GPC3分子上的表位。
在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，為了得到識(shí)別GPC3的氨基酸524-563的表位的抗體，可以使用含有氨基酸524-563的肽作為敏化抗原。
本發(fā)明對(duì)于被敏化抗原免疫的哺乳動(dòng)物沒有特別限定，但考慮到與細(xì)胞融合中使用的親代細(xì)胞的相容性，優(yōu)選選擇的動(dòng)物包括嚙齒類動(dòng)物，例如，小鼠、大鼠或倉鼠，或家兔，猴等。根據(jù)公知的方法用敏化抗原免疫動(dòng)物。例如，通常是對(duì)哺乳動(dòng)物腹膜內(nèi)或皮下注射敏化抗原。具體而言，以適量的磷酸緩沖液(PBS)或生理鹽水等稀釋或懸浮敏化抗原，根據(jù)需要混合適量的常規(guī)佐劑，例如，弗氏完全佐劑，乳化，對(duì)哺乳動(dòng)物給藥數(shù)次/每4-21天。另外，在用敏化抗原免疫時(shí)也可以使用適當(dāng)?shù)妮d體。
如上所述地免疫哺乳動(dòng)物，并在血清中檢測(cè)到期望的抗體水平后，從哺乳動(dòng)物中收集免疫細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞融合。作為用于細(xì)胞融合的免疫細(xì)胞，特別優(yōu)選脾細(xì)胞。作為與上述免疫細(xì)胞融合的親代細(xì)胞，使用哺乳動(dòng)物的骨髓瘤細(xì)胞。適合用作骨髓瘤細(xì)胞的公知的細(xì)胞株包括，例如，P3(P3x63Ag8.653)(J.Immnol.(1979)123，1548-1550)、P3x63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology(1978)81，1-7)、NS-1(Kohler.G.and Milstein，C.Eur.J.Immunol.(1976)6，511-519)、MPC-11(Margulies.D.H.等，Cell(1976)8，405-415)、SP2/0 (Shulman，M.等，Nature(1978)276，269-270)、FO(de St.Groth，S.F.等，J.Immunol.Methods(1980)35，1-21)、S194(Trowbridge，I.S.J.Exp.Med.(1978)148，313-323)、R210(Galfre，G.等，Nature(1979)277，131-133)。上述免疫細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的細(xì)胞融合基本上可以根據(jù)公知的方法，例如Kohler和Milstein的方法(Kohler.G.and Milstein，C.，Methods Enzymol.(1981)73，3-46)進(jìn)行。更具體而言，例如，在含有細(xì)胞融合促進(jìn)劑的常規(guī)培養(yǎng)液中進(jìn)行上述細(xì)胞融合。細(xì)胞融合促進(jìn)化學(xué)物質(zhì)的例子包括聚乙二醇(PEG)和仙臺(tái)病毒(HVJ)等。還可以根據(jù)需要，添加諸如二甲基亞砜等輔助劑以提高融合效率?？梢匀我庠O(shè)定免疫細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的比例，例如，優(yōu)選免疫細(xì)胞相對(duì)于骨髓瘤細(xì)胞的比例為1-10倍。作為上述細(xì)胞融合中使用的培養(yǎng)液，可以使用適用于培養(yǎng)這些細(xì)胞類型的常規(guī)液體培養(yǎng)基，例如，RPMI1640培養(yǎng)液、MEM培養(yǎng)液、以及適用于骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)的其它培養(yǎng)液。還可以并用胎牛血清(FCS)等血清添加劑。在細(xì)胞融合程序中，在上述培養(yǎng)液中充分混合規(guī)定量的免疫細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞，然后通常以濃度30-60％(w/v)加入預(yù)先升溫至37℃的PEG溶液(例如，平均分子量為約1000-6000)，混合，形成融合細(xì)胞(雜交瘤)。然后，添加適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)液，離心除去上清液。重復(fù)該步驟，由此除去不利于雜交瘤生長的所有細(xì)胞融合化學(xué)物質(zhì)。由此得到的雜交瘤通過在常規(guī)選擇培養(yǎng)液、例如HAT培養(yǎng)液(含有次黃嘌呤、氨基喋呤以及胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)液)中培養(yǎng)而進(jìn)行選擇。在上述HAT培養(yǎng)液中的培養(yǎng)持續(xù)充分的時(shí)間(通常數(shù)日～數(shù)周)，直到殺滅目標(biāo)雜交瘤以外的細(xì)胞(非融合細(xì)胞)。然后，進(jìn)行常規(guī)的有限稀釋，接著進(jìn)行產(chǎn)生靶抗體的雜交瘤的篩選以及單克隆。除了用抗原免疫非人動(dòng)物得到上述雜交瘤以外，還可以在體外用GPC3敏化人淋巴細(xì)胞，然后使敏化的淋巴細(xì)胞與無限增殖化人骨髓瘤細(xì)胞融合，得到具有GPC3結(jié)合活性的所希望的人抗體(參見特公平1-59878號(hào)公報(bào))。而且，可以向具有人抗體基因的所有組成成分的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物施用作為抗原的GPC3，得到產(chǎn)生抗GPC3抗體的細(xì)胞，并從無限增殖化細(xì)胞中收集抗GPC3的人抗體(參見國際專利申請(qǐng)
發(fā)明者中野清孝, 周鄉(xiāng)泉, 杉本正道, 石黑敬弘, 田中美谷米, 飯島成幸 申請(qǐng)人:中外制藥株式會(huì)社